5
Microanatomical Compartments of Clonal and Reactive T Cells in Mycosis Fungoides: Molecular Demonstration by Single Cell Polymerase Chain Reaction of T Cell Receptor Gene Rearrangements Sylke Gellrich, Ansgar Lukowsky, Tobias Schilling, Sascha Rutz, J. Marcus Muche, Sigbert Jahn, Heike Audring, and Wolfram Sterry Department of Dermatology, Medical Faculty (Charite Â), Humboldt-University Berlin, Germany Mycosis fungoides (MF) is a cutaneous T cell lym- phoma, clinically characterized by patches, plaques and tumors occuring in successive stages of the dis- ease. In early MF, an in®ltrate consisting of mainly reactive T cells is seen in the papillary dermis while tumor cells are mostly con®ned to the epidermis. By contrast, later stages show nodular in®ltrates formed mostly of tumor cells in the dermis while the epider- mis is relatively devoid of tumor cells; however, knowledge of the localization of clonal T cells has been based on histomorphologic features and immuno- histochemical stainings visualizing certain V-b sub- families of the T cell receptor (TCR). As these techniques do not allow for an unequivocal identi®- cation of clonal tumor cells, we used micromanipu- lation and single cell PCR amplifying the TCR chain gene rearrangement. A total number of 387 single T cells was isolated from six skin biopsies in ®ve patients in patch, plaque, and tumor stages. Of these, 180 T cells were picked from the epidermis and 207 from the dermal in®ltrate. The rearranged TCR-g DNA could be sequenced from 181 of 387 T cells. In three of six patients representing all three stages, epidermal T cells with a clonal rearrange- ment could be ampli®ed. In early plaque stage a higher degree of epidermal T lymphocytes was found than in initial patch, later plaque, and tumor stages with an inverse distribution found for reactive T lymphocytes. In two patients a biallelic rearrange- ment was demonstrated that had not been detected in prior PCR analysis from blood and skin samples. These data show that clonal (neoplastic) and non- clonal (reactive) T lymphocytes in MF preferentially in®ltrate different microanatomical compartments of the skin, depending on the stage of disease. The microanatomically distinct localization of reactive and clonal T cells suggests that the absence of direct contact between tumor and host-defense lympho- cytes may contribute to tumor persistence and pro- gression in epidermis, peripheral blood, and deep dermal tumor cell nests, respectively. J Invest Dermatol 115:620±624, 2000 M ycosis fungoides (MF) is an epidermotropic cutaneous T cell lymphoma clinically character- ized by the subsequent evolution of patches, plaques, and tumors caused by a proliferation of small to medium-sized neoplastic skin homing T cells with cerebriform nuclei (Edelson, 1980; Abel, 1985; Willemze et al, 1997). Histologically, early stages of MF are characterized by a band-like in®ltration in the papillary dermis with some of the T cells involving the epidermis either as single cells or in nests (Nickoloff, 1988; Smoller et al, 1995). It is broadly accepted that the lymphocytic in®ltration in MF involves both tumor cells and tumor-reactive T cells (Willemze et al, 1997). The precise localization of neoplastic cells, however, remains unclear. Many attempts have been made to identify the tumor cell clone in tissue sections to gather information regarding their numbers, their interactions with other cell types, i.e., keratinocytes, adnexal cells as well as with tumor-reactive cells (Smoller et al, 1995; Hansen, 1996; Asadullah et al, 1997). The techniques used to address this question included light and electron microscopy, morphometric techniques as well as immunopheno- typic assessment (Nickoloff et al, 1988; Ralfkiaer, 1991; Smoller et al, 1995). The use of monoclonal antibodies against variable segments of T cell receptor (TCR) -a or -b chain have shown that in many cases the epidermal T cells preferentially express one distinct TCR variable family. This staining, however, does not identify the malignant clone itself but only the expressed TCR variable region gene family (Bagot et al, 1992; Potoczna et al, 1996). In this study, for the ®rst time the techniques of micromanipula- tion and single cell PCR of immunolabeled T cells in tissue sections of different stages of MF have been applied in order to determine the exact localization of clonal and nonclonal T cells in different skin compartments. MATERIALS AND METHODS Patient I A 56 y old untreated female with relapsing MF in patch stage without extracutaneous involvement as established by chest X-ray and Manuscript received May 26, 1999; revised January 13, 2000; accepted for publication March 12, 2000. Reprint requests to: Dr. Sylke Gellrich, Department of Dermatology, Medical Faculty (Charite Â), Schumannstr. 20/21, 10117 Berlin, Germany. Email: [email protected] 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 620

Microanatomical Compartments of Clonal and Reactive T Cells in Mycosis Fungoides: Molecular Demonstration by Single Cell Polymerase Chain Reaction of T Cell Receptor Gene Rearrangements

  • Upload
    wolfram

  • View
    213

  • Download
    1

Embed Size (px)

Citation preview

������������� ������ ��� �� ���� ��� � ����� �� � �� ������� ������� �� �� ���� � ���������� ������ � ��� ��� ����� � ������ �� � � � � ����� � � ������ ���

����� ������� � ���� ��������� ������ ����� �� ���� ����� �� ����� ���� ������� �� ������ ����� �� � � ��� ��! ������"�#���!� � � "��!�������� ������ $����� %&�����'(� ��!�����)* �+������ ,���� � ���!� �

������� ������� � ��� �� � ����� ��� � � �!����" ������� ������� ��# � �� ����� �" ��$� ���� ����� �������� �� ���� ���� ���� � �� �� ���! �� % &� ��� ��" �� ��'���� ���������� �� ����� ����� � � � �� � � �� �� ������� � ��� (�� ���� � � �� ���� ���'� � �� �� ��� ���% )���������" �� � ���� � ���( ������ ��'���� � ��� ����� �� ���� � � �� �� � ��� (�� �� ��� �!�� �� � ���� � � ���� �� ���� � �* ��( � �"+��( �� �� �� ����#����� �� ���� � � � ���� � ��� � ���������������� � ���� � ��� ����!������� ��� ��������� ������#��� � ����� ,!� ���!���� � �� �� � � � � ���� ���� % -� �� � � ����$� � �� ��� ��( ��� �� �� $������ �� ���'!������ �� ���� ���� � �" ( �� � ���������!����� ��� ���� � ��� �������� �� �������� � � � ������ ��% - ���� ��� � �� ./0���� � � � (�� ����� � ��� ��1 �+�� ������ � ��'� ���� ��� �� �����" ��$� " ��� ���� ���� �% 2��� � " 3/4 � � � ( � ���+ � ��� �� ��� ������ 540 ��� �� � �� ��'���� % �� � ������ �

���!� �6- ���� � � $� �� � ��� 3/3 �� ./0 �� �% &� ��� �� ��1 ���� ��� � �� � ����� � ��� ���� �" ��� �� � � � (��� � ���� � ������ ! �� ���� � ���' �% &� ��� ��$� ���� ����� � � �� �� ��� �� � ������� � (������� ���� �� ������ �����" �� � ��$� " ��� �������� � (��� �� ��� �� ������������ ����� ��� � ����� � ������� �% &� �(� ���� ��� � ��� �� � ������ ! �� (�� � ������� � ���� ��� ��� � � � � �� ��� ����� ��� ������� ��� ���� ��� �+�� ��� �%�� � ���� ���( ���� ���� �� ������� ��� ���!���� �� ����� � ������� � �� �� �� � � �������'���� ���� � �� ������������ ������ ��� ���� �+��" � � ����� �� �� ���� �� ��� �� % �� ������������� �������� ����#����� �� � ����� ��� ���� � � � ���� ��� ���� �� ��� �� �� ��� ��������� � �( � ���� ��� ����!� � �� ����!��� � �� ��������� �� ���� � ����� �� ��� ���!�� ����� �� ��� ���" � ���� �� ����" ��� � �� �� ���� � � ���" � �� ���� �% � ����������� ������������ ����

������ � ������ %�$( �� � �#����!����#���� ���� � ��� ��!#�!� �� ����� ������)���� �� �� �����-�� � �+������ � #�����#��-���� � � ��!��� ����� �� � #���� ������ � �!��� �� !����!)����� ��#����� ��� �!� � �

���� ��� ������ ��! ���� %.����� � /0123 ����� /0143 �����!���� ��� /005(� �������������� ����� ������ � �$ ��� ���������� �� ��� �)���� � 6������� � �� #�#������ ���!�� ��� ��!� � �� ����� � +��+� � �� �#����!�� ����� �� �� ��� ���� �� � ����%7����� � /0113 �!����� �� ��� /004(�

8� �� ������� ��#��� ��� �� ��!#���� � 6������� � �$� +��+�� ��� ��!�� ���� � � ��!��)�����+� � ���� %�����!���� ��� /005(� �� #����� ���������� � ��#����� ����� ���+�����!�� � � ����� �� � ����!#�� �+� ��� !��� �� ��� �� � ����!�� ��� �� � � ������ ����� � �� ����� � ��!���� ������� �

���� �!����� ���� � ������� � ��� ���� ��� ��#��� ����������� ������ �� �9�� ���� �� ���� �� ��� ��!��)�����+� ����%�!����� �� ��� /0043 �� �� � /00:3 �������� �� ��� /005(� ���� �-��� ���� �� ������� ��� -������ � ����� ���� � � ������ !�����#�� !��#�!���� �� �-��� �� ���� �� �!!� �#� �)��#� ������!� � %7����� �� ��� /0113 ��� ������ /00/3 �!������� ��� /004(� �� ��� � !� ��� �� � �������� ���� �� +����������!� �� � � ��� ���#��� %�&�( )� �� )� �� �+� ��� ���� !� � ���� �� �#����!�� � ���� #�� ��� ������ �9#���� � ������ � �&� +������� �!���� ��� ���� � �� ���+��� ���� ����� �� � �� !���� � � �� � ����� ��� � �� �� �9#������ �&�+������� ����� �� � �!��� %,���� �� ��� /00;3 <���� � �� ��� /00:(�

8 ��� ������ �� �� 6��� ��!� �� �� �-��� � !���!� �#���)��� � � �� ��� ��� <&� � �!!� �������� � ���� � ������ ����� �� �� ��� � ������ � �$ �+� ��� �##���� � ����� �� �����!� ��� �9�� ���������� � �� �� � � � �� �� � ���� � �� ��� ���� �!#���!� ���

���.�8��� �7" �.��="�

���� �� & � 4: � ��� � ������� �!��� ��� ����#�� � �$ � #�� ����������� �9������ ���� � +��+�!� � �� ���������� �� ��� >)��� � �

�� ����#� ����+�� ��� ;:� /0003 ��+���� �� ���� /?� ;2223 ��#��� �� #�������� ��� /;� ;222�

��#�� � ��-����� ��@ "�� ����� ������� "�#���!� � � "��!�������������� $����� %&�����'(� ��!� ���� ;2A;/� /2//5 ,���� � ���!� ��.!���@ ������������B��������

22;;);2;>A22AC/4�22 D &�#����� � ;222 �� �� ������ �� 8 +��������+� "��!�������� 8 �

754

�������� � � �� ����!� � � ��!# ����� �������� �������� +��������� � ���� ��� � � ����� ��!#��� ��+����� � � ���#�#������ ��� � !� ��� �� �&�)� ������ ��!� �� �� � +������������ �#��!� � ���� ��! �� #��9�!�� ���� ����� #�� ����� �$ ��� ����!�� �� �)���� � 6������ � � �� � �� �!��� �� !����!)�������!#����� ��� ������ ��! ���� � � � !�E����� � ��!�9��� F�!!����� ���� � � � �� � +��� �!��� �!��� � �#����!����#� ���!#������ $�� �� ��� ��� #���!����� �� ������ %<&�(� &"GH ����� ���� �������� ��! �� ���!�� � 6������ �� �������� ������

���� �� && � :1 � ��� � ������� ��!� ��� ����#�� � �$ � #�� ����������� �9������ ���� � +��+�!� � �� ���������� � ��� ��� >)��� � ��������� � � ����!� � � ��!# ����@ !������� ������� � +��������� � ��+���� ��� � � ����� ��!#��� ��+����� � � ��� #�#������ ��� �!� ��� �� �&�)� ������ ��!� �� �� � +��������� ��� �#��!� � ���� ��! �� ����� ���� ����� #�� ����� �$ ��� � �� �)���� � 6������ � ��!��� �!��� � � ��!#����� ��� � ������ ��! ����� � � !� ���!�9�� � F�!!����� ���� � � � �� +��� �� �#����!����#� ���!#������ $�� �� ��� ��� <&�� &"GH � ���� ���� �������� ��! �����!�� � 6������ �� �������� ������

���� �� &&& � :: � ��� � ������� !��� ��� ����#�� � �$ � #��-�� ����������� �9������ ���� � +��+�!� � �� ���������� �� ��� >)��� � ��������� � � �� ��!# ���� � � ����!� � �������� �������� +��������� � � ��+���� ��� � � ����� ��!#��� ��+����� � !� ��� ���&�)� ������ ��!� �� �� � +��������� ��� �#��!� � ����� #�� ������� #��-�� ����� %888�( � � ��#��� #��-�� ����� %888�( �$� ���������������� �� � �� ����� � � �#����������� � �� �#����!��� � � � �9�� ��+���!#��������� � 6������� � �� ���!�� �!#���� � �!��� �� !����!)����� ��!#������ ��!� ���� �#���� � � � �� #���!� ���� %888�( %��� 3(�� � � �#��!� 888� ���# ���!�� ����#� � � �� ���#��� � ��!#�����%��!�� ���� ����(� � #����!� � � ���� � � ��� � ��)I�?)� ������ %,�����. ���� � .� �� ���!� �( ��� �����+��� $�� �� ��� ��� <&�� &"GH

%888�� 888�( � � I�?H %8888�( � ��!#����� ���� �������� ��! �� ���!���� �)���� � 6������ %888�� 888�(� ��! ���# ���!�� ��!�� ��� ���� %888�( � � ��! �#����!�� %888�� 888�( �� �������� ������

���� �� &, � 44 � ��� � ������� !��� ��� ����#�� � �$ � #��-�� ����������� �9������ ���� � +��+�!� � �� ���������� �� ��� >)��� � ��������� � � �� ����!� � � ��!# ����� �������� ������� 6 �� �� ��! �� ��� � ��� � � ����� ��!#��� ��+����� � �� �� � ��� #�#������ ��� � !� ��� �� �&�)� ������ ��!� �� �� � +��������� ��� �#��!� ����� ��! �� �##�� ���� ����� #�� �� #��-�� ����� �$ ��� � ���!���� �)���� � 6������ � �!��� �� !����!)����� ��!#����� � � ��!�9��� F�!!����� ����� �� � � ��!#����� ���� �� � ���� �� �#����!���� #����!� � � ���� � � ��� � ��)I�4�/)� ������ %,����� . ���� ( ��������+��� $�� �� ��� ��� <&�� I�4�/H ���� ���� �������� ��! ���#����!�� � 6������ �� �������� ������

���� �� , � :2 � ��� � ������� !��� ��� ����#�� � �$ � ��!�� ����������� �9������ ���� � +��+�!� � �� ���������� �� ��� >)��� � ��������� � � �� ����!� � � ��!# ����@ !������� �������� +��������� � ��+���� ��� � � ����� ��!#��� ��+����� � ���������&�)� ������ ��!� �� �� � +��������� ��� �#��!� ����� ��!������� �$ ��� !����! �� ����� ����� ���#��� � ��!#����� ��������� ��! ���� � � � �� � �� ��!�9�� � F�!!����� ���� ���� �����!�� � � � � 6������ � ���� � �� �� �#����!��� � #����!� � � ���� � ���� � ��)I�;;)� ������ %,����� . ���� ( ��� �����+��� $�� �� ��� ���<&� I�;;H � ��!#����� ���� �������� ��! �� ���!�� � 6������� ���������� ������

�� �������� �� ���� � � ��� ����� �+�� � ������ ����������������� ��� ��� ���#���� ���� � �# ���� � ��-��� ������ � � ������ �� J12�&� $���� ��� ����� � %/2�! ���( �������� �� ��� � ��)&"G � ������ %"�K=� ��!����� ���!� �( �� � ��)I�?� I�4�/ �� I�;;)� ������ %,����� . ���� ( ��� � ����� ������ $��� ��)!���� ������� �� ����#��+��� J#���9����� � E������ �!#��9��%���,)K�� ;@ "�K=( � � ������ #���9�����J��!��� %�.&��������� �����!@ "�K=( �� ��+���#� � ����� ��� �����-�� ������ ������� � � ��� �!���9��� ��� #�� ��!���

&"GH � � ���#���+��� I�9H ���� ���� �������� !�����#�����%7��� � "�L������� � ���!� �( �� !�� � � � ������� !���!� �#������%7�������� "�L������� � ���!� �(� ����� ���� �� ��� ���� ���� ��#������� �� � !���#�#�� %7�������(� #���� � �� ;2�� <&� �� �� ��##��!� ������ / � ��7� #���� %��� ��! ,���� ���� �� ��!� ���!� �(� � ������� �� J;2�&� <������#� ���� ���� �� ��� � � � ��� !���!� �#���)��� � �� ��� %��� 5(�

��� ���'������ �� � ������ � ���� !� ���!� � � � 8 ��������� ���� ���� � ������ ��� 2�;4�� #�� !� <����� ��� K %,���� ���( ��42 !� �� 44�& � � �� � ������� �� /2 !� �� 04�& %� ��!� � ���+���� (�

������ ��� �&�)� �� �� ���� �!#��6�� �� � ��!� ����� <&� ���#��!��� I�/ %4� &��&��&&�&�����&&� ?�( %I���� � �� �� ���/00?(� I�0�9� %��������&��������&(� I�/2A//�9� %&�&���)��&KK�&�����&( %��� �� ��� /005( � � ��/A; %4� &��&��)��������&&�& ?�( � �� 6���� � � ��� I���- %4� ���&&&)&�&��&��&��& ?�( %��� �� ��� /005(� I�0� � %������)����&���&���&&�(� I�/2 %���&&�&��&�&��&�&��&�(�I�// %�&�&�������&�&�������( %���� �� �� ��� /00/( � ����� � ��� ��

�� ������ !�9 %42 ��( �� �� 6��� ��� � � �!#��6���� � ������ � / � <&� �� �� %,���� ���(� ;�4 !� ��&�; %,���� ���(� ;22�� � �� �������� %���<� ���<� �&�<� ���<( %���� ��������������!� �(� 5 � � �� #��!��� � � ?�4 * .9#� � �� 6������ ��-)<���!����� %,���� ���(� <&� �!#��6���� ��� ������ ��� � � <���� ��&���� %,��!����� ��L��� �� � ���!� �(@ � � ��� �� 04�& �� ; !� �:4�& �� / !� %������� � ��-)<���!�����(� � � 5;�& �� / !� � ������� �� ?4 ���� �� 04�& �� / !� � 41�& �� / !� � � 5;�& ��/ !� � � � � 6 �� �9�� ��� �� 5;�& �� 4 !� � �� ��� � ��� � � <&���� ������ ��� ��� � /�� � �� <&� #����� ��! �� 6��� ��� �������� !�9����@ / � <&� �� �� %,���� ���(� ;�4 !� ��&�;%,���� ���(� ;22�� � �� �������� %���<� ���<� �&�<� ���<(%���(� 5 � � �� #��!�� � � / * ��-)#���!����� %,���� ���(� ����� � ��� � ��� #�����! ��� ������ ��� � � ����)���!�����%,��!����� ��L��� �� � ���!� �( � � � ������ � � � ��� �� 04�& ��; !� � :1�& �� 4 !� %������� � ��-)<���!�����(� � � �� 5;�& ��/ !� � G4 ���� �� 04�& �� / !� � �� 41�& �� / !� � 5;�& �� / !� � � � �6 �� �9�� ��� �� 5;�& �� 4 !� � � 4�� ���-��� � �� ������ !�9���� ���� ������ � � ;M ������� ��� �� ����� �� �!#��6���� �

�� ����� #������� ��� ������� � ������� � ����� �� �+���� ��!� ���� ��� "7�� �� !���!� �#������ � 6��� � � ��� � ��� �� <&� ���� ������ ��� ��#������� � ���� �� ��� � ���!�� ����������� ���� ���� #������� � �� ��!� !� �� �� �����+� � ������ ���� � �� ��� � � #�������

�� <&� #������ ���� #���6�� ��� � �� ��� "7� .9������ K��%,���� ���( ������� �� ����� ��-�� � � ��� 4�� "�� ���!� ����&��� ��-�� � � ����� ������ K�� %<���� .�!��� ���������������!� �( � �� ����!���� "7� ��-�� � � �����! �,8 ?5?� %�##����,�������!�� ������������ ���!� �( ��� � ?2 � #���6�� <&� #����� � �4�� I���-� I�0� I�/2� I�//)#��!��� �� ��-�� � �+������� ��� �� ���� �� ��# � �� ��-�� � 7�+������ �� ����� %�##���� ,�������!�(��� "7� ��-�� �� ����+�� ���� � ������ � �� � ��� � �� �� �����"7� ,�=� %������ �� ���� ������( � � �!#���� ��� �� .�,��� � �� � ���� %����������� ���!� �( �� � �� �&�)� �� ���

�.�*���

�� ������� ��� ��!!������ � ��� &� 8 ������ ?15 �� ��� � �������� � +���������� = � � ���� � � ����� � ��! �����#����!����#� � � ;25 ���� ������ � �� ���!��� �&�)���-�� �� ���� �� ����� �� ��! /1/ � ?15 �������� ���� %/2;

����� 3% 8 ���1��� ��� ���� ��������� � ����� �594� ������ �� &&&" ��� &&&�%

I=�� //4� 7=� G =&�=,.� ;222 �87��. � &.�� �&�)<&� 87 �N&=�8� $*7�=8".� 753

���!�� ����� 50 �#����!����#�(� ��� �#����!����#� � ����� +��������� %��!#��� 888�� 888�� 8I( ���� �� � �� ���� �#����!� � ��� �� �� �� �� #�#������ %;/ � ?; � 8I� 0 � /2� 888�� ?? � ?1� ���#���+���(� 7� �#����!����#� � ���� ���� ��!����������� � � � ������ � ��!#��� 8� 88� � � I� ��! ����� ���� � ����� #�� � � ��!�� ������ ������ � � ���� � �� +������� �#����!�� � 6������ %��� &(� �� !�E����� � ���!�� ���!#����� � #�� � � #��-�� ����� � %8� 88� 888�� 888�( ���� � �� �� � ���� %8@ ;; � ;;� 88@ /; � /;� 888�@ � � � � �(�8 ������� ���� ����#� � ���#��� � ��!#����� � �� ���# ���!��� #��-�� ����� �$ %888�@ /4 � ;2( � � � 6������� � ��!�� ����� �%I@ ;2 � ;:( � ������ #����!� � ��� � �� �� � �����

8 #���� �� 888 � � I � �������� ������ ��!� � ���� �� �� �%��� &&(3 ��� ��� ������� ���� �� �� ������� � �+��� ��!������ 7�+��������� ���� � ��!#����� ��� � �� � � � ���������� ������ ��� ����� �� �� �� �� �� � ��� #�#������ � ������ 8� #���� � 888 �� ��� ������� � �� ����� "7� � �� ��� ����� �� � ����� � � ��� �� ����� �� �� OO�� �� �&�)� ��-�� �PP%�������� �� ��� /001(�

"8�&*��8=7

�� !���� � !���!� �#������ � � �� ��� ��� <&� � #��+��� ������ � ��!���� ��� � �� ������ � �� ����+���������� � �� �� �!� ��-�� � � � � ��+����� ��� � �!�� )���� ��� �� �������� ����� � K�L##��� �� �� %/004( ��+���#���� �� ��� ��� <&� !���� �� , ��!#����� �� � +��������� � ������ �������� �� �� ���� ��� �##���� � ��� ���� , �����!#�!�� �� �� %������ �� ��� /005(� ���� �� �� �� %/00:(���#��� ��� �� �-�� �� �&�)� <&�� � � ������� � � � �#���������� ��� ��!#�!� %��&�( � � ��!# ���� 8 ��� ������ ���������� � ��!#����� ��! ��� ������ � 6+� #���� �� ��� �$�+��� � ��� ��#��� �������� ������� ��� ���� � ���� #��!�������! �� �� �&�)� �� � %���� �� �� ��� /00/3 I���� � �� �� ���/00?3 ��� �� ��� /005(�

� ����� � ?15 �� ��� &"GH �� I�9H � ���� ��� �������� ��!���!� �#������ 3 /12 ���� #���� ��! �� �#����!�� � � ;25 ��! �� ���!��� �� #��#������ � �� <&� #������ � �������)��� ������� ��-�� � � � /1/ � �� ��!�+�� �!!� ����� �� ����%G:�1M(� ��� �� � �� � 6�� �� ��� !����� �!#���� ���!����������� , ���� � ������ ��!#�!��� %K�L##��� �� ���/004( ���� ���� �� �!��� � � ������ ���� ����� ��

��#���� ����+� � ��������� � �� �$ ����� �� � ��!� �����<&� ��� � �� #��!��� ��� ��������� %I���� � �� �� ��� /00?3��� �� ��� /0053 ���� �� �� ��� /00/(

�� �� �6� � �� !���!� �#������ �� �-�� � ���������� !� � ���@ !������� �9�!� ���� � �� ��� ���� � ��#� �� �� ���� �������� ���������� � � ���� �!!� �#� ���#� ��#�������� �!��� �!#���!� ��� ��� � �� �� ��#������ ��������� � �� !�� ��� #�������� � �� ��������� ����� ��!����� ���� � �� ���#�� ���!�� � �$ �#��!� � �� � ������ � �� �� ��� !������� � � �� � � ��� � �� ����������!������� ������������ � � �� �����+� � ���� �� �� �������� ������� 8� ��� ���+��� � ��!�)� ��!� � � � ���)� �� ��+��� �-��� �����+��� ���� #�����+�� #� ���#���� ���� ���#� ������

I������ ����� !�� � ������� �� � � �!#��6���� � ���&�)� � ��-�� �� � ��!� � �� #���� � ��!#������ �� ���� ���� � ��#���� ����+� �� � ���!� �� �� ����� ����� ��� ���� � ��� ���� +������� � �� �� ���������� � "7� � �������������� #������ � %K�L##��� �� ��� /004(�

�� #����!� � � �&�)� �� � ���!� � �� ��� ��� ��6�� ��! ��+���� #��� 6 )�!������ ���#�� ����� � � � #���#��������� � ��� #���� ��� �� ��!� � ��+����� ������ ��!� � ���� �� �� � � ���� � 6+� #���� �� � �� �#����!��� =�+������� ���� ��� ��� ��-�� � � � 6������ � �� �� � ���� � �� � ����� #�������� 8 � +��� ����� �!��� � ���� ���� ��������� �� �� � ����!��� �� �� � �� �� ��� ��� <&� � � ��-�� � �� ����

������ !����� � �� � � ������ ��!� � � �� �� �� ����� �� ��� ��6�� ��! #���#���� ����� � � ��� %��� &�#���� �� 888 � � I(� � ��� � ������ ��� ������ ��� ������� � �� ��� ����� 8� ���!� ������ ��� � ��� ��� ���� �&�)� �� �<&� � ���!!���� �!#��6���� � �� ��� ������ ��� ����������� ���� #��� ��� �� �� ��� � � 6�� ��� � <&� � ����������� ��+� � � �� � � ������ �� � � �� �� �!#��6��� 8 �� ��� ����� �� �������� �� �� ��� � �� ���� �!#��� ���-�� �� ������� � ��! �� #����� �� � ���� ��� ���� �������� � �� ��� ������� �� �� �!#��6�� � �� 6�� � �!�� �� �� ������� � *# �� ��� ���+��� �� #���� � � ��� �� ����-�� �� ���� �� �� ����� �� �� ��� ��!�� ��� #�#������ �%���� ��( �� �� � � �� � %��������(� ,� !���!� �#������ � ��� ��� ��� <&�� �� �� 6��� ��!� �� ��!� ������� ������� � � �$ ���� ��� �������� ������ ��� �&�)��

�� �9�� ���������� � �� �� ��!�� � ���� � #���� �� ����$ �� ��� ���� � ��!���� �� �##������ � <&� � �� ��� �

����� 5% ��������������� �� ������ ���� ��:!����� � � � � ��� � ����� � ����� ������ �� &&& �� �744� " ��� &&&�� %�( � /2�! ��� �������� 3 %�( ������ ����� � ���!���!� �#������ �

755 �.���8&� �� � ��. �=*�7�� =$ 87I.��8���8I. ".����=�=�N

���� � �$ ������ ��!������� � ���� � �� �� !���� ���!���#�� ��� �� � �� ��!�� �����

�� �� �� � ���� � ��� � +������ �!#���!� �� � ��� ���� � ��� ��!#�!��� ����� � �� #���� �� � +��������� ������!�� ���� �� ��#������� ��� ������� � #���#���� ������ � ���#� � ��� #��+���� ��#���� %���� �� ��� /00G3 ��� �� ���/005(� 8� �� ������ ��� ��� � � ����� �!#���!� �� ��� � ������ ���������� �/ � ����������� � �� �� � ���� �� ��� #��������� � �� ����� � 6 �� � � ��!� � � �9#������ � ����� �I� �!����� ����� � �� �#����!��� �� ���!�� �� ��� %<���� ��� ��� /00:3 ,����� /00;3 <����!� �� ��� /00;3 ������ �� ��� /001(�8 �#��� ��� ���#���� � �$ #���� �� �� ��!� � � I� �9#������ ��� ��!� ������� �� �!!� ��������� ���� � � � � � �� �������� ��!� � �� <&� �� ������ ���� ��! ���� �#����!�� � ����!��� %$�+� �� �� ��� /00G( ���� ������� ��F�� �� ����������� ���� ��� �!#���!� ��� ��� � �� ��!� ������ � ��#���� �)���+� �� ��� ��!�� ���� 8 !� � ���� � �#��6 I�9) �!��� ���+��� � � �!!� ���������� 8 ��� ��!#��� � !� ����� � I�9H ���!#����� ���� �����+� � ��� �!#������ ��� �� &"GH � ����%��� &� #���� � I(�

�� ���������� � �� �� �� � ���� ���� �� ��� ��@ %�( � ������)�#��6 �9#������ � ������ !������� �� ����� �� %���������� ��� /005( �� ��!�� � ����� � �� �� �9#� ��� � � ���#�#������ � ��� )�!� � � ���� � ����� � �����3 %��( �� ������ � ��!������ �� � � � �� � ���� 3 �� %���( � �� ��� � � �#����!������������� ���������� � ���#� !�� ��! � ��!�� ����� ��������� !�� �� �� ������� �������� �� �����+� ��!#����� � ����!#���!� ��

8 �� ����#����!�� �� �)���� � 6������ � ����� �$ ������ �� �� � ������ ������ !��� #����� �� %����� �����+�( � ���� �� �� �� � �� %��� ��� &(� ���� �� � �� �#�������� ��� ������ �� !��� ��#���� � � ������� � ��!#����)!������� � ��)��!�� �� � ��� 8 ��� ����� �� �� ���� � �� ���� ��!�� ���� ������ ���� �� ���+�+� � � �� #���� ������ �� � ���#� � �� ���#����!��� 8� �� ��#���� ��� �� �����+� � ���� ��� ���� �

��� ���� ��!#���� ��������� � ���� %&��( �9#������ � �!�� �� ����� � �� �� �#����!�� %,������� �� ��� /00?(�

8 ���� � ��� ��!#�!��� �� �� � ����� ��� � �#�������!#�!�� ��!���� �����+���� � � �� ��� � #�#������ � %�� �� � � � �� �� � ����( � ��#� �� � � ���� �������� ���������� ���� !��� %���� �� �� ��� /00:(� 8 �� ��� � ����� ��� � �#�������!#�!�� ���+��� �� ��!�� ���� ���! �� �� ������� � � ������ �� #����� �� ����� ��� � ��!#������

8� �� ��� #��#���� ��� �� � � ���� � ���!������ ���� ��� +��+�� � �� � ������ �� �� � ��� �9#� ��� � �� ��� �!!� ������� �����!� �� �� ����� � �� ������� � � �� ���+�+�� � ��#���� �� %�� �� � /00:(� &"1H �����+� � ���� �������� ��! ������ ������� ���������� ��!�� ���� � � ���� 8 ��#� �� � ���� %,����� �� ��� /00:(� � � ��������� �!��� � &"1H ���!#����� ��� �� � � �� ���!�� � 6������ � #���� �� ����$ � � ��� ��������� ��� � �+������ #��� ���� %��##� �� ���/004(� 8 ��� ����� �� �� � ��� � F�!!������ � �� �� &"GH

� ���� ��� #���� � � �� ���!�� ����� �� � �� �#����!��� 8� ��#�������� ��� ���� ���� ��� � ����� � � � ��)��!�� �!!� ������� �

8 � ����� � �� �� 6��� ��!� �� ���� �� ��!� ������� � !������� ������� ��+�� � ��#��� ������ � �$ ��� �� �� � ���� ������ �� � �� �� %�����+�( � ��!#����� ��� #���� � #�� ��� )������ � �� ��� � !���� ���!��� �!#���!� �� � �� ��� ��#� �� � � �� ����� � ��������

�.$.�.7&.�

���� .�@ &�� ��� ������� � ��� ���� � ��� ��!#�!�� ����� � ���� ?@:G5J::G�/014

�������� K� $������ �� "�L�� �"� �� �� I��� �"� ������ �@ . � ���9#������ � �)��� ���+���� � � ������ ������ ��� � ���� � � ������ �����!�� ��)��!�� ���#� �� � ����� #��!��� ��� ���� �)��� ��!#�!�� � ����������� � /21@5G?J5G5� /005

,���� �� ������ �� ���� �&� ��+�� �� $���� <� ������� <@ 8 ����#����!������������ � �� �� � � ��� ���� �)��� ��!#�!�� � �� ���� ����� �;5@410J40?� /00;

,����� &�� �� � 7� &����� �� 8@ �� �!!� � ���#� �� �� ���� 8) �����������!��)�#��6 ��� ���� �)��� ��!#�!� � ���� �� � ������ ����� � /25@?0;J?05� /00:

,������� ��� ���� �� �� =��� .�� <���� ��@ �� ��!������� � ������� � �)������#�#������ � � #���� �� ��� ��� ���� �)��� ��!#�!�@ ��� ����

��� &% ���� ���" ���� �" ��������" ��� � ���� �� �������������� ��� ���� � ���

<���� �� &�!#���!� � ���� � � ����� 8������� 7�����+� <����� ��A����� &�� ��A��������� � ����� ��-�� �� ��-�� ��

8 "��!��� &"G 8 ����� #�� :? 5 ;;A;; 2A;;88 "��!��� &"G 8 ����� #�� ?: G /;A/; 2A/;888� "��!�� &"G <�� �� #��-�� /1 ; 0A0 2A0888� .#����!�� &"G <�� �� #��-�� ?: G /A/2 0A/2888� .#����!�� I�? <��-�� ?: G /A;4 ;GA;4888� .#����!�� &"G <��-�� ?: G ?A/? /2A/?888� "��!�� I�? <��-�� ;5 ? GA/? 0A/?888� "��# ���!��� ����#� � ���#��� ���� &"G <��-�� ;5 ? 4A;2 /4A;28I .#����!�� I�4�/ <��-�� 5; 1 //A?/ ;/A?/I "��!��� I�;; ��!�� ?: G :A;: ;2A;:

�7� � ���� ���� �� �������� ��! �� �#����!�� ������ � � +��� ���� �� ���� � �#����!����#� ��!#���� � 6�������

��� &&% ���!� � ������ ��� �� ���� ��� &&&" &," ��� ," � � �� � �� ���� � ���

<���� � I)�� � I)���!� � 7)��-�� � �)���!� � ������

888 IG ������������ �������� ��������������������� 8

I; ��������������� �������� ������������������ 88

8I I/2 ��������������� ������������������ ������������� 8

I I; �������������� � ��������� 8

I? �������������� ������ ��������������������� 88

/��� ��� ��� �� ������ �� �������� �@ ��+���� ��������� ������ �� �� ��� ����� � !����� � ������ � � �� ��-�� � � �� �� � ���� � �� ������ � ������ ����� � //2@4:4� /001 %������(

I=�� //4� 7=� G =&�=,.� ;222 �87��. � &.�� �&�)<&� 87 �N&=�8� $*7�=8".� 75.

