LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS

BIOLOGINöS CHEMIJOS KATEDRA

Guoda Giedraityt÷

MIKROORGANIZMŲ SĄVEIKOS YPATUMAI PORTUGALIŠKŲ FERMENTINIŲ SŪRIŲ BRANDINIMO METU

Magistro darbas

Darbo vadovas:

e.doc.p. dr. Aldona Baltušnikien÷

Kaunas, 2010

2

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS

BIOLOGINöS CHEMIJOS KATEDRA

Magistro darbas atliktas 2008-2010 metais Lietuvos veterinarijos akademijos Biologin÷s

chemijos katedroje, Portugalijoje, mikrobiologijos laboratorijoje, Katalikiškajame universitete,

chemijos laboratorijoje, Lisabonos universitete ir Idanha a Nova sūrių fabriko laboratorijoje.

Magistro darbą paruoš÷: Guoda Giedraityt÷ _________________

Magistro darbo vadovas: e. doc. p. dr. Aldona Baltušnikien÷

( LVA Biologin÷s chemijos katedra) _________________

Recenzentas (ai):

(Vardas, pavardė) (parašas)

(parašas)

3

SANTRAUKA

Mikroorganizmų sąveikos ypatumai portugališkų fermentinių sūrių brandinimo metu

Buvo tirti Sera da Estrella, Serpa ir jiems analogiški tradiciniai portugališki sūriai,

pienarūgšt÷s bakterijos, jų išskiriamos antimikrobin÷s medžiagos. Tyrimai atlikti Portugalijoje,

Porto miesto Katalikiškame Biotechnologijos Universitete, Idanha a Nova kaimelyje, sūrių

fabrike, ir Lisabonos mieste, Lisabonos Universitete. Atliktos Serpa ir Serra da estrela sūrių

chemin÷, mikrobiologin÷ ir juslin÷ analiz÷s. Idanha a Nova sūrių fabrike iš 116 pienarūgščių

bakterijų (PRB) išskirtos 4 bakterijos, su stipriausiu antimikrobiniu poveikiu 4 pasirinktiems

kontroliniams patogenams: Serratia sp., S. aureus, E. coli, L. inoccua. PRB buvo identifikuotos.

Didžiausią slopinantį poveikį Seratia sp., L. inoccua, E. coli ir S. aureus veiklai tur÷jo

Lactobacillus brevis ir Lactobacillus curvatus. Buvo stebimas PRB 7013, identifikuotos kaip

Lactobacillus brevis, antimikrobinis veikimas in vivo. Lisabonos Universitete tirta PRB išskirtų

bakterijų antimikrobin÷ medžiaga: jos atsparumas karščiui, kokią įtaką jos veikimui daro

fermentai, buvo atlikta aukšto patikimumo skysčių chromatografijos analiz÷, leidžianti daryti

prielaidą, kad bent viena iš 4 PRB sintetina bakteriociną.

Mikrobiologinio tyrimo metu nustatyta, kad visą sūrių nokimo laikotarpį, dominavo

abiejuose produktuose pienarūgšt÷s bakterijos. Tai patvirtina faktą, jok pienarūgšt÷s bakterijos

yra linkusios būti dominuojančiomis.

Pasteb÷ta, kad galutinis produktas priklauso nuo mikroorganizmų veiklos. Serra da

Estrela sūryje vystęsi mikroorganizmai suformavo lengvą, švelnų aromatą su įdomiu pikantišku

skoniu. Tuo tarpu Serpa sūryje veikę mikroorganizmai suformavo stipresnio kvapo ir aštresnio

skonio sūrį.

Reikšminiai žodžiai: mikrobiota, pienarūgšt÷s bakterijos (PRB), koliformin÷s

bakterijos (Serratia sp., E. coli), Pseudomonas spp., S. aureus, L. inoccua, bakteriocinai.

4

SUMMARY

Peculiarity interaction between microorganisms due to Portuguese fermented cheeses ripening time

There were investigated Serpa, Serra da Estrela and analogical Portuguese cheeses.

Researches have been done in Porto Catholic Biotechnological University, in a cheese factory -

Idanha a Nova village, at the University of Lisbon.

Serpa and Serra da Estrela cheeses were investigated by doing chemical, microbiological

and sensory analyses. There were isolated 116 lactic acid bacteria (LAB) strains in a cheese

factory of Idanha a Nova and selected 4 LAB strains with the best inhibitory activity against 4

control pathogens: Serratia sp., S. aureus, E. coli and L. inoccua. LAB strains were identified as

Lactobacillus brevis and Lactobacillus curvatus. The antimicrobial compound`s heat, enzym

resistance and HPLC analyses have been done.

The amount of microorganism intensity at different stages of cheeses ripeness has

been observed and there were established that lactic acid bacterias were dominated due to all

maturating time. The amount of Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Staphylococus spp.

decreased while cheeses maturing time.

The technology of cheese making is responsible for the final product as well as the

activity of microorganisms in it.

Key words: Lactic acid bacteria (LAB), Enterobacteriaceae (Serratia sp., E. coli),

Pseudomonas sp., S. aureus, L. inoccua.

5

TURINYS

ĮVADAS..............................................................................................................................1 1. LITERATŪROS APŽVALGA...................................................................................3 1.1 Pienarūgščių bakterijų charakteristika…………………………………………….3 1.2 Pienarūgščių bakterijų reikšm÷ sūrių gamyboje…………………………………..4 1.3 Pienarūgščių bakterijų antibakterinis pritaikymas………………………………..5

1.4 Bakteriocinų apžvalga…………………………………………………………….....6 1.5 Bakteriocinų klasifikacija...........................................................................................6 1.5.1 I bakteriocinų kategorija…………………………………………………………..7 1.5.2 II bakteriocinų kategorija.........................................................................................7 1.5.3 III bakteriocinų kategorija........................................................................................8 1.5.4 IV bakteriocinų kategorija.......................................................................................8 1.5.5 Gram - neigiamų bakterijų išskiriami bakteriocinai................................................8 1.6 Bakteriocinų chemin÷s ir fizikin÷s savyb÷s…………………………………….…..9 1.7 Bakteriocinų veikimo būdas ………………………………………………………..9

2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS.......................................................................12 2.1 Tyrimų vykdymo vieta……………………………………………………………..12 2.2 Tyrimų objektai.........................................................................................................12 2.3 Serra da Estrela ir Serpa sūrių gamybos technologija………………………...…12 2.4 Tyrimų metodai……………………………………………………………….…….12 2.4.1 Chemin÷ analiz÷ – rūgštingumo nustatymas…………………………….…….…12 2.4.1.1 Sūrio titruojamojo rūgštingumo nustatymas…………………………….….……13 2.4.1.2 Sūrio aktyviojo rūgštingumo (pH) nustatymas……………………………..……13 2.4.2 Juslin÷ analiz÷ …………………………………………………………….….….13

2.4.3 Mikrobiologin÷ analiz÷…………………………………………………………..15

2.4.4 Antibakterinio pienarūgščių bakterijų poveikio nustatymas………………..……16

2.4.4.1 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷ tik÷tinam antimikrobiniam poveikiui

nustatyti…………………………………………………………………..………16

2.4.4.2 “Medaus korio” mikrol÷kštel÷s paruošimas tyrimui……………………..………17

2.4.4.3 Antimikrobinio poveikio nustatymas Petri l÷kštel÷se……………………………17

2.4.4.4 Bakteriocino aktyvumo ir prigimties tyrimai…………………………………….18

6

2.4.4.5 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas…………………………18

2.4.4.6 Aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC tyrimas)…………………18

2.4.4.7 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu identifikavimas…18

2.4.4.8 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis in vivo………...……………………19

3. DARBO REZULTATAI…………………...……………………………………….20

3.1 Portugališkų Serpa ir Serra da Estrela sūrių mikrobiologin÷ analiz÷ ………….20

3.2 Juslin÷ Serra da Estrela ir Serpa sūrių analiz÷……………………….…………..21

3.3 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷……………………………………………..24

3.4 Antimikrobinio pienarūgščių bakterijų intensyvumo nustatymas Petri

l÷kštel÷se……………………………………………………………………………..27

3.5 Aktyvumo ir prigimties tyrimai................................................................................30

3.6 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas…………………………32

3.7 Tyrimas aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC

tyrimas)……………………………………………………………………………...33

3.8 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu

identifikavimas…………………………………………………………..………….35

3.9 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis sūryje…………………..…………..35

4. REZULTATŲ APTARIMAS………………………………………….…………..39

4.1 Portugališkų Serpa ir Serra da Estela sųrių mikrobiologinio tyrimo

aptarimas…................................................................................................................39

4.2 Pienarūgščių bakterijų sintetinmos antimikrobin÷s medžiagos apibūdinimas…40

5. IŠVADOS…................................................................................................................42

LITERATŪROS SĄRAŠAS………………………………………………………..….43

7

ĮVADAS

Sūris - tai maisto produktas gaminamas iš karvių, ožkų bei avių sutraukinto pieno -

varšk÷s. Nors pieno sutraukinimo procesai išaiškinti tik dvidešimto amžiaus pradžioje, tačiau

pieną ir iš jo pagamintus pieno produktus žmon÷s vartojo nuo seno (Gudonis, 1997).

Fermentiniai sūriai yra labai vertingi pieno produktai, turintys lengvai virškinamų

baltymų, riebalų, įvairių mineralinių medžiagų ir vitaminų. Jie plačiai paplitę įvairiose šalyse su

savitomis gamybos technologijomis ir įvairiu asortimentu (Masteikien÷, 2006).

Fermentiniai sūriai gaunami, traukinant pieną didelį proteolitinį aktyvumą turinčiais

fermentais (šliužo fermentu ar jo pakaitalais) ir dedant pienarūgščių bakterijų raugo, o kai kuriais

atvejais ir propionrūgščių, gleivių bakterijų, pel÷sinių grybų (Masteikien÷, 2006).

Sūrių gamyboje mikrobiologiniai procesai vaidina vieną svarbiausių vaidmenų. Čia

išskirtin÷s yra pienarūgšt÷s bakterijos. Sūrių gamybos technologijos proceso metu jos dauginasi

ir tampa pagrindine subrandintų sūrių mikrobiota (Masteikien÷, 2006). Pienarūgščių bakterijų

grup÷ susideda iš 13 Gram – teigiamų bakterijų genčių: Carnobacterium, Enterococcus,

Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,

Paralactobacillus, Streptococcus, Teragenococcus, Vagococcus, Weissella (Jay, Loessner,

Golden, 2001).

Pienarūgšt÷s yra sporų nesudarančios anaerobin÷s bakterijos ir gali būti rutulin÷s ar

lazdelin÷s formos. Fermentuodamos produkte esančius angliavandenius, jos kaip pagrindinį

galutinį produktą gamina pieno rūgštį (Jay, Loessner, Golden, 2001). Kai kurios iš šių bakterijų

yra homofermentin÷s – pagamina daugiau kaip 85 % pieno rūgšties, o kitos heterofermentin÷s –

tik apie 50 % pieno rūgšties, gana didelį kiekį etanolio, šiek tiek acto rūgšties ir CO2.

Pienarūgšt÷s bakterijos turi fermentus β-galaktozidazę, glikolazes ir laktodehidrogenazę (LDH),

kurios iš laktoz÷s gamina pieno rūgštį. Pieno rūgštis žmogaus organizme atlieka tokias naudingas

funkcijas kaip:

a) pagerina pieno baltymų virškinamumą,

b) gerina kalcio, geležies ir fosforo pasisavinimą,

c) stimuliuoja skrandžio sulčių sekreciją

(http://www.fao.org/docrep/x0560e/x0560e10.htm).

Nepaisant pieno produktų naudingumo žmogaus mityboje, svarbu žinoti kokie

patogeniški mikroorganizmai gali daugintis pieno produktuose ir sukelti nepageidautinas ligas:

8

salmoneliozę, stafilokokines maisto toksikoinfekcijas, listeriozę, bruceliozę, juodligę,

tuberkuliozę, Q karštinę, kampilobakteriozę, erkinį encefalitą, enterohemoraginius kolitus ir kitas

(Jay, Loessner, Golden, 2001 ). Enterobacteriaceae šeimai priklausančių genčių nariai yra

įvardijami kaip patogeniškiausi ir dažniausiai sutinkami mikroorganizmai klinikin÷je

mikrobiologijoje. Šios gram-neigiamos lazdel÷s paprastai siejamos su virškinamojo trakto

infekcijomis, bet jos taip pat yra paplitusios ir aplinkoje, kaip normali mikroflora. Ši

Enterobacteriaceae šeima apima Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella, Morganella,

Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, Edwardsiella ir Citrobacter

gentis. Visos šios šeimos nar÷s yra gliukoz÷s fermentuotojos ir azoto mažintojos

(http://www.merck.com/mmhe/sec17/ch190/ch190h.html).

Kiekviename žingsnyje žmogus susiduria su mus supančia mikropasaulio veikla.

Mikroorganizmai įtakoja ne tik geruosius ar bloguosius procesus žmogaus organizme, gamtoje,

bet yra ir labai svarbus veiksnys daugelio produktų gamyboje. Besivystantys mikroorganizmai

fermentiniuose sūriuose lemia ne tik jų tinkamumą vartoti, bet ir skonį bei aromatą.

Mikroorganizmai, dalyvaujantys į sūrių brandinime, gamina įvairius lakius komponentus, kurie

suteikia būdingą aromatą ir skonį – tai nulemia tokią sūrių įvairovę.

Darbo tikslai ir uždaviniai. Mūsų tyrimų tikslas - nustatyti mikroorganizmų sąveikos

ypatumus portugališkų fermentinių sūrių brandinimo metu. Tikslui pasiekti buvo numatyti šie

uždaviniai:

• Steb÷ti besivystančių mikroorganizmų kaitą Serra da Estrela ir Serpa

portugališkuose sūriuose.

