Microarray Data Analysis

Bioinformatics and statistics in drug discovery companyLetizia Magnoni

Microarray Data Analysis

Letizia MagnoniJunior Scientist

Sienabiotech Spa


Argomenti

• Cosa e’ un esperimento di microarray • A cosa serve• Come si puo’ disegnare un

esperimento• Normalizzazione• Analisi • Analisi Cluster • Annotazioni dei geni selezionati


• Ogni cellula contiene una copia completa del genoma dell’organismo.

• Esistono vari tipi e stati di cellule (cellule di sangue, nervi e pelle, cellule che si dividono, cellule cancerogene, ecc.)

Gene expression


Variazione dell’espressione

• Cosa rende le cellule diverse tra loro?

• L’espressione differente dei geni, cioe’ quando, dove e quanto ogni gene e’ espresso.

• In media, il 40% dei nostri geni e’ espresso in ogni momento.


mRNA

cDNA


Perche’ Microarrays

• In passato solo analisi di un gene (o pochi) alla volta (Northern blot)

• Oggi fino a 40.000 geni su una sola microarray.


Applicazioni di Microarrays

• Individuazione di target per farmaci e validazione – identificazione di geni modulati in modo specifico rispetto ad una

certa malattia (differential expression)

• Elicidazione dei meccanismi dell’azione– Drug safety profiling– Guilt by association (geni con comportamento connesso tra loro)– Pathway modeling

• Classificazione di nuovi composti• Diagnostica• Identificazione di Biomarkers


“Disegno” di un esperimento

• Insieme dei trattamenti selezionati per il confronto

• La specificazione delle unita’ a cui verranno somministrati i trattamenti

• Le regole secondo cui i trattamenti vengono assegnati ad ogni unita’ sperimentale

• La specificazione delle misurazioni (R/G)


Disegno Sperimentale

• Fonti di variazione:– Variazione biologica– Variazione tecnica– Variazione dovuta

alla collocazione degli elementi nelle arrays.

G. A. Churchill in Nature Genetics vol. 32, 2002


Vari Disegni Sperimentali

• Dye-swap:

• Dye-swap ripetuto:

• Dye-swap con replica biologica:

BA

A B

A1 B1

A2 B2



• Reference:

N.B. Questo disegno sperimentale non mette in luce la variabilita’ introdotta dalla colorazione.

• Per migliorare questo disegno:

N.B. Meta’ delle misurazioni vengono fatte nel campione di minore interesse.

A mix B

Ref

A

B

Ref

A

B

A mix B



• Loop: A1 B1

B2 A2


Trattamenti: A B

Replicati:

Colorazioni:

Arrays:

Disegno:

G R G R G R G RRNA1 RNA2 RNA3 RNA4

A1 A2 B1 B2

A2

A1 B1

B2


Trattamenti: A B

Replicati:

Colorazioni:

Arrays:

Disegno:

RGRNA1 RNA2 RNA3 RNA4

A1 A2 B1 B2

RG RG RG

A1 B1

A2 B2


Normalizzazione

• Si vuole togliere dai dati tutta quella variabilita’ che non ha origine biologica:– Campioni (isolamento, estrazione di RNA,..)– Probe nature (cDNA clones, oligos, ..)– Arrays (substrato, lotto, difetti di superficie, ..)– Colorazione (colore, attivita’ specifica, ..)– Ibridizzazione (tempo, temperatura)– Misurazione (hardware, software, saturation)


Normalizzazione

• Possibili approcci:

– Housekeeping genes set (which genes, mean value)

– Complete gene set (min./selected/all, fluorescence intensity)

– Spiked exogeneous control mRNAs (mean value)

– Linear regression analysis


Tecniche di normalizzazione

• Normalizzazione dell’intensita’ totale

– Questo tipo di normalizzazione assume una uguale quantita’ di mRNA per entrambi i campioni etichettati.

– Si cerca una costante “c” che aggiusti i dati in modo tale che i due campioni abbiano media o mediana uguale.


Normalizzazione dell’intensita’ totale

La trasformazione degli assi coordinati ci permette di visualizzare meglio i dati

i

ii

iii

G

RM

GRA

2

2

log

log


Tecniche di Normalizzazione

• Tecniche di Regressione:– Regressione lineare dei dati e successiva

normalizzazione in modo tale che il coefficiente lineare della retta di regressione abbia coefficiente angolare unitario.

