Mtodos de estudios de las clulas y los tejidosTECNICA HISTOLOGICA, TECNICA HISTOQUIMICASTcnica HistolgicaTcnica HistolgicaEsta tcnica tiene como finalidad conservar las estructuras celulares y tisulares, asi como tambin conservar los componentes qumicos de estas.Consiste en colorear las estructuras celulares, ya que que estas son transparentes, debido a su alto contenido en agua y a otros factores. Pero estas sustancias (colorantes) son toxicas para las clulas, provocando la destruccin de las extructuras internas y externas de la clula. Por tal motivo antes de ser coloreados, los tejidos deben sufrir los siguientes procesos:FijacinInclucionCorte

3Tcnica HistolgicaToma de MuestraTcnica HistolgicaToma de muestraDebe ser rpida. Puede provenir de:

biopsias quirrgicas, material obtenido de necropsias, utilizando animales de laboratorio, estudios experimentales en animales, material de cultivos de tejidos, frotis o extendidos.

Tcnica HistolgicaFijacinTcnica HistolgicaFijacinConsiste en la muerte de las clulas de una manera tal que las estructuras que posean en vida se conserven con un minumo de modificaciones, al igual que sus componentes qumicos.Caracteristicas de un buen fijadorAccion rpida, matando a las clulas antes que aparezcan los fenmenos agnicos;Poseer un alto grado de penetracin, con el fin de que todas las estructuras celulares se fijenAsi como conservar los detalles estructurales;Evitar la desaparicin de componentes qumicos tisulares (lpidos)Favorecer los pasos posteriores (inclucion, corte y coloracin)F. Qumicos: Se utilizan solo para conservar los detalles estructurales mas no la composicin qumica.Cuando se requiere una buena conservacin de la estructuras tisulares, el fijador se administra por va sangunea.Todos los fijadores qumicos reaccionan con componentes tisulares como las protenas.Ej.: Formol 10%, Liquido de flemming.F. Fsicos: Se utilizan para mantener intacta la composicin qumica de los tejidos.Ej.. Mtodo de congelacin.-desecacinTcnica HistolgicaFijacinMtodo de congelacion-desecacinConsiste en la congelacin rpida del tejido y su deshidratacin al vacio a bajas temperaturas.Congelacion: Introduccion de pequeas piezas de tejido a temperaturas de -160 a -190, logrado por Nitrogeno liquido. (algunas veces hielo liquido a 0 grados).Deshidratacion: Se realiza al vacion, a temepraturas que van de -30 a -40 grados.Ventajas:El tejido no se retrae,El tejido se fija de manera homognea,No extraccin de sustancia solubles,Composicion qumica y estructural de tejidos y clulas se mantienen sin cambios.

Tcnica HistolgicaInclusinTcnica Histolgica InclusinConsiste en preparar el material para que resista el cortado en laminillas muy delgadas.Para este proceso se suele utilizar parafina, en el cual el tejido previamente deshidratado en baos de alcohol etlico de graduaciones crecientes (78, 90, 96 y 100 grados).Se sumerge en un pequeo recipiente cubico con parafina liquida fundida a unos 55 grados, esta al enfriar se convierte en un bloque solido llamado vulgarmente taco, con el tejido en su interior.

Tcnica HistolgicaCorte del materialTcnica HistolgicaCorteEstudio estructuralesSe realiza por instrumentos llamados micrtomos; estos permiten obtener laminillas de 2 a 15 um de espesor, suficientemente delgados como para que la luz pueda atravesarlas, luego son montadas en un portaobjetos y despojados de la parafina mediante baos de xileno, luego baos de alcohol etlico, rematado con agua pura.

Estudios citoquimicosCuando se desea mantener la composicin qumica de los compoenentes celulares se emplean micrtomos dentro de cmaras enfriadas con CO2 liquido.

Tcnica HistolgicaColoracinTcnica HistolgicaColoracinSe emplean colorantes, que son sales de naturaleza orgnica:a) cidos: Tienen cargas negativas. Se unen a grupos catinicos como los grupos aminos de las protenas. Actan a pH bajo. Eosina, azul de anilina, fucsina cida Orange G. Son colorantes citoplasmticos.

b) Bsicos: Presentan cargas positivas. Se unen a los grupos fosfato de los cidos nucleicos, grupos sulfato de los glucosaminoglicanos(Gags) y grupos carboxilo de protenas. Acta a pH alto ya que los grupos se ionizan y se unen al colorante. Hematoxilina, azul de metileno, azul de toluidina. Son colorantes nucleares.

Tcnica HistolgicaColoracinLa Eosina es un colorante cido (predomina densidad de carga negativa), se asocia y colorea a estructuras catinicas del citoplasma y matriz extracelular, tales como: filamentos citoplasmticos (como los de clulas musculares); membranas intracelulares; y fibras extracelulares (por sus aminocidos bsicos ionizados).La Hematoxilina se asocia con mordientes para actuar como un colorante bsico, por lo cual se asocia y colorea estructuras anicnicas (que posean fosfatos, sulfatos y/o carboxilos ionizados): Heterocromatina y nuclolos RNA ribosoma Matriz extracelular.Hematoxilina-eosina Hematoxilina; Ncleo: violeta. Eosina; Citoplasma: rojizo.Hematoxilina-Eosina: Fundamento de la coloracin

Tcnica HistolgicaMontaje - ObservacinTcnica HistolgicaMontado - observacinColocacin del cubreobjetos: con la finalidad de proteger el preparado, se lo recubre con un cubreobjetos. Para adherir el cubreobjetos al portaobjeto se emplean resinas, por ejemplo: el Blsamo de Canad y se lleva a observar en el microscopio.

Tcnicas HistoqumicasHistoqumica, Inmunohistoquimica, radioautografiaTcnica HistoqumicaSon mtodos fsicos, que consiste en reacciones qumicas, en los cuales se emplean colorantes, que se unen selectivamente a los grupos qumicos de las molculas tisulares (cidos nucleicos, protenas, lpidos, hidratos de carbono).Reactivo de Schiff; Este reactivo es selectivo de los grupos aldehdos, de modo que permite detectar el ADN y algunos lpidos y carbohidratos.Esta preparado con fucsina bsica (parafucsina) con acido sulfuroso. Compuesto incoloro que cuando reacciona con los grupos aldehdos de las molculas tisulares se recolaran.Reaccin de Feulgen; Tambin permite detectar el ADN.En este mtodo la pieza de tejido previamente fijado y cortado se somete a una hidrolisis acida dbil y luego se trata con el reactivo de Schiff.La hidrolisis; va ha extraer el ARN y las purinas del ADN (guanina, adenina), en esa extraccin va a liberar los grupos aldehdos de la pentosa (desoxirribosa), y estas van a reaccionar con el reactivo de Schiff.Tcnica HistoqumicaReaccin de PAS; Esta reaccin se basa en la oxidacin, mediante el acido peryodico, de los grupos glicolicos 1,2 de los polisacridos, que va a permitir la liberacin de los grupos aldehdos que luego van a reaccionar con el reactivo de Schiff. Se utiliza para detectar mucinas, el acido hialuronico. Etc.Colorantes liposolubles; Permite la detencin de lpidos en tejidos fijados por congelacin, Se utiliza: el tetroxido de osmio, que es colorante liposubles que tie de negro a los cidos grasos no saturados de los triacilgliceroles.Sudan IV y rojo escarlata, tienen mayor valor histolgico debido a que actan por solubilidad y difusin.Sudan negro B; brinda un mayor contraste, y tiene la ventaja de disolverse en los fosfolpidos y el colesterol.Tcnica HistoqumicaTcnicas enzimticas; se basan en la detencin de las enzimas tisulares mediante un sustrato. La fijacin se puede realizar en algunas enzimas mediante el criostato, o a otras enzimas resistentes mediante acetona fra, formaldehido o glutarldehido.Ej.; Mtodo de Gomori; Para detectar la Fosfatasa alcalina se utiliza como sustrato esteres fosfricos de glicerol.Fluorescencia; Los componentes qumicos tisulares son descubiertos por la fluorescencia que emiten:Natural: derivada de sustancias normales del tejido.Secundaria: inducida por colorantes fluorescentes (fluorocromos)Tambin se le puede aplicar para el estudio de desplazamientos de protenas en las membranas celulares.Tcnica HistoqumicaTrazadores; Se utilizan para el estudio de ciertos procesos celulares, endocitosis.Estos trazadores suelen ser enzimas que poseen un alto grado de opacidad a los electrones que permiten detectar las vas de transporte de ciertas sustancias, tanto dentro como afuera de la clula.Ej.. La peroxidasa se detecta mediante la diaminobencidina en presencia de perxido de hidrogeno.

Positividad lnmunohistoquimica perivascular para actina de msculo liso. (Diaminobencidina x200).

La compleja estructura de la retina en el ojo de un ratn. Las clulas fueron resaltadas con un colorante fluorescente

Imagen de un corte de 60 m de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada para histoqumica enzimtica que pone de manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima xido ntrico sintasa neuronal que aparece en algunas neuronas (clulas con un color azul intenso). Tcnica InmunohistoquimicaEn esta tcnica se utilizan anticuerpos y la propiedad antignica de las protenas tisulares.Los anticuerpos se unen con el antgeno, formando el complejo anticuerpo-antgeno, el cual se conjuga con marcadores especiales, que se revelan con la ayuda del microscopio ptico comn, Microscopio de fluorescencia (colorantes fluorescentes) o el microscopio electrnico (ferritina, partculas de oro coloidal)Tambin el complejo anticuerpo-antgeno puede ser revelado mediante radioautografia cuando se marca con tritio.

Clulas epiteliales teidas con DAPI (azul) y dos anticuerpos (verde y rojo) mediante tcnica de inmunofluorescenciaTcnica de RadiautografiaSe basa en la marcacin de ciertas sustancias tisulares con un radioistopo.El preparado (el tejido marcado con el radioistopo) se pone en contacto con una emulsin fotogrfica que presenta cristales de bromuro de plata durante breve periodo.El radioistopo interactan con los cristales de bromuro de plata y se va revelar mediante una fotografa comn, (En forma de pequeos puntitos brillantes), el cual se observa al microscopio electrnico.

GRACIAS POR SU ATENCION