• Atlikti juslinę sūrių analizę įvairiais sūrių subrendimo tarpsniais.

• Nustatyti, kokią įtaką mikroorganizmai daro sūrio kokybei.

• Išskirti pienarūgštes bakterijas, stipriausiai įtakojusias Seratia sp., L. inoccua,

E. coli ir S. aureus veiklą.

• Tirti, kokia chemin÷ medžiaga baktericidiškai ar bakteriostatiškai veik÷

patogenų veiklą.

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Pienarūgščių bakterijų charakteristika

Pienarūgšt÷s bakterijos (PRB) yra vienos iš geriausiai žinomų ir ištyrin÷tų antagonistinių

mikrobų. PRB yra gram-teigiami, sporų nesudarantys, katalaz÷s - neigiamos reakcijos

mikroorganizmai. Jos yra anaerobin÷s, tačiau toleruoja deguonį, rūgštį ir sukelia rūgimą. Pieno

rūgštis yra pagrindin÷ galutin÷ angliavandenių fermentacijos metu išskirta medžiaga. Pieno

rūgštį gaminančios bakterijos apima Lactobacillus, Bifidobacterium gentis, Enterococcus

feacalis, Enterococcus feacium, Lactococcus lactis, Streptococcus cricetus, Leuconostoc

mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus

thermophilus ir kitas. Visos išvardintos rūšys išskyria baltymines medžiagas, vadinamas

bakteriocinais. Pastaruoju metu bakteriocinai naudojami pieno, m÷sos ir kitų produktų gamyboje.

Pieno rūgštį gaminančios bakterijos maisto gaminime atlieka ne tik apsauginę funkciją, jų veikla

suteikia maistui išskirtinį kvapą, skonį bei konsistenciją (Line ir kt., 2008).

Skirtingose terp÷se, pvz., tokiose kaip žarnynas, pienarūgšt÷s bakterijos (PRB) gamina įvairių

antimikrobinių medžiagų: organines rūgštis, bakteriocinus ir t.t. PRB, tinkamu kiekiu

pasiskirsčiusios organizme ir teigiamai veikiančios šeimininką, priskiriamos probiotikams

(Sigrid ir kt., 2006). Probiotikais vadinami gyvi mikroorganizmai, kurių tam tikras kiekis

organizme yra naudingas sveikatai. Jie tapo svarbiausia tema PRB tyrin÷jime per pastaruosius 10

m. Tipiškais probiotikais galima įvardinti Lactobacillus ir Bifidobacterium gentis. Naudingas

probiotikų poveikis pagrįstas tuo, kad šie mikroorganizmai apima tokių patogenų slopinimą, kaip

Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas spp. ir Helicobacter spp. Be to, buvo pasteb÷tas

kitas teigiamas probiotikų poveikis organizmui: maž÷ja laktoz÷s netoleravimas, slopina alergines

ligas, stiprina imuninę sistemą, pasireiškia priešv÷žinis poveikis ir veikia kaip prevencin÷

priemon÷ prieš uždegimines žarnų ligas (Zoumpopoulou ir kt., 2008). Pasteb÷ta, kad probiotikai

teigiamai įtakoja sveikatą, tačiau mažai žinoma, kas lemia pager÷jusią savijautą. Probiotikų

veikimas priklauso nuo pačio probiotiko paderm÷s ir aplinkos sąlygų. Jų veikimas priklauso nuo

pagaminamos antimikrobin÷s medžiagos, konkuravimo d÷l maisto medžiagų, konkurencin÷s

sąveikos su patogenais ir sukeltos imunin÷s sistemos moduliacijos (Todorov ir kt., 2005; Albano

ir kt., 2007).

10

1.2 Pienarūgščių bakterijų reikšm÷ sūrių gamyboje

Pienarūgšt÷s bakterijos sūrių gamyboje atlieka šias funkcijas:

• Keičia pagrindinius pieno komponentus (pieno cukrų, baltymus, riebalus) į

junginius, lemiančius skonines ir aromatines sūrių savybes, jų maistinę ir

biologinę vertę;

• Skatina šliužo ir kt. pieną traukinančių fermentų veiklą ir sutraukos sinerezę, nes

perstumia pH reikšmę į sritį, kurioje šliužo fermentas geriausiai veikia;

• Dalyvauja sūrio konsistencijos susidarymo ir išakijimo procesuose;

• Sudaro nepalankias sąlygas žalingai mikrobiotai vystytis (Albano ir kt., 2007).

Tuo pačiu skaidomi pieno riebalai, kurių hidroliz÷s produktai yra svarbūs sūrio skoniui,

aromatui ir konsistencijai susidaryti.

1890 m E. Freudenreichas nurod÷, kad sūrių brendimui pagrindinę reikšmę turi pieno

rūgšties bakterijos. Kiti autoriai kritikavo tokią mokslininko pažiūrą, nurodydami, kad pieno

rūgšties bakterijos neturi proteolizinių fermentų, kurie gal÷tų skaldyti baltymus. V÷liau buvo

nustatyta, kad pieno rūgšties bakterijos turi proteolizinių endofermentų, kurie, žuvus ląstelei,

išsiskiria į aplinką ir hidrolizuoja baltymus.

Nokinimo metu susidariusios laisvosios aminorūgštys suteikia sūriui būdingų juslinių

savybių. Be to, bakterijų fermentų veikiamos aminorūgštys kinta toliau ir sudaro įvairių junginių,

kurie taip pat turi nemažą įtaką sūrių kokybei. Ypač aktyviai aminorūgštis skaido endofermentai,

kurie išsiskyria autolizuojantis bakterijoms. Tiek pienarūgščių, tiek kitų mikroorganizmų

fermentų veikiamos aminorūgštys gali deaminintis, dekarboksilintis, dalyvauti peramininimo

reakcijose. Šių kitimų produktai – organin÷s rūgštys, amoniakas, aldehidai, ketonai, aminai –

svarbūs sūrių skonį ir aromatą formuojantys junginiai (Masteikien÷, 2006);

Daugelio sūrių ydų atsiradimo priežastis yra mikrobiologin÷s kilm÷s (Macedo, 1993).

Svarbiausi sūrių ydų suk÷l÷jai yra koliformin÷s, sviestarūgšt÷s, psichrotrofin÷s, proteolitin÷s

bakterijos, miel÷s ir pel÷siniai grybai. Didel÷ pašalinių mikroorganizmų dalis žūva pasterizuojant

pieną, tačiau jie gali patekti į sūrius antrinio užteršimo metu – nuo įrenginių, darbuotojų rankų ir

rūbų, vandens ir iš oro (Roseiro ir kt., 2003).

Psichrotrofin÷s bakterijos – tai daugiausia gram - neigiamos, porų nesudarančios lazdel÷s,

kurios vyrauja piene d÷l nepakankamos įrenginių švaros ir vandens patekimo į pieną.

11

Psichrotrofų išskiriami fermentai termostabilūs ir tod÷l gali tur÷ti įtakos sūrių kokybei. Šių

bakterijų augimas sūriuose, kaip ir kitų technologiškai žalingų mikroorganizmų (koliforminių,

sporinių anaerobinių), priklauso nuo pienarūgščio rūgimo aktyvumo, psichrotrofų, kaip ir

koliforminių bakterijų, randama mažiau (Rizzello ir kt., 2005).

Patekę į sūrius, pašaliniai mikroorganizmai dauginasi ir gali sukelti skonio ir kvapo,

konsistencijos ir išakijimo ydas (Tavaria ir kt., 1999). Sūriuose gali pasitaikyti ir patogeninių

bakterijų. Jos patenka į sūrius iš pieno, kai jis pasterizuojamas žemesn÷je kaip 74°C

temperatūroje. Be to, stafilokokai gali išlaikyti ir aukštą pasterizavimo temperatūrą. Tačiau

dauguma besporių patogeninių bakterijų ilgo nokinimo metu (kieti sūriai) žūva, o minkštuose

sūriuose neišsilaiko d÷l rūgštaus pH, nors pasitaiko Listeria monocytogenes bakterijų. Jas

sunaikinti galima kruopščiai dezinfekavus visus įrenginius (Masteikien÷, 2006).

1.3 Pienarūgščių bakterijų antibakterinis pritaikymas

Susidom÷jimas pienarūgšt÷mis bakterijomis auga, tiriamas jų geb÷jimas būti natūraliais

konservantais maisto pramon÷je. PRB medžiagų apykaitos metu išskiriamos antimikrobinį

aktyvumą turinčios medžiagos - organin÷s rūgštys (pieno r., acto r. ir pan.), vandenilio

peroksidas, antimikrobiniai fermentai, bakteriocinai, reuterinai ir kt. (Albano ir kt., 2007).

Dauguma PRB yra aktyvios prieš PRB ir kitas gram-teigiamas bakterijas. Bakterijų išskiriami

bakteriocinai dažnai yra aktyvesni prieš bakterijas, kurios yra genetiškai artimesn÷s bakteriociną

išskyrusiai padermei (Line ir kt., 2008, Ralph ir kt., 1995). Yra daugyb÷ straipsnių, kuriuose

teigiama, kad bakteriocinai gali būti aktyvūs ir prieš gram-teigiamas, ir prieš gram-neigiamas

bakterijas (Todorov ir kt., 2005; Oscariz, Pisabarro, 2001; Oh ir kt., 2000, Maldonado ir kt.,

2004).

Pastaraisiais metais buvo pagrįstas bakteriocinų, kaip bio-konservantų, naudojimas

maisto pramon÷je. Labai s÷kmingai buvo panaudoti tam tikri bakteriocinai įvairiame maiste L.

monocytogenes slopinimui, pvz. Nizinas - Kamemberto sūryje. Jis Listeria monocytogenes

sumažino 3x3 log grame, o paruoštose valgymui Cezario salotose 1x4 log ir panašiai. Daugelyje

straipsnių stebimas ženklus Listeria monocytogenes bakterijų sumaž÷jimas maiste, panaudojus

PRB išskiriamus bakteriocinus, tokius kaip: nizinas, pediocinas PA-1, lakticinas3147

(O`Sullivan ir kt., 2006). Bakteriocinais domimasi ir kaip farmaciniais preparatais. Šioje srityje

pagrindinis bakteriocinų panaudojimo privalumas gal÷tų būti jų saugumas organizmui (Sine´,

2007; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC429093/?page=2).

12

1.4 Bakteriocinų apžvalga

Bakteriocinai yra ribosomose sintetinamos antimikrobin÷s baltymin÷s medžiagos,

gaminamos daugelio mikroorganizmų. Dauguma bakteriocinų yra mažos molekulin÷s mas÷s,

aktyvios katijonin÷s membranos komponentai. Jų peptidai formuoja membranose poras,

sukeldami ląstelių žūtį. Toks apsisaugojimo mechanizmas, kada ląstel÷s išskiria katijoninius

peptidus gynybos tikslams, yra aptiktas ir augaluose bei gyvūnuose. Įvairūs autoriai pateikia šiek

tiek skirtingas bakteriocinų klasifikacijas

(http://www.answers.com/topic/bacteriocin; http://en.wikipedia.org/wiki/Antimicrobial_peptides;

http://www.teagasc.ie/research/reports/dairyproduction/4207/eopr-4207.asp;

http://cmdr.ubc.ca/bobh/peptides.html).

Antagonistin÷ sąveika tarp konkuruojančių bakterijų pasteb÷ta jau 1877 metais, kuomet

Pasteras ir Joubertas atkreip÷ d÷mesį, kad kai kurios Escherichia coli atmainos trukdo augti

Bacillus anthracis abiejomis bakterijomis užkr÷stuose gyvūnuose, tačiau bakteriocinai pirmą

kartą buvo aptikti tik 1925 m. Andre Gratia pasteb÷jo, kad kai kurių virulentiškų E. coli štamų

veiklą stabdo viena antibakterin÷ medžiaga, kurią jis pavadino kolicinu V. V÷liau kolicinas V

buvo apibūdintas, kaip atspari karščiui baltymin÷ medžiaga. 1954 m. Piero Frederiko pasteb÷jo

bakteriocinų genetinio gyvavimo mechanizmą, panašų į ląstelių lytinį dauginimąsi. Reikšmingos

apsaugin÷s antimikrobin÷s peptidų savyb÷s pasireiškia d÷l juose esančios išskirtin÷s

aminorūgščių sekos. Daugelį bakteriocinų galime apibūdinti kaip mažos molekulin÷s mas÷s,

katijonines, hidrofobines, karščiui atsparias baltymines medžiagas. Visi jie yra koduoti

struktūrinių genų, kurie laisvas aminorūgštis ribosomose transliuoja į peptidus (Oscariz,

Pisabarro, 2001; Michaelidou ir kt., 1998).

Antimikrobiniai peptidai, išskirti bakterijų, buvo sugrupuoti į kelias skirtingas klases,

atsižvelgiant į molekulinį dydį, peptidą išskiriantį organizmą, cheminę struktūrą ir jo veikimo

metodą. D÷l skirtingų klasifikacijų atsirado ir keletas skirtingų antimikrobinių peptidų

pavadinimų, tokių kaip: mikrocinai, kolicinai, bakteriocinai, lantibiotikai, tiolbiotikai,

cystibiotikai, kurie gali skirtingose klasifikacijose tur÷ti kitokį pavadinimą (Jack ir kt., 1996).

