Métodos de separación celular

8/12/2019 Métodos de separación celular

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MÉTODOS DE SEPARACIÓN

CELULAR Lic. Masyelly Rojas

Tutor: Msc. Luisa Barboza

ULA – IDIC



La obtención de muestras celulares adecuadas

requiere varios procedimientos de separación,fraccionamiento y caracterización, basados

normalmente en las propiedades de cada tipo celular

existente en la muestra. Su elección depende de

muchos factores: muestra de partida, grado de

separación deseado, conservación de la viabilidad,

operaciones y técnicas a aplicar posteriormente



Métodos Físicos de separación

Métodos basados en anticuerpos

Métodos magnéticos

Citometría de flujo




Principios físicos del método

• Sedimentación por gravedad

• Ecuaciones para el movimiento unidimensional departículas a través de un fluido

• Centrifugación

• Velocidad de sedimentación

• Coeficiente de sedimentación




A.- Sedimentación por gravedad

Se produce Sedimentación porgravedad si la densidad de lapartícula (ρ) es mayor que ladensidad del disolvente (ρo).

Ley de Hidrostática:

Cuando se sumerge un cuerpo enun fluido, el cuerpo experimentauna fuerza E (empuje) de sentidoopuesto al Peso (P), que tieneigual valor que el peso del líquidoque ha desplazado.

Las partículas en disolución pueden sufrir alteración espacial, es decir, puedencambiar de posición con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusión o bien a procesos de sedimentación.

P = mg; P = ρgV

E = mg; E = ρogVFR = f Vs

Fuerza Total = FT = P - E = (ρ - ρ

o )gV

Por lo tanto, para que hayasedimentación por gravedad, debe

cumplirse que ρ > ρo

F r

P

E

E : Empuje hidrostático

F r : Fuerza de roce viscosa

P : Peso



B.- Ecuaciones para el movimiento unidimensional de partículas a través de un fluido.


La velocidad a la que sedimenta una célula (o una partícula) viene definida por la Leyde Stokes. Se suele considerar que las partículas a aislar en Biología son esferas;cuando éstas se encuentran en un campo gravitacional y alcanzan una velocidadconstante, la fuerza neta sobre cada esfera es igual a la fuerza de resistencia queopone el líquido a su movimiento•

La velocidad de sedimentación es proporcional a la densidad de la partícula y a la delmedio,•La velocidad de sedimentación es nula cuando ambas densidades se igualan•La velocidad de sedimentación disminuye al aumentar la viscosidad del medio, y•La velocidad de sedimentación aumenta al aumentar el campo de fuerza



Las velocidades de sedimentación que se dan en condiciones naturales son muy bajas.

A veces interesa incrementar esa velocidad de sedimentación, para lo que se utiliza latécnica de la CENTRIFUGACIÓN.


C.- Centrifugación.

La centrifugación es unatécnica de separación departículas que se basa

en la distinta velocidadde desplazamiento delas partículas en unmedio líquido al sersometidas a un campocentrífugo.



Fuerzas que actúan sobre la partícula:

Peso (P) y Fuerza centrífuga (Fc) debido al giro que experimenta.

La suma de estas dos fuerzas da como resultante otra fuerza denominada Peso Efectivo (PE ): es la fuerzaque realmente produce la sedimentación, la que lleva la partícula al fondo del tubo:

PE = P + Fc = m (g + ac ) PE = m gE (gE gravedad efectiva)

Módulo de la gE | gE | = √ g2 + ac2 ac = w 2 r

w = velocidad angular = dα / dt y α = ángulo respecto al eje de giro

En la centrifugación: gE = √ g2 + (w 2 r) 2

Si g <<<< w2 r se puede despreciar el término más pequeño gE =w2 r

Empuje efectivo (Ee): Ee = ρo gE V = (ρo / ρ ) m gE

Fuerza de resistencia al avance (Fd)= Peso efectivo (PE ) – Empuje efectivo (Ee)=

Vs = m gE (1 - ρo / ρ) / f




Velocidad de sedimentación Vs:

- Proporcional a la masa de la partícula. Esta propiedad es la que permiteseparar partículas con diferente masa. Cuanto mayor sea la masa de la partículamayor es la velocidad de sedimentación.