– Regressione lineare locale (LOWESS)“LOcally WEighted Scatter plot Smooth”


Normalizzazione con tecniche di regressione locale


Analisi Statistica dei dati

• Si vuole rispondere alle domande:

– La differenza che vedo nei miei dati e’ significativa?

– Le differenze osservate sono dovute solo alla diversa risposta dei campioni ai trattamenti?


T-test con due campioni: confronto tra le due medie

• Ipotesi:– I campioni hanno distribuzioni normali;– I campioni sono originati da due variabili

indipendenti;– Due possibili assunzioni sulle varianze:

se o altrimenti.22

21

La statistica test ha una distribuzione t di Student


Confronto tra medie di due campioni in un esperimento di Microarray• Si vogliono evitare tutte le assunzioni fatte

precedentemente. • Statistica test (Welch Statistic); per ogni gene i

calcoliamo:

1

21

2

22

12

n

s

n

s

xxt

ii

iii

• Per determinarne la distribuzione possiamo utilizzare algoritmi di permutazione o di bootstrap.

B. Efron, R. J. Tibshirani: “An Introduction to the Bootstrap”, Chapman & Hall (1993)

S. Dudoit et al: “Statistical methods for identifying differentially expressed genes in replicated cDNA Microarray Experiments”, Statistica Sinica 12(2002), pp 111-139


Permutation test

– Stima la distribuzione della statistica test sotto l’ipotesi nulla (che non ci sia differenza tra i due campioni) tramite permutazioni dei campioni etichettati.

– Il p_value e’ dato come frazione delle permutazioni per cui il valore della statistica test e’ (almeno) tanto estremo quanto quello che e’ stato osservato.

gp


Multiple testing

• Supponiamo di avere un esperimento con 10.000 geni e decidiamo di controllare l’errore di tipo I al 5% (rifiuto l’ipotesi nulla quando il p-value e’ minore di 0.05):

– il valore atteso di rigettare in modo errato l’ipotesi nulla sara’: 10.000 x 0.05 = 500.


Multiple testing methods

• Dobbiamo considerare il fatto di dovere aggiustare il livello di significativita’ del nostro test (multiple testing procedure)

– Bonferroni (non e’ consigliabile per esperimenti di microarrays)

– Westfall and Young step-down procedure– False Discovery Rates (FDR; Benjamini and

Hochberg, 1995)

Dudoit et al, “Multiple Hypothesis Testing in Microarray Experiments”, U.C. Berkeley Division of Biostatistics Working Paper Series, 2002


Modelli ANOVA

• Questi modelli cercano di dare una stima delle piu’ importanti fonti di variabilita’ presenti in un esperimento.– Arrays (Ai) i = 1,2,..,#arrays

– Dyes (colorazione) (Dj) j = 1,2

– Varieties (trattamenti) (Vk) k = 1,2,..,#varieties

– Genes (Gg) g = 1,2,..,#genes

ijkgjgkgiggkjiijkg DGVGAGGVDAy )()()()log(

Il modello che si assume e’:


Modelli ANOVA e disegno sperimentale

• Disegno Dye-Swap

• Disegno reference

ijkgkgiggkjiijkg VGAGGVDAy )()()log(

A B

ijkgkggkiijkg VGGVAy )()log(

RefA

B


Analisi da un punto di vista Bayesiano

• Entrambe le tecniche presentate hanno un approccio mediante la statistica Bayesiana.

– P. Baldi,”A Bayesian framework for the analysis of microarray expression data: regularized t-test and statistical inferences of gene changes”, Bioinformatics, Vol.17, no 6, pp 509-519 (2001)

– D.A.Henderson, “Bayesian Statistical Methods for the Detection of Differential Gene Expression and Control of Multiple Hypothesis Testing in cDNA and Oligonucleotide Microarray Experiments”, University of Arizona


Siti interessanti

http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/Group/index.html

http://www.jax.org/staff/churchill/labsite/research/index.html

http://www.gene-chips.com/

http://www.nslij-genetics.org/microarray/analy.html

http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html

http://www.bioconductor.org/

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html

http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/Group/index.html

http://www.jax.org/staff/churchill/labsite/research/index.html

http://www.gene-chips.com/

http://www.nslij-genetics.org/microarray/analy.html

http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html

http://www.bioconductor.org/

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html


Grazie

Documents

Microarray Data Analysis