1.5 Bakteriocinų klasifikacija

Gram-teigiamų bakterijų išskiriamoms skirtingoms antimikrobin÷ms medžiagoms

sugrupuoti buvo panaudota keletas klasifikavimo kriterijų. Bakteriocinai buvo sugrupuoti į 4

13

grupes: 1 grupei priklauso antibiotikai su neįprastomis, po transliacijos pakeistomis,

aminorūgštimis, tokiomis kaip dehidroalaninas, dehidrobutirinas, lantioninas, ar β-metil-

lantioninas (lantibiotikai). 2 grup÷s antibiotikai (cystobiotikai) savo sud÷tyje turi nors vieną

disulfidinį (S-S) tiltelį – pagrindinį veiksnį, lemiantį jų veiklą. 3 grupei priklauso dariniai savo

struktūroje turintys vieną SH radikalą. Kad antibiotikai veiktų, jie tur÷tų būti redukuotoje

formoje (tiolbiotikai). 4 grupei priklauso antibiotikai be cisteino radikalo (Jack ir kt., 1995;

Abee, 1995).

Tikrasis cisteino radikalo poveikis bakteriocino aktyvumui n÷ra galutinai aiškus, tačiau

yra nustatyta, kad kuo daugiau disulfidinių tiltelių bakteriocinas turi, tuo platesnis jo veikimo

spektras (Oscariz, Pisabarro, 2001).

Daugiausia nagrin÷ti ir ištirti pienarūgščių bakterijų išskiriami bakteriocinai, d÷l jų

galimo panaudojimo kaip maisto biokonservantų ir d÷l vis dažn÷jančių maisto sukeltų infekcinių

ligų (Michaelidou ir kt., 1998).

Remiantis Klaenhammeriu, bakteriocinai gali būti skirstomi į 4 kategorijas, atsižvelgiant į

jų molekulinę masę, termostabilumą, jautrumą fermentams, po transliacijos pasikeitusias

aminorūgštis ir veikimo metodą (Oscariz, Pisabarro, 2001).

1.5.1 I bakteriocinų kategorija

Ši grup÷ susideda iš lantibiotikų ir gali būti padalinta į 2 pogrupius, atsižvelgiant į jų

struktūrą ir elementą, lemiantį jų aktyvumą.

Ia – maži katijoniniai peptidai esti sraigto formos, amfipatiniai, jų veikimas priklauso nuo

sukuriamo elektinio lauko tarp lastelių membranos taikinių ir bakteriocino. D÷l nenustatytos

sąveikos su ląstel÷mis taikiniais sudaro poras, sukurdami įtampą ląstelių membranose.

Ib – susideda iš anijoninių arba rutuliškos formos neutralių peptidų. Šio pogrupio

bakteriocinų molekulin÷ mas÷ apima ribas nuo 1,959 (duramicinas) iki 4,635 (didžiausias iki šiol

aprašytas lantibiotikas karnocinas UI49) (Maragkoudakis ir kt., 2009; Oscariz, Pisabarro, 2001).

1.5.2 II bakteriocinų kategorija

Šis tipas apima karščiui atsparius peptidus, sudarytus iš nemodifikuotų aminorūgščių,

kurių molekulin÷ mas÷ mažesn÷ už 10 kDa. Šios grup÷s bakteriocinai yra skirstomi į dar 3

pogrupius:

II a pogrupiui priklauso anti-listeriniai peptidai, tokie bakteriocinai kaip: pediocinas

AcH/PA1, mesentericinas Y 105, sakacinas A, sakacinas P ir karnobakteriocinas B2. Šie

14

komponentai yra baktericidiniai, nes jie sugriauna citoplazmos membranos vientisumą, sukelia

joninį disbalancą ir organinio fosfato pralaidumą, taip sukeldami ląstel÷s žūtį.

II b grupei priklauso poras formuojantys bakteriocinų kompleksai, kurie susideda iš 2

peptidų. Šie du peptidai gali veikti ir po vieną, tačiau jų kompleksas veikia sinergetiškai (pvz.:

enterocinas L50A ir L50B).

II c grupei priklauso 2 bakteriocinų tipai: antibiotikai su 1 ar 2 cisteino radikalais

(tiolbiotikai ir cystibiotikai) ir antibiotikai be cisteino (laktokocinas A ir acidocinas B) (Jack ir

kt., 1996; Oscariz, Pisabarro, 2001).

1.5.3 III bakteriocinų kategorija

Šiai klasei priklauso peptidiniai antibiotikai, kurie yra karščiui neatsparūs, jų molekulin÷

mas÷ yra didesn÷ nei 30 kDa. Daugelis jų yra gaminami Lactobacillus genties bakterijų. Šiai

bakteriocinų grupei priklauso helveticinas J sintetinamas L. helveticus 481 ir lacticinas B

gaminamas L. acidophilus (Gottlieb ir kt., 2008).

1.5.4 IV bakteriocinų kategorija

Šiai grupei priklauso glikoproteinai (laktocinas 27) arba lipoproteinai (lakstrepcinai),

kurių aktyvumas priklauso nuo nebaltymin÷s bakteriocino dalies, t.y. nuo prie baltymo

prisijungusių oligosacharidų ar lipidų (Oscariz, Pisabarro, 2001).

1.5.5 Gram-neigiamų bakterijų išskiriami bakteriocinai

Mokslininkai Kolter ir Moreno daugiausia dom÷josi bakteriocinais, išskiriamais iš gram-

neigiamų bakterijų. Kolicinai ir mikrocinai buvo lengvai apibūdinti d÷l mažos molekulin÷s

mas÷s, mikrocinai mažesni nei 10 kDa, o kolicinai vos didesni. Kolicinai ir mikrocinai yra

sintetinami Enterobacteriaceae šeimos bakterijų ir slopina, būtent, gram-neigiamų

mikroorganizmų veiklą. Pirmasis atrastas bakteriocinas - kolicinas yra apibr÷žiamas, kaip siauro

spektro antibiotikas, kurio bakteriocidinis aktyvumas atsiskleidžia, sąveikaujant su specifiniais

ląstelių membranose esančiais receptoriais. Kai kurie bakteriocinai yra labai saviti, nes jų sintez÷

yra kontroliuojama SOS-signalui pavaldaus mechanizmo, kuris įtraukia ir bakteriociną

išskyrusios ląstel÷s susinaikinimą. Mikrocinai turi daug panašumų su II kategorijos

bakteriocinais: jų molekulin÷ mas÷ mažesn÷ nei 10 kDa, jie sintetinami stacionariosios faz÷s

metu ir neturi nelaim÷s signalo. Turintys būdingiausius bruožus šios rūšies bakteriocinai yra 2:

kolicinas V, pats pirmasis aprašytas bakteriocinas, nes jo molekulin÷ mas÷ yra apie 6 kDa ir

15

mikrocinas C7, modifikuotas heptapeptidas, kuris yra laikomas mažiausiu iki šiol aprašytu

antibakteriniu peptide (Fahimdokht, 2008; Oscariz, Pisabarro, 2001; Charles M. ir kt., 2007).

1.6 Bakteriocinų chemin÷s ir fizikin÷s savyb÷s

Letalinei misijai įgyvendinti, I ir II kategorijoms priklausantys bakteriocinai turi atitikti 2

pagrindinius reikalavimus - būti katijoniniai ir stipriai hidrofobiniai. Dauguma mažos

molekulin÷s mas÷s bakteriocinų yra veiklūs gana plačiose terp÷s pH r÷muose (3.0-9.0) ir kurį

laiką gali nesuirti tokiose ekstremaliose pH reikšm÷se kaip pH 1.0 (acidocinas B) arba pH 11.0

(bavaricinas A). Pasteb÷ta, kad beveik visi bakteriocinai yra katijoniniai prie pH 7.0, kol kas tik

laktocinas S išimtinai buvo pasteb÷tas neutraliame pH, turintis -1 joninį krūvį. Dar vienas ryškus

mažos molekulin÷s mas÷s antimikrobinių peptidų bruožas yra jų atsparumas karščiui. Junginiai,

susidedantys iš monosulfidų ir disulfidų tarpmembraninių jungčių, padeda stabilizuoti baltymus

(entropinis efektas). Žvelgiant į bakteriocinų molekulinę sud÷tį, tarpmolekulinių tiltelių

efektyvumas priklauso nuo jų kiekio. Kuo didesnis jų skaičius bakteriocine, tuo didesnis peptido

stabilumas. Cintas ir kt. (Cintas ir kt., 1995) ištyr÷, kad dauguma supernatantinių bakteriocinų

struktūrų, sujungtų tokiais tilteliais, yra atsparios karščiui - net autoklavavimui (100-121ºC).

Žinoma, kai kurie bakteriocinai išskirti Lactobacillus genties (helveticinas J) buvo inaktyvuoti

10-15min pakaitinus 60-100ºC. Bakteriocinai gali būti nesunkiai atkurti ne vien iš klasikinių

bakterijų kultūrų, bet taip pat ir iš ryžių luobel÷s pelenų. Iš jų rūgštimi buvo išskirtas pediocinas

PA-1.

Daugiausia išstudijuotas bakteriocinas – nizinas, atrastas 1928 m. Jis gaminamas

Lactococcus lactis ir susideda iš 34 aminorūgščių, turi 5 lantionino tiltus. Nizino stabilumas labai

priklauso nuo pH ir temperatūros santykio. Prie pH 2.0 nizinas yra tirpus, antimikrobiškai

aktyvus ir termostabilus (išliko aktyvus 10 min kaitinant 100ºC temperatūroje). Tačiau nesunkiai

neutralizuojamas prie pH 7.0. D÷l nizino jautrumo virškinimo fermentams jo nebuvo galima

panaudoti klinikin÷je praktikoje, bet jis s÷kmingai pritaikytas kaip maisto konservantas (E-234)

(Barnby-Smith, 1992; Aly ir kt., 2006).

1.7 Bakteriocinų veikimo būdas

D÷l įvairios bakteriocinų chemin÷s struktūros jie paveikia skirtingas ląstelių būtinąsias

funkcijas (transkripciją, transliaciją, replikaciją ir ląstel÷s sienel÷s biosintezę), tačiau dauguma jų

veikia formuodami ląstelių membranose kanalus ar poras, taip sunaikindami ląsteles

(Benkerroum ir kt., 2000).

16

Nizinas (pagal Klaenhammerį priskiriamas grupei Ia) yra bakteriocinas, kurio veikimo

mechanizmas buvo geriausiai išnagrin÷tas. Šis katijoninis lantabiotikas siejasi elektrostatiškai su

neigiamo membranos krūvio fosfolipidais. Lizinas yra katijonin÷ aminorūgštis, dalyvaujanti šioje

elektrostatin÷je sąveikoje. Tarp hidrofobin÷s nizino dalies ir bakterijos membranos taikinio yra

sukuriamas nespecifinis joninis kanalas, kurio formavimui padeda aukštas transmembraninis

potencialas ir anijoninių lipidų buvimas, esant mažesniam kiekiui katijoninių. Porų formavimas

maž÷ja, esant dvivalenčiams katijonams (Mg2+ ar Ca2+), nes jie neutralizuoja fosfolipidų

neigiamą krūvį, sumažindami membranos nestabilumą. Nizino sukurtos poros membranoje

leidžia vykti pasyviai jonų difuzijai (K+ ir Mg2+), aminorūgščių (glutaminui, lizinui) ir ATP, bet

ne dideliems citoplazminiams proteinams, lengvai pasiduodantiems membranos paj÷gumo ir

protonų siurblio išeikvojimui, po ko įvyksta ląstel÷s žūtis (Oscariz, Pisabarro, 2001).

II a klas÷s bakteriocinų veikimo schema yra panaši į nizino. Šios klas÷s bakteriocinai yra

antilisteriniai, atsižvelgiant į YGNGV eil÷s tvarką aminorūgšties N-gale. Dabartin÷ šio

bakteriocino veikimo mechanizmo hipotez÷ yra jo elektrostatinis apvadas, sąveikaujantis su

ląstelių membranos taikiniais – receptorin÷m molekul÷m, nors, šių specifinių receptorių

svarbumas dar yra ginčytinas. Sp÷jami ląstelių receptoriai būtų reikalingi, atpažįstant peptide

esantį YGNGV antilisterinį motyvą (Ennahar ir kt., 2000).

Pagal Klaenhammerio bakteriocinų klasifikavimą IIc pogrupis gali būti padalintas į dar 2

dalis, priklausomai nuo to, juose yra ar n÷ra tarpmolekulinių disulfido tiltelių. IIc pogrupio abiejų

dalių veikimas gali ženkliai skirtis. Laktokocinas A (šis bakteriocinas yra be cisteino radikalo)

veikia bakterijos membraną, formuodamas joje poras. Cereino 7/8 (cystibiotiko) aktyvumas

maž÷ja, kuomet jį supančios terp÷s osmosinis sl÷gis did÷ja. Kaip ir įprasta bakteriocinams, šis

taip pat veikia ląstel÷s membraną. Platus šių junginių veikimo spektras leidžia daryti prielaidą,

kad membranos išor÷je esantys specifiniai receptoriai n÷ra būtini. Visoje II c klas÷je yra

teigiamai įkrautos aminorūgštys. Triptofanas hidrofiliniame N-gale gali palengvinti neįprastą

sąveiką su neigiamai įkrautais fosfolipidais ląstelių membranos taikiniuose, be to, sulygina

tarpmembranines poras. Cereino 8 atveju 3 triptofano liekanos ir 1 lizino liekana lokalizuojasi

aštuntame amino rugšties N – gale ir skatina statybinę funkciją. Šis galas seka paskui stipriai

hidrofobinę C galo dalį, kuri gali dalyvauti formuojant transmembranines poras panašiu būdu,

kuriuo veikia Pediocinas PA1 (II a klas÷). Cystibiotikai priklausantys II c klasei (cereinas 7/8,

enterocinas B, karnobakteriocinas A ir divergicinas A) tur÷tų būti antrin÷s stukrūros, kuriai

17

būdinga ilga kilpa, užimanti beveik visą hidrofobinę dalį. Visose klas÷se pirmas cysteino

radikalas yra po teigiamai įkrautu lizino radikalu hidrofobinio ploto gale ir antrasis radikalas

trečioje paskutin÷s eil÷s pozicijoje. Disulfido tiltai, kurie būtini antibakteriniam bakteriocino

poveikiui, tur÷tų glaustis su proteino C galo dalimi, su kompaktiška hidrofobine struktūra,

praturtinta glicino radikalais, kurie yra stuktūriškai lankstūs. Toks lankstumas sudaro galimybę

molekul÷ms pereiti iš β formos į α formą, atsakingą už hidrofobiškumą aplinkai. Hidrofobin÷s

kilpos ilgio užtenka prasiskverbti pro citoplazmos membraną ir, susitelkus daugiau tokių kilpų,

padaryti mirtiną porą membranoje (Ennahar ir kt. 2000; Yanagida ir kt., 2005; Oscariz,

Pisabarro, 2001; Fayol-Messaoudi ir kt., 2005;Fahimdokht, 2008).

