Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

Szerin proteinázok specificitás vizsgálata kompetitív oligopeptid

szubsztrát rendszer fordított fázisú HPLC analízisével.

Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

, P1-P1’ kötés: a hasadó kötés;

P6-P4’: szubsztrát hatóhelyek;

S6-S4’: a P6-P3’ helyeknek megfelelő enzim hatóhelyek;

P6-P1: a szubsztrát savkomponense (N-terminális rész);

P1’-P4’: a szubsztrát aminkomponense (C-terminális rész);

S1: az elsődleges specificitást meghatározó hely;

P1: az S1 helyet elfoglaló szubsztrát alegység.

Schechter-Berger nómenklatúra

P4’

Enzim

S5

S3

S1S2 S1’

S2’

S6

P5

P3

P2

P2’

P1’

P6

P1

Hasadó kötés

N C

S3’

S4’

S4

P4

P3’Szubsztrát


S1A proteinázok kötőfelszínei

189. pozíció

S’ helyek

Katalitikus triádS2 helyek

S4 helyek

S1 helyek

N-terminális domén

C-terminális domén


Hatóhely preferenciákTripszin Kimotripszin

P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ P4 P3 P2 P1 P1’ P2’

Szerpinek A I P - S I I T L - S AKompetitív/kvázi kompetitív kísérletek adatai - G P - I Aro.

Hfb - - - - - Ali.

Hfb

Acil-transzfer kísérletek adatai - - - - M Aro.

Hfb - - - - R Ali.

Hfb

Peptid szubsztrát hasítóhelyek

Hfb N S/A - S Kis

HfbHfb Y/T R/T - T/A N

Szerkezeti adatok Ali.Hfb X Hfb - Hfb

Aro.

HfbAli. Hfb X Hfb - + Ali.

Hfb

„Konszenzus” Ali.Hfb

HfbHfb/

P - Hfb / S

Aro.

HfbAli.Hfb T Hfb - +/S

Ali.

Hfb

Hfb: hidrofób; Kis Hfb: kis hidrofób Ali.Hfb: alifás hidrofób; Aro.Hfb: aromás hidrofób+: pozitív töltésű

S1A tagok általábanP4 P3 P2 P1 P1’ P2’

Szerpin statisztika Ali.Hfb Ali.Hfb/T Hfb/P - S Ali.Hfb

Kompetitív/kvázi kompetitív kísérletek adatai Hfb Hfb/P Hfb/P - S/Kis Hfb HfbAcil-transzfer kísérletek adatai - - - - - -Peptid szubsztrát hasítóhelyek Ali.Hfb X Hfb/P - S/Kis Hfb Ali.Hfb

Szerkezeti adatok Ali.Hfb X Hfb - Hfb/+ Hfb

„Konszenzus” Ali.Hfb Hfb Hfb/P - S/Hfb Hfb


Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások

Alapkövetelmények:

1. S–P és S’–P’ kölcsönhatások kialakítása

2. Kompetitív reakcióelrendezés


S–P és S’–P’ kölcsönhatások kialakítása

A P’ kölcsönhatások hiánya miatt a kromogén szubsztrátok nem jöhetnek szóba.

↓Az S1A enzim-szubsztrát kölcsönhatásokban általában szükséges és elégséges P4–P2’ távolságot átfogó oligopeptid szubsztrát

Kompetitív reakcióelrendezés↓

Olyan oligopeptidek keveréke, melyek azonos aminosavakat hordozó „gerinccel” rendelkeznek, és csak a hasítóhelyen (P1 pozíció) tartalmazzák a

vizsgálandó specificitásoknak megfelelő aminosav oldalláncokat




Analitikai módszer:

1. Optikai detektálás

2. Egyéb módszerek (HPLC, fehérje-

szekvenálás, MS)



Optikai detektálásEgy lépéses egyszerű jelöléses vagy IFQ detektáláshoz egyelőre nem áll rendelkezésre kellő számú különböző csoport.

↓Azonos jelölőcsoportot, vagy IFQ csoport párt tartalmazó szubsztrátok

Az enzimatikus hasítás csak a komponensek elválasztása után lenne követhető.

Egyéb módszerekFehérjeszekvenálás: a reakcióelegy „pool” szekvenálása több analitikai buktatót is rejt.

