mikrobiologi pewarnaan bakteri

Pewarnaan Benda-Benda Mikroskopik

Semua zat-zat pewarnaan bakteri adalah produk sintetik, misalnya za-zat warna analin. Meskipun zat-zat warna sintetik bervariasi dalam sifat-sifat kimia dan sifat-sifat pewarnaannya, tetapi untuk tujuan praktek maka zat-zat warna dibagi ke dalam dua grup, yaitu 1) acid dyes (zat-zat warna sifat asam), 2) basic dyes (zat-zat warna sifat basa/alkalis).Bentuk garam daripada zat-zat warna tersebut adalah lebih muda melarut, penetrasi lebih baik dan warna lebih permanen. Acid dyes (zat warna asam) sifat warnanya disebabkan oleh anion, sedangkan basic dyes (zat warna basa) disebabkan oleh kation.

Akan tetapi, reaksi sesungguhnya dari suatu larutan zat warna (dalam aqua) adalah tergantung pada beberapa faktor sehingga acid dyes bisa bereaksi basa, sedangkan basic dyes bisa bereaksi asam.Basic dyes mempunyai afinitas paling besar terhadap inti sel, barangkali karena sifat asam daripada material inti, sedangkan acid dyes mempunyai tendensi yang lebih kuat untuk berkombinasi dengan sitoplasma.

Jenis pewarnaan:- Metode pewarnaan sederhana: Suatu metode pewarnaan umum dimana dapat digunakan beberapa larutan tunggal zat warna dengan tujuan untuk melihat bentuk-bentuk sel-sel bakteri.- Metode pewarnaan negatif: suatu metode pewarnaan umum dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatarbelakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk yang kosong tak berwarna (negatif)..

Lima metode pewarnaan spesiala. Metode pewarnaan GramKegunaannya : - untuk melihat/mengamati bentuk-bentuk sel-sel bakteri- untuk mengetahui sifat reaksi pewarnaan bakteri, apakah negatif- gram (berwarna merah) atau positif-gram (berwarna biru).

b. Metode pewarnaan tahan asam (acid-fast staining)Kegunaannya : - untuk melihat/mengamati bentuk-bentuk sel-sel bakteri yang tahanpewarnaan asam, yang dengan pewarnaan-pewarnaan ini berwarna merah sedangkan bakteri lain berwarna biru.

c. Metode pewarnaan FultonKegunaan : - untuk mendemonstrasikan adanya spora di dalam sel vegetatif darigenus bacillus dan genus Clestridium.- dengan pewarnaan fulton inii, spora berwarna hijau, sedang sel vegetatif berwana pink

Metode pewarnaan HissKegunaan : - untuk melihat/mengamati kapsul dari spesies bakteri tertentu.- dengan perwarnaan hiss, kapsul akan berwarna faint pink (merah jambu pucat), sedang sel

bakteri berwarna ungu tua.

Dua kelompok spesimen/bahan pemeriksaan yang bisa digunakan dengan metode-metode pewarnaan tersebut:

a. Spesimen Klinik:1). Cair (liquid) : - urine- transudat- Eksudat- Cerebro spinal fluid- Synovial fluid- dll

2). Semi/non-liquid : - septum- pus- feces- sekret (mata, hidung, vagina dll)

b. Spesimen non-klinik1). Cair (liquid) : - suspensi bakteri- biakan bakteri dalam medium cair2). Non-liquid : - biarkan bakteri pada pembenihan padat (ditabung ataulempeng petri)

