8/8/2019 MBKY ders4

1/21

MOLEKLER BYOLOJDEMOLEKLER BYOLOJDEKULLANILAN YNTEMLER IKULLANILAN YNTEMLER I

DERS 4DERS 4

Prof. Dr. ule ARIProf. Dr. ule ARIMolekler Biyoloji ve GenetikMolekler Biyoloji ve Genetik

BlmBlm

20052005--20062006

8/8/2019 MBKY ders4

2/21

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforeziG oran eitli faktrlere baldrG oran eitli faktrlere baldr

1) DNAnn molekl bykl1) DNAnn molekl bykl

Byk molekl yava hareket ederByk molekl yava hareket eder

2) Agaroz konsantrasyonu2) Agaroz konsantrasyonu

Yksek agaroz konsantrasyonu kk, dkYksek agaroz konsantrasyonu kk, dk

ise byk molekllerin ayrlmasndaise byk molekllerin ayrlmasndakullanlrkullanlr

8/8/2019 MBKY ders4

3/21

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezi3) DNA konformasyonu3) DNA konformasyonuDNA sper dnmler yaparDNA sper dnmler yapar

Ayn molekl arlna sahip DNAAyn molekl arlna sahip DNAmoleklnnmoleklnn

sperdnml halkasal (form 1)sperdnml halkasal (form 1) Kesilmi halkasal (form 2)Kesilmi halkasal (form 2) Dorusal (form 3)Dorusal (form 3)

formlar agaroz jelde farkl hzda hareketformlar agaroz jelde farkl hzda hareketederlerederler

Sperdnm

8/8/2019 MBKY ders4

4/21

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezi

1. DNA arlk standart

2. Farkl plazmit formlar3. B.subtilis genomik DNAs

8/8/2019 MBKY ders4

5/21

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezitamponun iyonik kuvveti,tamponun iyonik kuvveti,

elektrik akm,elektrik akm,sper kvrm younluunasper kvrm younluuna

EBeEBe

bal olarak bu formlarn birbirlerine grebal olarak bu formlarn birbirlerine grehareketlilikleri deiir.hareketlilikleri deiir.

8/8/2019 MBKY ders4

6/21

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezi4) Uygulanan voltaj4) Uygulanan voltajDk voltajda dorusal DNA hareketi voltajlaDk voltajda dorusal DNA hareketi voltajla

doru orantldr, g art harekettedoru orantldr, g art harekettefarklamaya yol aar. 2kbden byk DNAfarklamaya yol aar. 2kbden byk DNAiin 5V/cmden fazla olmaliin 5V/cmden fazla olmal

5)Elektrik alannn yn5)Elektrik alannn yn5050--100 kblik DNAlar iin elektrik alan yn ayn100 kblik DNAlar iin elektrik alan yn ayn

kaldka DNA ayrlma oran ayndr, ama ynkaldka DNA ayrlma oran ayndr, ama yndeiirse DNA harekete kar koyar (pulsedeiirse DNA harekete kar koyar (pulsefield jel elektroforez)field jel elektroforez)

8/8/2019 MBKY ders4

7/21

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezi6) Baz ierii ve temparatr6) Baz ierii ve temparatr

Poliakrilamid jel elektroforezinin aksinePoliakrilamid jel elektroforezinin aksinebaz ierii g etkilemez. Odabaz ierii g etkilemez. Odascaklnda uygulanrscaklnda uygulanr

%0.5lik jel kullanmnda 4%0.5lik jel kullanmnda 400CC

8/8/2019 MBKY ders4

8/21

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezi7) Boya7) Boya

EB baz iftleri arasna yerletiinden DNAEB baz iftleri arasna yerletiinden DNAhareketini %15 azaltrhareketini %15 azaltr

8) Elektroforez tampon kompozisyonu8) Elektroforez tampon kompozisyonu

Tamponunu iyonik kuvveti g etkiler.Tamponunu iyonik kuvveti g etkiler.

yon kuvveti az/yokyon kuvveti az/yok g yava/yokg yava/yok

yon kuvveti okyon kuvveti ok snma, erimesnma, erime

8/8/2019 MBKY ders4

9/21

Elektroforez tamponlarElektroforez tamponlarTrisTris--asetat (TAE) pH 8.0asetat (TAE) pH 8.0

TrisTris--fosfat (TPE) pH 8.0fosfat (TPE) pH 8.0

TrisTris--borat (TBE) pH 8.0borat (TBE) pH 8.0

Alkalin pH 8.0Alkalin pH 8.0

8/8/2019 MBKY ders4

10/21

Jel ykleme tamponuJel ykleme tamponuDNA rnei kuyuya yklenmede nceDNA rnei kuyuya yklenmede nce

tamponla kartrlrtamponla kartrlr

Kullanm amalar:Kullanm amalar:

1.1. Kuyuya kmeyi salarKuyuya kmeyi salar

2.2. rnei boyar, grnr yaparrnei boyar, grnr yapar

3.3. Yrme yerini belirlerYrme yerini belirler

8/8/2019 MBKY ders4

11/21

Poliakrilamid JelPoliakrilamid Jel

Elektroforezi (PAGE)Elektroforezi (PAGE)

Akrilamid polimeriAkrilamid polimeriHazrlanmas agarozdan gHazrlanmas agarozdan g

Hazrlamada hassasiyet ve deneyimHazrlamada hassasiyet ve deneyim

gerekligerekli

8/8/2019 MBKY ders4

12/21

Poliakrilamid JelPoliakrilamid Jel

Elektroforezi (PAGE)Elektroforezi (PAGE)

Dikey kullanm

ki cam aras kullanm

Jel boyu 10-100cm

8/8/2019 MBKY ders4

13/21

Poliakrilamid JelPoliakrilamid Jel

Elektroforezi (PAGE)Elektroforezi (PAGE)Agaroza stnlkleriAgaroza stnlkleri1)1) Ayrma gc yksekAyrma gc yksek

1b bakmndan farkl DNAlar1b bakmndan farkl DNAlarbirbirinden ayrrbirbirinden ayrr2)2) Daha fazla miktarda DNADaha fazla miktarda DNA

(10(10QQgdan fazla) uygulanabilirgdan fazla) uygulanabilir

3)3) Jelden geri kazanlan DNA dahaJelden geri kazanlan DNA dahasaftrsaftrR:R: fare embriyosuna enjektefare embriyosuna enjekteedilebiliredilebilir

8/8/2019 MBKY ders4

14/21

Poliakrilamid JelPoliakrilamid Jel

Elektroforezi (PAGE)Elektroforezi (PAGE)Poliakrilamid jellerin molekler biyolojide iki tipiPoliakrilamid jellerin molekler biyolojide iki tipi

kullanlrkullanlr

1) Non1) Non--denatre poliakrilamid jeller:denatre poliakrilamid jeller:ift iplikli DNAnn ayrlmas ve saflatrlmasift iplikli DNAnn ayrlmas ve saflatrlmasiin kullanlriin kullanlr

Jel dk voltajda (1Jel dk voltajda (1--8V/cm) yrtldnden8V/cm) yrtldndenift ipliin almas engellenirift ipliin almas engellenir

8/8/2019 MBKY ders4

15/21

Poliakrilamid JelPoliakrilamid Jel

Elektroforezi (PAGE)Elektroforezi (PAGE)2) Denatre poliakrilamid jeller:2) Denatre poliakrilamid jeller:

Tek iplikli DNA paralarnn ayrlmas veTek iplikli DNA paralarnn ayrlmas vesaflatrlmas iin kullanlrsaflatrlmas iin kullanlr

Jeller hazrlanrken eklenen re/formamidJeller hazrlanrken eklenen re/formamid

Nkleik asitlerin baz ifti oluturmasnNkleik asitlerin baz ifti oluturmasnengellerengeller

8/8/2019 MBKY ders4

16/21

Pulse Field Jel ElektroforeziPulse Field Jel Elektroforezi

(PFGE)(PFGE)Byk DNA molekllerinin ayrlmas iinByk DNA molekllerinin ayrlmas iin

kullanlrkullanlr2Mb byklndeki DNAlar2Mb byklndeki DNAlar

(kromozomlar) bile ayrlabilir(kromozomlar) bile ayrlabilirElektrik akmnn yn periyodik olarakElektrik akmnn yn periyodik olarak

deitirilerek uygulanrdeitirilerek uygulanrGenom projesinde kullanm ok yararlGenom projesinde kullanm ok yararlolmuturolmutur

8/8/2019 MBKY ders4

17/21

Pulse Field Jel ElektroforeziPulse Field Jel Elektroforezi

(PFGE)(PFGE)Shigella sonneiShigella sonneininXbaIninXbaI

PFGEPFGE kesimininPFGE analizikesimininPFGE analizi

8/8/2019 MBKY ders4

18/21

8/8/2019 MBKY ders4

19/21

8/8/2019 MBKY ders4

20/21

DNAnn Jelden GeriDNAnn Jelden Geri

KazanlmasKazanlmasJELDEN GER KAZANMADA KARILAILANJELDEN GER KAZANMADA KARILAILANGLKLER:GLKLER:

3.3.Az miktardaki DNAnn etkin biimde geriAz miktardaki DNAnn etkin biimde gerikazanlamamaskazanlamamas(500ngdan daha aza miktarlar geri kazanm iin(500ngdan daha aza miktarlar geri kazanm iinyeterli deildir)yeterli deildir)

4.

4. Farkl DNA molekllerinin ayn anda geriFarkl DNA molekllerinin ayn anda gerikazanmlarnn glkazanmlarnn gl

8/8/2019 MBKY ders4

21/21

DNAnn Jelden GeriDNAnn Jelden Geri

Kazanlmas YntemleriKazanlmas Yntemleri DEAEDEAE--selloz membran zerinde elektroforezselloz membran zerinde elektroforez

1.1. Jel paralarnn kolona yklenmesiJel paralarnn kolona yklenmesi2.2. Elsyon tamponu ile kolondan DNAnn alnmasElsyon tamponu ile kolondan DNAnn alnmas

Diyaliz tpnde elektroelsyonDiyaliz tpnde elektroelsyon1.1.Yrtme tamponu ieren diyaliz tpne jel parasnnYrtme tamponu ieren diyaliz tpne jel parasnn

konmaskonmas2.2. DNAnn jelden tp iindeki dilsyon tamponuna geiiDNAnn jelden tp iindeki dilsyon tamponuna geii

Low melting temperature agoroz jelLow melting temperature agoroz jelkullanmkullanm6565ooCnin altnda eriyebilen agaroz jeller kullanarak erimedenCnin altnda eriyebilen agaroz jeller kullanarak erimedensonra DNAnn saflatrlmassonra DNAnn saflatrlmas