18

2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS

2.1 Tyrimų vykdymo vieta

Tyrimai buvo atliekami Portugalijoje, Porto miesto Katalikiškojo Biotechnologijos

Universiteto mikrobiologijos laboratorijoje. Toliau tyrimas buvo tęsiamas Portugalijos Idanha a

Nova kaimelyje, sūrių fabrike, ir Lisabonos mieste, Lisabonos Universitete.

2.2 Tyrimų objektai

Tyrimų objektai: Sera da Estrella, Serpa ir jiems analogiški tradiciniai portugališki sūriai;

pienarūgšt÷s bakterijos, jų išskiriamos antimikrobin÷s medžiagos.

2.3 Serra da Estrela ir Serpa sūrių gamybos technologija

Serra da Estrela ir Serpa sūriai buvo tiriami nuo 1 iki 60

sunokimo dienos. Abiejų sūrių gaminimo technologija yra labai

panaši. Žalias avių pienas gamybos metu sutraukinamas Cynara

cardunculus L. (žr. 2.3.2 pav.) ekstraktu 30°C temperatūroje. Po

pieno koaguliacijos (nustatoma iš akies) jis yra supjaustomas

nevienodų formų gabalais, kurie perpilami į r÷tį, kad nuvarv÷tų

išrūgos. Galiausiai yra įtrinama druska abiejose sūrio pus÷se ir

sūris paliekamas 30-45 dienoms nokti be temperatūros ar dr÷gm÷s

kontrol÷s (žr 2.3.1 pav.). Brandinimo metu sūriai yra kasdien

apverčiami, o plaunami šiltu vandeniu kartą per savaitę.

2.4 Tyrimų metodai

2.4.1 Chemin÷ analiz÷ – rūgštingumo nustatymas

Rūgštingumas yra rodiklis, kuris priklauso nuo sūryje

esančių baltymų savybių, baltymų kiekio sūryje, sūrio rūgšties kiekio, sūryje esančių druskų

(rūgštinių ar šarminių) savybių ir jų kiekio. Rūgštingumas yra nustatomas titravimo bei

indikatorinių popier÷lių (ekspres) metodais ir matuojamas pH – metru. Naudojant titravimo ar

indikatorinių popier÷lių metodus, rūgštingumas išreiškiamas Ternerio laipsniais (°T) arba pieno

rūgšties procentais. Naudojant pH-metrą, nustatomas aktyvusis sūrio rūgštingumas. Jis parodo

vandenilio jonų koncentraciją sūryje ir išreiškiamas pH dydžiu.

2.3.2 pav. Cynara Cardunculus L.

2.3.1pav. Sūriai nokinimo metu

19

2.4.1.1 Sūrio titruojamojo rūgštingumo nustatymas

Metodo esm÷. Šiuo metodu nustatomas bendras sūrio

rūgštingumas. Natrio hidroksido tirpalu, naudojant indikatorių

fenolftaleiną, neutralizuojamos laisvosios rūgštys, rūgščiosios

druskos, laisvosios baltymų rūgštin÷s grup÷s ir sūryje ištirpęs CO2

(žr. 2.4.1.1 pav).

2.4.1.2 Sūrio aktyviojo rūgštingumo (pH) nustatymas

Sūrio aktyvusis rūgštingumas yra laisvųjų vandenilio

jonų koncentracija, išreikšta neigiamu logaritmu ir žymima pH

vienetais. Sūrio aktyvusis rūgštingumas matuojamas pH-metru

(žr. 2.4.1.2 pav.).

2.4.2 Juslin÷ analiz÷

Juslin÷ analiz÷ – tai produktų organoleptinių savybių

tyrimas jutimo organais. Juslin÷s analiz÷s laboratorija (žr. 2.4.2.1

pav.) turi atitikti bendruosius reikalavimus:

• Laboratorijai geriausiai tinka pastovaus ir

vienodo intensyvumo dienos apšvietimas.

• Pagalbin÷s vietos m÷giniams ruošti ir plauti

indams turi būti izoliuotos nuo vietos, kurioje atliekama juslin÷

analiz÷.

• M÷ginius analizei reikia pateikti šviesiuose

induose, kad nebūtų blaškomas vertintojų d÷mesys.

• Laboratorijoje turi būti prietaisai, rodantys

patalpos santykinę oro dr÷gmę ir temperatūrą.

Kiekvienas juslinio vertinimo dalyvis vadinamas

vertintoju (Gudonis, 2004).

Serra da Estrela ir Serpa sūrių juslin÷ analiz÷ buvo

atliekama pagal 2.4.2.2 pav. pavaizduota schemą.

2.4.1.1pav. Sūrio titruojamojo rūgštingumo nustatymas

2.4.1.2pav. Sūrio aktyviojo rūgštingumo nustatymas

2.4.2.1 pav. Juslin÷s analiz÷s laboratorijų pavyzdžiai

20

2.4.2.2 pav. Juslin÷s analiz÷s atlikimo schema Serra da Esrela ir Serpa sūriams

Vienuolikos atrinktų ir apmokytų vertintojų grup÷ atliko juslinę analizę. Vertintojai buvo

atrinkti, atsižvelgiant į jų juslinius geb÷jimus. Kandidatų atrankai buvo naudojami šie testai:

ageuzijos (nepilnai išvystytų skonio dirgiklių) nustatymo testas ir anosmijos (nepilnai išvystytų

uosl÷s dirgiklių) nustatymo testas. Dalyviai buvo apmokomi atlikti standartinį kvapų nustatymą

tam, kad jutimų organai priprastų prie pieno produktų juslinių savybių. Buvo paruoštas šešiolikos

įprastų pieno produktų kvapų sąrašas. Juslin÷s analiz÷s dalyviai per kelias nuoseklias sesijas

tur÷jo atlikti Serra da Estrela ir Serpa sūrių analizę. Šių regionų sūriai buvo pateikti nuo 1 iki 60-

tos subrendimo dienos iš dviejų pieninių. Susitelkę ties kvapų sąrašu, vertintojai tur÷jo

identifikuoti ir išmatuoti pagrindinius sūrių aromatus. Kiekvienas iš analizuotojų uost÷

pavyzdžius, išmatavo ir vertino skaičiais nuo 0 iki 7 . Čia 0 reiškia, kad toks aromatas visai

nejaučiamas, o 7 – labai stiprus kvapas.

Vertintojų atranka juslinei analizei atlikti

Jutimų lavinimas

Juslinių rodiklių sąrašo sudarymas

Juslin÷ analiz÷

Pieno produktų pavyzdžiai

21

2.4.3 Mikrobiologinis tyrimas

Buvo tirti portugališki Serpa ir Serra da Estrela sūriai jų

nokinimo metu. Brandinimo trukm÷ tęs÷si iki 60 dienų. Per šį

laikotarpį buvo stebimas mikroorganizmų vystymasis, kiekis ir

skirtumai abiejuose sūriuose. Atskirais brandinimo tarpsniais buvo

skaičiuojamas atskirų mikroorganizmų kiekis. Steb÷jome:

• Bendrą mikroorganizmų kiekį sūryje;

• Koliforminių bakterijų kiekį;

• Pieno rūgšties bakterijas: Lactobacillus spp.,

Lactococcus spp., Enterococcus spp. ir Leuconostoc spp.;

• Pseudomonas spp.;

• Staphylococcus spp.;

• Mieles ir pel÷sinius grybus.

1, 7, 15, 30, 45 ir 60 sunokimo dieną buvo paimti pasirinktų

Serra da Estrela ir Serpa sūrių pavyzdžiai. Pašalinama žiev÷, tada

atpjaunama plona riek÷ sūrio iš giliausių jo sluoksnių, po to iš

vidutinio gilumo ir, galiausiai, atriekiama sūrio skiltel÷, esanti

arčiausiai krašto. Visų šių trijų skiltelių bendra mas÷ tur÷tų būti apie

10 g. Jos įdedamos į vienkartinį plastikinį maišelį kartu su 2 % (w/v)

natrio citratu (90 g), kuris naudojamas, kaip ekstrahuojantis buferinis

tirpalas, ir 2 min homogenizuojamos Stomacher Lab-Blender 400 (žr.

2.4.3.1 pav.). Po to, pipete paimamas 1ml taip apdoroto sūrio ir dar 10 kartų praskiedžiamas

steriliame 0,1 % (w/v) peptoninio vandens tirpale. Tada skiedinys yra pas÷jamas ant keleto

skirtingų terpių (žr. 2.4.3.2 pav.): PCA – Plate Count Agar, mitybos terp÷ bendram

mikroorganizmų skaičiui nustatyti (pagal LST EN ISO 4833); VRTL – violetiškai raudonas

tulžies ir laktoz÷s agaras, mitybos terp÷ koliformin÷ms (Enterobacteriaceae) bakterijoms

nustatyti (pagal LST ISO 5541 – 1); RA – Rogoso agaras, parūgštintas ledine acto rūgštimi (96

%) iki pH 5,5. Ši mitybin÷ terp÷ skirta Lactobacillus spp. nustatyti; M17A – M17 agaras

Lactococcus spp. atpažinimui; Mayeux, Sandine ir Elliker Agaras (MSEA) – Leuconostoc spp.;

Kanaycine Azide Agar (KAAA) – Enterococcus spp.; Baird-Parker Agar (BPA), sumaišytas su

50 ml L-1 sterilaus kiaušinio trynio, skirtas Staphylococcus spp. augti; Potato Dextrose Agar

2.4.3.2pav. Petri l÷kštel÷s su įvairiom mitybos terp÷mis mikrobiologinei analizei atlikti

2.4.3.1pav. Stomacher Lab-Blender 400

22

(PDA), prarūgštintas 10 ml L-1 10 % (v/v) sterilia pieno rūgštimi, naudojamas miel÷ms ir

pel÷siniams grybams atpažinti; Pseudomonas Agar Base (PAB), sumaišytas su 10 ml L-1 CFC

priedais, naudojamas Pseudomonas spp. atpažinimui.

2.4.4 Antibakterinio pienarūgščių bakterijų poveikio nustatymas

Antibakteriniam PRB poveikiui nustatyti buvo pasirinkti 4 patogeniniai

mikroorganizmai: 2 gram - teigiami ir 2 gram – neigiami. Visi panaudoti mikroorganizmai buvo

išskirti iš avies ir ožkos pieno, išskyrus referencinius kamienus - Listeria inoccua ATCC 33090

ir Escherichia coli ATCC 8739. Išskirtos mikroorganizmų kultūros buvo užšaldytos

atitinkamame sultinyje, patalpintos į šaldiklį ir laikomos -20ºC temperatūroje. Paruoštos

naudojimui kultūros buvo laikomos 4ºC temperatūroje. Tyrin÷jimams buvo panaudotos lentel÷je

Nr. 2.1 pateiktos bakterijos:

2.1 lentel÷. Tyrimui naudotos indikatorinių mikroorganizmų kultūros

Mikroorganizmai Gauta iš

Serratia sp. “Lauko paderm÷” (iš avies pieno)

Staphylococcus aureus “Lauko paderm÷” (iš avies pieno)

Listeria inoccua Užpatentuotas ATCC 33090 šablonas

Escherichia coli Užpatentuotas ATCC 8739 šablonas

Buvo tiriamas šių tik÷tinų PRB veiksmingumas: Lactococcus spp., Lactobacillus spp. ir

Leuconostoc spp.

2.4.4.1 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷ tik÷tinam antimikrobiniam poveikiui

nustatyti

Greitam antimikrobiniam min÷tų bakterijų poveikiui steb÷ti, buvo panaudoti

mikroorganizmai: Serratia spp., Staphylococcus aureus, Listeria inoccua ATCC 33090 ir E. coli

ATCC 8739. Tyrimai atlikti, naudojant aukšto patikimumo atrankos analizę (High Throughput

Screening Assay) Bioscreen C aparatu.

Pasirinkti tyrimui mikroorganizmai buvo auginami TSB (Tryptic Soy Broth) 30ºC temperatūroje

24 val., išskyrus Serratia spp., buvo inkubuojama 25ºC temperatūroje. Bakterijų kolonijos

skaičiuojamos CFC Pseudomonas Selective Agar – Serratia spp., Baird Parker Agar + RPF

priedu - Staphylococcus aureus, Oxoid Chromogenic Listeria Agar - Listeria inoccua

skaičiavimams ir Rapid E.coli Agar 2 - E.coli su būdingu dešimtainiu atskiedimu peptoniniame

23

vandenyje 0,1%. Pieno rūgšties bakterijų (PRB) Lactobacillus ir Leuconostoc gentys buvo

auginamos MRS sultinyje, o Lactococcus genčiai auginti panaudotas M17 sultinys. Abi terp÷s su

mikroorganizmais laikytos 30ºC temperatūros termostate 24 val. – 48 val. PRB kiekiui nustatyti

panaudoti MRS ir M17 agarai.