Cara membuat preparat/sediaan:a. Spesifik klinik cair (liquid)- kocok spesimen dalam tabung/botolnya agar tercampur baik.- Pipet sejumlah volume (5 – 10 ml) spesimen ke dalam tabung centrifuge- Putarselama 10 menit dengan kecepatan 3 x 103 rpm- buang supernatan dan buat smear dari defesitnya pada sebuah objek gelas yang kering dan bersih.- keringkan smear di udara dan kemudian lidah apikan (flaming) beberapa kali pada nyala pembakar bunsen atau lampu spirtus guna lebih melekatkan smear pada permukaan gelas dan mematikan mikroba.- sediaan/preparat siap untuk diubar

b. Spesimen klinik non-liquid- dengan sengklit yang steril (sebelumnya sampai memijar pada nyala lampu spirtus), ambil spesimen secukupnya kemudian buatlah smear pada sebuah objek gelas yang bersih dan kering.- usahakan smear itu setipis mungkin- keringkan di udara dan kemudian lidahapikan beberapa kali pada nyala bunsen- preparat siap diubar.

c. Spesimen non-klinik cair- dengan sengkli steril ambil sedikit biakan cair dari tabung dan buat smear setipis mungkin pada

objek gelas yang bersih dan kering.- keringkan di udara dan kemudian lidah apikan beberapa kali pada nyala lampu spirtus atau pembakar bunsen.- sediaan/preparat siap diubar

Spesimen non-klinik non-liquid- dengan sedikit steril ambil 1-2 koloni dari plate solid culture medium atau sedikit pertumbuhan dari tabung pembenihan agar miring dan suspensikan dalam aquadest pada permukaan sebuah objek gelas yang bersih dan kering.- Buatlah smear dengan suspensi tersebut setipis mungkin- Keringkan di udara dan kemudian lidahapikan beberapa kali pada nyala lampu spirtus atau pembakar bunsen- sediaan/preparat siap diubar

Teknika. Pewarnaan Sederhana- warnai smear 3 – 4 menit dengan salah satu larutan zat warna untuk metode pewarnaan sederhana.- cuci preparat dengan air kran mengalir- Keringkan di udara (jangan dilidahapikan pada bunsen)- Periksa di bawah mikroskop cahaya:* Pertama pakailah lensa okuler 10 dan lensa objektif 10 untuk melokalisasi bagian smear yang baik (tidak tebal, sel-sel bakteri tidak bertumpuk atau bertindihan)* tetesi imersion oil bagian smear yang baik tersebut* pakailah lensa objektif 100 untuk mengamati sel-sel bakteri.

b. Pewarnaan negatif- Suspensi bakteri dicampur dengan larutan zat warna sama banyak (masing-masing 1 lop penuh) pada permukaan sebuah objek gelas yang bersih dan kering, ratakan sehingga menjadi smear yang tipis.- keringkan di udara dan selajutnya periksa di bawah mikroskop cahaya seperti tersebut di atas.

c. Pewarnaan gram- warnai smear selama 1 menit dengan larutan ammonium oksalat kristal violet- cuci dengan air kran mengalir 2 detik- celupkan 1 menit dalam larutan lugol- cuci dengan air kran mengalir dan lap kering- lunturkan setengah menit di dalam alkohol 95% dengan agitasi perlahan-lahan dan lap kering- counterstain 10 detik dalam larutan safranin- cuci di air keran mengalir- keringkan dan periksa di bawah mikroskop cahaya seperti tercantum pada pewarnaan sederhanaCatatan: oleh karena sifat positif-gram atau negarif gram dari bakteri tergantung pada komposisi kimia atau integritas dinding sel bakteri dan kemantapan hal ini tergantung pula pada beberapa faktor (faktor umur, nutrisi, suhu pertumbuhan dan lain-lain), maka bisa terjadi hal yang sebaliknya. Dianjurkan untuk pewarnaan gram digunakan biakan yang berumur 18-24 jam.

http://sitzkrieg-awan.blogspot.com/2009/03/mikrobiologi-pewarnaan-bakteri.html

Teknik pewarnaan   mikroorganisme

Posted on April 19, 2009 by firebiology07

BAB IPENDAHULUANI.1 Latar BelakangMikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pengecatan sederhana, pengecatan negatif maupun pengecatan gram serta mengetahui morfologi mikroorganisme.I.2 Tujuan PercobaanAdapun tujuan dari percobaan ini adalah :1. Untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme dengan cara pengecatan negatif, pengecatan sederhana dan pengecatan gram.2. Untuk mengetahui morfologi mikroorganismeI.3 Waktu dan Tempat PercobaanPraktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 25 Maret 2009, pukul 14.00- 17.30 WITA dan bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.

