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MTODOS DE ESTUDIO EN
BIOLOGA CELULAR
Profesora Carla Maturana Valdivia
BIOLOGA CELULAR - CLASE 05
Identifica mtodos de estudio de las
clulas y sus fundamentos.
Microscopia ptica: Partes de un
microscopio ptico, sistema ptico y
mecnico.
Microscopa electrnica de transmisin
y barrido.
Cultivo celular y/o de tejidos.
Centrifugacin fraccionada y en
gradiente.
Electroforesis de DNA y protenas.
Microscopio
Instrumento que permite la observacin de objetos, organismos,
tejidos o clulas de un tamao inferior al que se puede reconocer a
simple vista por el ojo humano.
Tipos de microscopios
Microscopios pticos
De Campo Claro
De Campo Oscuro
De Contraste de Fases
De Interferencia
De Luz Polarizada
De Fluorescencia
Lser Confocal
Microscopio Electrnico
De Transmisin
De Barrido
Microscopio ptico
Instrumento que permite aumentar la imagen utilizando uno o ms
lentes.
Dos principios estn involucrados en el uso del microscopio:
la magnificacin (capacidad de aumentar el tamao de una
imagen) y la resolucin (capacidad de producir imgenes bien
definidas de puntos situados muy cerca uno del otro).
Se pueden utilizar aceites de alta viscosidad para aumentar el
ndice de refraccin (en comparacin con la refraccin del aire = 1) y mejor la resolucin de la imagen formada.
Ventajas:
Permite el estudio de microorganismos vivos.
Limitantes:
Poder de resolucin (debido a que existe un lmite de resolucin
correspondiente a 0,2 micrmetros.
Microscopio ptico: Simple y Compuesto
Microscopio de
Zaccarias y Hans
Jenssen (1595)
Aumento: 9x
Microscopio de van
Leeuwenhoek
(1668)
Aumento: 275x
Microscopio
de Hooke
(1665)
Aumento: 30x
Microscopio
de Gallileo Galilei
(1609)
Aumento: 8x
Giovanni Faber adoptado el trmino microscopio para describir la invencin de Galileo en (1625)
Componentes del Microscopio ptico
Partes del Microscopio ptico
Tubo
Revlver
Sistema ptico del microscopio
Sistema de Amplificacin
Lente ocular
Lentes objetivos
Sistema de Iluminacin
Fuente Luminosa
Condensador
Diafragma
Anillo Porta Filtro
Sistema mecnico del microscopio
Tubo o caon
Revlver
Columna o brazo
Pie
Platina
Tornillos de focalizacin:
Macromtrico
Micromtrico
Tipos de microscopios pticos
Microscopio de Campo Claro: la muestra se
observa ms oscura que el campo que la
rodea.
Microscopio de Campo Oscuro: se bloquea la
luz que no atraviesa por la muestra y solo
atraviesan los haces de luz refractados y
alcanzan al lente objetivo (La muestra aparece
iluminada en un fondo oscuro).
Tipos de microscopios pticos
Microscopio de Contraste de Fases: utiliza
las diferencias de densidad de las
estructuras celulares (diferente ndice de
reaccin). Las estructuras ms densas se
observan ms oscuras mientras que las
menos densas (densidad cercana al agua) se
observan ms claras.
Microscopio Diferencial de Contraste de
Interferencia de Nomarski (DIC): utiliza un
prisma refrigente que divide la luz en dos
rayos polarizados que interfieren entre s
proporcional una imagen tridimensional.
Tipos de microscopios pticos
Microscopio de Fluorescencia: se utilizan sustancias
fluorescentes llamadas fluorocromos para teir ciertas
estructuras subcelulares de inters. El microscopio posee una
lmpara que que emiten las radiaciones en el espectro UV de las longitudes de onda necesarias para que el compuesto
brille en la oscuridad (fluoresca).
_
Tipos de microscopios pticos
Microscopio Lser Confocal: Emplea un sistema de iluminacin con
rayo lser que es muy convergente y, en consecuencia produce un
punto de barrido muy poco profundo, iluminando un solo punto por
vez.
Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con
este rayo mvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolucin.
Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definicin mxima a la imagen. Es posible
tambin crear imgenes mltiples a diferentes profundidades dentro
del espcimen y realizar reconstrucciones tridimensionales. _
Microscopio electrnico
Microscopio que usa electrones para iluminar el objeto que se
desea observar y lo refleja en una pantalla fluorescente,
obtenindose imgenes ms amplificadas que en un microscopio
convencional.
Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual
debe mantenerse el vaco.
Ventajas:
La resolucin y el aumento son mayores.
Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente
pueden verse a travs del microscopio electrnico.
Limitaciones:
No se pueden observar microorganismos vivos.
Microscopio Electrnico de Transmisin
(MET)
Es un instrumento que aprovecha los fenmenos fsico-atmicos que se
producen cuando un haz de electrones suficientemente acelerado colisiona
con una muestra delgada convenientemente preparada (requiere que se
aumente el contraste utilizando metales pesados como el osmio).
Cuando los electrones colisionan con la muestra, en funcin de su grosor y
del tipo de tomos que la forman, parte de ellos son dispersados selectivamente, es decir, hay una gradacin entre los electrones que la
atraviesan directamente y los que son totalmente desviados.
Se obtienen imgenes bidimensionales.
Se pueden observar detalles finos de estructuras subcelulares.
Componentes del Microscopio
electrnico de Transmisin
Ocular o lente electromagntica,
que aumenta la imagen.
