Microbe cultivation

Microbes cultivation in industrial scale and its factorsGroup one

R. YUVITA RAKHMAN, VIA NUR FADILAH, TRI WIJAYANTI IRMA S.VITA1INTRODUCTIONSProduction of antibiotics, alcohols, vinegar, amino acids, vitamins, therapeutic antibodies, acetone and other solvents, and recombinant proteins is accomplished by the large-scale cultivation of microbial cells such as bacteria, algae, yeast, and fungus on industrial scale.

In all these industrial applications the metabolic activities or the biochemical pathways are used for the production of specific chemicals with the consumption of the substrates or a carbon source such as sucrose. Here, the microbial culture acts as a factory, where the substrate is the raw material

VITA2The composition of the medium used for cultivation of microorganisms is directly reflected in their physiological phenotype and their fermentation performance, which in turn affects the results of strain analyses and strain performance in industrial applications.For this reason, the successful development of strains for large scale industrial production of heterologous proteins and low-value fuels, chemicals and materials merits the composition of cultivation media in various steps of strain development to be reconsidered.

Persyaratan Media / suplemen untuk produksi protein heterolog

Ekspresi protein merupakan strategi yang melekat teknik metabolik, apakah itu dilakukan untuk produksi protein itu sendiri atau untuk mengarahkan jalur metabolisme. Itu awal mengamati bahwa tingkat tinggi ekspresi protein dipengaruhi fisiologi sel dari kedua mikroorganisme prokariotik dan eukariotik. Efek yang paling menonjol berkurang pertumbuhan sel. Fenomena ini dinamakan "metabolisme" dan kemudian "protein" beban sejak diskriminasi dari pengaruh aktivitas katalitik dari protein. Besarnya dan penyebab beban protein diperkirakan dengan membandingkan strain rekombinan S. cerevisiae mengungkapkan T. reesei -1, 4-xilanase dikodekan oleh gen XYN2 [85]. Kedua pengenalan promotor glikolitik tanpa gen struktural, dan gen struktural itu sendiri, dilakukan beban metabolik pada host. Penurunan tingkat pertumbuhan maksimum tertentu, hasil biomassa dan tingkat konsumsi glukosa tertentu yang jauh lebih besar dari yang diharapkan dari jumlah protein heterolog yang dihasilkan [85]. Ketika media budidaya dilengkapi dengan campuran yang seimbang dari asam amino yang disukai (Ala, Arg, Asn, Glu, Gln dan Gly) atau suksinat, efek metabolik merugikan bisa sebagian lega [38]. Asam amino meningkatkan pertumbuhan sel dan produksi protein heterolog, yang mendukung pengamatan bahwa ragi rekombinan mengekspresikan protein heterolog mengalami penipisan asam amino dan prekursor biosintesis [88]3Microbial culture techniqueA chemical reaction requires an appropriate temperature, pressure, pH, and solvent system for maximum product output. The microbial system also has to be provided with the optimum environmental and nutritional conditions such as temperature, pH, and the correct substrate for converting it into the product. The efficiency of microbial conversion of substrate into product is comparatively less because a major part of the metabolic energy is utilized for the generation of biomass by cell growth and multiplication.The chemical environment of a microbial cell is its nutritional conditions in which it is growing. It also includes the correct pH and temperature.

VITA If we want to produce a specific quantity of the product over a period of time it is possible to calculate the number of bacterial or microbial cells required to operate the bioprocess on an industrial scale.