- gE es el término que provoca la sedimentación forzada. Para sedimentar

antes se puede aumentar la velocidad angular (w ). En esto se basan lasULTRACENTRÍFUGAS que permiten separar partículas de muy similar masa debido alas altas velocidades a las que trabajan.

- El resto de términos no se pueden modificar.

Coeficiente de sedimentación: s = Vs / r w 2 Unidades de tiempo (segundos), perosiempre tiene un valor muy bajo, por lo para medir el coeficiente de sedimentaciónse usa otra unidad: el Svedber (1 Svedber (S) = 10 -13 segundos ).

Vs = m gE (1 - ρo / ρ) / f







Centrífuga Las centrífugas son instrumentos quepermiten someter a las muestras aintensas fuerzas que producen la

sedimentación en poco tiempo de laspartículas que tienen una densidad mayorque la del medio que las rodea.• Centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g),• Super-centrífugas (o centrífugas de altavelocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y• Ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g)

En las centrífugas se suele controlar latemperatura de la cámara para evitarsobrecalentamiento de las muestras

debido a la fricción

En las ultracentrífugas, la velocidadextrema (más de 100000 rpm), hace quesea necesario hacer un intenso vacio en lacámara de la centrífuga para evitar el

calentamiento de rotor y muestra.




Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podrá centrifugar lamuestra. Son especialmente importantes el ángulo de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la

velocidad máxima de giro. La relación entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto(rpm) y la fuerza de aceleración (fuerza centrífuga relativa, RCF : relative centrifuge force) a que sesomete la muestra (g) se recoge en la expresión siguiente :

RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2


CENTRIFUGA DE LABORATORIO

Pequeño tamaño.Velocidad: 5000 rpm máximo.Sin sistemas auxiliares.Útil para partículas grandes(células, precipitados de salesinsolubles).

MICROFUGAS

Velocidad: más de 10000 rpm.

Tubos cortos.Sin sistemas auxiliares.Volúmenes muy pequeños.Útiles en Biología Molecular.

CENTRIFUGA DE ALTA VELOCIDAD

Velocidad: 18000 - 25000 rpm.Sistemas auxiliares: sistemas de refrigeración,algunas con sistema de vacío.Útiles en la separación de fracciones celulares.Insuficientes para la separación de ribosomas,virus o macromoléculas.

ULTRACENTRIFUGA

Velocidad: a partir de 50000 rpm.Sistemas auxiliares: sistemas de refrigeración, sistemasde alto vacío.

Analíticas: obtención de datos precisos de propiedadesde sedimentación (S, PM).Preparativas: aislamiento de partículas de bajo S

(microsomas, virus, macromoléculas).



Centrifugacióndiferencial




Centrifugación en gradiente de densidad


El método de gradiente de densidad implica lautilización de un soporte fluido, cuya densidadaumenta desde la zona superior a la inferior. El

gradiente se consigue con un solutopreferiblemente de baja masa molecular en unsolvente en el que la muestra a analizar pueda sersuspendida. La muestra se sitúa en la parte superiordel gradiente como una fina banda. La separaciónde los componentes de la muestra se presenta como

diferentes bandas o zonas



La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente dedensidad preformado. Bajo fuerza centrífuga las partículas comenzarán asedimentar a través del gradiente, moviéndose cada partícula adiferentes velocidades dependiendo de su masa.