BAB IITINJAUAN PUSTAKAMelihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan

suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).Macam-macam pewarnaan (Yulneriwanti, 2008) :1. Pewarnaan negatif- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta2. Pewarnaan sedehana- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel3. Pewarnaan diferensial- menggunakan lebih dari satu macam zat warna- Tujuan untuk membedakan antar bakteri- Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam4. Pewarnaan khusus- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dllCara pewarnaan negatif- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskopUntuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasinya, kuman perlu diwarnai.Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (filzahazny, 2008).Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (filzahazny, 2008).Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dilihat pada table berikut ini (filzahazny, 2008) :Bakteri Gram Positif Bakteri Gram NegatifDinding Sel:Lapisan petidoglikan Lebih tebal Lebih tipis

Kadar lipid 1-4% 11-22%

Resistensi terhadap alkali (1% KOH)Lebih pekat LarutKepekaan terhadap Yodium Lebih peka Kurang pekaToksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka

Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam

Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka

Kepekaan terhadap streptomisin Tidak peka Peka

Teknik pewarnaanPewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990).Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang Membentuknya (Dwidjoseputro, 1989).Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu (Hadiotomo, 1990) :- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam d 10%engan jumlah sedikit dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.- Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.- Tidak resisten terhadap gangguan fisik.Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu (Hadiotomo, 1990) :- Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.- Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.- Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu (Volk & Wesley, 1998):1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safraninBAB IIIMETODOLOGIIII. 1 AlatAlat yang digunakan pada percobaan ini adalah mikroskop, objek gelas, ose bulat, gegep kayu,lampu spritus , korek api,pipet tetes,wadah baskom, botol semprot , dan hand sprayerIII.2 BahanBahan yang digunakan pada percobaan ini adalah Aquadest steri, lBiakan Eschericia coli, Biakan Bacillus cereus, Biakan Salmonella typii, Gram A (Kristal violet), Gram B (larutan lugol), Gram C (Alkohol asam), Gram D (Safranin), Minyak imersi, Tissue roll, Alcohol 70 %, Spirtus, Larutan nigrosin (tinta cina).III.3 Prosedur KerjaA. Pengecatan Sederhana1. Membuat preparat olesan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii lalu fiksasi dengan pembakar spirtus.2. Meneteskan larutan Kristal violet diatas olesan preparat tersebut sebanyak 1-2 tetes dan membiarakan selama 1-2 menit.3. Mencuci dengan air mengalir sampai sisa cat tercuci habis, kemudian mengeringkan dengan hati-hati mengunakan tissue roll.4. Mengamati dibawah mikroskop dengan menggunakan pembesaran 100x dan minyak imersi.5. Menggambar dan mencatat hasil yang diamati.B. Pengecatan Negatif1. Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70 % agar bebas lemak.2. Mengambil 1 ose yang digunakan umntuk mengambil biakan, meletakkan biakan pada objek gelas kemudian mencampur dengan 1-2 tetes nigrosin.3. Dengan menggunakan objek gelas lain menyentuhkan sisi objek gelas C,tersebut pada sampel tersebut sehingga membentuk sudut 300 selanjutnya menarik objek gelas tersebut dengan arah yang berlawanan hingga membentuk film tipis.4. Membiarkan hingga mengering lalu mengamati diubawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi.5. Menggambar dan mencatat hasil pengamatan.C. Pengecatan Gram1. Menyiapkan preparat olesan bakteri Bacillus cereus, Eshcericia coli dan Salmonella typii lalu fiksasi pada pembakar spirtus.2. Meneteskan larutan gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri, membiarkan selama 1 menit.3. Mencuci dengan air mengalir dan mengeringkan dengan tissue roll dengan hati-hati.4. Meneteskan larutan gram B, membiarkan selama 1 menit.5. Mencuvi dengan air dan keringkan.6. Meneteskan larutan gram C, membiarkan selama 30 detik.

