8/8/2019 MBKY ders3

1/19

MOLEKLER BYOLOJDEMOLEKLER BYOLOJDEKULLANILAN YNTEMLER IKULLANILAN YNTEMLER I

DERS 3DERS 3

Prof. Dr. ule ARIProf. Dr. ule ARIMolekler Biyoloji ve GenetikMolekler Biyoloji ve Genetik

BlmBlm

20052005--20062006

8/8/2019 MBKY ders3

2/19

NKLEK ASTLERN SAFLIKNKLEK ASTLERN SAFLIK

KONTROLKONTROL

Bu amala kullanlan iki temel yntem:Bu amala kullanlan iki temel yntem:

1)1) SpektralSpektral yntemyntem2)2) ElektroforetikElektroforetik yntemyntem

kullanlrkullanlr

zole edilen DNA ve RNAnn saflk kontrol ve miktarnnzole edilen DNA ve RNAnn saflk kontrol ve miktarnn

belirlenmesi dahabelirlenmesi dahasonra yaplacak almalar iin gereklidirsonra yaplacak almalar iin gereklidir !!!!!!

8/8/2019 MBKY ders3

3/19

Spektral YntemSpektral YntemDNA ve RNA miktarnn ve saflnnDNA ve RNA miktarnn ve saflnn

belirlenmesi iin kullanlrbelirlenmesi iin kullanlr

Nkleotidlerin bazlar UV 260 nmdeNkleotidlerin bazlar UV 260 nmdemaksimum dzeyde absorbe etmemaksimum dzeyde absorbe etmezelliinden yaralanarak lm yaplrzelliinden yaralanarak lm yaplr

8/8/2019 MBKY ders3

4/19

Spektral YntemSpektral YntemAA260260 = 260nmdeki absorbsiyon deeri= 260nmdeki absorbsiyon deeri

miktar belirlemede kullanlrmiktar belirlemede kullanlr

ift zincirli DNA iin 1 Aift zincirli DNA iin 1 A260260 = 50= 50QQg/mlg/ml

Tek zincirli DNA/RNA iin 1 ATek zincirli DNA/RNA iin 1 A260260 == 4040QQg/mlg/ml

8/8/2019 MBKY ders3

5/19

Spektral YntemSpektral Yntem

ift iplikli DNA (Qg/ml)=A260 x sulandrm oran x 50

Tek iplikli DNA ya da RNA (Qg/ml)=A260 x sulandrm oran x 40

Miktar belirlemek iin

8/8/2019 MBKY ders3

6/19

Spektral YntemSpektral YntemSaflk belirlemek iin;Saflk belirlemek iin;A260/A280 oranndan

yararlanlr

Proteinler UV 280nmde maksimum absorbeederler

A260/A280=1.95 (saf DNA iin), E.coli iinA260/A280=2 (saf RNA iin)

Fenol, protein gibi safszlklar varlnda deerlerder

8/8/2019 MBKY ders3

7/19

Spektral YntemSpektral Yntemspektrofotometrespektrofotometre

8/8/2019 MBKY ders3

8/19

Elektroforetik YntemElektroforetik YntemAvantajlarAvantajlar

BasitBasit

HzlHzl

GlGl

Nkleik asit fragmentlerininNkleik asit fragmentleriningsterilebilmesigsterilebilmesi

8/8/2019 MBKY ders3

9/19

Elektroforetik YntemElektroforetik YntemElektroforezElektroforez znm haldeki yklznm haldeki ykl

molekllerin elektriksel bir alandamolekllerin elektriksel bir alanda

kitlelerine bal oranda hareket etmelerikitlelerine bal oranda hareket etmeleri(g) ve buna bal olarak birbirlerinden(g) ve buna bal olarak birbirlerindenayrlmalardrayrlmalardr

+_

8/8/2019 MBKY ders3

10/19

Jel ElektroforeziJel Elektroforezi

Elektrik akm varlnda jele uygulanmElektrik akm varlnda jele uygulanmnegatif yklnegatif ykl DNADNA ntral pHda anodantral pHda anodadoru hareket ederdoru hareket eder

8/8/2019 MBKY ders3

11/19

Jel ElektroforeziJel Elektroforezi Nkleik asitleri ayrmada sklkla kullanlrNkleik asitleri ayrmada sklkla kullanlr Nkleik asitler bir destek materyalineNkleik asitler bir destek materyaline

(matriks) uygulanrlar(matriks) uygulanrlarMatriks materyalleriMatriks materyalleri

AgarozAgaroz PoliakrilamidPoliakrilamid

NiastaNiastaAgarozAgaroz--poliakrilamidpoliakrilamid

8/8/2019 MBKY ders3

12/19

Jel ElektroforeziJel Elektroforezi Kullanlan matriks tipine greKullanlan matriks tipine gre

Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezi -- Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) --

Matriks konumuna greMatriks konumuna gre Yatay elekroforezYatay elekroforez

Dikey elektroforezDikey elektroforez

DNA

protein

proteinDNA

8/8/2019 MBKY ders3

13/19

Jel ElektroforeziJel Elektroforezi Jele uygulanm nkleik asitler UV kJele uygulanm nkleik asitler UV k

altnda fluoresan veren boya etidyumaltnda fluoresan veren boya etidyum

bromid (EB)varlnda gzle grlebilirbromid (EB)varlnda gzle grlebilir((bantbant)) parlak bantlar halinde ayrlrlarparlak bantlar halinde ayrlrlar

EBkanserojenEBkanserojen!!!!!!

UV gze zararlUV gze zararl!!!!!!

8/8/2019 MBKY ders3

14/19

Jel ElektroforeziJel Elektroforezi11--10 ng kadar az miktardaki DNAnn10 ng kadar az miktardaki DNAnnjeldekijeldekiYerini belirlemekYerini belirlemek

Jelden kesip almakJelden kesip almak

mmkndrmmkndr

8/8/2019 MBKY ders3

15/19

Jel ElektroforeziJel Elektroforezi1)1) Matriks materyali tarak yerletirilmi olanMatriks materyali tarak yerletirilmi olan

elektroforezelektroforez kasetkasetine dklrine dklr2)2) Matriks donduktan sonraMatriks donduktan sonra taraktarak karlrkarlr

3)3) rneklerin ykleneceirneklerin yklenecei kuyukuyucuklar oluurcuklar oluur4)4) rnek ykleme ii kaset iinde elektroforezrnek ykleme ii kaset iinde elektroforez

tamponu bulunantamponu bulunan tanktankta yaplrta yaplr5)5) EB genellikle jel hazrlanrken eklenirEB genellikle jel hazrlanrken eklenir6)6) Sistemin kapa kapatlrSistemin kapa kapatlr

7)7) ElektrodElektrodlar yerletirilirlar yerletirilir8)8) G kaynaG kaynandan istenen gte akm geirilirndan istenen gte akm geirilir

8/8/2019 MBKY ders3

16/19

8/8/2019 MBKY ders3

17/19

Jel ElektroforeziJel ElektroforeziAGAROZ JELLERAGAROZ JELLER

HazrlamasHazrlamas kolaykolay Genellikle yatayGenellikle yatay

znrl dkznrl dk

Ayrma alan fazlaAyrma alan fazla 200b200b 50.000 b50.000 b

POLAKRLAMD JELLERPOLAKRLAMD JELLER

Hazrlamas zorHazrlamas zor Genellikle dikeyGenellikle dikey

znrl yksekznrl yksek

1blik fark1blik farkAyrma alan darAyrma alan dar

55--500 b500 b

8/8/2019 MBKY ders3

18/19

Agarozun DNA ayrm etkinliiAgarozun DNA ayrm etkinliiAgaroz miktarAgaroz miktar

(% w/v)(% w/v)

Linear DNAnn etkin birLinear DNAnn etkin birbiimde ayrlabileceibiimde ayrlabilecei

boyutboyut

(kb)(kb)0,30,3

0,60,6

0,70,7

0,90,91,21,2

1,51,5

2,02,0

55--6060

11--2020

0,80,8--1010

0,50,5--770,40,4--66

0,20,2--33

0,10,1--22

8/8/2019 MBKY ders3

19/19

Poliakrilamid jellerin DNAPoliakrilamid jellerin DNA

ayrma etkinlikleriayrma etkinlikleriAkrilamid

(% [w/v])aEtkin Ayrma

Alan (bp)

Ksilen

Siyanol

FFb

Bromofenol

mavisib

3,5 1000-2000 460 100

5,0 80-500 260 65

8,0 60-400 160 45

12,0 40-200 70 20

15,0 25-150 60 15

20,0 6-100 45 12

a) N,N' metilenbisakrilamid akrilamidin 1/30u kadar

b) Boya ile birlikte g eden ift iplikli DNA molekllerinin baz ifti says