4Nutrients for Microbial Culture

Like any other living system, microorganisms also require a source of energy, carbon, nitrogen, oxygen, iron and other minerals, micronutrients, and water for growth, and multiplication. All these nutrients that are essential for microbial organisms are supplied in the form of nutrient media. For laboratory-scale cultivation we may use certain costly media components, but for industrial purposes they should be economical and readily available.But in large-scale microbial cultivation for industrial purposes, the pH and the dissolved salts present should be considered when formulating the media requirements and its concentrationA cultivation medium is designed to reflect the elemental composition and the biosynthetic capacity of a given microbial cell (see e.g. [11]). While the elemental composition of microbial cells is relatively similar, their biosynthetic capacity Furthermore, economic constraints make the large-scale production of low-cost products reliant on cheap sources of carbon and nitrogen, such as molasses from the sugar industry, corn steep liquor from the starch industry, spent sulphite liquor from the forest products industry and cheese whey from the dairy industry [14,15]. In addition to providing carbon, nitrogen, vitamins and trace elements necessary for cell growth and metabolite production, such industrial media may also contain substances which inhibit growth and metabolite production

5Metabolic engineering, evolutionary engineering and systems biology in strain development

Several studies have pointed out that the cultivation conditions and media composition used for the analysis of engineered strains strongly influence the data generated Finally, genetic engineering approaches to overcome industrial media constraints are also exemplified.

Strain dengan ciri-ciri baru sekarang juga dikembangkan oleh teknologi ilmu kehidupan termasuk rekayasa genetika dan metabolisme (Gambar 2). Dalam beberapa tahun terakhir konsep rekayasa ini telah diperluas dalam konteks sistem biologi untuk juga mencakup informasi dan teknologi ilmu sistem .Dalam rekayasa metabolik, sel iteratif dianalisis, dirancang dan disintesis (Gambar 2) dengan menggunakan alat molekul seperti teknologi rekombinan DNA dan informasi genomik. Rekayasa evolusi (Gambar 1) bergantung pada hati-hati dirancang protokol seleksi, i. e. media dan kondisi budidaya untuk pengembangan strain dengan karakteristik industri yang menarik. Metabolisme dan rekayasa evolusi teknologi juga dapat digabungkan untuk menghasilkan sifat-sifat baru. Banyaknya data yang dihasilkan dalam analisis genom, transcriptome, proteoma dan metabolome memerlukan penggunaan informasi dan ilmu sistem teknologi untuk menerjemahkan data ini ke dalam strategi desain untuk putaran berikutnya metabolisme dan rekayasa evolusi

Karena data tersebut menjadi dasar bagi strategi desain untuk putaran berikut pembangunan strain , jelas bahwa pilihan media budidaya adalah bagian mendasar dan integral dari pembangunan strain6Principle of Evolutionary engineering

Traditionally, novel production strains have been developed by mutagenesis, breeding, and the lately revived concept of evolutionary engineering

VITA7Media and strain stability

The typical industrial production strain is genetically undefined and adapted to perform in rather poor, toxic, viscous, and nutrient-limited media. Once desired traits have been established in recombinant laboratory strains, the strains are either directly transferred to the industrial production environment or as occurs much more frequently a potential production strain has to undergo a new round of metabolic engineering procedures.The genetic stability of strains is an absolute requirement for utilization in industrial processesVITAKarena sifat adaptif mikroorganisme , perhatian juga harus diarahkan pada stabilitas sifat apapun baru dalam strain rekombinan atau mutan . Dalam industri , media kaya atau tidak terdefinisi sering digunakan , yang dapat mengakibatkan kerugian yang tidak terduga dari plasmid dan bahkan modifikasi kromosom . Budidaya berkepanjangan , misalnya dalam fermentasi kontinyu set- up , meningkatkan kemungkinan ketidakstabilan genetik merugikan . Bahkan di media mineral , kehilangan plasmid dengan spidol auksotrofik telah dilaporkan dalam budaya terus menerus berkepanjangan [ 40 ] . Hal ini disebabkan oleh asam amino yang dilepaskan dari sel-sel mati , dan mungkin juga oleh kromosom penyisipan spontan gen penanda8Pengertian Kultivasi Upaya pemeliharaan bagi pertumbuhan mikroba. Untuk berhasilnya kultivasi mikroba diperlukan teknik aseptik, medium serta lingkungan fisik yang sesuaiKultur sel

Kultur secara mikroKultur secara makroMikroba = kelompok jasad hidup berukuran kecil dengan kisaran ukuran sel sekitar 0,1 10 mVIA9Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap kultur selMedium kultur yang meliputi: temperature, pHc. Komposisi mediumd. dissolved oxygen tension (DOT)VIA10STUDY CASE