Centrifugación zonal





Centrifugación de equilibrio en gradiente o

isopícnica

Mientras en la centrifugación zonal la densidad del gradiente nodebe exceder a la de las partículas a separar, en la centrifugación deequilibrio en gradiente la condición fundamental es que la densidad

máxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de

las partículas

La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especiessedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan unpunto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cualtambién se le llama centrifugación isopícnica



Centrifugaciónzonal

Centrifugaciónisopícnica

Colocación de la

muestra

Parte superior de un

gradiente dedensidad preformado

La muestra se

disuelve en unasolución isocrática

Separación enfunción de

Masa de la partícula Densidad de la

partícula




1.04

1.05

1.06

1.07

1.08

1.09

1.101.11

1.12

Densidad

(g/ml) Eritrocitos

Neutrófilo

MonocitoLinfocito

Basófilo

Eosinófilo






Gradientes de densidad


Sacarosa. La sacarosa ha sido un disacárido ampliamente empleado en la separación ypurificación de materiales biológicos mediante centrifugación zonal. Sin embargopresenta una alta viscosidad, lo que no le permite alcanzar grandes densidades. La

molécula es además osmóticamente activa, por lo que no es la más adecuada para aislarcélulas o componentes celulares.

Ficoll. Se trata de un polisacárido sintético de alto peso molecular (400 kDa). Presentaun alto contenido en grupos hidroxilo por lo que tiene una buena solubilidad en mediosacuosos. Además no presenta grupos ionizables que puedan servir de unión a lasmuestras. Es estable a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin degradarse.Su viscosidad es menor que la de la sacarosa.




Obtención de células mononucleares de sangre periférica por gradiente de Ficoll - Hypaque

Diatrizoato de sodium



Percoll. Se trata de una suspensión de partículas (5.15 nm) de ácido silícico revestidas

de un derivado de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que presenta baja viscosidad adensidades altas, no afecta prácticamente a la presión osmótica del medio y es establea pH comprendidos entre 5 y 10. Es soluble en solución acuosa y estable en ellassiempre que no haya aniones bivalentes (sulfato), especialmente a bajos pH

Derivados iodados del ácido benzoico. Son biológicamente inertes. Pueden seriónicos (metrizoato) o neutros (metrizamida y Nycodenz). Presentan una densidadmáxima de 1.4 g/cm3, una gran estabilidad y fácil formación. Son útiles para laseparación de estructuras sensibles a la fuerza iónica

Sales de metales alcalinos pesados: cesio y rubidio. Presentan una elevada fuerzaiónica, lo que hace que sean útiles para la separación de macromoléculas resistentes ala fuerza iónica (como ácidos nucleicos).




Separación de monocitos provenientes de Ficoll-Hypaque

• Adherencia: A superficie de vidrio o plástico (menor % de recuperación, buen %

de pureza)

• Gradiente de Percoll (40-50 %): Buena recuperación y pureza mayor al 90 %

Percoll

Percoll

Percoll

Buffer de extracción Restos celulares y algunas plaquetas

Plaquetas y pocos monocitos

Monocitos

Linfocitos y glóbulos rojos




Purificación de polimorfonucleares provenientes

de Ficoll-Hypaque

• Por sedimentación sobre dextran 6 %

PMN + GR *

GR

Dextran

PMN + GR + SF

* Los GR se lisan con agua destilada por 1 minuto y luego se lleva a isotonicidad

Agitación por inversión ysedimentación por 30 min.




Gradientes l ineales (cont inu os y

d iscont inuos)


Son aquellos en los que la

densidad aumenta linealmentecon el incremento en la distanciadesde el centro de rotación

Los gradientes continuos pueden serhechos a partir de gradientes

discontinuos, de tal manera que loslímites de forma entre las capascomienzan a desaparecer en la medidaque los solutos difunden, así lasdiscontinuidades comienzan alinearizarse y en un tiempo suficiente la

densidad se volverá completamenteuniforme




Elutriación centrifuga



Métodos basados en anticuerposy Métodos Magnéticos






Selección

positiva

Selecciónnegativa


























Caracterización celular y medidas de viabilidad

Ensayos de exclusión

El Naranja de acridina entralibremente en todas lascélulas.Emite una fluorescencia dedistinto color:• Verde: unido a ADN doblehebra

• Tonos de amarillo a naranja:cuando el ADN estaparcialmente desnaturalizado

• Roja: con ADN de cadenasencilla, es decir, totalmentedesnaturalizado

El Yoduro de propidio es excluido de

las células intactas entrando solo enlas dañadas, emite una fluorescenciaintensa de color rojo



http://www.jove.com/index/details.stp?ID=326



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