Merjenje krvnih koncentracij tirozin kinaznih inhibitorjev s tekočinsko

kromatografijo s tandemsko masno spektrometrijo

Jurij Trontelj, Eva Kralj, Tadej Pajič, Simon Žakelj, Irena Preložnik Zupan, Peter Černelč, Janja Marc, Barbara

Ostanek, Helena Podgornik, Albin Kristl

Univerza

v Ljubljani

Fakulteta za farmacijo

Okviren načrt predstavitve

1. Pomen spremljanja koncentracij TKI

2. Princip metode LC-MS/MS

3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije

4. Novosti -- DBS

5. Zaključek

Zakaj spremljati krvne koncentracije imatiniba in ostalih TKI ? 1/2

• Velika interindividualna variabilnost v farmakokinetiki imatiniba

Picard S et al. Blood 2007; 109:3496-3499.

• In – pomembno:

• Nekateri avtorji:

Dobra povezava med plazemskimi c. in učinkom

Zakaj spremljati krvne koncentracije imatiniba in ostalih TKI? 2/2

Marin D et al. J Clin Oncol 2010; 28(14):2381-2388.

2. Komplianca oz. adherencaAdherenca ima izjemen vpliv na uspešnost zdravljenja, še posebej, če želimo doseči CMR – popolni molekularni odgovor

Adherenca imatiniba

Št

pac

ien

tov

Meseci

0-1

3500

3000

2500

2000

1500

0

1000

500

1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 10-11 11-12 12-13 13+

2921

Tsang J et al. J Clin Oncol. 2006;24:330s. Abstract 6119.

Zakaj spremljati krvne koncentracije imatiniba in ostalih TKI?

(23%)

Ibrahim AR et al. Blood 2011;117(14):3733-3736.

(100%)

1) Izkazalo se je, da imajo pacienti s adherenco nižjo od 85% kar 18 krat večjoverjetnost, da izgubijo citogenetski odgovor (CCyR) (p=0,0002)

2) Slaba adherenca naj bi bila glavni razlog za izgubo citogenetskega

odgovora po 2 letih in za končni neuspeh terapije

Jabbour et al. Am J Hematol. Aug. 2012;87(7).

Kdaj oz. kako pogosto spremljati krvne koncentracije ?

3. Smernice- ne zapovedujejo rutinskih meritev krvnih konc.• Izmeriti plazemsko koncentracijo imatiniba:

– pri tistih pacientih, ki ne dosegajo optimalnega odgovora,• ne dosežejo CCyR (12 mes.), MMR (18 mes.)

– slabo prenašajo, – sum na interakcije (PK:inhibitorji, induktorji CYP3A4)– kjer se sumi na slabo komplianco

• Preveri se, ali je dosežena ciljna minimalna plazemska koncentracija (1002 ng/mL)

Eutos for CML: European Treatment and Outcome Study, Using blood level testing to optimize therapywww.eutos.org, dostopano Aprila 2012

Okviren načrt predstavitve

1. Pomen spremljanja koncentracij TKI

2. Princip metode LC-MS/MS

3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije

4. Novosti -- DBS

5. Zaključek

Zakaj potrebujemo za določevanje TKI tehnologijo(LC-MS/MS)?

1. zaradi potrebne velike občutljivosti:- koncentracije TKI v plazmi pacientov so relativno nizke, območje:

- 10 ng/mL – 2 µg/mL

Analit

2. zaradi potrebe po čim večji selektivnosti metode:- plazma vsebuje različne endogene ali eksogene snovi, ki

lahko motijo analizo

Princip metode LC-MS/MS

Priprava vzorcev Kromatografija Masna detekcija

Glavni princip delovanja tandemskega masnega detektorja

m/z = 494 = prekurzor = imatinib

394 = hčerinski ion

HPLCčrpalka

pripravljenvzorec

kolona

Površina pod kromatografskim vrhom je sorazmerna s koncentracijo prekurzorja v vzorcu

• Priprava vzorcev – metoda LLE (liquid-liquid extraction)

250µL

Titier et al. Ther Drug Monitor 2005; 27(5):634-40.