For example, it was found that a strain of the lactic acid bacterium Streptococcus thermophilus engineered for enhanced exopolysaccharide production a trait highly desirable in yoghurt production failed to express the phenotype in milk without the addition of an extra nitrogen source. Similarly, a genetically modified strain of the yeast Saccharomyces cerevisiae, which had been communicated as the ultimate solution to the fermentation of lignocellulose derived xylose [6,7], was found to require yeast extract, additional hexose sugar and oxygenation to efficiently ferment the xylose fraction in spent sulphite liquor [8]. Furthermore, heterologous protein production in yeast is strongly influenced by the nitrogen-composition of the production medium. Thus the final industrial environment must be considered throughout the strain development process to avoid unfounded expectation and more importantly to prevent costly investment into premature production facilities.

VIA11Mikroorganisme Yang Cocok Untuk Proses IndustryMampu tumbuh dengan cepat.Menghasilkan produk yang banyak dalam suatu periode singkat.Unggul, Sifat unggul yang ada harus dapat dipertahankan untuk menghasilkan dan mempertinggi produk yang diharapkan.Stabil, Pada kondisi yang diberikan, mikrobia harus mempunyai sifat-sifat yang tetap, tidak mengalami perubahan karena mutasi atau lingkungan.Bukan pathogen.

VIA12Sifat penting lain yang harus dimiliki mikroorganisme industri

Tidak berbahaya bagi manusia, dan secara ekonomik produknya penting bagi hewan dan tumbuhan. Harus non-patogen dan bebas toksin, atau jika menghasilkan toksin, harus cepat di-inaktifkan. Mudah dipindahkan dari medium biakan. Mikroorganisme industri harus dapat direkayasa secara genetik. Memilki karakteristik genetik yang stabil.

VIA13TEKNIK DASAR KULTUR MIKROBA

Dapat ditumbuhkan dalam medium padat (misal: tempe, tape, oncom, jamur konsumsi) dan medium cair (misal: untuk menghasilkan antibiotik, etanol, asam asam amino, nata de coco).Berdasarkan komposisi medium untuk menumbuhkan mikroba: -medium lengkap-medium minimal

VIA14Types of Microbial Cultures

The culturing of the microbial system can be achieved in different ways. The type of culture method sometimes depends on the type of the microbial system or on the type of the product that we expect. For example, one can get two entirely different products from the same organism by changing the nutritional and other parameters or even culturing vessels.

VIA151. KULTUR BATCH (sekali panen)Mikroba ditumbuhkan dalam medium sampai mencapai fase pertumbuhan maksimal kemudian dipanen produknya (sel/biomassa atau produk metabolitnya).This is a small-scale laboratory experiment in which a microbial culture is growing in a small volume flask. In batch cultures, the nutrients are not renewed and the exponential growth of cells is limited to a few generations.

TEKNIK KULTIVASI MIKROBA

Kurva pertumbuhan mikroba dalam kultur tertutup (batch culture)VIA16Aplikasi Kultur Batch Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekunder Untuk produksi biomassa digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai maksimal Untuk prodiksi metabolit primer kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesis produk Untuk produksi metabolit sekunder kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase stasionerVIA17Types of Microbial Cultures2. Fed-batch culture. This method is specially suited for cultures in which a high concentration of substrate is inhibitory to cell multiplication and biomass formation. In such situations the substrate can be fed at low concentrations to achieve cell growth. This method can easily produce a high cell density in the culture medium, which may not be possible in a batch fermentor or shake flask culture. This is especially important when the product formation is intracellular to achieve maximum product output per biomass.