PRB filtratas išgautas MRS ar M17 sultiniuose, per naktį auginant anksčiau nurodytas

PRB kultūras ir filtruojant jas steriliu “Filtropur S 0,2 µm membrane” filtru. Filtratas buvo

panaudotas aukšto patikimumo atrankos analizei, testuojant jį prieš pasirinktus patogeninius

mikroorganizmus. “Medaus korio” mikrol÷kštel÷s su paruoštomis tikrinimui mikroorganizmų-

filtratų kultūromis buvo inkubuojamos į Bioscreen C aparatą 24-48 val. 30ºC temperatūroje su

l÷kštelių pakratymu ir optinio tirštumo plačiabang÷s OD 450-580nm bangos nustatymu kas 30

min. Antimikrobinis filtratų poveikis buvo matomas d÷l skirtingo mikroorganizmų augimo

kontrolin÷je srityje ir srityje su filtratais. Kiekvienas bandymas buvo atliktas 3 kartus.

2.4.4.2 “Medaus korio” mikrol÷kštel÷s paruošimas tyrimui

Sterili “medaus korio” mikrol÷kštel÷ (žr. 2.4.4.2.1 pav.) su 100 duobučių buvo

paruošiama analizei steriliame laminariume, padalinus jį į 2 dalis, kad vienu metu būtų galima

tikrinti tuos pačius filtratus dviems patogenams. Į Bioscreen C aparatą d÷jome dvi “Medaus

korio” mikrol÷kšteles, kad vienos analiz÷s metu gal÷tume matyti pasirinktų PRB filtratų

aktyvumą visiems keturiems kontroliniams patogenams.

Tuo pat metu gal÷jome išsiaiškinti 10 filtratų aktyvumą

mikroorganizmams. Viena mikrol÷kštelių eil÷ buvo padalinama į 4

dalis. Buvo įpilama 50µl PRB filtrato į 200µl TSB terp÷je per naktį

užaugintų indikatorinių mikroorganizmų. Nuo viršaus į pirmas 3

duobutes įšvirkšdavome 250µl indikatorinių mikroorganizmų, kad

bendras jų kiekis būtų vienodas testuojamose ir kontrolin÷se

duobut÷se. Paskutin÷, 10-oji duobut÷, buvo paliekama, kaip kontrolin÷,

į ją įšvirkščiant 250µl strerilaus TSB.

2.4.4.3 Antimikrobinio poveikio nustatymas Petri l÷kštel÷se

Pienarūgšt÷s bakterijos, kurių filtratai pirmuoju bandymu parod÷ patogenus slopinantį

poveikį, buvo dar kartą tikrinamos kitu metodu. Bandymas buvo atliekamas Petri l÷kštel÷se (15

cm skersmens), pas÷jant 1ml patogeninio mikroorganizmo kultūros ir jį atskiedžiant 10 kartų su

Mueller-Hinton agaru. Terpei sustingus, joje padaromas atitinkamas skylučių kiekis į kurias

2.4.4.2.1 pav. „Medaus korio“ mikrol÷kštel÷

24

įšvirkščiamas filtratas ar kita pasirinkta testavimo medžiaga, kaip pvz,: pieno rūgštis pH 3.

Kultūros 30ºC temp. termostate buvo paliekamos augti 24 val. Pasibaigus inkubavimo laikui,

antimikrobinis poveikis buvo matuojamas skaidriu plotu apie padarytą agare skylę.

2.4.4.4 Bakteriocino aktyvumo ir prigimties tyrimai

Tam, kad įsitikintume, jog antimikrobinį poveikį sąlygojo baltymin÷ medžiaga, bandymai

buvo dar kartą pakartoti PRB filtratus paveikus fermentais: proteaze, papainu, tripsinu ir

chimotripsinu. Į 1ml filtrato įd÷jome 100µl proteazių. M÷gintuv÷lis buvo lengvai pavartomas ir

įdedamas į 70ºC temperatūros vonelę, kurioje laikomas 2 valandas. V÷liau tyrimai buvo

kartojami iš naujo ir stebimas antimikrobinio poveikio pasikeitimas.

PRB filtratai buvo veikiami ir karščiu: 121ºC temperatūroje 20 min autoklavuojami ir

atv÷sus v÷l buvo tiriamas filtrato antibakterinis poveikis mikroorganizmams.

2.4.4.5 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas

PRB filtratas, rodantis didžiausią antimikrobinį poveikį, buvo paveiktas butanu,

izobutanu bei eteriu, kad atskirti vandenyje tirpią ir netirpią organinę filtrato dalis. M÷gintuv÷liai

centrifuguojami, organin÷ dalis atskiriama nuo vandenin÷s dalies, tyrimai kartojami ir stebima,

kurioje dalyje yra antimikrobin÷ medžiaga. V÷liau buvo atliekami HPLC tyrimai su pasirinktu

filtratu, kurio antimikrobin÷ medžiaga buvo aptikta jo organin÷je dalyje.

2.4.4.6 Aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC tyrimas)

HPLC tyrimai buvo atlikti su Skysčių chromatografu FinniganTM Surveyor® Plus

Modular LC System parengta su Purospher® STAR RP-18 kolon÷le iš Merck ir Xcalibur

programin÷s įrangos. Ekstraktai buvo analizuojami HPLC metodu, įšvirkščiant 25 µl ir naudojant

gradientą, sudarytą iš tirpalo A (0.1% tūrio dejonizuotas vanduo), tirpalo B (TFA praskiesta

1000 kartų dejonizuotu vandeniu) ir tirpalo C (metanolio). Tirpalų kiekio paskirstymas laike: 0

min 90% A, 10% B; 50 min 5% A, 80% B, 15% C.

2.4.4.7 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu

identifikavimas

Tos kultūros, kurių antimikrobinis poveikis patogenin÷ms bakterijoms buvo didžiausias,

buvo identifikuojamos panaudojus API 50 CH metodą. Patalpinamos termostate 37ºC

temperatūroje 48 valandoms. Atpažinimas atliekamas pagal spalvų intensyvumą tam tikrose

sunumeruotose duobut÷se.

25

2.4.4.8 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis in vivo

Atliekant bandymus su PRB in vivo, buvo gaminamas sūris, atsižvelgiant į tradicinio

portugališko sūrio gaminimo technologiją. Jam pagaminti buvo naudojami du kibirai

pasterizuoto avių pieno, į juos įpylus komercinio sūrių starterio mišinio rekomenduojamo tokio

tipo sūriams gaminti. Tada mišinys pašildomas iki 32ºC temperatūros. Į abu kibirus pieno

įpyl÷me po 1ml kiekvieno indikatorionio mikroorganizmo, kurie buvo auginami TSB: E. coli,

Staphylococcus aureus, Listeria inoccua ir Serratia spp. Aktyviausios pienarūgšt÷s bakterijos

veiksmingumui patikrinti, tokiame kolonizuotame patogeniniais mikroorganizmais sūryje, vieną

pieno kibirą papild÷me 1ml per naktį MRS terp÷je užauginta PRB 7013 kultūra. Abu kibirai

pieno buvo sutraukinti Cynara cardunculus L. ekstraktu ir pagal įprastą gaminimo technologiją

pagaminti 300g sūriai. Jie supresuoti ir po 2 valandų įtrinti druska bei patalpinti 8-11ºC

temperatūros 90-95% santykinio dr÷gnio kameroje. Po 13 dienų sūriai buvo perkelti į 12-14 ºC

temperatūros ir 85-90% dr÷gnumo kamerą, ten laikomi iki 30-tos sūrių brandinimo dienos.

M÷giniai tyrimams buvo imami 1, 7, 15, 30 ir 75-tą surių brandinimo dieną. Buvo nustatomas

sūrių pH pagal anksčiau aprašytą metodą pH-metru ir skaičiuojami mikroorganizmai abiejuose

sūriuose (kontroliniame ir su PRB 7013). Bakterijos buvo skaičiuojamos CFC Agare Serratia

spp. nustatyti, Baird Parker Agare + RPF priedu Staphylococcus aureus, OCLA Listeria inoccua,

Rapid E.coli Agaras 2 - E.coli ir MRS agaras Lactobacillus spp. bakterijoms suskaičiuoti.

26

3. DARBO REZULTATAI

3.1 Portugališkų Serpa ir Serra da Estrela sūrių mikrobiologinis tyrimas

Steb÷tas mikroorganizmų vystymasis, kiekis ir skirtumai Serpa ir Serra da Estrela

sūriuose atskirais brandinimo tarpsniais. 3.1.1 ir 3.1.2 paveiksl÷liuose pateiktos min÷tų sūrių

stebimos mikrobiotos dauginimosi dinamika.

Bendrai apžvelgus abiejų nokinamų sūrių mikroorganizmų vystymąsi, matome, jog

pienarūgšt÷s bakterijos buvo dominuojančios visą sūrio brandinimo periodą. Enterobacteriaceae

šeimos bakterijų, Staphylococcus spp. ir Pseudomonas spp. kiekiai, bręstant sūriui, maž÷jo,

išskyrus Staphylococcus spp. Serra da Estrela sūryje.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 7 15 30 45 60

Laikotarpis dienomis

log(ksv/ml)

Bendras mikroorganizmų skaičius Enterobacteriaceae Lactobacillus

Lactococcus Enterococcus Leuconostoc

Pseudomonas Staphylococcus Miel÷s ir pel÷siniai grybai

3.1.1 pav. Serpa sūrio mikroorganizmų dauginimosi dinamika.

27

0

2

4

6

8

10

12

1 7 15 30 45 60

Laikotarpis dienomis

log (UFC/ml)

Bendras mikroorganizmų skaičius Enterobacteriaceae Lactobacillus

Lactococcus Enterococcus Leuconostoc

Pseudomonas Staphylococcus Miel÷s ir pel÷siniai grybai

3.1.2 pav. Serra da Estrela sūrio mikroorganizmų dauginimosi dinamika.

3.2 Juslin÷ Serra da Estrela ir Serpa sūrių analiz÷

Pasirinkti 16 skirtinų kvapų, kurie pavaizduoti 3.2.1 ir 3.2.2 paveiksl÷liuose, nustatyti Serra

da Estrela ir Serpa sūrių jusliniams rodikliams skirtingais nokinimo tarpsniais. Iš žemiau pateikto

paveiksl÷lio matome, kad Serra da Estrela sūris per visą nokimo laikotarpį savyje išlaik÷ visus

galimus kvapų variantus.

28

0

0,5

1

1,5

22,5

3

3,5

4Šviežias pienas, šviežia grietin÷

Virintas pienas

Jogurtas, kefyras, prarūgusi varšk÷

Žol÷s

G÷lių, f loros

Džiovintų vaisių

Alyvuogių aliejaus, alyvuogių

Avies, gyvulio odos, vilnos

Rūgšties

Sudusęs, gaižus, apkartęs

Muilo

Kepimo mielių

Purvinų kojų

Kūdikio v÷malų

V÷malų

Puv÷sių

1d 7d 15d 30d 45d 60d

3.2.1pav. Serra da Estrela sūrio juslin÷s analiz÷s diagrama

Šie kvapai buvo jaučiami skirtingo intensyvumo. Tai leidžia sugrupuoti sūrį į 2

brandinimo tarpsnius su jauno ir subrendusio sūrio kvapais.

• Sūryje nuo 0 iki 15 brandinimo dienos buvo juntami kvapai: šviežaus

pieno kvapas, virintas pienas. Aitriausiai jaut÷si parūgšt÷jusios varšk÷s, jogurto kvapai. Šiuos

kvapus būtų galima pavadinti jauno sūrio kvapais.

• Subrendusio sūrio kvapai buvo juntami nuo 30-tos iki 60-tos nokinimo

dienos t.y.: v÷malų, purvinų kojų, kultūrinių mielių, rūgšties kvapas, o intensyviausi šiuo periodu

buvo alyvuogių aliejaus, alyvuogių kvapai.

Serpa sūryje nokinimo metu buvo juntami visi aromatai, žinoma, skirtingo intensyvumo.

29

00,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4Šviežias pienas, šviežia grietin÷

Virintas pienas

Jogurtas, kefyras, prarūgusi varšk÷

Žol÷s

G÷lių, floros

Džiovintų vaisių

Alyvuogių aliejaus, alyvuogių

Avies, gyvulio odos, vilnos

Rūgšties

Sudusęs, gaižus, apkartęs

Muilo

Kepimo mielių

Purvinų kojų

Kūdikio v÷malų

V÷malų

Puv÷sių

1d 7d 15d 30d 45d 60d

3.2.2pav. Serpa sūrio juslin÷ diagrama

Pagrindiniai įgyti aromatai buvo: alyvuogių aliejaus, prarūgusios varšk÷s, purvinų kojų ir

v÷malų. Ryškiausiai juntami kvapai per brandinimo periodą 0, 7, 15, 30, 45 ir 60 dienų buvo:

• 0 dienų. Visi galimi kvapai buvo gana silpnai juntami, ryškiausiai buvo juntamas

šviežio pieno kvapas.

• 7 dienų. Labai aiškiai buvo juntami rūgšties ir prarūgusios varšk÷s kvapai.

• 15 dienų. Visų kvapų ryškumas sumaž÷jo, tačiau puv÷sių, alyvuogių aliejaus ir

avies kvapai šiuo tarpsniu buvo juntami aiškiausiai.

• 30 dienų. Labai stipriai juntamas alyvuogių aliejaus, alyvuogių kvapas.