Proyector o lente proyectora que
ampla la imagen.
Pantalla fluorescente, que recoge
la imagen para hacerla visible al
ojo humano.
Un filamento de tungsteno (ctodo) que emite electrones.
Condensador o lente electromagntica, que concentra el haz de electrones.
Objetivo o lente electromagntica, que ampla el cono de proyeccin del haz de luz.
Microscopio Electrnico de Barrido
(MEB o SEM)
Su funcionamiento se basa en el recorrido de la muestra con un haz muy
concentrado de electrones.
Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la
aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los
secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico
situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pixel en la pantalla. A medida que el haz de electrones
barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor.
No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo
con un SEM si no que puede colocarse en
el microscopio con muy pocos preparativos.
Produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie
del objeto.
Microscopio Electrnico de Barrido
(MEB o SEM)
Funcionamiento de los diferentes Microscopios
Cultivo celular
Conjunto de tcnicas de aislamiento y obtencin de clulas, con la
obtencin de poblaciones celulares in vitro manteniendo al mximo
sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas.
Cultivo celular
Aplicaciones:
Estudios de Investigacin:
Comprender la fisiologa celular, toxicologa y
virologa.
Ingeniera de Tejidos:
Trasplantes
Injertos (piel, hueso, cartlagos, piel, etc)
Cultivo celular
Aplicaciones:
Produccin de compuestos qumicos de importancia:
Enzimas
Vacunas
Hormonas
Citogentica:
Estudios cromosmicos
Agronoma:
Transgnicos
Organismos genticamente modificados
Cultivo tisular
Cultivo de rganos:
mantenimiento de rganos o
parte de rganos in vitro
Cultivo de tejidos y explantes:
Mantenimiento de tejidos in vitro
Cultivo de clulas madres
Centrifugacin
Tcnica que permita la separacin de slidos de lquidos
a partir de la densidad que posean, utilizando la fuerza
giratoria (centrifuga).
Se puede utilizar como una tcnica de tipo:
Preparativo: Se utiliza para aislar partculas para su
aprovechamiento posterior.
Analtico: permite determinar propiedades fsicas como la
velocidad de sedimentacin o el peso molecular.
Centrifugacin fraccionada
Se utiliza para separar partculas segn la velocidad de sedimentacin
(centrifugacin diferencial).
Centrifugacin en gradiente
Se obtienen partculas que se distribuyen en
fracciones de diferentes densidades de un
fluido lquido.
Puede ser de dos tipos:
Centrifugacin zona: Separacin debido a la
masa.
Centrifugacin isopcnica: Separacin
debido la densidad.
Centrifugacin en gradiente
Mtodo de separacin de molculas con
carga elctrica que se desplazan al
exponerse a un campo
electromagntico.
La migracin de produce desde el nodo
(-) al ctodo (+) y depende del pH del
medio(buffer).
Electroforesis
El desplazamiento de las muestras en el medio (movilidad
electrofortica), est determinada por:
La carga de la molcula.
Tamao y forma
Aplicaciones de la electroforesis :
Determinacin de la masa molecular de protenas (kDa) y de ADN (pb),
Determinacin del punto isoelctrico de las protenas.
Diferenciacin de isoenzimas.
Diseo de mapas de restriccin.
Secuenciacin de ADN.
Friccin (porosidad del soporte)
Velocidad del desplazamiento
Potencial elctrico
Electroforesis
Cubetas de Electroforesis, electrodos
y peine
Marcador Micropipetas
Escalera Revelador
Fuente de voltaje
Tampn
Electroforesis: Componentes
Medios de alta porosidad Medios de baja porosidad
Papel
Acetato de celulosa
Gel de almidn
Gel de agarosa
Gel de poliacrilamida
Gel de agarosa+poliacrilamida
Separacin principalmente
por carga
Separacin por carga, tamao y forma
Naturaleza y disposicin
Macromolculas Soporte
Geles
cidos Nucleicos
Agarosa (horizontal)
Protenas Poliacrilamida
(vertical)
Medios de Soporte
Naturaleza Compuesto intercalante
Reveladores
ADN
Bromuro de Etidio
GelRed
Protenas Azul de
Coomasie
Necesitan instrumento
revelador UV
Transluminador UV
Reveladores
Electroforesis de ADN
Electroforesis de Protenas
Cromatografa
Mtodo fsico-qumico de separacin de componentes estrechamente
relacionados en mezclas complejas.
Existen distintos tipos de mtodos cromatogrficos.
Algunas de las ventajas que poseen las tcnicas cromatogrficas son:
Rapidez
Simplicidad
Moderado coste que poseen (dependiendo del tipo de tcnica),
Una gran aplicacin como mtodo de separacin
Permite proporcionar tambin resultados cuantitativos de los compuestos ya
separadas.
Cromatografa: Componentes
Fase mvil (FM) La muestra se disuelve en ella para permitir la separacin.
Normalmente est formada por un gas, o un lquido.
Fase estacionaria (FE) Es inmiscible.
La cual se mantiene fija en un soporte que puede ser una columna o
en una superficie slida.
Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la
muestra, se distribuyen de forma distinta entre ambas.
Anlisis
Cuantitativos
Anlisis
Cualitativos
Afinidad con Fase Mvil
Afinidad con Fase
Estacionaria
Cromatografa: Revelada
Tipos de Cromatografa: Plana
Tipos de Cromatografa: En columna