��!#����)��������� � ���� �9#������ � � ���� ��������� ��� �9�� � � �������� ������� 5@140J1:?� /00?

.����� ��@ &��� ���� � ��� ��!#�!�@ ������ � ������� ��'���� �� ���!�� � ����� +���� ��� � �� ���� ����� � ;@10J/2:� /012

$�+� �� "<� �� �� &�� 7����� ,�@ ���������� � �� �� � ���� �� ���#����!�� � ��� ���� �)��� ��!#�!�� � �� ���� ����� � ?/@5/5J5;?�/00G

������ �� ����!������ �� ����� � �� �� �� ������ �@ �������� � ������ � ���!!� �������� I� �� � ������ ��!� � � � #��!��� ��� �����!!� ������� ,)��� ��!#�!� �� !���!� �#������ � � �� ���)��� <&��� ������ ����� � /20@4G/J4G4� /005

�� �� .�@ 8!!� ����������� �+� �� � �� ��� � #���� �� ��� ��� ���� �)�����!#�!��� ���� ����� � /?;@44GJ4:/� /00:

��##� ��� �������� �� ��� �� ��� ���� ��@ &"1)#�����+� ��!��)� 6������ ���!#����� � F�� � �� �� �)���! ���+�+�� � #���� �� ��� !����� � ������� � �� ���� ����� � ?;@GG1J44G� /004

K�L##��� �� �� �!� ��� ��E����� K@ ����!� �#������ � � <&� � ������ � �� ��� ��� ��! ������ ����� �� 8 ���� "�� ,������� &� �������� �� %���(������ � � ������������ ����� � ��� 4� �� � &�!������� ��@ ,���������� �� /004

���� �� �� �� ���� &� Q��)��L �� ��!� � �� K��L� �� �� $���� ���� �!� ��@ �� ���)��� � ������ � �)��� ���#���) ������ ��!� � � �����)��� � �#����� ��!#�!�� ���� � !��� � 4@/2J/0� /00:

�������� �� ����� � �� ������ *� ����� �� ������ �@ 7����� +� !� ���� ��� �)Q���� !������ �&� )<&� ��� ������ � ������ %�$(�������"� G0@:G/J:G4� /001

��� ��� �������� �� �������� K� ������ �� ������ �@ "�!� ������� � ��-�� � ����� � � �� �� � &���� � �� #���#���� ����� � #���� �� ������ ���� �)��� ��!#�!�� #� � 02@/:?:J/:G;� /005

7����� ,�@ ����)!�����#� ������!� � � /22 #���� �� ��� #��A#��-�� �����!����� � ������� �� � ����� ���� � /2@G:0JG55� /011

<���� � 7� ,�� �� ,�� 7����� $=� K�� ��� &� ������ �� ,��� �� "�!!���@ �)��� ���#��� +������� ����� %I( ����� � ��� ���� �)��� ��!#�!��%&�&�(@ �!#����� �� ��!�� � � � ���!������ ��� � � ����� !��� �;?@;01J?24� /00:

<����!� ��� �� �Q� ���� �� ���� �� ��@ �)��� ���#��� I ����) �!��� ����� � #��!��� ��� ���� � � #��!��� ���� �)��� � )������ P� ��!#�!���� ������ ����� � 00@415J40?� /00;

��� ����� .@ 8!!� ������!��� !������ �� �� ���� ���� � ��� ������!#�!��� $���� ���� !��� � 1@:;J5;� /00/

�!����� ,�� ,���# K� ����� .� ��� �� �@ ��������!� � � �������� #���!������ �� ���� ���� � !����� � ������� �� � $��� !��� � /0@/G;?J/G?2� /004

������ <�� ��� ����� .� �� ����� �� ����!�� �� I�E������� ��� Q���� �@ �)������#��� +������� ����� �� �� � ��� ���� �)��� ��!#�!��� #� � ����� �/?1@?J/;� /001

���� �� K�� ,���� ��� �� ��� 7�� �� ����� �� ������ ��@ �� � ������ ��!� �� ,) � � �)��!#�#���� �����+� ������� ������� �� �� #���!����� �� ������ R��� �!!� ��S� #� � /%51(@/0;J/0:� /00/

I���� � �� �� ����� �<� &���� � �� K� =�� ���#���� �� K��� �@ ��������������� � �� �)�#��6 "7� � �#�#��!� ��� ����� � � � #���� � �������� �+��+� � !����� � ������� #� � ����� � /;1@G;?JG;1� /00?

�����!�� �� K��� �� ������ �� �� ��@ .=��& �����6���� �� #��!��� ��� ������!#�!��@ � #��#���� ��! �� &��� ���� ��!#�!� ����� ����# � ��.���#�� =��� ������ �� ������ � � �����!� � � &� ��� #� � 02@?4GJ?5/� /005

���� ��� �� � ��� ��� �� �&� �� ��@ "������ � �� �� �)��� ���#��� ��!!��� � ������ ��!� �� � ����� !����� � ������A��'���� �� ���!� ��#���!����� �� ������ � � �� ����� � ������ � ��� ������#������ %<I�A"��.(� � ������ ����� � /2?@?GJG/� /00G

75: �.���8&� �� � ��. �=*�7�� =$ 87I.��8���8I. ".����=�=�N