• 45 dienų. Intensyviausias v÷malų kvapas.

• 60 dienų. Ryškiausias buvo alyvuogių aliejaus kvapas, aiškiai juntami ir

dvokiančių p÷dų bei v÷malų kvapai.

Nesubrendusiam Serpa sūriui yra būdingi prarūgusios varšk÷s, prarūgusio jogurto,

išrūgos, šviežio pieno, varšk÷s, grietin÷s, šviežio sviesto, kultūrinių mielių, kūdikio v÷malų,

30

puv÷sių kvapai; tuo tarpu kai subrendęs sūris pasižymi alyvuogių aliejaus, v÷malų ir purvinų

kojų kvapais.

3.3 Aukšto patikimumo atrankos analiz÷

Išskyr÷me 116 pieno rūgštį gaminančių bakterijų iš sūrio ir avies pieno naudojamo PDO

Beira Baixa sūriams gaminti. PRB filtratai buvo testuojami prieš indikatorinius mikrobus,

minimus 2.1 lentel÷je. N÷ viena iš numanomų išskirtų 49 Lactococcus spp. ar 18 numanomų

Leuconostoc spp.paderm÷s mikroorganizmų netur÷jo slopinančio poveikio tyrimui pasirinktiems

patogenams. Keturi iš numanomų Lactobacillus genties bakterijų pažym÷tų skaičiais 7013, 7014,

7015 ir 7043 paveik÷ gram – teigiamų (Listeria inoccua ir S.aureus) ir gram-neigiamų (E.coli ir

Serratia sp.) bakterijų veiklą (žr. 3.3.1 pav). Šių bakterijų filtrato aktyvumas buvo patikrintas ir

prieš Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Lactobacillus brevis referencinį

kamieną ATCC 8287 ir Salmonella spp. Visų jų augimas buvo slopinamas, išskyrus, toks pat

išliko Lactobacillus brevis ATCC 8287 atveju.

3.3.1 pav. Procentinis skirtingų pinarūgščių bakterijų filtratų veikimas, slopinant

patogenų veiklą

%

31

3.3.1 pav. tęsinys. Procentinis skirtingų pienarūgščių bakterijų filtratų

veikimas, slopinant patogenų veiklą

Visų 4 PRB filtratų poveikis kontroliniams patogenams buvo panašus. Žemiau pateiktuose

paveiksl÷liuose (žr. 3.3.3, 3.3.4, 3.3.5, 3.3.6 pav.) galima steb÷ti, kad patogenų sustojusio

vystymosi faz÷ truko daugiau nei 100 valandų E. coli ir S. aureus bakterijoms, o Listeria inoccua

ir Serratia sp. bakterijoms ši faz÷ truko trumpiau. Akivaizdu, kad filtratuose esanti antimikrobin÷

medžiaga skirtingai veik÷ skirtingus patogenus, tačiau netur÷jo įtakos ar patogenas buvo gram-

teigiamas, ar gram-neigiamas. E. coli visuose filtratuose buvo paveikta bakteriocidiškai,

paveiksl÷lyje nesimato net užuominos apie galimą bakterijų augimą. Kiti patogenai, greičiausiai,

buvo paveikti bakteriostatiškai arba juos veikusios medžiagos koncentracija buvo per maža.

%

Lactobacillus spp.

sp.

32

3.3.3 pav. S. aureus vystymasis paveikus 7043 pienarūgščių bakterijų filtratu

3.3.4 pav. Serratia sp. vystymasis, paveikus 7043 pienarūgščių bakterijų filtratu

33

3.3.5 pav. L. inoccua vystymasis, paveikus 7013 pienarūgščių bakterijų filtratu

3.3.6 pav. E. coli vystymasis, paveikus 7015 pienarūgščių bakterijų filtratu

Iš pateiktų rezultatų grafikuose matome, kad pienarūgščių bakterijų filtratai 7013, 7014, 7015 ir 7043 tur÷jo slopinantį poveikį prieš E.coli, S.aureus, Serratia sp. ir Listeria inoccua.

3.4 Antimikrobinio pienarūgščių bakterijų intensyvumo nustatymas Petri l÷kštel÷se

PRB filtratai, kurie rod÷ didžiausią indikatorinių mikroorganizmų slopinimą, tiriant

Bioscreen C aparatu, buvo patikrinti Petri l÷kštel÷je, specialiai jautrumui antibiotikams tirti

34

skirtoje terp÷je - Mueller-Hinton agare. Visi 4 PRB filtratai tur÷jo švarią zoną apie agare išskobtą

skylutę, tačiau mūsų tiriamos antimikrobin÷s medžiagos paliktas apvadas apie skylutę, gal÷tų

būti suskirstytas į 2 zonas. Pirma zona, esanti arčiau išskobtos skylut÷s, buvo visiškai skaidri, bet

labai siaura, o antroji zona, šiek tiek apsinešusi bakterijomis, tačiau kur kas platesn÷ (žr. 3.4.1 ir

3.4.2pav.).

Pienarūgščių bakterijų 7013, 7014, 7015 ir 7043 filtratai, kuomet jų pH nuo 3.7 iki 3.9,

demonstruoja platų antimikrobinį veikimą, tačiau, pak÷lus pH iki 7, visas antimikrobinis

veikimas neutralizuojamas (žr. 3.1 lentel÷).

3.1 lentel÷ – Skaidraus apvado skersmuo (mm) Mueller-Hinton agare

PRB

filtratai

Indikatorinis

mikroorganizmas

1 m÷nesio

senumo

filtratai*

1 savait÷s

senumo

filtratai*

pH 7 Autoklavuotas

filtratas

L. inoccua 9 9 0 7 Serratia sp. 8 8 0 8 E. coli 8 7 0 6

7013

S.aureus 8 8 0 7 L. inoccua 10 9 0 9 Serratia sp. 9 8 0 8 E. coli 8 8 0 7

7014

S.aureus 8 8 0 7 L. inoccua 10 10 0 10 Serratia sp. 9 9 0 8 E. coli 8 8 0 7

7015

S.aureus 9 9 0 9 L. inoccua 10 9 0 9 Serratia sp. 9 7 0 7 E. coli 8 7 0 7

7043

S.aureus 8 8 0 8 (* laikyti 4ºC temperatūroje)

35

PRB filtratai yra antimikrobiškai veiksnūs, juos laikant 4ºC temperatūroje bent 1 m÷nesį,

ir lieka aktyvūs prieš visus indikatorinius patogenus. Visų PRB filtratų pH yra žemas, palyginus

su PRB filtratais neturinčiais antimikrobinio poveikio. Ištyr÷me ryšį tarp filtratų pH ir skaidrios

zonos skersmens agare. Iš gautų rezultatų matome, kad PRB filtratai yra aktyvūs tik tuomet, kai

jų pH žemesn÷ už 4, tačiau antimikrobinis aktyvumas, maž÷jant filtratų pH, nedid÷ja (žr. 3.4.3

pav.).

3.4.1 pav. Pienarūgščių bakterijų filtratais

veikiama Serratia spp. Viršuje kair÷je pus÷je:

1 m÷nesio senumo filtratai; Viršuje, dešin÷je

pus÷je: 1 savait÷s senumo filtratai ir MRS

sultinys sumažinus jo pH iki 3,5; Apačioje

kair÷je: neutralizuoti pienarūgščių bakterijų

filtratai pak÷lus pH iki 7 ir pieno rūgštis pH

3,5; Apačioje dešin÷je: autoklavuoti

pienarūgščių bakterijų filtratai.

3.4.2 pav. Pienarūgščių bakterijų filtratų

veikiama L. inoccua. Viršuje kair÷je: 1

m÷nesio senumo filtratai; Viršuje dešin÷je:

1 savait÷s senumo filtratai ir MRS sultinys

pH 3,5; Apačioje kair÷je: neutralizuoti

pienarūgščių bakterijų filtratai sumažinus

pH iki 7 ir pieno rūgštis pH 3,5; Apačioje

dešin÷je: autoklavuoti pienarūgščių

bakterijų filtratai.

36

3.4.3 pav. pH įtaka pienarūgščių bakterijų filtratams, slopinant indikatorinius mikroorganizmus

3.5 Aktyvumo ir prigimties tyrimai

Autoklavavus pienarūgščių bakterijų filtratus 20 min 121ºC temperatūroje, buvo

tikrinamas jų antimikrobinis veikimas Biocreen C aparate ir Petri l÷kštel÷se, matuojant skaidrią

zoną apie išskobtą skylutę. Tyrimas parod÷, kad mūsų antimikrobin÷ medžiaga yra atspari

karščiui.

3.5.1 pav. Paveiktų ir nepaveiktų karščiu pienarūgščių bakterijų filtratų antimikrobinis

aktyvumas

Atlikus dar vieną tyrimą su fermentais, iš gautų rezultatų paaišk÷jo, kad papainas

paveikia mūsų antimikrobinę medžiagą 7015 PRB filtrate (žr. 3.5.2 pav. ir 3.2 lentelę).

Poveikio

zona

(mm)

S. aureus zona (mm)

L. inoccua zona (mm)

E. coli zona (mm)

Serratia sp. zona (mm)

Vidurkis % S. aureus

37

Analogiški rezultatai gauti 7015 PRB filtratą veikiant tais pačiais fermentais, stebint Serratia sp.,

S. aureus ir L. inoccua veiklą.

3.5.2 pav. E. coli vystymasis paveikus 7015 pienarūgšt÷s bakterijos filtratą fermentais

Iš žemiau pateiktos lentel÷s duomenų matome, kad 7015 PRB filtratas, paveikus papainu,

visiškai prarado savo antibakterinį poveikį 3 patogenams. S. aureus išlaik÷ 15 mm skersmens

apsinešusią zoną apie agare išskobtą skylutę, tačiau skaidrios zonos nebuvo matyti. Tik÷tina, kad

S. aureus gal÷jo būti jautresnis organin÷ms rūgštims, kurios suk÷l÷ koncentrišką jo depresiją,

prasiskverbdamos į agarą.

Įprastas E. coli

augimas

38

3.2 lentel÷ Fermentų poveikis filtratų aktyvumui prieš kontrolinius mikroorganizmus

Chimo-tripsinas Papainas Proteazė Trypsinas

Mikroorganizmai

Tiriamas

PRB

filtratas skaidri

zona

apsinešusi

zona

skaidri

zona

apsinešusi

zona

skaidri

zona

apsinešusi

zona

skaidri

zona

apsinešusi

zona

Serratia sp. 7013 * 0 11 0 10 7 12 7 13

Serratia sp. 7014 8 15 6 15 7 13 8 14

Serratia sp. 7015* 8 16 0 0 8 16 8 15

Serratia sp. 7043 9 14 8 15 8 16 7 13

E. coli 7013 * 0 9 0 10 0 11 0 11

E. coli 7014 7 13 0 11 0 13 7 12

E. coli 7015 * 6 15 0 0 7 14 7 14

E. coli 7043 7 14 7 15 6 15 0 11

S. aureus 7013 * 15 16 10 8

S. aureus 7014 10 0 7 11

S. aureus 7015 * 13 0 15 11 11

S. aureus 7043 10 11 12 0

L. inoccua 7013 * 0 9 0 10 8 11 8 15

L. inoccua 7014 9 12 8 13 6 11 9 14

L. inoccua 7015 * 8 13 0 0 9 15 8 15

L. inoccua 7043 8 13 9 15 8 14 12 12

3.2 lentel÷je palikti neužpildyti langeliai vaizduoja situaciją, kada nebuvo galima

vizualiai tiksliai nustatyti skirtumo tarp dviejų patogenų slopinimą vaizduojančių zonų.

Pažym÷ta tik aiškiai matoma apsinešusi zona.

Žalia ir raudona žvaigždut÷mis pažym÷jau PRB, su kuriomis būtų įdomu toliau tęsti

bandymus.

3.6 Antimikrobin÷s medžiagos išskyrimas ir apibūdinimas

Šio bandymo tikslas - išsiaiškinti, kurioje filtrato dalyje yra antimikrobin÷ medžiaga.

Vandenin÷je ar organin÷je, t.y. tirpi ar netirpi vandenyje. Deja, šis bandymas nedav÷ norimų

rezultatų. Aptikome tik vandenyje tirpių organinių rūgščių tam tikrą poveikį patogenams.

Paveikus mūsų filtratą eteriu, butanu, izobutanu ir centrifugavimu atskyrus organinę ir vandeninę

dalis, neaptikome tik÷tino bakteriocino poveikio organin÷je dalyje.

39

3.3 lentel÷ PRB filtratų organin÷s ir vandenin÷s dalių aktyvumas

Izobutanas Eteris Butanas Mikroorganizmai

PRB filtratai

Organin÷ (o)/ vandenin÷ (w)

dalis Skaidri zona

Apsinešusi zona

Skaidri zona

Apsinešusi zona

Skaidri zona

Apsinešusi zona

Serratia sp. 7013 w 0 10 0 10 0 0

Serratia sp. 7013 o 0 0 0 0 0 0

Serratia sp. 7015 w 0 11 0 11 0 11

Serratia sp. 7015 o 0 0 0 0 0 0

E. coli 7013 w 0 9 0 9* 0 0

E. coli 7013 o 0 0 0 0 0 0

E. coli 7015 w 0 9* 0 10* 0 0

E. coli 7015 o 0 0 0 0 0 0

S. aureus 7013 w 0 0 0 0 0 0

S. aureus 7013 o 0 0 0 0 0 0

S. aureus 7015 w 0 0 0 0 0 0

S. aureus 7015 o 0 0 0 0 0 0

L. inoccua 7013 w 0 10 0 9* 0 9

L. inoccua 7013 o 0 0 0 10* 0 10

L. inoccua 7015 w 0 9* 0 10* 0 10*

L. inoccua 7015 o 0 0 0 0 0 8 O - organin÷ dalis; w – vandenin÷ dalis

3.7 Tyrimas aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC tyrimas)

Atlikus bandymus aukšto efektyvumo skysčių chromatografu, pasteb÷jome, kad MRS

terp÷s pikai skiriasi nuo pikų, kuriuos demonstruoja 7015 PRB filtratas, turintis antimikrobinį

poveikį. Akivaizdu, kad besivystydamos MRS terp÷je pieno rūgšties bakterijos suvartoja tam

tikras maisto medžiagas ir sintetina naujas, jas apsaugančias medžiagas. MRS terp÷je, nuo 20 iki

26 min pastebimas vienas aiškus medžiagos pikas (pav. 3.7.1). Filtratas, su antibakteriniu

poveikiu (pav. 3.7.2), atlikus aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją, tame pačiame laiko

tarpe rodo du pikus. Apie 22 min išryšk÷jęs pikas gali būti patogenus slopinančios medžiagos

pliūpsnis. Piko registracijos metu buvo surinkta medžiaga “x” ir pakartoti bandymai jos

veiksmingumui nustatyti. Medžiaga “x” patogenus veik÷ slopinančiai.

