Master Thesis, Department of Chemistry Tung-Hai University ...thuir.thu.edu.tw/retrieve/22391/101THU00065016-001.pdf · vrrwrsry)之類似物，具有抑制微生物生長之功效及極低的溶血性。

東海大學化學研究所

碩士論文

Master Thesis, Department of Chemistry

Tung-Hai University

Ixosin-B amide 之胜肽類緣物的設計、合成及抗菌活性

Design, Synthesis and Antimicrobial Activity of

Peptidic Analogs of Ixosin-B Amide

研究生：廖柏宗

Graduate Student：Po-Tsung Liao

指導教授：龍鳳娣博士

Advisor：Feng-Di Lung, Ph. D.

中華民國一 O 二年七月

July, 2013

誌謝

這本論文，代表著我這兩年來的所有成果，完成這本論文，也讓

我小有成就感。回憶兩年來的點點滴滴，這當中經歷了許多人事物，

有了不一樣的感受，也讓視野變得更加不同，在此感謝我所遇見的這

些人。

首先感謝的人是我的指導老師，龍鳳娣老師，她是個嚴格又親切

的母親，她總是耐心的一步一步教導我，也不時的訓練我們獨立思

考、判斷及解決問題的能力。老師除了教導我做實驗外，還會教導我

們做人處世的道理和看待事物的態度，再此同時，也要感謝吳雨珊老

師和錢偉鈞老師們不遺餘力的指導和幫助，以及在東海大學、朝陽科

技大學和台中榮總的儀器使用，才能完成此本論文。

感謝實驗室的全體同仁，特別感謝又誠、德倫和凱宣學長在實驗

上給予我意見與幫助。感謝聖凱、淳光、芳吟、克文、亭汝、亞洳學

弟妹在實驗上諸多的幫忙。還要感謝勝惟、巾妤同學一起在實驗上及

生活上的挺力相助。因為你們，我的實驗得以順利完成。

最後，感謝我的父母，沒有你們付出心力與勞力的栽培和養育，

就不會造就出今日的我，而我也要感謝我的女友昀彣，總是陪在我身

邊，不斷的支持與鼓勵。最後謹以此論文獻給我所愛的家人朋友，和

所有關心我的人。

I

摘要

近年來由於抗生素的過度使用，導致越來越多具有抗藥性的致病菌

產生，而抗微生物胜肽為最具有潛力的新型抗生素。因為抗微生物胜肽

是先天免疫系統的主要成分，具有廣譜性、高效性、選擇性、穩定性及

不易產生抗藥性。本實驗室最近發表的 MAP-04-04 胜肽

(KRLRRVWRRWR)，為 Ixosin-B(QLKVDLWGTRSGIQPEQHSSGKSD

VRRWRSRY)之類似物，具有抑制微生物生長之功效及極低的溶血性。

本研究之目的為設計並合成 MAP-04-04 之胜肽類緣物、建立評估抗微

生物活性之測試方法、以及研究抗菌之作用機制，以期研發胜肽類緣物

成為治療用的抗菌試劑。實驗流程：首先根據 MAP-04-04 之胺基酸序

列設計一系列胺基酸置換及環狀的胜肽，接著應用固相胜肽合成法研發

最佳之反應條件以合成胜肽，再經過 RP-HPLC 純化及 MALDI-TOF MS

確認胜肽之純度及分子量。最後，應用抗微生物活性之測試方法評估其

抑制微生物生長之功效，並評估其溶血性；此外，亦將探討胜肽之抗菌

作用的機制。實驗結果發現：胜肽 MAP-04-04-01 及 MAP-04-04-02 經

過活性分析，得知其抑制微生物 E. coli, S. aureus, P. aeruginosa 生長之

MIC 值分別為 5, 2.5, 2.5 μM 及 5, 5, 5 μM，溶血性測試結果分別為 15.81

%及 13.86 %。圓二色光譜分析得知胜肽在十二烷基硫酸鈉（SDS）環境

下，α-螺旋 %（α-helix %）分別為 77.73 %及 87.59 %。根據探討內外

膜機制之實驗結果，證實胜肽破壞細菌外膜及內膜所需之時間分別為

100 分鐘及 180 分鐘，並發現環狀胜肽不但可以增加抗菌效率，且抗菌

機轉有別於線性胜肽，即不是以 α-螺旋結構進行破膜而達到其抑菌效

果。另一方面，將胜肽環化不但增加抗菌能力，還降低溶血性的副作用。

從圓二色光譜分析可知，胜肽在蒸餾去離子水（DDW）或十二烷基硫

酸鈉（SDS）的溶劑中，其二級結構沒有顯著的差異。本研究之結論為：

MAP-04-04-01 及 MAP-04-04-02 為最具有抗菌潛力之胜肽。環化有助於

增加抗菌能力及降低溶血性，且可進一步探討研究抗菌機轉。研究成果

有助於研發低副作用、高選擇性之抗菌藥物，以期廣泛地應用於治療致

病菌引起的疾病。

關鍵字：抗生素、抗藥性、抗微生物胜肽、Ixosin-B、固相胜肽合成法、

環狀胜肽、抗菌作用機制

II

Abstract

The excessive use of classical antibiotics has led to the increased pathogens resistance, and

the antimicrobial peptides are the greatest potential to represent such a new class of antibiotics.

The antimicrobial peptides is the main component of innate immunity, with broad-spectrum,

efficient, selectivity, stability and difficult to produce drug resistance. Recently, we reported a

peptide MAP-04-04 (KRLRRVWRRWR), an analog of Ixosin-B-amide

(QLKVDLWGTRSGIQPEQHSSGKSDVRRWRSRY), which exhibited antibacterial activity with

