Metodi di Conferma per la rivelazione delle SE nel cibo: ELISA quantitativa e spettrometria di massa

Sabine Herbin, Anne-Laure Prufer, Annick Ostyn, Jac ques-Antoine Hennekinne

Unità Caractterizzazione delle tossine, equipe tossi ne battericheLR-UE per CPS

V workshop del laboratorio nazionale di riferimento (NRL) per gli stafilococchi coagulasi positivi compreso S. aureus

14 - 15 giugno 2012, Torino

���� Exoproteine prodotte da ceppi CPS enterotossigenici

(principalmente S. aureus)

La capacità di produzione dipende dal ceppo: da 1 ng/mL a piu’ di 1µg/mL

���� Proteine preformate in cibi ad alto contenuto proteico

���� MW: da 22 a 30 kDa

���� Attualmente ci sono piu’ di 20 SE descritte (SEA ����

SElV)

La rivelazione di solo 5 delle 20 é possibile grazie à kit

disponibili nel commercio!

���� Presenza tra le SE di sequenze altamente conservate

ricche di AA (SEA e SEE, SEB e SEC)

Ono et al., 2008

30 81 % AA homology

Caratteristiche delle enterotossine stafilococciche (SE)

2

•• BioBio--assays (test animali e cellulari) assays (test animali e cellulari)

•• Biologia molecolare Biologia molecolare (PCR, RT(PCR, RT--PCR, iqPCR) PCR, iqPCR)

•• Immunologia diagnostica Immunologia diagnostica (RPLA, ELISA, ELFA)

•• Spettrometria di massaSpettrometria di massa

-- 2D PAGE/Maldi ToF2D PAGE/Maldi ToF

-- nanoLC/MS/MSnanoLC/MS/MS

Rivelazione delle SE : quali mezzi ?

3

ELISA quantitativa

Contesto generale:

� Dagli anni ‘80 al 2010,

� LRUE usa l’ELISA quantitativa con degli anticorpi “made by hand” per rivelare e

quantificare le tossine di tipo A, B, C, D, E.

� Questi anticorpi non sono disponibili nel commercio (non accessibili) …

� … Grazie al progetto francese « UMT TERESA » é stata sviluppata una ELISA

quantitativa che usa anticorpi disponibili nel commercio per quantificare SEA, B, C, D

e SEE . Questo metodo é utilizzato in rutine dall’LRUE per i ceppi CPS

� Tale metodo deve esser trasferito ai centri tecnici francesi e ai LNR

� Perche si usa questo metodo ?

� La risposta é veloce (1 giorno) nel caso di intossicazioni alimentari stafilococciche

colletive o di controlli ufficiali : per informazione personale � non c’é bisogno di

spedire i campioni al LRUE per i ceppi CPS

� Questo metodo sarà usato su del materiale certificato di riferimento per

l’assegnazione di un valore di referimento

Metodo ELISA quantitativa: criteri sviluppati

� Scelta degli anticorpi piú competitivi tra tutti gli anticorpi disponibili in

commercio

� Sviluppo del protocollo ELISA quantitativa usando sia il metodo diretto

che indiretto ("single and double sandwiches“)

� (a seconda della tossina)

� I risultati ottenuti con gli anticorpi disponibili nel commercio sono stati

confrontati ai risultati ottenuti con gli anticorpi “made by hand”:

� Ottimizzazione delle concentrazioni usate

� Curva di taratura (gamma standard)

� Valori di LOD e LOQ (limite di rivelabilità e limite di quantificazione)

� Reazioni crociate con altre tossine (test effettuati alla concentrazione di 4ng/ml)

� reazione crociata tra SEA e SEE / e viceversa reazione crociata tra SEE e SEA

� Analisi di alimenti naturalmente e artificialmente contaminati

� 2 schemi diversi d’ELISA quantitativa usando una piastra PCR da 96 :

1/metodo diretto (per SEB); 2/metodo indiretto (per SEA, SEC, SED e SEE)

Metodo ELISA quantitativa: informazioni generali

Ab anti-SE labeled

with peroxydase

Metodo diretto(Single

Sandwich)

Ab anti-SE

GARPOX (Ab labeled with peroxydase)

Metodo

indiretto (double

sandwich)

Substrat + chromogen (ABTS)

Colore blu/verde e lettura della

piasta a 405/630 nmCapture Ab

Concentrated treated extract

Nota: corrisponde all’anticorpo; l’anticorpo deve esser verificato prima dell’uso

Concentrated treated extract

Capture Ab

Metodo ELISA quantitativa: Esigenze

� Se il metodo é realizzato per la prima volta:

�é necessario utilizzare degli anticorpi che siano stati già provati e la cui

concentrazione sia stata verificata dal LRUE

� I LNR devono provare ogni nuovo lot di anticorpi e di tossine e, devono

comparare i risultati con quelli ottenuti con i lot precedenti

� Il metodo d’ELISA quantificativa deve essere realizzato e quindi valutato anche su

alimenti naturalmente contaminati

� Fare attenzione a:

� I reagenti selezionati (ogni nuovo lot ricevuto deve esser provato e confrontato a quelli usati

precedentemente)

� Il tipo di piastra usata

� I tamponi di lavaggio

� Il tempo, la temperatura, la velocità di miscelazione per l’incubazione delle piastre

Metodo ELISA quantitativa – conclusioni e prospettive

� La 1a formazione sulla ELISA quantitativa é prevista nel 2012

� Sviluppo di un test ELISA per la rivelazione di SEG e SEI (numerosi SFPO in

Francia contengono i geni seg e sei !)

� Validazione del metodo ELISA quantitativa secondo la norma francese

AFNOR NF V03-110 :

� La validazione richiede molte analisi e quindi molto tempo !

� Validazione di 5 tipi di cibi e di 5 tossine (SEA, B, C, D e SEE) :

� Piú di 1000 analisi sono necessarie per realizzare la validazione!

� Partecipazione collettiva dei diversi LNR (ciascuno responsabile della

validazione per un alimento)(un po’ per ciascuno non fa male a

nessuno):

questo tipo d’organizzazione é stata menzionata al workshop di

Malta in modo da attirare l’attenzione dei LNR (23 to 25th May 2012)

Spettrometria di massa per la rivelazione e/o la

quantificazione delle SE

Spettrometria di massa: quali benefici ?

• Obbiettivo: sviluppare e validare un metodo che usi un principio diverso dall’EIA per rivelare specificatamente e quantificare le SE in campioni complessi (surnatante di cultura, camplioni di alimenti …)

• Principio: identificare peptidi specifici (ottenuti dalla digestione tripsinica delle tossine) grazie alla sequenza AA, al loro tempo di ritenzione et alla proporzione m/z

Vantaggi MS vs EIA:

- Alta specificità (tutte le SE potrebbero esser identificate se le loro sequenze fossero disponibili nelle banche dati)

- Un’alta sensibilità (LOD : fM, aM)

Svantaggi MS vs EIA:

- Bisogno di standard altamente purificati per la quantificazione

- Il costo dell’apparecchiatura (400 k€!) e delle analisi ( > 200 €) é elevato

- Il tempo di preparazione dei campioni e delle analisi (4 giorni vs 1,5 giorni)

12

Il metodo scelto per identificare i peptidi: MRM =

Multiple Reaction Monitoring

• Q1 seleziona uno ione [M+H]+

• Q2 frammenta lo ione selezionato

• Q3 identifica uno solo di questi frammenti (detto

anche “ione di transizione”)

Come funziona? Rivelazione e quantificazione

N2 CAD GasPrecursor ion selection

Fragmentation

Q0 Q1 Q2 Q3

Ion transition selected

Strategia globale della spettrometria di massa

1- Disegnare in silico dei peptidi specifici (provenienti dalla digestione

delle SE con la tripsina)

2- Scelta della straregia quantitativa, acquisto / creazione degli standard

3- Estrazione / concentrazione e purificazione

4- Digestione con la tripsina su gel

5- Cromatografia separativa

6- Identificazione / Quantificazione

Da 1 a 6 : nanoLC/ESI/MS/MS : per campioni complessi

1, 3, 4, 6 : Maldi ToF : per campioni purificati

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 mass 0

100

%

147.1

361.2 474.3

603.3 731.4

802.4

903.4 1002.5

1115.6 1243.7

Enterotoxin H (SEH)– S. aureus. 218 aa

(25210 da / 5.6)

… fk nk nvdiygasfyyk cek isenisecly ggttlnsek laqer viganvwvdgiqk etelir tnk k nvtlqeldik irk ilsdk yk iyyk dseisk gliefdmk tprdysfdiydlk gendyeidk iyednk tlk sddishidvnlytk k k v

CPS strainGenotype (sea

à seu)Accession number (Swiss-Prot Trembl)

Description

379 F seh

ATL_STAAC Bifunctional autolysin precursor [Includes: N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase - Staphylococcus aureus (strain COL)

ETXH_STAAU Enterotoxin type H precursor - Staphylococcus aureusGPMA_STAAB 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase

Q1Y2T4_STAAU Aldo/keto reductase

SODM_STAXY Superoxide dismutase [Mn/Fe]

Esempio 2D PAGE / Maldi ToF : analisi di un surnatante (BHI) di cultura CPS

1- Costruzione di un peptide "trypsico": esempio per SEA

Brun et al. (2007) Mol Cell Proteomics 6 (12) 2139-2149.

Brun et al. (2009) Journal of proteomics. 72:740-749

2- Scelta della strategia quantitativa (1/2)

3 strategie quantificative al confronto(SEA / urine)

Brun et al. (2007) Mol Cell Proteomics 6 (12) 2139-2149.

���� La strategia PSAQ é stata scelta!

2- Creazione degli standard (2/2)

2.2 Digestione dell’isotopo della SE con la tripsina

2.3 Analisi NanoLC/MS/MS dei peptidi trypsici della SE per determinare la loro sequenza, il loro tempo di ritenzione e il rapporto m/z

2.1 Clonaggio, espressione e

purificazione di SE (RTS 500 ProteoMaster E.

coli HY kit).

Uso di [13C6, 15N

4] L-Arg & [13C

6, 15N

2] L-Lys per

ottenere l’isotopo di SE

• Per ogni SE, bisogna caratterizzare 2 peptidi specifici per effettuare l’identificazione e quantificare (idealmente 3 peptidi):

18

SE type Peptides selected

SEAQNTVPLETVK

NVTVQELDLQAR

SEBIEVYLTTK

VTAQELDYLTR

SECSVTAQELDIK

TELLNEDLAK

SEDVSYDLFDVK

LYNNDTLGGK

SEEEVTVQELDLQAR

ESDDQFLENTLLFK

SEGFATADLAQK

GENDYEIDK

• Per ogni peptide, 1, 2 o 3 frammenti sono

ricercati specificatamente per esser sicuri

d’identificare correttamente la proteina,

esempio con SEA/SEA*:

Peptid

selected

Ion parent

(m/z)

Ion fragment

(m/z)

CE

(eV)

QNTVPLETVK 564,82 686,433,4

QNTVPLETVK* 567,82 692,4

NVTVQELDLQAR 693,37

487,3

39,8

972,5

1172,6

NVTVQELDLQAR

*696,37

493,3

978,5

1178,63

Definiion: m/z = mass of ion / charge of the ion

CE = Collision energy

• Per quantificare, scegliere tra frammenti diversi

Come funziona? Rivelazione e quantificazione

Progetto PSAQ - Risultati

19

Esempio dei risultati per SEA/SEA* (soluzioni standard):

Peptide 1:

QNTVPLETVK for SEA and

QNTVPLETVK* for SEA*

Peptide 2:

NVTVQELDLQAR for SEA and

NVTVQELDLQAR* for SEA*

1 ion fragment / peptide

followed

3 ion fragments / peptide followed

3- Estrazione / concentrazione (DC) e purificazione

Obbiettivo : estrarre e concentrare le SE (concentrazione via dialisi), poi purificare via l’immunocattura (colonne o biglie) per eliminare tutte le proteine non pertinenti e concentrare le SE

+

100 ng100 ng

ArgArg LysLys

TrypsinTrypsin

PSAQ 1

Cheese contaminated by a CPS strain

encoding for sea / sed / sej / ser genes

100 ng

21

y = 3,0411x + 0,103R2 = 0,9866

y = 4,144x + 0,087R2 = 0,8859

y = 0,6038x + 0,047R2 = 0,9995

y = 0,4124x + 0,083

R2 = 0,9969

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

0 0,25 0,5 0,75 1 1,25

[SE] ng/mL

Abs

U.A

. (40

5/63

0 nm

)

Gamme SEA Gamme SEBGamme SED Gamme SEC

Linéaire (Gamme SEA) Linéaire (Gamme SED)

Linéaire (Gamme SEC) Linéaire (Gamme SEB)

Esempio SEA / formaggio (1/3)Studio di fattibilità

4

5

6- Esempio SEA / formaggio (2/3)

AL IM T O X _ 1_A (2+ 8 )

m /z693 69 4 69 5 696 69 7 69 8 6 99 700 701

%

0

10 0

U F 87 11 1 345 (29 .96 8 ) T O F M S E S + 4826 9 8 .3 1

4 82

6 9 3 .3 33 2 5

6 9 3 .3 130 8

6 9 3 .2 11 8 2

6 9 2 .9 67 3

6 9 2 .3 37 2

69 8 .2 22 7 5

6 9 3 .8 22 1 8

6 9 3 .7 51 7 3

6 9 3 .6 91 2 6

6 94 .3 31 7 6

6 9 7 .871 0 8

69 4 .8 41 0 76 9 4 .7 7

1 0 46 9 5 .28

9 46 94 .8 9

7 3

69 6 .2 99 3

6 9 5.3 48 5 6 9 6.1 8

6 36 9 5 .6 6

6 3

6 9 5 .9 44 7

6 9 7 .3 37 9

6 9 7 .2 574

6 9 6 .8 15 4

6 9 6 .6 94 9

6 9 8 .3 34 6 8

6 9 8 .8 535 2

6 9 8.8 33 4 0

6 9 8.8 03 2 3

6 9 8 .7 82 8 6

6 9 8 .6 71 31

6 9 9 .3 12 7 2

6 9 9 .2 72 63

69 9 .2 01 4 6

69 9 .3 52 2 4

6 9 9.8 01 6 3

6 9 9 .741 0 7 7 0 0 .3 0

1 0 7

7 0 1 .186 57 0 0 .6 5

6 37 0 0 .9 5 ;5 6

SEA native trypsic

peptide

3774

SEA PSAQ 1 trypsic

peptide

6179

ESI + spectrum after injection of trypsic peptides on C18 column (75µm x 150mm).

Elution par ACN (10 – 80 %) / Acide formique (0.1 – 0.08%). Flow rate 200 nL/min.

[SEA] = (3774 / 6179) *100

= 61.1 ng dans 25 g

= 2.4 ng/g

12C / 14N

m

13C / 15N

m’ = m + ∆∆∆∆m

∆∆∆∆m

22

6 - Esempio SEA / formaggio (3/3)

sample CPS strain PCR result

RPLA

result

(BHI )

ELISA/ELFA results on

concentrated extractQuantitative ELISA

result on

concentrated extract

(ng/g)

nanoLC/MS/MS

result

(ng/g)ELISA ELFA

Cheese361 F

3.108 cfu/g

S.aureus

sea / sed / sej

SEA +

SED ++ +

SEA = 2.9 ±±±± 0.3 *

SED = 4.6 ng/g

SEA = 2.4 ±±±± 0.2

*/**

* : n = 3

** : quantification usingPSAQ1

Hennekinne et al. (2009) Appl Environ Microbiol 75 (3) 882-884

Dupuis et al. (2008) Proteomics 8 (22) 4633-4636

23

� Risultati soddisfacenti nel formaggio

�Questo metodo é stato applicato a dei campioni proveniti

da intossicazioni alimentari stafilococciche collettive

Lavoro realizzato e prospettive

� Realizzazione del metodo all’Anses

� PSAQ SEA*, SED*, SEE*, SEH* già disponibili, SEB*, SEC* e SEG*

prossimamente disponibili

� Ottimizzazione delle condizioni MS (DP, CE)

� Prospettive e azioni dell’EURL CPS:

� Parametri della digestione con la tripsina (attesi per Giugno

2012)

� Ottimizzazione della tappa di immunocattura (attesa per

l’estate 2012)

� Esecuzione del metodo per un tipo di PSAQ in campioni di

cibo artificialmente e naturalmente contaminati (2012-2013)

� Esecuzione del metodo per varie PSAQ in campioni di cibo

(artificialmente e naturalmente contaminati ) (2012-2013)

� Validazione del metodo secondo la norma francese NF V03-

110 (2014?)

Hennekinne et al. (2011) FEMS microbiol rev. DOI: 10.1111/j.1574-69 76.2011.00311.x.

Staphylococcal enterotoxinstraductiontranscription

se mRNA

RT-PCR

ELISA and/or RPLA

CPS counts

SEA to SEE detection

ELISA

se genes

Broth culture

PCR

DC and IA coupled to

nanoLC/ESI/MS

2D PAGE coupled to Maldi ToF

A L IM T O X _1_ A ( 2+ 8)

m /z6 9 3 6 94 69 5 6 9 6 6 9 7 6 98 69 9 7 0 0 7 0 1

%

0

1 00

U F 8 7 1 1 1 34 5 (2 9. 9 68 ) T O F M S E S+ 48 26 98.3 1

482

693 .3332 5

693 .3130 8

69 3.2 1182

69 2.9 673

692 .3372

698 .2227 5

693 .8221 8

69 3.7 5173

6 93.6 9126

694 .3317 6

697 .8710 8

69 4.841 0769 4.7 7

10469 5.2 8

94694 .89

7 3

6 96. 2993

69 5.3485 69 6.18

6 3695 .66

6 3

695 .944 7

697 .337 9

69 7.2574

696 .8154

69 6.6 949

69 8.334 68

6 98.8 5352

6 98. 8334 0

698 .8032 3

698 .7828 6

69 8.671 31

699 .3127 2

69 9.272 63

69 9.2 0146

699 .3522 4

69 9.8 01 63

6 99.7 4107 7 00. 30

107

7 01. 186570 0.6 5

63700 .95 ;56

Grazie per la vostra attenzione !