40

RT: 0.00 - 115.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110Time (min)

-20000

-10000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

130000

140000

150000

uA

U39.37

24.94

5.05

33.344.68

23.6926.305.78 45.31

46.8630.3720.70

19.9248.82

49.6416.11 55.7413.5556.418.81

62.26

63.71

65.77

NL:1.53E5Total Scan PDA 210909_01

3.7.1 pav Tiriama MRS terp÷

RT: 0.00 - 115.00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110Time (min)

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

uA

U

39.62

22.33

25.08

18.08 33.52

26.416.77 14.53

42.3648.79

55.7456.57

62.1863.67

NL:1.88E5Total Scan PDA MRS210909_02

3.7.2 pav. Tiriamas 7015 pienarūgščių bakterijų filtratas, turintis antibakterinį poveikį

41

3.8 Pienarūgščių bakterijų su ryškiausiu antimikrobiniu poveikiu identifikavimas

Pienarūgšt÷s bakterijos 7013, 7014, 7015 ir 7043 buvo identifikuojami API 50 CHL

metodu. Nustatyta: 7013 – Lactobacillus brevis; 7014 - Lactobacillus curvatus (99,5%); 7015 –

Lactobacillus brevis; 7043 - Lactobacillus curvatus (99,9%).

3.9 Apsauginis pienarūgščių bakterijų poveikis sūryje

Pateiktuose paveiksl÷liuose (žr. 3.9.1, 3.9.2, 3.9.3, 3.9.4 ir 3.9.5 pav.) matome, kad buvo

pasirinktas neapgalvotai didelis patogeninių mikroorganizmų kiekis sūryje. Natūraliai esant

tokiam patogenų kiekiui sūryje, jis laikomas supuvusiu.

Apžvelgus visų patogenų vystymąsi iki 70-tos sūrių brandinimo dienos, matome, kad

geresni rezultatai gauti sūryje, kuriame panaudojome PRB 7013. Kontroliniame sūryje patogenų

kiekis taip pat maž÷jo, nes žymus Lactobacillus genties mikroorganizmų kiekis pateko iš

specialaus pieno raugo, kurį naudojome sūrių gaminime. Tokio starterio sud÷tyje yra

Lactobacillus delbrueckii ir Lactobacillus bulgaricus. Patogenų kiekis abiejų sūrių paviršiuje

nokstant buvo panašus. Tai galima paaiškinti tuo, kad po gaminimo sūriai yra įtrinami druska,

kuri yra labai geras konservantas. Sūriams nokstant, jų paviršiuje vandens kiekis yra mažesnis,

tod÷l patogenų vystymuisi ši terp÷ yra mažiau palanki.

Lactobacillus spp. kiekis did÷jo tiek kontroliniame, tiek sūryje su PRB 7013, tačiau,

pasiekus 70-tą brandinimo dieną, pastarajame sūryje Lactobasillus spp. kiekis buvo net 2 log

didesnis.

Iki 30-tos sūrių brandinimo dienos abiejuose sūriuose pH skyr÷si nedaug. Listeria

inoccua vystymosi diagramoje stebimas staigus populiacijos smukimas tik sūryje papildytame

PRB 7013 kultūra. Greičiausiai PRB 7013 gamina kažką, kas stipriai slopina patogenus ir tai

n÷ra tik organin÷s rūgštys. Nuo 7 iki 30-tos brandinimo dienos sūryje su 7013 PRB pH išsilaik÷

toks pats. Kaip tik šiomis dienomis įvyko ryškiausias L. inoccua bakterijos smukimas. Nuo 30-

tos iki 70-tos brandinimo dienos L. inoccua kiekis sūryje nebekito, kai tuo tarpu pH sūriuose

išsiskyr÷ labia aiškiai (žr. 3.9.6 pav.).

Iš gautų rezultatų matome, kad PRB 7013 baktericidiškai, t.y. žudančiai, veik÷ E.coli,

Listeria inoccua ir Serratia sp. patogenus, o S. aureus buvo paveiktas bateriostatiškai. Jo veikla

buvo slopinama (žr. 3.9.2 pav. 70d rezultatus), bet kiekis pakankamai nesumaž÷jo.

PRB 7013 gaminamos medžiagos, jautrios neutralioms pH sąlygoms, buvo įtrauktos į patogenus slopinantį mechanizmą sūrių brandinimo metu.

42

3.9.1 pav. E. coli vystymasis kontroliniame sūryje ir sūryje paveiktame pienarūgšte

bakterija 7013

3.9.2 pav. S. aureus vystymasis kontroliniame sūryje ir sūryje paveiktame pienarūgšte

bakterija 7013

Log

(ksv/ml)

Log

(ksv/ml)

43

3.9.3 pav. Serratia sp.vystymasis kontroliniame sūryje ir sūryje paveiktame pienarūgšte

bakterija 7013

3.9.4 pav. L. inoccua vystymasis kontroliniame sūryje ir sūryje paveiktame pienarūgšte

bakterija 7013

Log

(ksv/ml)

Log

(ksv/ml)

44

3.9.5 pav. Lactobacillus spp. vystymasis kontroliniame sūryje ir sūryje paveiktame

pienarūgšte bakterija 7013

3.9.6 pav. pH kontrolinio sūrio centre ir sūrio su 7013 pienarūgšte bakterija

Log

(ksv/ml)

pH

45

4. REZULTATŲ APTARIMAS

4.1 Portugališkų Serpa ir Serra da Estrela sūrių mikrobiologinio tyrimo

aptarimas

Pienarūgšt÷s bakterijos sudaro nepalankias sąlygas žalingai mikroflorai vystytis. Jos

išskiria organines rūgštis ir sumažina sūrio pH, konkuruoja d÷l laktoz÷s (Masteikien÷, 2006). D÷l

Staphylococcus spp. kiekio padid÷jimo nuo 45-tos brandinimo dienos Serra da Estrela sūryje

galima įtarti, jog jis buvo netinkamai laikomas ar prižiūrimas.

Normaliai augant pienarūgštei mikrobiotai, paprastai slopinama pašalinių, techniškai

kenksmingų, mikroorganizmų veikla ir sudaromos sąlygos normaliam biocheminiam nokimo

procesui.

Iš gautų duomenų matome, kad šviežias sūris yra puiki terp÷ vystytis įvairiai mikrobiotai.

Nors abiejų sūrių mikrobiologiniai rodikliai šiek tiek skiriasi, tačiau tiek viename, tiek kitame

šviežiame sūryje yra aukštas kiekis patogeninių bakterijų. Enterobacter genties bakterijos yra

priskiriamos natūraliai mikrobiotai piene. Nuo pieno kokyb÷s labai priklauso ir sūrio kokyb÷

(Tavaria, 1998). Koliformin÷s bakterijos ir Pseudomonas spp. yra techniškai žalingi

mikroorganizmai, o jų buvimas piene gali būti paaiškinamas skurdžiom sanitarin÷m sąlygom,

surenkant pieną (Bamforth, Ch, 2005).

Tokios bakterijos kaip Pseudomonas spp. ir Staphylococcus spp. yra užkrečiamos ir

pavojingos žmogaus organizmui. Tirtuose nesubrendusiuose sūriuose jų kiekis viršijo leistinas

ribas, tačiau, sūriams bręstant, kenksmingų mikrobų maž÷jo ir sūrį buvo galima vartoti. Šie

tradiciniai portugališki sūriai yra valgomi tik po 30-45 brandinimo dienų, o jų nokinimas gali

tęstis iki 180-tos dienos, kada pienarūgšt÷s bakterijos sudaro nepalankias sąlygas žalingai

mikrobiotai vystytis (Masteikien÷, 2006; Franco, 2007; Roseiro, Wilbey, Barbosa, 2003). Serra

da Estrela sūrio mikrobiologiniame tyrime pastebimas netik÷tas ir nenaudingas Staphylococcus

spp. populiacijos išaugimas nuo 45 d. iki 60 d. Tai gal÷tų būti sūrio apdorojimo klaidos (Franco,

2007). Visgi toks aukštas Staphylococcus spp. kiekis sūryje yra žalingas žmogaus sveikatai. Tokį

sūrį reikia brandinti ilgiau arba jis tur÷tų būti išbrokuojamas. Pienarūgšt÷s bakterijos yra patys

svarbiausi mikroorganizmai, bręstant sūriui (Tavaria ir kt., 1999). Buvo stebimos net 4 PRB

gentys, besidauginančios sūryje: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus ir Leuconostoc.

Bręstančiame sūryje pasteb÷tas PRB sumaž÷jimas gal÷jo įvykti d÷l sumaž÷jusio laktoz÷s kiekio

46

ir susidariusių mažiau palankių sąlygų šių bakterijų augimui. Surauginus visą pieno cukrų, pieno

rūgšties bakterijos žūva. PRB bakterijos gali stimuliuoti ar slopinti viena kitos veiklą, tad

nepalankios sąlygos vystytis kuriai nors iš PRB gal÷jo susidaryti ir d÷l jų išskiriamų

bakteriocinų, kurie dažai būna aktyvūs prieš bakterijas, panašias į jį susintetinusį

mikroorganizmą. D÷l išbrokuotų pavyzdžių Serpa sūryje n÷ra pavaizduotas 60-tos dienos

Lactococcus sp. kiekis.

Kai kurios mielių ir pel÷sinių grybų rūšys yra svarbios ir naudingos sūrio gamyboje,

nes gamina malonaus aromato, suteikiančius pikantišką skonį, junginius. Kadangi mielių ir

pel÷sinių grybų kiekis Serpa sūryje did÷jo visą nokimo periodą, galima spręsti, jog ši mikrobiota

yra atspari pienarūgščių bakterijų išskiriamoms organin÷ms rūgštims ir sumaž÷jusiai terp÷s pH.

Pienarūgšt÷s bakterijos, skaldydamos laktozę, stimuliuoja mielių dauginimąsi. Miel÷s pagreitina

pienarūgščių bakterijų augimą savo gaminamais stimuliatoriais (Franco, 2007). Serra da Estrela

sūryje miel÷s ir pel÷siniai grybai prad÷jo sparčiai vystytis tik nuo 15-tos nokinimo dienos. Jie

išgyvena prisodrintoje oru vidutinio dr÷gnio aplinkoje. Kadangi pienarūgščių bakterijų

suformuota rūgšti tep÷s pH jiems neturi blogos įtakos, o pel÷siniai grybai aktyviai skaido ir

riebalus, tai išsiskiria įvairios lakiosios riebalų rūgštys, suteikiančios sūriams aštroką savitą skonį

ir aromatą (Masteikien÷, 2006; Dahl ir kt., 1999).

4.2 Pienarūgščių bakterijų sintetinamos antimikrobin÷s medžiagos

apibūdinimas

Remiantis daugeliu autorių (įrašytų literatūros sąraše) aprašytais metodais iš 116 pieno

rūgštį sintetinančių bakterijų išskyr÷me 4, labiausiai slopinusias Serratia sp., E. coli, S. aureus ir

L. inoccua veiklą. Bandymus pakartojus Petri l÷kštel÷se buvo pasteb÷tos 2, mikroorganizmų

veiklos slopinimą įrodančios, zonos. Platesnioji, apsinešusi zona, gal÷jo atsirasti d÷l PRB

gaminamų organinių rūgščių. Kadangi organinių rūgščių molekulin÷ mas÷ labai maža, jos gal÷jo

prasiskverbti agaru toliau ir taip suformuoti šiek tiek apsinešusį apvadą. Neatmetama galimyb÷,

kad tai įvyko d÷l mažos molekulin÷s mas÷s antimikrobinių peptidų (žr. 3.4.1 ir 3.4.2pav.).

Daugelio mokslininkų, tyrin÷jusių bakteriocinus, darbuose, Petri l÷kštel÷se antibiotinį veikimą

turintys bakteriocinai agare sudaro labia aiškią skaidrią zoną, apie padarytą skylutę, tačiau jie

savo antimikrobinę medžiagą labia stipriai koncentruoja, tod÷l nenuostabu, kad ir medžiagos

veikimas yra stipresnis.