SRM:m/z 494����394

Princip metode LC-MS/MS

• Kromatografija in masna detekcija

kalibracijski vzorec na meji določitve (LLOQ):25 ng/mL

vzorec pacienta

imatinib

CGP 74588=N-desmetilmetabolit im.

IS

imatinib

IS

CGP 74588=N-desmetilmetabolit im.

Princip metode LC-MS/MS

• Validacija metode – po smernicah FDA, EMA– Točnost– Ponovljivost– Učinek matrice– Linearno območje– LOQ– stabilnost

Validacija metode – točnost, linearno območje

konc. ng/mL imatinib IS

imatinib/IS uteženo

Bias [%]Brez Izotopnooznač. IS

izrač. konc.ng/mL

Bias [%]z uporaboImatiniba-D8kot IS

0 62 54343 0,0011 32,39242 - 2,8717651 -25 561 53024 0,0106 54,394836 117,57934 26,71516 6,8606382

100 1986 53130 0,0374 117,2345 17,234499 94,417683 -5,5823165

200 4236 55870 0,0758 216,46151 8,2307526 191,52906 -4,2354697

500 11338 58101 0,1951 529,6481 5,9296199 492,96797 -1,406407

700 14510 52727 0,2752 669,5179 -4,3545863 695,18663 -0,6876239

1000 20991 53825 0,3900 955,31145 -4,4688548 985,17005 -1,4829947

2000 40251 51123 0,7873 1804,6665 -9,7666737 1989,0161 -0,5491939

3000 70654 58227 1,2134 3145,3728 4,8457589 3065,4087 2,1802914

5000 110427 55343 1,9953 4899,2818 -2,0143642 5040,6345 0,8126901

6000 123033 52315 2,3517 5455,1844 -9,08026 5941,0823 -0,9819615

slope 22,67657 0,000395843

intercept -672,32675 8,21649E-06

y = 0,0004x + 8E-06R² = 0,9998

0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

umeritvena krivulja imatinib/IS

optimalnoterapevtsko področje

Validacija metode – učinek matrice in ponovljivost

Različne plazmene vplivajo natočnostmetode

Okviren načrt predstavitve

1. Pomen spremljanja koncentracij TKI

2. Princip metode LC-MS/MS

3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije

4. Novosti -- DBS

5. Zaključek

Merjenje intracelularne koncentraciije imatiniba

Zakaj?Zato, ker je tirozinkinaza intracelularni encim. Imatinib torej deluje intracelularno.

mononuklearne celice ?ali granulociti ?ali oboje?

Potrebna separacija krvnih celic(Ficoll), Separacija z magneti

↓

Nato liza cca 3 mio celic

↓

tekočinska ekstrakcija,

↓

Dvojno koncentriranje � LCMS

V katerih celicah?

Kako?

Faktorji: aktivnost Pgp, hOCT1...

Metoda je že razvita in se uporabljaza meritve pri Projektu ARRS

Mer

jenj

e im

atin

iba

v ta

rčni

hce

licah

Rezultat: metoda, ki je sposobna z gotovostjo določiti do 6.2 pg imatiniba / 2000 celicKar je podoben uspeh, kot so ga dosegli v avstralski skupini, kjer pa so morali uporabiti radioaktivno označen imatinib.

Okviren načrt predstavitve

1. Pomen spremljanja koncentracij TKI

2. Princip metode LC-MS/MS

3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije

4. Novosti -- DBS

5. Zaključek

DBS

(=Dried Blood Spots)

• Stara metoda več desetletij, predvsem v neonatalni in pediatrični diagnostiki (bilirubin, PKU),

• Ponoven vzpon (10-100 x ↑ občutljivosti LC-MSov v zadnjih 3 letih)• Manj invazivna metoda kot punkcija vene

Nekatere slabosti:-slabša občutljivost,-slabša ponovljivost,-spremenljiv hematokrit in

njegov vpliv,-odvisnost rezultata od velikosti lise,-porazdeljevanje uč. v Erc

Glavne prednosti:

+ malo vzorca 10-20 µL+ pacienti se lahko sami zbodejo+ lahko shranjevanje vzorcev+ lažji transport

Cilj: razviti metodo za kvantifikacijo imatiniba, nilotiniba, dasatiniba z DBS

vbodNanos na listič

Sušenje na zraku

Izre

z lis

e

Ekstrakcija z močnim topilom terOdstranjevanje motečih proteinov ter fosfolipidovLC-MS/MS

Zakaj?Kakšne so prednosti tovrstnega jemanja vzorcev?