very low hemolytic effect. The aim of this study is to develop analogs of MAP-04-04 as

antimicrobial agents, to establish bioassays for antimicrobial activity, and to study the mechanism

of antimicrobial action. A series of peptide analogs, including the amino acid substituted and

cyclic peptide analogs, were designed on the basis of the amino acid sequence of MAP-04-04.

Peptides were synthesized under the optimized conditions by solid phase peptide synthesis,

followed by RP-HPLC purification and MALDI-TOF MS characterization of synthetic peptides.

Finally, each peptide was assayed for the antimicrobial activity to analyze its inhibitory effect on

bacterial growth and for hemolytic activity. Additionally, the mechanism of antimicrobial action

were investigated. Results indicated that the minimal inhibitory concentrations of MAP-04-04-01

and MAP-04-04-02 against E. coli, S. aureus, P. aeruginosa are 5, 2.5, 2.5 μM and 5, 5, 5 μM,

respectively, and their hemolytic activities are 15.81 % and 13.86 %, respectively. By

deconvoluting the CD spectra, the α-helical contents of MAP-04-04-01 and MAP-04-04-02 which

were dissolved in sodium dodecyl sulfate （SDS） solution were determined as 77.73 % and 87.59

%, respectively. Results of the experiments for studying the membrane permeabilization

mechanism demonstrated that these peptides required 100 min and 180 min to destroy the outer

and inner membrane, respectively; in addition, the cyclic peptide increased the antimicrobial

activity, but its antimicrobial mechanism was not the same as that of the linear peptide in which

the α-helical structure is essential for penetrating membranes to achieve antibacterial effect.

Cyclization of peptide not only enhanced the antimicrobial activity, but also reduced the side

effect- the hemolytic activity. The CD spectra showed that there is no significant difference in the

secondary structures between peptides dissolved in distilled deionized water（DDW）and peptides

dissolved in sodium dodecyl sulfate（SDS）solvent. Conclusions：Biological results showed that

MAP-04-04-01 and MAP-04-04-02 were the most potent antimicrobial peptides. Cyclization was

contributive to the increased antimicrobial activity, the reduced hemolytic activity, and the

investigation of the mechanism of antimicrobial action. Results of these studies should be useful

for developing antibacterial drugs with high selectivity and the least side effects which can be

used for the treatment of diseases caused by pathogenic bacteria.