47

Savo tyrimuose pasteb÷jau, kad PRB sintetinama antimikrobin÷ medžiaga praranda

veikimą pak÷lus terp÷s pH. Tai gali būti paaiškinama neutralizuojamomis bakterijų išskirtomis

rūgštimis, tod÷l ir nebelieka antimikrobinio veikimo. PRB išskiriamos rūgštys gali būti

panaudotos, saugantis nuo bakterin÷s populiacijos padid÷jimo ir nuo kitų bakterijų. Neseniai

buvo paskelbta, kad Lactobacillus helveticus 50P1 tuo pačiu metodu paveikia Escherichia coli

HB101 ir Pseudomonas aeuroginosa (Nikolova, D.ir kt., 2009). Tai rodo, kad toks nenustatytas

PRB filtratų veikimas prieš gram-teigiamas ir gram-neigiamas bakterijas gal÷tų priklausyti nuo

rūgščių. Jei antimikrobin÷ medžiaga būtų bakteriocinas, jis taip pat gal÷tų būti neutralizuojamas

pak÷lus terp÷s pH. Ne vieno autoriaus, tyrin÷jusio bakteriocinus, yra minima, kad kai kurių

bakteriocinų stabilumas labai priklauso nuo terp÷s pH, pvz. nizino.

Galima manyti, kad PRB filtratų žemas pH padidina jų slopinantį poveikį kontroliniams

patogenams d÷l jų jautrumo rūgštims. Iš daugyb÷s bandymų galima spręsti, kad ne pieno rūgštis

lemia tokį stiprų slopinantį patogenus poveikį. Atlikome bandymus su pieno rūgštimi, kurios pH

3,5 ir ji nerod÷ aiškaus žudančio poveikio mikrobams. Sumažinus MRS terp÷s pH, iki 3,5,

patogenai nebuvo slopinami.

Autoklavavus PRB filtratus 20 min 121°C temperatūroje pamat÷me, kad mūsų

antimikrobin÷ medžiaga yra atspari karščiui. Yra keliatas straipsnių, kuriuose minimas mažų

antimikrobinių peptidų atsparumas karščiui. Taip pat karščiui atsparios organin÷s rūgštys.

Paveikus PRB filtratus fermentais, pateb÷jome, kad papainas neutralizuoja antimikrobinį

veikimą. Papainas yra fermentas, veiksmingas terp÷je su žemu pH. Kadangi mūsų filtratų pH

buvo žemas, papainas galimai sukarp÷ tam tikrose vietose baltymin÷s medžiagos jungtis tarp

aminorūgščių, tod÷l antimikrobin÷ medžiaga prarado savo veikimą. Chimotripsinas, proteaz÷s ir

tripsinas nepaveik÷ filtrato. Gali būti, kad šių fermentų veikimui buvo nepalankios sąlygos d÷l

žemos terp÷s pH. Fermentai organinių rūgščių veikimui neturi įtakos.

Atlikus aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją, buvo surinktas antimikrobin÷s

medžiagos pliūpsnis, kuris pasirod÷ apie 22min. Organinių rūgščių mažos molekulin÷s mas÷s

eliucija buvo tik÷tina iki 15 min, tad toks v÷lyvas medžiagos registravimas gal÷jo reikšti aptiktą

bakteriociną.

Kadangi išskirtoji medžiaga turi antibakterinių savybių, yra atspari karščiui, ją

neutralizuoja fermentas papainas, tod÷l manome, kad tai yra bakteriocinas.

48

5. IŠVADOS

1) Nustatyta, kad abiejuose tirtuose sūriuose visą brandinimo laikotarpį dominavo

pienarūgšt÷s bakterijos. Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., koliformin÷s bakterijos

sūriui nokstant maž÷jo.

2) Buvo nustatyta, kad pienarūgšt÷s bakterijos yra svarbios ne tik d÷l skonio, aromato,

konsistencijos, bet ir sudaro nepalankias sąlygas vystytis patogeniniams

mikroorganizmams.

3) Didžiausią slopinantį poveikį Seratia sp., L. inoccua, E. coli ir S. aureus veiklai tur÷jo

Lactobacillus brevis ir Lactobacillus curvatus.

4) Bakteriocidiškai ir bakteriostatiškai patogenus veik÷ organin÷s rūgštys ir neidentifikuota

medžiaga „x“.

49

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Abee T. Pore-forming bacteriocins of gram-positive bacteria and self-protection

mechanisms of producer organisms; 1995; FEMS Microbiol Lett 129:1-10

2. Albano H., Oliveira M., Aroso R., Cubero N., Hogg T., Teixeira P. Antimicrobial activity

of lactic acid bacteria isolated from “Alheiras” (traditional Portuguese fermented

sausages): In situ assays. Elsevier, Science direct, 2007; 76:796-800

3. Aly S., Ouattara Cheik A.T, Bassole Imael H. N, Alfred T. S., Ouattara Cheik A.T,

Bassole Imael H. N, Traore S. A.; Bacteriocins and lactic acid bacteria - a

minireview;African Journal Of Biotechnology Vol. 5 (9), Pp. 678-683, 2 May

4. Bamforth, Ch. W., 2005. Food fermentation and micro-organisms. Department of Food

Science and Technology, University of California, Davis, USA. 160-171p

5. Barnby-Smith F.M. Bacteriocins:applications in food preservation, Trends food science

technology, 1992, 3:133-137

6. Benkerroum N., Oubel H., Zhar M., Dlia S., Filali-Maltouf A. Isolation of a bacteriocin-

producing Lactococcus lactis subsp. Lactis and application to control Listeria

monocytogenes in Maroccan jben; Journal of Applied microbiology; 2000; 89:960-968

7. Charles M. A. P. F., Van Belkum M. J., Holzapfel1 W. H., G´ Alvez H. A. A.;

Diversityof enterococcal bacteriocins and theirgrouping in a new Classic cation scheme;

Federation of European Microbiological Societies published by Blackwell publishing

Ltd.; 2007; 31: 293–310

8. Cintas L.M., Rodriguez J.M., Fernandez M.F., Sletten K., Nes I.F., Hernandez P.E., Holo

H. Isolation and characterization of pediocin L50, a new bacteriocin from Pediococcus

acidilactici with a broad inhibitory spectrum. Appl Environ Microbiol; 1995, 61:2643-

2648)

9. Dahl, S. Relationships between flavour and microbiological profiles in Serra da Estrela

cheese throughout ripening. International Dairy Journal. 1999.

10. Ennahar S., Sashihara T., Sonomoto K., Ishizaki A.; Class II a bacteriocins: Biosynthesis,

structure and activity; FEMS Microbiology Reviews; 2000; 24:85-106

50

11. Fahimdokht Mokhtari ; Developing a test method for determining the effectiveness of

antimicrobial preservatives; Research Journal of Biological Sciences; 2008; 3(9):984-988

12. Fayol-Messaoudi D., Berger C. N., Coconnier-Polter M., Moal V. L., Servin A. L.; Ph-,

Lactic Acid-, and non-Lactic Acid-dependent activities of probiotic Lactobacilli against

Salmonella enteric, Serovar typhimurium; Applied and environmental microbiology,

2005; 71: 6008–6013

13. Franco, M. I., Relationships between sensory attributes and volatile compounds

constituents in an ovine Portuguese traditional cheese (Serra da Estrela cheese), 2007.

14. Freni K. Tavaria, F. Xavier Malcata. 1999. On the microbiology of Serra da Estrela

cheese: geographical and chronological considerations.

15. Gottlieb C.T., Thomsen L.E., Ingmer H., Mygind P.H., Kristensen H.H. ir Gram L.

Antimicrobials peptides effectively kill a broad spectrum of Listeria monocytogenes and

Staphylococcus aureus strains independently of orign, sub-type, or virulence factor

expression. MBC Microbiology, 2008, 8:205, 1-10

16. Gudonis A. Sūriai: klasifikavimas, savyb÷s, gamybos technologijos, 1997m 2, 64p

17. Gudonis A., 2004. Pieno ir pieno produktų juslin÷s savyb÷s, Kaunas.

18. http://cmdr.ubc.ca/bobh/peptides.html; Prieeiga per internetą žr. 2010m.

19. http://en.wikipedia.org/wiki/Antimicrobial_peptides; Prieeiga per internetą 2010m

geguž÷s 10d.

20. http://www.answers.com/topic/bacteriocin; Prieeiga per internetą, žr. 2010m.

21. http://www.fao.org/docrep/x0560e/x0560e10.htm; Prieeiga per internetą, 1998m.

22. http://www.merck.com/mmhe/sec17/ch190/ch190h.html; Prieiga per internetą, žr.2008m.

23. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC429093/?page=2; Prieeiga per internetą

žr. 2010m.

24. http://www.teagasc.ie/research/reports/dairyproduction/4207/eopr-4207.asp; Prieeiga per

internet, žr 2010m.

25. Jack R. W., Wan J., Gordon J., Harmark K., Davidson B. E., Hillier A. J., Wettenhall R.

E. H., Hickey M. W., Coventry M. J. Characterization of the chemical and antimicrobial

properties of piscicolin 126, a bacteriocin produced by Carnobacterium piscicola Jg126;

Applied and environmental microbiology, 1996; 62: 2897–2903

51

26. Jack R.W., Tagg J.R., Ray B. Bacteriocins of gram positive bacteria. 1995,Microbiol.

Rev. 59:171-200.

27. James M. Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2001. Modern food microbiology,

Springer.

28. Line J.E., Svetoch E.A., Eruslanov B.V., Perelygin V.V., Mitsevich E.V., Mitsevich I.P.,

Levchuk V.P., Svetoch O.E., Seal B.S., Siragusa G.R. ir Stern N.J. Isolation and

purification of Enterococin E-760 with broad antimicrobial activity agains gram-positive

and gram-negative bacteria. Antimicrobial agents and chemotherapy; 2008; 52:1094-

1100

29. Macedo A. C., Malcata F. X., Oliveira J. C.. 1993. The Technology, Chemistry and

Microbiology of Serra Cheese: A Review, Journal of Dairy Science.

30. Maldonado A., Jimenez-Diaz R., Ruiz-Barba J.L. Introduction of Plantaricin in

Lactobacillus plantarum NC8 after Coculture with specific gram-positive bacteria is

mediated by an autoinduction mechanism. Journal of Bacteriology; 2004; 186:1556-1564

31. Maragkoudakis P.A., Mountzouris K.C., Psyrras D., Cremonese S., Fisher J., Cantor

M.D., Tsakalidou E. Functional properties of novel protective lactic bacteria and

application in raw chicken meat against Listeria monocytogenes and Salmonella

enteritidis. Internationa journal od food microbiology. 2009; 130:219-226

32. Masteikien÷ R. R. 2006. Maisto produktų mikrobiologija, 2knyga, Technologija,

Kaunas. (112 – 140p)

33. Michaelidou A., Alichanidis E., Urlaub H., Polychroniadou A. ir Zerfiridis G. K.

Isolation and identification of some major water – soluble peptides in Feta cheese.

Journal of dairy science. 1998, 81:3109-3116

34. Nikolova D., Evstatieva Y., Georgieva R., Danova S., Savov V., Ilieva S., Dalev P.

Molecular taxonomic characterisation of probiotic strain Lactobacillus sp. 50P1,

Biotechnol. & Biotechnol. Eq; 2009; 23:779-782

35. O`Sullivan L., O`Connor E.B., Ross R.P., ir Hill C. Evaluation of live-culture-producing

lacticin 3147 as a treatment for the control of Listeria monocytogenes on the surface of

smear-ripened cheese; Journal of Applied Microbiology; 2006; 100:135-143

52

36. Oh S., Kim S. H., Worobo R. W. Characterization and Purification of a Bacteriocin

Produced by a potential probiotic culture, Lactobacillus acidophilus 30SC; Journal dairy

science 2000; 83:2747–2752

37. Oscariz J.C., Pisabarro A.G. Clasification and mode of action of membrane-active

bacteriocins produced by gram-positive bacteria. 2001, 4:13-19;

38. Ralph W. J., Tagg J. R., Bibek R.; Bacteriocins of gram-positive bacteria;

Microbiological reviews, 1995; 59:171–200

39. Rizzello C. G., Losito I., Gobbetti M., Carbonara T.,M. D. De Bari, Zambonin P. G.;

Antibacterial activities of peptides from the water-soluble extracts of italian cheese

varieties; American Dairy Science Association, 2005. 88:2348–2360.

40. Roseiro L. B., Wilbey R. A., Barbosa M. 2003. Serpa cheese: Technilogical,

Biochemical and microbiological characterisation of PDO ewe´s milk cheese coagulated

with Cynara cardunculus L., INRA, EDP Sciences,

41. Sigrid C.S. De Keersmaecker, Verhoeven T.L.A., Desair J., Marchal K., Vanderleyden J.

ir Nagy I. Stron antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnossus GG against

Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid; Federation of European

Microbilogical Societies Published by Blackwell Publishing; 2006; 259:89-96.

42. Sine´Ad C. Corr, Yin Li, Christian U. Riedel, Paul W. O’Toole, Colin Hill, And Cormac

G. M. Gahan; Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of

Lactobacillus salivarius ucc118; 2007 prieeiga per internetą

Www.Pnas.Org_Cgi_Doi_10.1073_Pnas.0700440104

43. Tavaria F. K., Malcata F. X.; 2000; P: 293-304. Microbiological Characterization of

Serra da Estrela Cheese throughout its Appellation d’Origine Protegee Region, Journal of

Food Protection.

44. Todorov S.D., Dicks L.M.T. Lactobacillus plantarum isolated from molasses produces

bacteriocins active against gram-negative bacteria. Enzyme and Mycrobial Technology

2005; 36: 318-326

45. Yanagida F., Chen Y., Shinohara T. Searching for bacteriocin-producing lactic acid

bacteria in soil; Journal of Applied microbiology; 2005; 52:21-28

46. Zoumpopoulou G., Foligne B., Christodoulou K., Grangette C., Pot B., Tsakalidou E.

Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 displays probiotic potential in vitro and protects

53

against trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis and Salmonella infection in

murine models. International journal of food microbiology. 2008; 121:18-26