7. Mencuci dengan air dan keringkan.8. Menetesi dengan larutan gram D, membiarkan selama 30 detik, mencuci dengan air dan mengeringkan dengan tissue.9. Mengamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASANIV.1 HasilIV.2 PembahasanA. Pengecatan SederhanaPengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya warna Kristal violet. Pada pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat warna yang umunya digunakan yakni yang bersifat alkalin (kromatofornya bermuatan +).B. Pengecatan NegatifPada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak terwarnai serta untuk mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah pengamatan dibawah mikroskop diperoleh preparat mikroba berwarna hitam sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna (berwarna putih) dan berbentuk basil (batang).C. Pengecatan GramPengecatan gram termasuk pengecatan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif. Pada pengecatn ini digunakan 3 jenis bakteri yaitu Bacillus cereus, Salmonella typii dan Eshericia coli.. Pengecatan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Bacillus cereus dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli bersifat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin.Perbedaan gram (+) dan gram (-)Sifat Gram (+) Gram (-)• Komposisi Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi• Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan• Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat• Ketahanan terhadap fisik Lebih tahan Kurang tahan• Kebutuhan Nutrien Kompleks Relatif

BAB VPENUTUPV.1 KesimpulanBerdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :- Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan gram, pengecatan sederhana dan pengecatan negative.- Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna sedangkan pewarnaan negative berguna untuk mewarnai latar belakang preparat dan bakteri sendiri tidak terwarnai.- Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.V.2 SaranSaran untuk laboratorium agar percobaan berikutnya keanekaragaman bakteri yang digunakan dapat bertambah lagi sehingga hasil yang diperoleh dapat bervariasi.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.

Jimmo., 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. diakses pada tanggal 14 April 2009, Makassar.Fauziah., 2008, www.fkugm2008.com/wp-content/uploads/HSC/1- 2x/6/Praktikum6.pdf. diakses pada tangan 04 April 2009, Makassar.Filzahazny., 2008, , http:/wordpress.com/Penganta-tentang-bakteri.htm.di akses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar.Rizki., 2008, http ://ngecat bakterimakul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi- kuliah.html. diakses pada tanggal 04 April 2009, Makassar.Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Yulneriwanti., 2008, http://01-bakteri.html. diakses pada tanggal 08 Maret 2009. Makassar.

http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan[1].

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies[2].

Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru[3].

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai[4].

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina[5].

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya[6].

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah

diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi[7].

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai

lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.4.  Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik[8].

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:1.    Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.2.    Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit  10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

3.    Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.4.    Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.5.    Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.6.    Tidak resisten terhadap gangguan fisik[9].

[1]Filzahazny, “Teknik Pewarnaan Mikrobiologi,” Blog Filzahazy. http:/wordpress.com/ Penganta-tentang-bakteri.htm (05 Desember 2009).

[2]Dwidjosoeputro, Dasar-Dasar Mikrobiologi  (Malang : PT Djambatan, 1989), h. 159.

[3]Hadioetomo, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek (Jakarta : Pt Gramedia, 1990), h. 99. [4]Rizki, “Pengecatan Bakteri,”  Blog Rizki. http ://ngecat bakterimakul-

rizki.blogspot.com/ 2008/02/materi- kuliah.html (05 Desember 2009).

[5]Margareth F. Wheeler, Mikrobiologi Dasar (Jilid I ; Jakarta : Erlangga, 1998), h. 120. [6]Yulneriwanti, “Mikrobiologi Dasar,” Blog Yulneriwanti. http://01-bakteri.html (05

Desember 2009).

[7] Ibid.

[8]Natsir Djide, Analisis Mikrobiologi Farmas, (Makassar : Universitas Hasanuddin, 2008), h. 126.