↓Megelőző analitikai HPLC Egyéb módszerekHPLC: a jelölt oligopeptidek alkalmazásához képest csökkent érzékenység

↓A reakcióidő növelése



•P1 pozícióban a két archetípust, a tripszin és kimotripszin specificitást reprezentáló

oldalláncok: Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr és Leu•P1 pozícióban a HPLC elválasztás belső standardjaként az egyik komponens

tartalmazzon inert aminosavat: Pro-t•A közös szekvencia egyformán elfogadható vagy elfogadhatatlan mindkét archetípus és várhatóan a belőlük származtatható mutánsok, általában S1A proteinázok számára.•P1’ pozícióban nem tartalmazhatnak a szerin proteináz hidrolízisben kedvezőtlen,

„tiltott” aminosavakat: prolint, savas oldalláncot.•A közös szekvencia aminosavai nem szolgálhatnak jó hasítási helyként szerin proteinázok számára.•Az oligopeptideknek oldhatóaknak kell lenniük fiziológiás körülmények között,

nem tartalmazhatnak az oldódást gátló hidrofób „magot”lehetőleg tartalmazzanak az oldódást megkönnyítő hidrofil oldalláncokat.

•A peptidszekvenciákban ne legyenek olyan savas vagy bázikus „magok”, melyek a pH helyi megváltoztatása révén befolyásolhatják az enzimreakció lefolyását.•Kerülendő olyan aminosavak beépítése, melyek problémát okozhatnak a szintézis vagy a tisztítási lépések során.


Optimális közös peptidgerinc tervezéseA közös P4-P2’ mag tervezése

•P1 pozíció: Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Leu és Pro

•P2 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján,

illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: Pro•P3 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján,

illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: kis hidrofób: Ala•P4 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján,

illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: kis hidrofób: Ala•P1’ pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján,

átlagosan elfogadott: Ser •P2’ pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján kis

hidrofób: Ala


Retenciós idő becslésA peptidkeverék komponensek retenciós időinek becslésére a következő

képletet használtuk

Tr= B+A Dini

Ahol Tr a retenciós idő, Di: i aminosav oldallánc hozzájárulása a peptid

retenciójához, ni: i aminosav száma a peptidben, A és B: a kromatográfiás

rendszerre az oszlop, holttérfogatok, gradiens, és az eluensek által meghatározott állandók.

Aminosav Gly Ala Val Ile Leu Phe Tyr Trp Met Pro

D 4,0 2,4 7,4 27,4 26,4 31,4 21,0 35,8 14,5 7,9

Aminosav Ser Thr His Arg Lys Asp Glu Asn Gln

D 1,1 7,4 7,8 0,0 -3,1 -0,1 2,7 7,9 3,2


Optimális közös peptidgerinc tervezése. A komponensek RP-HPLC elválasztásának hangolása.

Retenciós idő hangoló tagok bevitele

lépés peptid

Rekker retenciós idő (TRr)

ha X

K R P Y L F W

Analitikai célú bővítés

2.

N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3

T HAAPXSA 21,9 25,0 32,9 46,0 51,4 56,4 60,8

C SA 3,5

A magszekvencia retenciós viszonyai

1.

N AAPX 9,6 12,7 20,6 33,7 39,1 44,1 48,5

T AAPXSA 13,1 16,1 24,1 37,2 42,6 47,6 52

C SA 3,5

3.

N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3

T HAAPXSADI 49,2 52,3 60,2 73,3 78,7 83,7 88,1

C SADI 30,8

4.

N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3

T HAAPXSADIQI 79,8 82,9 90,8 104 109,3 114 119

C SADIQI 61,4

5.

N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3

T HAAPXSADIQIDI 107,1 110,2 118,1 131,2 136,6 141,6 146

C SADIQIDI 88,7


RP-HPLC körülmények beállítása

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0 5 10 15 20 25 30 35

Retenciós idő [min]

Ab

szo

rban

cia

220

nm

-en

0.0

5 F

S [

mV

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Elu

ens

öss

zeté

tel [

% B

]

Xxx= Lys Arg Pro Tyr Leu Phe Trp

C

-te

rmin

áli

s p

ep

tid

A gradiens elúció sarokpontjai:

Idő [perc] Összetétel [%B]