IRMA18Types of Microbial Cultures3. Continuous culture. Bacterial cultures can be maintained in a state of exponential growth over long periods of time using a system of continuous culture, designed to relieve the conditions that stop exponential growth in batch cultures.Continuous culture is very suitable for the production of cell biomass and products, if it is excreted into the medium. It is widely used for the production of single-cell protein from liquid effluents as a byproduct of the waste treatment. The organic waste present in the effluent is converted into microbial biomass, which is known as single-cell proteins.IRMA19KULTUR KONTINYU...Ada 2 cara :KEMOSTAT :Menambahkan nutrien dalam suatu tangki sehingga komposisi nutrien di dalam fermentor tempat kultivasi mikroba selalu dalam keadaan tetap.TURBIDOSTATMenambahkan nutrien secara kontinyu sehingga kerapatan sel selalu dalam keadaan tetap. Dalam turbidostat aliran medium diatur berdasarkan kerapatan optik kultur mikrobia.

IRMA20Aplikasi Kultur KontinyuDigunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan media diperkayaUntuk produksi biomassa, contoh ICI (Imperial Chemical Industries, kapasitas bioreaktor 3000 m3, substrat metanol)Untuk produksi bir menggunakan bioreaktor menara (tower bioreactor)IRMA21Kelebihan Kultur Kontinyu

Produktivitas lebih tinggi, laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol, pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur. Dapat dijalankan pada waktu yang lama.Cocok untuk proses yang kontaminasnya rendah dan produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan.Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana.Tidak ada akumulasi produk yang menghambat

IRMA22Kelemahan Kultur Kontinyu

Aliran umpan yang lama, resiko kontaminasi besar (operasi harus hati-hati & desain peralatan lebih baik).Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus biasa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama.Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunkan pada waktu yang lama (Irianto, 2007).

IRMA23CHEMOSTATS

Reservoir mediumFlow rate regulatorAir inletAir filterPassage innoculationSiphon and overflowGrowth chamberRespectaclePada chemostat, kecepatan aliran dari reservoir medium pertumbuhan diatur pada nilai tertentu dan kecepatan pertumbuhan biakan mengatur kecepatan alirannya.Karena produk akhir tidak diakumulasi dan nutrient tidak seluruhnya dipergunakan bakteri tidak pernah mencapai tahap stationer.

Bakteri dalam chemostats tumbuh dalam nutrisi yang terus disuplai dan produk yang terus dipindahkan.IRMA24Kemostat untuk Bioreaktor sel kontinyu

IRMA25fermentorsThese are bioreactors used for the cultivation of microbial cells on large scale under controlled conditions for industrial purposes.

IRMA26FERMENTOR KULTUR CAIRPrinsip kultivasi mikroba dalam sistem cairMikroba berada dalam cairan yang mengandung nutrien sebagai substrat untuk tumbuh dan berkembang bercampur dengan produk-produk yang dihasilkan termasuk limbah. Nutrien dan oksigen yang diperlukan untuk pertumbuhan optimal mikroba harus tercampur merata (homogen) pada semua bagian fermenter.Untuk mendapatkan sistem fermentasi yang optimum, maka fermenter harus memenuhi syarat sebagai berikut:1. Terbebas dari kontaminan2. Volume kultur relatif konstan (tidak bocor atau menguap)3. Kadar oksigen terlarut harus memenuhi standar4. Kondisi lingkungan seperti: suhu, pH harus terkontrol. Stirred tank reactor system model yang banyak dipakai.IRMA27Contoh bioreaktor kultur cair yang digunakan untuk kultur kontinyu:Fermentor skala laboratorium

IRMA28Penggandaan skala produksi mikrobaAlur proses pembuatan inokulum bakteri secara industri

IRMA29The benefit of using YEp plasmids is the high gene copy number of up to 70 copies per cell [52] resulting in high expression levels of the desired proteins, although their high segregational instability often results in plasmid loss especially in rich medium [53,54]. However, the stability of YEp-type vectors can be improved by autoselection systems, such as the fur1 ura3 system [55], where the deletion of FUR1 together with the use of a plasmid containing the URA3 marker results in stable plasmid expression even in continuous culture [56]. Without such autoselection systems it is necessary to use a selective medium to overcome the instability of YEp plasmids, which may pose a limitation to the industrial use of such strains especially with lowcost products.

VITA30