- možnost odvzema v ambulantah zdr. domov,

- možnost odvzema celo na domu,

- pošiljanje vzorcev po pošti (ni treba hladiti)

Rezultat: metoda za simultano spremljanje treh TKI v vzorcih DBS

13C-D3-nilotinib

nilotinib

D8-imatinib

D8-dasatinib

imatinib

dasatinib

Primer vzroca na spodnji meji določitve (LLOQ)

Rezultat• Uspešno validirana metoda DBS• Točnost in ponovljivost:

imatinib dasatinib nilotinib

nominal concentration [µg/L] 300 800 2000 15 40 100 300 800 2000

intra day statistics (n=5)

mean concentration found [µg/L] 314,6 768,7 2001,2 13,1 42,3 99,1 309,4 831,3 2008,6

accuracy (%bias) 4,9 -3,9 0,1 -12,9 5,7 -0,9 3,1 3,9 0,4

precision (%CV) 3,1 4,4 5,6 2,8 4,9 7,1 6,9 5,3 6,8

inter day statistics (n=15)

mean concentration found [µg/L] 312,3 725,6 1994,3 13,0 41,4 99,6 323,5 782,5 1914,5

accuracy (%bias) 4,1 -9,3 -0,3 -13,2 3,4 -0,4 7,8 -2,2 -4,3

precision (%CV) 9,1 8,1 8,2 9,9 9,3 8,2 10,3 7,7 7,1

Rezultat• relativni matriks efekt – primerjava odzivov istih

koncentracij analitov v krvi več ljudi (DBS)primerjava različnih vzorcev krvi- imatinib

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0 500 1000 1500 2000 2500

vzorec A

vzorec B

vzorec C

vzorec D

vzorec E

primerjava različnih vzorcev krvi- dasatinib

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,3500

0,4000

0,4500

0,5000

0 20 40 60 80 100 120

vzorec A

vzorec B

vzorec C

vzorec D

vzorec E

primerjava različnih vzorcev krvi- nilotinib

0,0000

1,0000

2,0000

3,0000

4,0000

5,0000

6,0000

7,0000

0 500 1000 1500 2000 2500

vzorec A

vzorec B

vzorec C

vzorec D

vzorec E

USPEH:RSD naklonov < 4 %

Uporaba imatiniba-D8nilotiniba-13C D3dasatiniba-D8

Rezultat – navzkrižna validacija

(N=15)

Spomladanski “Novi” izzivi• Razviti in validirati ter objaviti metodo z DBS

• Razviti metodo za merjenje intracelularne koncentracije nilotiniba, dasatiniba.

• Aplicirati metodo za spremljanje plazemskih koncentracij imatiniba tudi pri pacientih z GIST.

• Vpeljati analitiko za najnovejše TKI, ki so še v razvoju, npr. za bosutinib, ponatinib, bafetinib (učinkoviti tudi pri T315).

Zahvala

• Pomembni sodelujoči:

– Eva Kralj, mag farm. – za odlično delo v laboratoriju,– dr. Simon Žakelj, mag farm. – za pomoč pri razvoju metod,– dr. Tadej Pajič, univ.dipl. inž, spec. med. biokem. - za zbiranje

vzorcev,– vsi ostali, ki sodelujejo na projektu,– Novartis Slovenia, - za pomoč pri pridobitvi standardov,– ARRS za financiranje projekta,– ARRS za sofinanciranje nakupa LC-MS/MS-a.