Ekvilibrálás -12-0 23-23

Injektálás 0 23

Elválasztás0-5 23-23

5-31 23- 35

Mosás 31-35 100-100

Elválasztási körülmények

•Oszlop:Aquapore OD 300 (2,1 x 220mm)•Áramlási sebesség:300 ml/perc•Injektálási térfogat: 5 ml•Detektálás: 220 nm, 0,05 Full Scale

Lehetséges adattartományok:•A teljes szeparációs tartományt kihasználva adatgyűjtést végzünk az N-, és C-terminális peptidek és az intakt szubsztrátok retenciós tartományában.•Az adatgyűjtést csak az N-, és C-terminális peptidek retenciós tartományában végezzük.•Csak a C-terminális és az intakt peptidek retenciós tartományában gyűjtünk adatokat.


Az enzimatikus emésztések reakciókörülményeiA enzimreakciókat nyolc különböző enzimmel (szarvasmarha tripszin, kimotripszin, plazmin és trombin, egér endoproteináz Arg-C, patkány kimotripszin és mutáns tripszin (Tyrpszin), kecskerák tripszin) végeztük. Az enzimkoncentrációkat úgy optimalizáltuk, hogy összehasonlítható, közel azonos reakciósebességet eredményezzen a különféle enzimekkel végzett emésztésekben. A szubsztrátkeverék komponensek ekvimoláris elegyét a reakciópufferben (0,05 M TRIS-HCl, 18 mM CaCl2) oldott egyedi oligopeptidek 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldataiból

készítettük. A reakciókat 30 ml optimalizált koncentrációjú enzimoldat 670 ml szubsztrátkeverék-oldatba való pipettázásával indítottuk és 25 oC-on, 8-as pH-n vezettük le. Az emésztéseket különböző reakcióidőknél (0, 1, 4, 16, 32, 64 perc) 100 ml térfogatú alikvotok 20 ml 5 M-os ecetsavoldatba történő injektálásával állítottuk le. P

eptidkeverék komponens

szarvasmarha egér patkány rák

tripszin

kimotripszin

plazmin

trombin

endoproteináz Arg-C

kimotripszin

Tyrpszin

tripszin

c M] 40 0,0012 0,0075 0,0012 0,0075 0,0075 0,0150 0,1500 0,0012


Patkány kimotripszin kromatogramserege

0 10 20 30

64 perc

32 perc

16 perc

4 perc

1 perc

0 perces állapot

UV

ab

szo

rban

cia

220

nm

-en

Retenciós idő [perc]

reakcióidő


0 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Lys Arg C-term Pro Tyr Leu Phe Trp

0 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


1 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


1 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


4 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


4 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


16 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


16 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


32 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


32 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


64 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


64 perces állapot

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000


A reproduktivitás ellenőrzése

Ab

szo

rban

cia

220

nm

-en

Tartalmú peptid

szarvasmarha kimotripszin szarvasmarha tripszin


A szelektivitás ellenőrzése I.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Lys Arg Tyr Leu Phe Trptartalmú peptid

Cs

úc

ste

rüle

t c

sö

kk

en

és

[%

]

szarvasmarha kimotripszin szarvasmarha tripszin

16 perces állapotok összehasonlítása


A szelektivitás ellenőrzése II.

16 perces állapotok összehasonlításaPhe tartalmú peptid fogyására normalizált diagram

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0


Csú

cste

rüle

t cs

ökk

enés

[%

]

patkány kimotripszin szarvasmarha kimotripszin A

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0


Csú

cste

rüle

t cs

ökk

enés

[%

]

patkány kimotripszin szarvasmarha kimotripszin A


Szerin proteinázok teszteléseTyrpszin

0

10

20

30

40

50

Lys Arg Tyr Leu Phe Trp

Szarvasmarha kimotripszin

0

10

20

30

40

50


Patkány kimotripszin

0

10

20

30

40

50


Szarvasmarha plazmin

0

10

20

30

40

50


Szarvasmarha tripszin

0

10

20

30

40

50


Kecskerák tripszin

0

10

20

30

40

50


Egér endoproteinázArg-C

0

10

20

30

40

50


Szarvasmarha trombin

0

10

20

30

40

50


Cs

úc

ste

rüle

t c

sö

kk

en

és

[%

]

16 perces állapotok összehasonlítása

Documents

Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár