Mecanismos de transporte a través de membranas biológicas: transporte

transepitelial

Dr. Diego Álvarez de la Rosa

Investigador del Programa Ramón y Cajal. Departamento de Farmacología. Universidad de La Laguna

diego.alvarez@ull.es

Publicado en www.fisionet.org en octubre de 2006

ÍNDICE

1. Definición de epitelio. Estructura de las células epiteliales: organización de la membrana plasmática epitelial. Definición y papel de la polaridad en la función epitelial. Uniones intercelulares: naturaleza y estructura. Relación entre uniones intercelulares y permeabilidad paracelular.

2. Transporte vectorial de solutos y fluidos. Fuerzas motrices del transporte epitelial. Gradientes electroquímicos en las membranas apical y basolateral: papel de la Na + K + -ATPasa. Medida del transporte transepitelial: flujos netos; flujos de trazadores; flujos de volumen; corriente de cortocircuito.

3. Mecanismos de transporte epitelial: reabsorción y secreción. Modelos de flujos reabsortivos en condiciones fisiológicas: transportadores implicados en los flujos reabsortivos. Papel de la ruta paracelular. Modelos de secreción en condiciones fisiológicas: rutas de salida apical y entrada basolateral de iones. Movimiento de agua.

4. Regulación del transporte transepitelial de iones. Ejemplos de regulación de transportadores y sus mecanismos: a) fosforilación; b) tráfico de transportadores; c) cambios en la abundancia de proteína del transportador; d) proteínas modificadoras de la función de transporte. Regulación de la ruta paracelular. Regulación debida a cambios en la concentración del soluto transportado.

5. Cólera y fibrosis quística: el papel del canal de Cl - CFTR ( cystic fibrosis conductance regulator ) en secreción; regulación de CFTR. Consecuencias fisiológicas de la ausencia de CFTR. Consecuencias fisiológicas de un exceso de función de CFTR.

6. Desórdenes en la regulación de transportadores: el síndrome de Liddle. Papel del canal epitelial de sodio (ENaC) en la reabsorción de Na + y secreción de K + en el túbulo colector renal. Regulación de la función de las células principales del túbulo colector renal: papel de la aldosterona. Consecuencias fisiológicas de un exceso de actividad de ENaC.

7. Desórdenes en el tráfico de transportadores: Diabetes insipidus nefrogénica. Regulación del transporte de agua en el túbulo colector del riñón: control fisiológico por vasopresina. Regulación del tráfico de acuaporina 2 (AQP-2). Consecuencias fisiológicas de la ausencia de actividad AQP-2.

8. Bibliografía

1.- Definición de epitelio. Estructura de las células epiteliales: organización de la membrana plasmática epitelial. Definición y papel de la polaridad en la función epitelial. Uniones intercelulares: naturaleza y estructura. Relación entre uniones intercelulares y permeabilidad paracelular.

De la misma manera en que la membrana celular es la barrera que separa el fluido intracelular del extracelular, los epitelios son las barreras que separan el medio interno del organismo del medio externo. El transporte de solutos y agua a través de los epitelios tiene por tanto un importantísimo papel en el mantenimiento de la homeostasis del medio interno.

Un epitelio está compuesto por una capa ininterrumpida de células conectadas entre ellas por complejos proteicos de unión. Estas uniones funcionan como barreras selectivas de permeabilidad y además marcan la frontera entre la membrana apical , en contacto con el medio externo, y la membrana basolateral , que está orientada hacia el medio interno. Las membranas apical y basolateral presentan grandes diferencias en sus funciones de transporte y por tanto se dice que las células epiteliales están polarizadas. Esta polarización es lo que posibilita el transporte vectorial , es decir, el transporte neto de solutos y agua de un lado a otro del epitelio. Las membranas apical y basolateral pueden recibir distintos nombres dependiendo del epitelio en cuestión. Así, la membrana apical puede denominarse membrana en cepillo, mucosa o membrana luminal. Por su parte, la membrana basolateral se conoce a veces como serosa o membrana peritubular.

Existen cuatro tipos de uniones entre células epiteliales.

I.- Las uniones herméticas ( tight junctions , también llamadas zonula occludens ) son estructuras complejas que impiden el paso libre de fluidos y solutos entre las células del epitelio. Si bien los componentes moleculares de las uniones herméticas no se conocen completamente, se sabe que su estructura consiste en filas paralelas con alta densidad de proteínas transmembrana que mantienen juntas las membranas de células adyacentes. El grado de permeabilidad de un epitelio parece estar relacionado con el número de estas filas paralelas. Las tight junctions tienen tres funciones importantes: 1) constituyen la barrera que separa el medio interno del externo; 2) actúan como elementos de permeabilidad selectiva, dejando pasar algunas moléculas con mayor facilidad que otras; 3) separan la membrana apical de la basolateral, permitiendo el mantenimiento de composiciones lipídicas y proteicas distintas en ambas membranas, lo que a su vez posibilita el transporte vectorial de sustancias y agua a través de un epitelio.

II.- Las uniones de adhesión ( zonula adherens ) se sitúan en los laterales de las células epiteliales y están constituidas por proteínas de adhesión célula-célula. Estas uniones proporcionan información a la célula sobre la

identidad y proximidad de las otras células del epitelio. En tumores epiteliales, la pérdida de estas moléculas de adhesión está relacionada con el inicio del crecimiento incontrolado y la capacidad de metástasis de las células tumorales.

III.- Las uniones comunicantes ( gap junctions ) son canales que interconectan células epiteliales adyacentes y que permiten el paso intercelular de moléculas de bajo peso molecular (< 1000 daltons). Debido a que los iones pueden atravesar este tipo de uniones, su presencia implica que las células de un epitelio están eléctricamente acopladas. Además, se sabe que las gap junctions son de gran importancia en la transmisión de señales mediadas por Ca 2+ intracelular. Su estructura molecular consiste en dos hemicanales denominados conexones, que a su vez son homo- o heterohexámeros de proteínas de la familia de las conexinas.

IV.- Los desmosomas ( macula adherens ), unen membranas de varias células adyacentes en un solo punto. Son abundantes en zonas donde el epitelio está sometido a grandes tensiones mecánicas, como ocurre en el intestino grueso, contribuyendo a su estabilidad.

Figura 1. Tipos de uniones celulares

1.- zona ocludens

2.- zona adherens

3.- desmosomas

4.- tonofilamentos de los desmosomas

5.- microvellosidad

6.- citoesqueleto de la microvellosidad

7.- microtúbulos

8.- microfilamentos

2.- Transporte vectorial de solutos y fluidos. Fuerzas motrices del transporte epitelial. Gradientes electroquímicos en las membranas apical y basolateral: papel de la Na + K + -ATPasa. Medida del transporte transepitelial: flujos netos; flujos de trazadores; flujos de volumen; corriente de cortocircuito.

Debido a que las composiciones del medio externo y del medio interno son diferentes y que el mantenimiento de estas diferencias es esencial para la vida, todos los epitelios están expuestos a gradientes de concentración química y de potencial eléctrico entre su lado luminal (medio externo) y su lado intersticial (medio interno). Por ello, el gradiente electroquímico existente en la membrana apical es distinto al de la membrana basolateral, ya que aunque ambas comparten el citoplasma celular a un lado de la membrana, están expuestas a fluidos de distinta composición química al otro lado. El mantenimiento de los gradientes electroquímicos en las membranas apical y basolateral es posible porque todos los epitelios comparten, además de la presencia de uniones herméticas, tres características básicas que son esenciales para su funcionalidad. En primer lugar, la presencia exclusiva de la Na + ,K + -ATPasa en la membrana basolateral de todos los epitelios, con la notable excepción del plexo coroideo. En segundo lugar, la abundancia de canales de K + en la membrana basolateral, que son independientes de voltaje y reciclan el K + introducido en la célula por la Na + ,K + -ATPasa, creando un gradiente de K + en la membrana basolateral. Este gradiente de K + es el principal determinante de la diferencia de potencial en esta membrana (unos 50-60 mV con el interior negativo respecto al exterior). En tercer lugar, todas las células epiteliales mantienen una concentración intracelular de Na + que ronda entre 10-30 mM, muy inferior a la del fluido extracelular. Este efecto es también debido a la actividad Na + ,K + -ATPasa. El gradiente de Na + es utilizado como fuerza motriz para la entrada de Na + a través de canales de Na + apicales y para el transporte secundario activo de otros solutos, tanto en la membrana apical (ejemplos: cotransportador de Na + y glucosa, intercambiador de Na + y H + , cotransportador de Na + , K + y Cl - ) como en la basolateral (ejemplo, el intercambiador de Na + y Ca 2+ ).

La principal consecuencia de la existencia de gradientes electroquímicos diferentes en la membrana apical y en la membrana basolateral de los epitelios es que estas células pueden promover la absorción o secreción de distintos solutos controlando la inserción selectiva de canales o transportadores específicos en cada una de sus membranas. En el siguiente apartado se exponen ejemplos concretos de flujos de secreción o de absorción. Pero antes es necesario examinar cómo la presencia y

características de las uniones herméticas de un epitelio son parte esencial en la funcionalidad de un epitelio. También repasaremos las distintas técnicas experimentales que nos permiten estudiar la función epitelial.

Mediante técnicas electrofisiológicas, podemos determinar la diferencia de potencial entre el lumen y el intersticio de un epitelio, parámetro denominado voltaje transepitelial . El voltaje transepitelial es la suma de los voltajes de la membrana apical y la basolateral. Además de la diferencia de potencial, existe otro parámetro eléctrico de gran importancia al definir un epitelio: la resistencia transepitelial . La resistencia de un epitelio está directamente determinada por las propiedades de sus uniones herméticas ( tight junctions ), que regulan el paso de fluidos y sustancias entre las células que componen el epitelio, denominada ruta de transporte paracelular . La resistencia de los distintos epitelios es enormemente variable y está relacionada con su función. En general se habla de epitelios � impermeables � ( tight epithelia ), que poseen una elevada cantidad de uniones herméticas y por tanto alta resistencia eléctrica, o de epitelios � semipermeables � ( leaky epithelia ), con menor cantidad de uniones herméticas y por tanto baja resistencia eléctrica. Es necesario resaltar aquí que muchos de los epitelios llamados �impermeables� permiten cierto grado de transporte paracelular, proceso que tiene gran importancia fisiológica, como se verá más adelante. Los epitelios �semipermeables� no son buenos para mantener gradientes iónicos u osmóticos pronunciados. En general, se encuentran en zonas encargadas del transporte masivo de solutos o agua de forma isosmótica. Ejemplos de epitelios de baja resistencia son el intestino delgado y el túbulo proximal del riñón. Por el contrario, los epitelios �impermeables� mantienen gradientes osmóticos o de concentración iónica muy pronunciados. Ejemplos de epitelio de alta resistencia son el túbulo distal del riñón, el intestino grueso y el de la vejiga urinaria.

Existen distintas técnicas para cuantificar el transporte transepitelial. La más directa es la medida del flujo neto de una sustancia desde un lado del epitelio a otro. Por ejemplo, si tomamos un segmento del intestino delgado con sus extremos ligados y con una solución rica en glucosa en su interior, y lo situamos en una solución fisiológica sin glucosa, podemos medir el paso de glucosa desde el lumen hasta el intersticio. Si la tasa de transporte es baja, es más práctico medir el flujo de trazadores radiactivos , que permiten seguir el transporte transepitelial de pequeñas cantidades de moléculas; el isótopo del rubidio, 86 Rb, se utiliza como trazador para el estudio del transporte transepitelial de K + (el Rb + y el K + son cationes monovalentes con un radio muy similar y por tanto los transportadores y canales de K + no lo distinguen del Rb + ). El transporte de agua puede estudiarse midiendo el flujo de volumen desde un compartimiento al otro. Por último, existe una técnica electrofisológica, denominada corriente de cortocircuito , que proporciona de forma sencilla y con gran sensibilidad información acerca del flujo neto de iones a través de un epitelio. Básicamente, consiste en la colocación de

electrodos a ambos lados del epitelio, para generar el paso de una corriente a través de ellos de forma que anule la diferencia de potencial a ambos lados del epitelio, esto es, provoque un �cortocircuito� del epitelio. La corriente necesaria para anular la diferencia de potencial es igual a la corriente generada por el flujo neto de iones de un lado da otro del epitelio, que es lo que determina su potencial de reposo. Mediante la sustitución de iones en las soluciones apical o basolateral por otros no permeables se puede determinar la naturaleza de los flujos de iones que generan el potencial transepitelial. Por otra parte, experimentos en los que se emplean fármacos que inhiben específicamente la función de algún canal o transportador permiten identificar los transportadores implicados en el proceso. Una aplicación clínica muy importante de técnicas electrofisiológicas que estudian la función epitelial consiste en la medida del potencial transepitelial en epitelio nasal en pacientes con fibrosis quística ( ver apartado 5 ), prueba muy importante para el correcto diagnóstico de esta enfermedad.

3.- Mecanismos de transporte epitelial: reabsorción y secreción. Modelos de flujos reabsortivos en condiciones fisiológicas: transportadores implicados en los flujos reabsortivos. Papel de la ruta paracelular. Modelos de secreción en condiciones fisiológicas: rutas de salida apical y entrada basolateral de iones. Movimiento de agua .

Como se ha explicado en el apartado anterior, la existencia de gradientes electroquímicos diferentes en la membrana apical y la basolateral, unida a la inserción selectiva de canales y transportadores específicos en ambas membranas, permite la reabsorción de solutos desde el lumen hasta el intersticio o, por el contrario, su secreción desde el intersticio al lumen. A continuación se exponen cuatro ejemplos ilustrativos de procesos de secreción y absorción, seguidos de una breve descripción del movimiento de agua a través de los epitelios.

Figura 2: Mecanismos de transporte de sodio, cloro, potasio y glucosa en las células epiteliales renales

I.- Absorción de NaCl en los túmulos conector y colector del riñón.

El modelo celular de absorción transepitelial de NaCl fue propuesto por primera vez por Hans Ussing, pionero en el campo del estudio del transporte transepitelial. A pesar de que este modelo fue propuesto para la reabsorción de NaCl a través de la piel de la rana, se ajusta perfectamente para explicar la reabsorción de NaCl en el túbulo colector del riñón de mamíferos (ver Fig. 2). Como se ha dicho con anterioridad, la actividad Na + K + -ATPasa en la membrana basolateral hace que la concentración intracelular de Na + sea baja, generando un gradiente electroquímico favorable para la entrada de Na + en la célula. Este gradiente hace que el Na + presente en el lumen del túbulo penetre de forma pasiva en la célula a través de la membrana apical, donde se sitúa un canal de Na+ denominado ENaC ( E pithelial Na + C hannel ). El Na + que entra de esta manera en la célula es bombeado hacia el exterior por la Na + ,K + -ATPasa de la membrana basolateral, intercambiándolo por K + , que vuelve a entrar en la célula de forma pasiva a través de los canales de K + basolaterales. De esta manera se crea un flujo neto de Na + desde el lumen hasta el intersticio. Este flujo neto de cargas positivas a través del epitelio genera una corriente eléctrica, que crea una diferencia de potencial entre el lumen, con carga negativa, y el intersticio, con carga positiva. Este gradiente eléctrico se aprovecha para el transporte paracelular de Cl- a través de las uniones herméticas. El resultado neto del proceso es la reabsorción de NaCl en el proceso de formación de la orina.

II.- Excreción de K + en el túbulo colector.

El modelo que explica la reabsorción de Na + en el túbulo colector del riñón puede utilizarse también, con pocas modificaciones, para explicar la excreción de K + en el mismo segmento del túbulo (ver Fig. 1). Si la célula posee en la membrana apical, además de los canales de Na + ENaC, canales de K + , se permite la salida pasiva de parte del K + intracelular hacia el lumen tubular. La salida de K + tiene a su favor tanto el gradiente eléctrico, ya que la membrana apical está parcialmente despolarizada debido a la entrada de Na + , como el gradiente químico, ya que la concentración intracelular de K + es alta en comparación con la del fluido tubular. Este mecanismo es de hecho el utilizado por las células del túbulo distal para excretar K + , lo que puede comprobarse si se utilizan fármacos como el amiloride, que inhiben el transporte de Na + mediado por ENaC. Estos diuréticos se denominan �fármacos ahorradores de K + �, ya que el bloqueo de la reabsorción de Na + bloquea la excreción de K + . El efecto contrario, la excesiva excreción de K + en condiciones de hiperestimulación de ENaC, se detecta en una enfermedad hereditaria humana, el síndrome de Liddle ( ver apartado 6 ), causado por mutaciones activadoras del canal de Na + .

III.- Absorción de glucosa en el túbulo proximal del riñón y en el intestino delgado.

Tanto el túbulo proximal como el intestino delgado absorben solutos orgánicos mediante transporte acoplado al gradiente de Na + (ver Fig. 2). Un buen ejemplo es el co-transporte de Na + y glucosa mediado por el transportador SGLT ( S odium/ Gl ucose Co- t ransporter ). Existen tres isoformas de SGLT. Mientras que SGLT1 tiene una estequiometría Na + : glucosa de 2:1 (en cada ciclo de transporte se introducen en la célula dos iones Na + por cada molécula de glucosa), las isoformas SGLT2 y SGLT3 tienen una estequiometría de 1:1. Por tanto, el gradiente electroquímico favorable para la entrada de Na + en la célula sirve como fuerza motriz para la acumulación de glucosa en la célula en contra de su gradiente de concentración. Las isoformas SGLT2 y SGLT3 constituyen transportadores de alta capacidad y de baja afinidad, participando en las fases iniciales de la reabsorción, cuando la cantidad de glucosa en el lumen es muy alta (p.e. SGLT2 se sitúa en el segmento inicial del túbulo proximal del riñón, donde se reabsorbe aproximadamente el 98% del total de glucosa transportada). Por el contrario, la isoforma SGLT1 es un transportador de baja capacidad y alta afinidad, capaz de crear un mayor gradiente en la concentración de glucosa debido a la estequiometría 1:1. Por tanto, SGLT1 participa en el proceso cuando la concentración luminal de glucosa es menor (p.e. en el segmento más distal del túbulo proximal del riñón). Como consecuencia de la acumulación de glucosa en la célula en contra de su gradiente de concentración, esta molécula puede ser transportada de forma pasiva (independiente de Na + ) a través del transportador GLUT ( glu cose t ransporter ), situado en la membrana basolateral de la célula. De esta manera se produce una reabsorción neta de glucosa. A su vez, el Na + introducido en la célula con la glucosa abandona la misma a través de la Na + ,K + -ATPasa situada también en la membrana apical. Este flujo neto de Na + crea un gradiente eléctrico a través del epitelio que impulsa el transporte paracelular de Cl - . Por tanto, el resultado final es la reabsorción acoplada de glucosa y NaCl.

IV.- Secreción de NaCl .

Existen células secretoras en el intestino y en el epitelio de las vías aéreas pulmonares capaces de realizar una secreción neta de NaCl. Este proceso se basa en la inserción en la membrana basolateral de estas células de un co-transportador que utilizando el gradiente de Na + creado por Na + ,K + -ATPasa transporte de forma secundaria Cl - al interior celular. La molécula encargada de realizar esta función es el co-transportador de Na + , K + y Cl - ( NKCC ). El Cl - acumulado en el interior celular debido a la acción de NKCC es transportado de forma pasiva al lumen debido a la presencia de un canal de Cl - apical, normalmente el canal CFTR . El resultado neto es el movimiento de carga negativa al lumen, impulsando el transporte pasivo de Na + a través de la ruta paracelular. De esta manera se produce la secreción de NaCl al lumen, aunque la actividad Na + ,K + -ATPasa bombee Na + a través de la membrana basolateral al intersticio.

V.- Movimiento de agua a través de epitelios .

Hasta ahora hemos discutido el transporte transepitelial de solutos. Desde un punto de vista fisiológico, el transporte de agua tiene también una gran importancia, ya que el mantenimiento del volumen extracelular es fundamental para la homeostasis del organismo. En general, el agua se mueve a través de los epitelios de forma pasiva en respuesta a gradientes osmóticos. La permeabilidad de la membrana plasmática y la presencia de canales de agua, también llamados acuaporinas, asegura que el equilibrio osmótico de las células con respecto al fluido extracelular se realice rápidamente. En los epitelios semipermeables la ruta paracelular de transporte tiene también importancia en el transporte de agua. En distintos epitelios, la permeabilidad al agua ( conductividad hidráulica ) es variable, dependiendo de los tres parámetros que acabamos de mencionar: 1) permeabilidad de la membrana, que a su vez depende de la composición lipídica; 2) presencia de acuaporinas; 3) características de las uniones herméticas. La presencia o ausencia de acuaporinas en la membrana puede ser regulada, pudiendo variar la conductividad hidráulica de un epitelio de forma rápida en respuesta a estímulos determinados, como es el caso de la inserción de acuaporina-2 en la membrana apical de las células principales del túbulo distal en respuesta a arginina-vasopresina (ver apartado 4 ). Por otra parte, un epitelio con alta capacidad de transporte de solutos y baja permeabilidad al agua es capaz de generar gradientes osmóticos transepiteliales de gran magnitud (ejemplo, el segmento ascendente grueso del asa de Henle del riñón).

Un caso especial de transporte de agua lo constituyen los epitelios del intestino delgado y del túbulo proximal del riñón. En ambos casos se detecta un flujo neto de agua desde el lumen hasta el intersticio sin que exista ningún tipo de gradiente osmótico transepitelial. Se han propuesto dos explicaciones a este fenómeno. En la primera, la presencia de un alto número de acuaporinas en las membranas apical y basolateral provocaría una gran permeabilidad al agua, posibilitando su flujo neto en respuesta a diferencias osmóticas mínimas no detectables experimentalmente. La segunda hipótesis explica la reabsorción de agua debido a gradientes osmóticos locales creados en la cercanía de la membrana basolateral debido a un retraso en la difusión de los solutos reabsorbidos por el epitelio.

4.- Regulación del transporte transepitelial de iones. Ejemplos de regulación de transportadores y sus mecanismos: a) fosforilación; b) tráfico de transportadores; c) cambios en la abundancia del transportador; d) proteínas modificadoras de la función de transporte. Regulación de la ruta paracelular. Regulación debida a cambios en la concentración del soluto transportado.

Existe una enorme diversidad de estímulos fisiológicos capaces de modular el transporte transepitelial para adaptarlo a condiciones variables. En general, todos estos estímulos acaban por controlar la tasa de transporte de solutos

determinados a través de canales iónicos o transportadores. Prácticamente todos los tipos de receptores y de rutas de segundos mensajeros conocidos han sido implicados en algún proceso de modulación de transporte transepitelial. A su vez, la activación de las rutas de señalización puede modular la tasa de transporte de solutos mediante los siguientes procesos:

I.- Regulación de la actividad de las proteínas de transporte .

La actividad de los transportadores o canales implicados en el flujo transepitelial de iones puede ser regulado mediante modificaciones post-traduccionales. La más común de estas modificaciones es la fosforilación de proteínas. Un ejemplo muy conocido es el del canal de Cl- CFTR ( C ystic F ibrosis T ransmembrane Conductance R egulator ). El aumento en los niveles intracelulares de adenosín monofosfato cíclico (AMPc) provoca la activación de protein kinasa A, que a su vez fosforila diversos residuos de serina y treonina del canal CFTR, provocando un aumento en su actividad (ver más adelante, apartado 5 ) y por tanto en la secreción apical de Cl - , un proceso importante en la secreción intestinal y pulmonar.

II.- Regulación de la abundancia de las proteínas de transporte en la membrana celular.

La abundancia de un transportador en la membrana plasmática puede controlarse almacenando transportadores en vesículas intracelulares e insertándolos en la membrana en respuesta a determinados estímulos. Dos ejemplos clásicos de esta modalidad de regulación los proporcionan la acuaporina-2 (AQP-2) y la bomba de protones gástrica (H + ,K + -ATPasa). La AQP-2 es un canal de agua que en las células principales del túbulo distal del riñón se encuentra normalmente almacenado en vesículas intracelulares. En respuesta al estímulo de la hormona antidiurética, ADH (también conocida como arginina-vasopresina, AVP), las vesículas que contienen AQP-2 se fusionan con la membrana apical, permitiendo que este canal aumente la permeabilidad del túbulo al agua. En el segundo ejemplo, la histamina hace que las vesículas tubulares que contienen la H + ,K + -ATPasa en las células parietales gástricas se fusionen con la membrana apical, iniciando la secreción gástrica de ácido clorhídrico.

III.- Regulación de la abundancia de las proteínas de transporte en la célula.

Una posibilidad obvia para modular la tasa de transporte de un soluto es modificar la cantidad total de su transportador en la célula. Para ello se puede modificar la tasa de síntesis, la de degradación o ambas simultáneamente. Un ejemplo clásico de este tipo de regulación es la acción de la hormona esteroidea aldosterona sobre los transportadores implicados en la reabsorción de Na + en epitelios como el del túbulo distal renal o el del colon, el canal epitelial de sodio (ENaC) en la membrana apical y la bomba de sodio

(Na,K-ATPasa) en la membrana basolateral. El receptor de aldosterona, conocido como receptor de mineralocorticoides (la aldosterona es el principal mineralocorticoide fisiológico), es un factor de transcripción que en condiciones de reposo reside en el citoplasma. Una vez estimulado por la unión de aldosterona, el receptor viaja al núcleo celular, donde aumenta la transcripción de genes implicados en la reabsorción de Na + , como los relacionados con los mecanismos señalados anteriormente.

IV.- Regulación de la actividad de un transportador por asociación de proteínas reguladoras.

Una estrategia de regulación menos común es la asociación física del canal o transportador con otra proteína con efecto modulador de la actividad de transporte. Un buen ejemplo de este tipo de regulación es del de la unión de la isoforma 3 del intercambiador de Na + y H + (NHE3) con proteínas de la familia NHERF ( Na + -H + E xchanger R egulatory F actor ). Actualmente se conocen cuatro proteínas NHERF, todas ellas presentes en los bordes en cepillo de los epitelios del intestino, colon y túbulo proximal del riñón. La unión de las proteínas NHERF con complejos multiproteicos que incluyen a NHE3 es altamente dinámica y regulada por distintos estímulos. Las consecuencias funcionales de la unión de las proteínas NHERF a NHE3 son diversas y no todas bien estudiadas. Quizá el ejemplo mejor conocido es el de NHERF2, cuya unión a NHE3 resulta imprescindible para la inhibición de la actividad de transporte de NaCl en el intestino delgado debida a un aumento en los niveles de GMPc intracelular. Al parecer, el mecanismo molecular de la inhibición se basa en el papel de NHERF2 como proteína adaptadora que facilita la unión de una protein kinasa dependiente de GMPc (cGKII) a NHE3, que resulta fosforilado.

Además de la regulación de la actividad de canales y transportadores, existen dos parámetros que tienen importantes efectos en la tasa de transporte transepitelial de solutos. El primero es el cambio en la permeabilidad de la ruta paracelular . El movimiento pasivo de solutos a través de las tight junctions puede contribuir tanto al movimiento neto de un soluto como a su recirculación. Si la permeabilidad del epitelio cambia, el transporte neto del soluto puede ser regulado. Por ejemplo, la permeabilidad paracelular a Na + en el túbulo proximal del riñón aumenta cuando hay un incremento en el volumen extracelular. Esto contribuye a disminuir la reabsorción de Na + , y por consiguiente la de agua, dado que aumenta la recirculación del Na + reabsorbido de forma transcelular, que vuelve al lumen del túbulo por la ruta paracelular.

Por último, la concentración luminal del soluto transportado es fundamental para determinar la tasa de transporte transepitelial. Un ejemplo importante es el de la reabsorción de glucosa en el túbulo proximal del riñón. El proceso de reabsorción de glucosa hace que su concentración vaya disminuyendo según se avanza a lo largo del túbulo, provocando una

disminución en la tasa de transporte. Si se aumenta la tasa de filtración aumenta la concentración de glucosa en los segmentos del túbulo encargados de su reabsorción y por tanto aumenta la tasa de dicha reabsorción.

5.- Cólera y fibrosis quística: el papel del canal de Cl - CFTR ( cystic fibrosis conductance regulator ) en secreción; regulación de CFTR. Consecuencias fisiológicas de la ausencia de CFTR. Consecuencias fisiológicas de un exceso de función de CFTR.

CFTR ( C ystic F ibrosis T ransmembrane conductance R egulator ) es un canal de Cl - activado por adenosín monofosfato cíclico (cAMP) presente en la membrana apical de muchas células epiteliales. CFTR es una diana muy importante de agentes neurohumorales que controlan la secreción de electrolitos y fluido en distintos epitelios, incluyendo el del pulmón, conductos del páncreas e intestino delgado (ver apartado 4 ). El clonaje de la secuencia codificante de este canal se produjo a raíz de la identificación de mutaciones en este gen como causantes de la fibrosis quística . CFTR es una glicoproteína de membrana de 170 kDa que funciona como un canal de Cl - de baja conductancia. CFTR posee dos dominios transmembrana, con seis segmentos transmembrana cada uno, y dos dominios de unión a núcleotidos (NBD1 y NBD2). La presencia de estos dominios de unión a núcleotidos hace que CFTR se encuadre en la superfamilia de proteínas ABC ( A TP- b inding c assette ). Hacia la mitad de la molécula se encuentra además un gran lazo intracelular denominado dominio R (por R egulador). La regulación de la actividad de CFTR como canal de Cl - se lleva a cabo fundamentalmente por ATP. La activación de protein kinasa A debida a un aumento en los niveles intracelulares de cAMP resulta en la fosforilación de distintos residuos del dominio R de CFTR. La fosforilación inicial de algunos de estos residuos provoca un cambio de conformación en el dominio NBD1 que lo hace accesible a la unión de ATP y su consiguiente hidrólisis, lo que provoca una breve apertura del canal. Si la fosforilación de residuos en el dominio R prosigue, se produce un cambio conformacional en NBD2, haciéndolo también accesible a ATP. La unión de una molécula de ATP a NBD2 estabiliza el canal en su forma abierta, haciendo que conduzca Cl - desde el citoplasma hacia el lado luminal del epitelio. La hidrólisis del ATP en NBD2 hace que el canal se cierre, aunque la unión de una nueva molécula de ATP provoca una nueva apertura. Para que CFTR vuelva a su estado de reposo es necesario que los residuos del dominio R sean defosforilados, con el consiguiente cambio de conformación de los dominios NBD, que vuelven a ser inaccesibles a ATP.

La mayor parte de las mutaciones causantes de la fibrosis quística resultan en la producción de moléculas de CFTR que adoptan estructuras tridimensionales anormales tras ser sintetizadas en el retículo endoplásmico. El sistema de control de calidad existente en el retículo endoplásmico reconoce estas moléculas como defectuosas y hace que sean degradadas por la ruta del proteasoma, en un proceso dependiente de ubiquitina. Por

tanto, las moléculas de CFTR mutante nunca llegan a la membrana plasmática, eliminándose la conductancia apical de Cl - . Esto es particularmente importante en el páncreas, donde la ausencia de la conductancia apical de Cl - produce un déficit en la secreción de HCO 3 - y de agua. El resultado es la producción de secreciones densas y ricas en proteínas que llevan a la obstrucción de los conductos pancreáticos, produciendo la acumulación de tejido fibrótico y graso que reemplaza al parénquima del páncreas, produciendo la destrucción del órgano. El déficit en la secreción de enzimas pancreáticas provoca una mala digestión de los alimentos, con la consiguiente malnutrición. Actualmente los pacientes con fibrosis quística reciben un tratamiento oral con enzimas que reemplazan la función de las secretadas por el páncreas, solucionando en su mayor parte los problemas nutricionales. Actualmente la causa de la elevada morbilidad y mortalidad de la fibrosis quística es la progresión de la enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad. La destrucción del tejido pulmonar observada en estos pacientes se debe a una tasa elevada de infecciones, acompañadas de procesos inflamatorios. La relación mecanística entre la actividad deficiente de CFTR y el aumento en los procesos infecciosos en el pulmón ha sido objeto de intenso debate en este campo, con dos teorías que intentan explicar la aparición de los síntomas. La primera, actualmente desacreditada por muchos autores, propone que la deficiencia en CFTR provoca un desequilibrio iónico en el fluido que recubre las vías aéreas (paradójicamente, produce un aumento en la concentración de NaCl), lo que inactiva la acción bactericida de moléculas secretadas por el propio epitelio, que forman parte de mecanismos de inmunidad innata en el pulmón. La segunda teoría, que actualmente es más aceptada, propone que el epitelio pulmonar es capaz de secretar fluido en un proceso dependiente de CFTR y de reabsorberlo en un proceso dependiente del canal epitelial de sodio (ENaC). La pérdida de la actividad CFTR produce un desequilibrio entre la secreción y la reabsorción, promoviendo esta última y provocando la deposición de una gruesa capa de moco en la superficie del epitelio. Esta densa capa de moco inhibe la acción de los cilios del epitelio para retirar cuerpos extraños de la superficie, incrementando la tasa de infección bacteriana.

Las consecuencias patológicas de la situación contraria a la de la fibrosis quística, esto es, de un aumento en la actividad de CFTR, están bien ejemplificadas por una enfermedad infecciosa diarreica, el cólera . Esta enfermedad está causada por una toxina secretada por la bacteria Vibrio cholerae . Esta toxina es un oligómero de una subunidad A catalítica y cinco subunidades B que posibilitan la entrada de la toxina en las células epiteliales del intestino. Una vez dentro de las células, la subunidad A es procesada proteolíticamente, produciendo un péptido activo (fragmento A1), que cataliza la ribosilación con ADP de la proteína G a s , inhibiendo su actividad guanosina trifosfatasa (GTPasa). Como consecuencia, la proteína G a s permanece en un estado activo permanente, estimulando la producción de cAMP por la adenilato ciclasa y por consiguiente la activación de CFTR. El aumento en la conductancia de Cl - en la membrana apical de las células

epiteliales del intestino produce un aumento en la secreción de este ión y en paralelo un aumento en la secreción de agua. Esto provoca lo que se conoce como una diarrea secretora (opuesta a una diarrea osmótica como la causada por la malabsorción de lactosa). Como la alteración causada por la toxina del cólera no afecta a los procesos de transporte de nutrientes acoplados a Na + , el tratamiento más efectivo para estos pacientes es la administración de soluciones de rehidratación orales con glucosa y Na + , revirtiendo la deshidratación y la acidosis metabólica, que son las consecuencias patológicas más importantes de la diarrea secretora.

6.- Desórdenes en la regulación de transportadores: el síndrome de Liddle. Papel del canal epitelial de sodio (ENaC) en la reabsorción de Na + y secreción de K + en el túbulo colector renal. Regulación de la función de las células principales del túbulo colector renal: papel de la aldosterona. Consecuencias fisiológicas de un exceso de actividad de ENaC

La mayor parte de la reabsorción renal del sodio filtrado en el glomérulo se realiza en el túbulo proximal. Esta reabsorción es constitutiva y resulta fundamental para el mantenimiento de la homeostasis. Por el contrario, la reabsorción de sodio en el túbulo distal es cuantitativamente mucho menor, pero de gran importancia para el ajuste de la excreción de sodio con respecto a la ingesta en la dieta. En el túbulo distal el paso limitante de la reabsorción de sodio lo constituye el canal epitelial de sodio ( E pithelial Na + C hannel, ENaC), situado en la membrana apical de las células principales. A su vez, la reabsorción de sodio se encuentra acoplada a la excreción de potasio en las mismas células, ya que el transporte de este último ión a través del canal de potasio ROMK ( R enal O uter M edulla K + channel ) depende del gradiente eléctrico establecido en la membrana apical gracias al transporte de sodio. Debido a la importancia fisiológica de ENaC, la actividad de este canal está estrechamente regulada por multitud de estímulos, siendo el principal de ellos la hormona mineralocorticoide aldosterona . La confirmación del papel fundamental de ENaC en la homeostasis del sodio y por tanto en la regulación del volumen extracelular proviene del descubrimiento de las bases genéticas de una tubulopatía hereditaria muy poco frecuente en la población, el Síndrome de Liddle . Este síndrome se caracteriza por una hipertensión grave, un exceso de reabsorción de sodio y un exceso en la excreción de potasio remediable por amiloride, un diurético que inhibe ENaC de forma altamente específica. El estudio de una familia con Síndrome de Liddle permitió la identificación de una mutación dominante en el extremo carboxilo de la subunidad beta de ENaC que se asociaba a la aparición de la enfermedad. Posteriormente, se identificaron otras mutaciones, casi todas ellas en los extremos carboxilo de las subunidades beta y gamma. El estudio funcional de las proteínas mutantes expresados en células en cultivo o en ovocitos de Xenopus laevis demostró que los canales que se formaban poseían un exceso de actividad de transporte de sodio. Esta actividad aumentada se debe a que existe un mayor número de canales activos en la

membrana plasmática, ya que las mutaciones responsables del Síndrome de Liddle bloquean la endocitosis de ENaC. Dado que la síntesis de canales y su tráfico hasta la membrana son normales, el efecto de la mutación es producir una acumulación excesiva de canales en la membrana. Esto a su vez genera un exceso de reabsorción de sodio en los pacientes, que se acopla a un exceso de retención de agua y por tanto un aumento en el volumen extracelular, lo que provoca una hipertensión severa. La despolarización de la membrana apical debido al exceso de actividad de ENaC (ver Fig. 1) genera un gradiente electroquímico más favorable para la excreción de potasio, provocando la característica hipopotasemia de los pacientes con Síndrome de Liddle. El mecanismo molecular por el cual las mutaciones causantes de este Síndrome provocan la disminución en la endocitosis del canal es aún objeto de controversia. Las mutaciones afectan en general a una zona rica en prolinas y tirosinas denomina dominio PY. Se ha demostrado que esta región de la proteína es la responsable de la endocitosis del canal mediada por clatrina. Varios autores han propuesto además que este dominio PY constituye la unión de una proteína denominada Nedd4, una ligasa de ubiquitina que en condiciones normales se uniría al canal produciendo su ubiquitinación, que a su vez serviría como señal de endocitosis. Cuando el dominio PY está mutado Nedd4 no lo reconoce y por tanto el canal no se ubiquitina, estando ausente la señal necesaria para la endocitosis mediada por clatrina.

Como se ha mencionado en el párrafo anterior, el principal regulador de la actividad de ENaC es la hormona aldosterona. La aldosterona se sintetiza en al zona glomerular de la glándula adrenal en respuesta a la angiotensina II, producto de la activación del eje renina-angiotensia debida a una disminución en el volumen circulante efectivo, y al aumento de los niveles de K + en plasma. Una vez secretada la aldosterona llega a sus tejidos diana, principalmente el epitelio del túbulo distal del riñón. Dada su naturaleza esteroidea, la aldosterona difunde a través de la membrana plasmática y se une al receptor de mineralocorticoides, un factor de transcripción de la superfamilia de receptores de hormonas esteroideas y tiroideas. Se sabe hace tiempo que este receptor, una vez activado, modula la expresión de genes implicados en la reabsorción de sodio. Si bien se suponía que estos genes podían ser directamente los que forman las subunidades de ENaC, tras la identificación molecular de este canal se comprobó que la regulación no es directa. Se propuso entonces que el receptor de mineralocorticoides modula la expresión de otros genes que a su vez regulan la actividad de ENaC. La búsqueda de estos genes ha sido intensa y se han propuesto algunos candidatos, como la quinasa dependiente de suero y glucocorticoides (SGK). No obstante, la importancia de estos genes para la acción de la aldosterona in vivo sigue siendo objeto de debate.

7.- Desórdenes en el tráfico de transportadores: Diabetes insipidus nefrogénica. Regulación del transporte de agua en el túbulo colector del riñón: control fisiológico por vasopresina. Regulación del tráfico de

acuaporina 2 (AQP-2). Consecuencias fisiológicas de la ausencia de actividad AQP-2.

Las células principales del túbulo distal del riñón poseen, además de la reabsorción de sodio y la excreción de potasio, otra importante función, que es la reabsorción de agua. Este transporte se realiza de forma transcelular gracias a la actividad de la acuaporina 2 ( AQP-2 ) en la membrana apical de las células principales y a la actividad de AQP-3 y AQP-4 en la membrana basolateral. En condiciones normales las moléculas de AQP-2 permanecen secuestradas en vesículas intracelulares. Es necesario un estímulo, que en condiciones fisiológicas es principalmente la unión de la hormona vasopresina a su receptor de tipo V2 (V2R) en las células principales, para que las vesículas portadoras de AQP-2 se fusionen de forma selectiva a la membrana apical y comiencen el transporte transcelular de agua. Existen mutaciones en humanos asociadas a la aparición de diabetes insípida (no confundir con diabetes mellitus , que es una enfermedad totalmente diferente) y que producen un defecto en la actividad de AQP-2. La diabetes insípida es una enfermedad poco común que puede ser neurogénica (debido a un fallo en la secreción de vasopresina) o nefrogénica (respuesta inadecuada de los riñones a la vasopresina circulante). La enfermedad se caracteriza por poliuria (exceso de producción de orina) y polidipsia (consumo excesivo de agua), lo que históricamente contribuyó a su clasificación conjunta con la diabetes mellitus. Si la enfermedad no se controla adecuadamente, desemboca en una hipernatremia muy acusada, hipotensión y shock. Los pacientes producen gran cantidad de orina muy diluida debido a la baja actividad de AQP-2. Esto puede ser originado por defectos en la síntesis de arginina-vasopresina (en el caso de la diabetes insípida neurogénica ) o por defectos en la activación a través de los receptores de vasopresina tipo V2 o en el tráfico de AQP-2 a la membrana plasmática ( diabetes insípida nefrogénica ). La identificación y caracterización molecular de las mutaciones recesivas de AQP-2 y V2R responsables de la mayor parte de los casos de diabetes insípida nefrogénica ha puesto de manifiesto que los aminoácidos afectados en general causan un plegamiento defectuoso de estas proteínas y su retención en el retículo endoplásmico. Algunas mutaciones permiten la salida de AQP-2 del retículo, pero provocan su retención en el aparato de Golgi. Existe otro grupo de mutaciones en AQP-2 que causan diabetes insípida de forma dominante. Estas mutaciones afectan a sitios de fosforilación del canal implicados en el control del tráfico del mismo a la membrana plasmática. Estos canales mutantes son capaces de unirse a canales normales, impidiendo su tráfico normal, lo que explicaría el carácter dominante de dichas mutaciones.

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