[9]Jimmo, “Pembuatan Preparat Dan Pengecatannya,” Blog Jimmo. http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht (05 Desember 2009).

http://megabohari.blogspot.com/2011/12/laporan-mikrobiologi-pengecatan.html

Pewarnaan Gram

02:10 Bakteriologi 0 comments

  Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli

histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

1.    Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).

2.   Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ).

3.    Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam.

4.   Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.

Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui

Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas saring.

Perlu kita ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan bakteri tadi, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor, antara lain:

a)    Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough).

b)   Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami sedikit perubahan.

c)    Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll.Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika gentian violet tidak ada.

·        Larutan Standard Gentian Violet.Bubuk (kristal) gentian violet        : 5 gram.Alkohol 95-96%                         : 95 ml.

·        Larutan Pakai. Larutan standard gentian violet     : 10 ml. Karbol (phenol) 5%                     : 90 ml.

·        Larutan Standard Fuchsin.Bubuk (kristal) fuchsin         : 5 gram.Alkohol 95-96%                   : 95 ml.

·        Larutan Pakai. Larutan standard fuchsin      : 10 ml. Aquadest                            : 90 ml.

Bubuk digerus dalam mortir dengan alkohol sedikit demi sedikit, setelah larut masukkan ke dalam botol (untuk gentian violet harus botol yang cokelat atau sawo matang). Genapkan volume alkohol sampai volume yang diperlukan. Biarkan 24 jam baru dapat dipakai. Jika hendak dipakai larutan stam ini harus diencerkan dahulu 10x dan disaring. Filtrat ini dipakai untuk pewarnaan.

·        Larutan Lugol (J-KJ).Jodium kristal                     : 1 gramKalium jodida (KJ)               : 2 gramAquadest                            : 300 ml.Mula-mula Jodium + KJ dalam kira-kira 10 ml aquadest. Sesudah jodium larut, genapkan volumenya menjadi 300 ml. Larutan lugol ini disimpan dalam botol yang sawo matang. Dapat juga kita sediakan larutan lugol dalam 5x atau 10x kuat. Pada waktu pemakaian encerkan dengan aquadest. Bila perlu disaring. Larutan lugol yang dibuat seperti di atas, langsung dipakai tanpa ditipiskan lagi.

A.    Cara pewarnaan Gram :1. Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi)

3x di atas api Bunsen. 2. Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin),

biarkan selama 5 menit.3. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol),

diamkan selama kira-kira 1-3 menit. 4. Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai

warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).5. Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-

penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2 menit.

6. Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif  = ungu. Gram negatif = merah.

B.    VARIASI PEWARNAAN GRAM yang digunakan di Bagian Pathologi Klinik Fakultas Kedokteran dan Rumah Sakit Dr. Cipto Mangunkusumo di Jakarta.

Larutan-larutan zat warna :1.  Carbol Gentian Violet.

Gentian violet 1 gram; Phenol kristal 2 gram; Alkohol 95 % 10 ml dan aquadest ad. 100 ml. Gentian violet digerus dengan alkohol dalam mortir tambahkan phenol dan campur. Kemudian tambah air sedikit demi sedikit dengan mengaduk terus, biarkan 24 jam kemudian disaring.

2.  Larutan Lugol (J-KJ)

Jodium 1 gram, KJ 2 gram dan aquadest 300 ml. Geruslah Jodium bersama KJ hingga homogen, tambah air sedikit demi sedikit, biarkan 24 jam. Saring dan disimpan dalam botol yang cokelat. Larutan ini gunanya sebagai mordant.

3.  Larutan safranin (counter stain).

Safranin 1 gram, alkohol 95% sebanyak 4 ml dan aquadest 360 ml. Geruslah safranin dengan alkohol, tuangkan ke dalam botol, mortir berkali-kali dicuci dengan air, biarkan 24 jam. Saring dan siap untuk digunakan.

Cara pewarnaan :~     Buat sediaan pada objek gelas, rekatkan di atas api Bunsen 3x, tunggu

sampai dingin.~     Pulas dengan karbol gentian violet selama 60 detik.~     Cuci dengan aquadest, bubuhi lugol selama 30 detik.

~   Cuci dengan aquadest, buang zat warna dengan alkohol (decolorisasi) sampai tidak ada lagi warna yang dilepaskan dari sediaan. Boleh juga dicuci lagi dengan aquadest.

~     Pulas dengan larutan safranin (counter stain) kira-kira 30 detik.~      Cuci dengan aquadest, biarkan kering dalam temperatur kamar dan periksa

dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak.Hasil pewarnaan Gram :Bakteri Gram positif   : Biru-ungu (ungu kebiru-biruan).Bakteri Gram negatif   : Merah kekuning-kuningan.

C.    Pewarnaan Gram modifikasi BURKE.(Burke’s modifikation : J. Bact. 7: 159, 1922).

1.    Sediaan sesudah difiksasi 3x di atas api, dituangi dengan larutan 1% gentian violet (crystal violet) dalam alkohol, kemudian segera ditambah dengan larutan Natrium-Bikarbonat 5%, biarkan selama kira-kira 1 menit.

2.   Cuci degan air, bubuhi dengan larutan mordant yaitu larutan lugol ( 1 gram J + 2 gram KJ + 200 ml aquadest), biarkan selama 1 menit.

3.   Segera dicuci dengan air. Bubuhi larutan decolorisasi tetes demi tetes (bahan peluntur) yang terdiri dari : 1 bagian ether + 3 bagian aceton, sampai zat warna utama terlepas atau bahan peluntur tidak berwarna lagi.

4.   Bersihkan dengan air, kemudian bubuhi dengan larutan counter stain (cat penutup) safranin 0,5 % beberapa detik lamanya.

5.   Bersihkan dengan air, keringkan pada temperatur kamar, lihat dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak.Gram positif : biru-ungu.Gram negatif : merah kekuning-kuningan.

Catatan :Sebagai counter-stain dapat juga digunakan karbol fuchsin encer, yaitu Karbol Fuchsin Z. Neelsen 1 ml + 9 ml aquadest (pengenceran 10x). Jika karbol fuchsin ini dipakai waktunya dipersingkat, paling lama 1 menit. Karbol fuchsin encer ini sering digunakan untuk memulas vibrio, waktunya kira-kira 5-10 detik. Vibrio berwarna merah jambu dan bentuk koma. Susunan pulasan karbol fuchsin lihat pada pewarnaan tahan asam.

http://labmikrobiologi.blogspot.com/2012/02/pewarnaan-gram.html

Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)

16:23 Bakteriologi 0 comments

           Beberapa mikroba tertentu tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan

sederhana ataupun Gram, misalnya golongan Mycobacterium, Retinomycites, dll. Hal ini disebabkan sel-sel mikroba diliputi oleh semacam lilin (lipid) dan asam mycolat, sehingga tubuhnya sukar ditembus oleh zat-zat warna. Tetapi dia dapat diwarnai dengan karbolfuchsin panas (sambil dipanasi), ternyata zat warna ini dapat meresap dan diikat oleh tubuh bakteri tersebut. Keistimewaan dari kuman tahan asam ini, zat warna yang telah diikat itu sukar dilepaskan walaupun dilakukan dengan pencucian dengan alkohol-asam, misalnya asam sulfat dan asam chlorida. Oleh karena kuman-kuman seperti itu tahan terhadap pencucian asam-asam mineral, maka disebut kuman tahan asam. Kuman-kuman yang tahan asam ialah:

1. Mycobacterium tuberculose ( bakteri tbc).2. Mycrobacterium leprae (basil Hansen).3. Golongan saprophyt (apathogen).4. Bakteri S*#@?!. S*#@?! Walaupun tahan asam tetapi zat warna yang

diikat luntur oleh pencucian decolorisasi (alkohol-asam).

I.    Cara ZIEHL NEELSEN.Larutan-larutan yang diperlukan :

A.  Carbol-fuchsin : Basic fuchsin          : 1 gram.                          Alkohol 95%           : 10 ml.                          Phenol 5% dlm air   :100 ml.Mula-mula fuchsin dilarutkan dalam alkohol (gerus dalam mortir), kemudian tambah phenol, biarkan 24 jam, saring.    

B.   Alkohol-asam, yaitu 3-5 ml asam chlorida pekat dalam alkohol 95% sampai 100 ml.

C.   Methylen biru biasa, sebagai counter stain. Methylen biru : 1 gram. Aquadest       : 100 ml. Dapat juga digunakan methylen biru menurut Loffler. Caranya :

1.    Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian disiram dengan carbol-fuchsin.

2.   Panasilah sediaan itu dengan hati-hati sampai kelihatan uap tetapi jangan sampai mendidih, biarkan menguap kira-kira 3-5 menit.

3.   Cuci dengan aquadest kemudian warna carbol-fuchsin dibuang dengan decolorisasi HCl-alkohol.

4.   Pencucian selesai bila air cucian tidak berwarna merah lagi, cuci lagi dengan aquadest.

5.   Warnai dengan counter stain methylen biru, biarkan kira-kira 2-3 menit. (Loffler m. blue 20-30 det).

6.   Cuci dengan air, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop. Hasil pewarnaan:Bakteri tahan asam  : merah.Tidak tahan asam    : biru.

II.    Cara KINYOUN. (Am. J. Pub. Health th 5: 867, 1915).A.    Larutan Carbol-fuchsin menurut Kinyoun : Basic fuchsin 4 gram, alkohol 95%

20 ml, phenol 8 gram, dan aquadest 100 ml. Fuchsin digerus dalam mortir dengan alkohol sampai larut. Cucilah berkali-kali mortir itu dengan air dan pindahkan ke dalam botol. Panasilah phenol di atas penangas air 56°C sampai mencair dan tambahkanlah phenol itu ke larutan tadi. Biarkan 24 jam, kemudian disaring dan siap untuk dipakai.

B.    Decolorisasi : HCl 3-5% atau Asam-sulfat 5%.C.    Counter stain : Methylen biru 1% dalam air.

Caranya :1.    Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian fiksasi di atas api. 2.    Tuangi dengan larutan Kinyoun, biarkan 3-5 menit. 3.    Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit.4.    Tetesi dengan asam-sulfat 5%, biarkan : ½ menit. 5.    Bubuhi dengan alkohol 70%, biarkan : ½ menit.6.    Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit. 7.    Warnai dengan methylen biru, biarkan : 1 menit. 8.   Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.

Cara Kinyoun tidak perlu dipanasi.9.   Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah. Tidak tahan asam    : biru.

III.   Cara GOBBET.1.    Buat preparat, keringkan dan fiksasi di atas api, kemudian tuangi dengan

basic-fuchsin yang terdiri dari : basic fuchsin 0,9 gram, alkohol 95% 10 ml, phenol 5% 90ml, panasi sampai keluar uap dan biarkan selama 3-5 menit.

2.     Bersihkan dengan air kran mengalir pelan-pelan ½ menit. 3.     Celupkan ke dalam larutan Gobbet selama 1 menit. Larutan Gobbet terdiri

dari : Methylen biru 1 gram, asam-sulfat 96% 20 ml, alkohol absolut 30 ml dan aquadest 50 ml.

4.     Bilasi dengan air kran, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop. 5.     Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah. Tidak tahan asam    : biru.

IV.    Cara TAN THIAM HOK.Cara ini merupakan kombinasi dari Kinyoun dan Gabbet.

1.    Sediaan sesudah difiksasi di atas api, celupkan ke dalam larutan Kinyoun selama 3 menit.

2.    Cuci dengan air kran selama ½ menit. 3.    Celupkan lagi dalam larutan Gabbet selama 1 menit. 4.    Bilasi dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar dan dilihat

dengan mikroskop. 5.     Hasil pewarnaan:

Basil tahan asam : merah.Tidak tahan asam : biru muda.http://labmikrobiologi.blogspot.com/2012/02/pewarnaan-bakteri-tahan-asam-bta.html