Keywords: Antibiotics, Drug resistance, Antimicrobial peptide, Ixosin-B, Solid phase peptide

synthesis, Cyclic peptide, Mechanism of antimicrobial action

III

目錄

中文摘要.....................................................................................................I

英文摘要...................................................................................................II

圖目錄.......................................................................................................V

表目錄.....................................................................................................VII

附錄.......................................................................................................VIII

名詞縮寫對照表......................................................................................IX

第一章研發抗微生物胜肽之重要性......................................................1

1-1 前言.................................................................................................1

1-2 細菌的種類及結構特性.................................................................2

1-2-1 細菌的種類及其細胞壁的結構...........................................2

1-2-2 原核生物及真核生物之細胞膜的組成.…………....……..4

1-3 抗微生物胜肽之簡介……………………………...…..…………6

1-3-1 抗微生物胜肽的結構與特性…………………….....……..6

1-3-1-1 α-螺旋（α-helix）結構之抗菌胜肽……………...….7

1-3-1-2 β-摺疊（β-sheet）結構之抗菌胜肽………….……...9

1-3-1-3 延展結構（Extended-structure）之抗菌胜肽….……11

1-3-1-4 環型結構（Loop-structure）之抗菌胜肽....…………12

1-3-2 抗微生物胜肽的殺菌機制……...……………..…………12

1-3-3 抗微生物胜肽的臨床應用…………………..…………...17

1-4 研究動機….……………………………………………………..19

1-5 國內外相關研究之情況及重要參考文獻之評述………….…..20

第二章實驗材料與方法……………………………………….……...23

2-1 抗微生物胜肽之設計……………………………...……………25

2-2 固相胜肽合成法原理…….……………………………...……...27

2-2-1 固相胜肽合成法的實驗流程……………………..……...27

2-2-2 環狀胜肽合成法的實驗流程………………...…………..34

2-3 Ninhydrin test 原理…………………...………………………….37

2-4 高效能液相層析法原理 ……………………………………….39

2-4-1 材料與方法…..………………………………..………….40

2-4-2 實驗步驟…..…………………………..………………….41

2-5 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜法簡介及原理…….…..42

2-5-1 MALDI-TOF MS的應用與優勢………………..….…..43

2-5-2 MALDI-TOF MS的實驗材料、試劑和設備………….44

2-5-3 MALDI-TOF MS的基質溶液與標準溶液配製方法….45

2-5-4 MALDI-TOF MS的待測樣品製備方法……..……..….46

IV

2-6 細菌培養之常用藥品試劑及設備……………………..……….47

2-6-1 細菌培養基的配製……………………..………………...48

2-6-2 無菌操作台及容器的滅菌方法..……………..………….48

2-6-3 細菌冷凍保存的方法.........................................................49

2-6-4 冷凍細菌活化的方法…………………..………………...50

2-6-5 紅血球冷凍保存及使用方法………………..…………...50

2-7 細菌之培養及抗菌功效測試方法之建立...................................51

2-7-1 細菌的接種（劃碟法）………………….………..………..51

2-7-2 細菌的培養（液態培養）............................................…….52

2-7-3 細菌數目的測量………………………………..………...53

2-7-4 抗微生物胜肽的粗篩方法………………………..……...55

2-7-5 抗微生物胜肽活性的評估方法MIC, MBC的制定……..55

2-8 溶血性分析……….………………………………..…….……..56

2-9 抗菌機制分析….............………………....................................58

2-9-1 胜肽破壞細菌外膜之分析…………………..…..……….59

2-9-2 胜肽破壞細菌內膜之分析……………………..…..…….60

2-10 圓二色光譜原理…………………………………..……….…..62

2-10-1 圓二色光譜波長範圍………………………..……….…62

2-10-2 圓二色光譜實驗條件………………………..……….…62

2-10-3 圓二色光譜標準曲線…………………………..…….…63

第三章實驗結果與討論……………………………….………...……64

3-1 抗微生物胜肽製備……………………...………………………64

3-2 細菌活性測試…………………………….……………………..66

3-3 溶血性分析結果……………………………..………………….69

3-4 胜肽破壞細菌外模之分析結果…………………….…..………71

3-5 胜肽破壞細菌內模之分析結果………………….….……….…76

3-6 圓二色光譜結果…………………………….…….………….…81

第四章結論…………………………………………..……….…….…91

第五章未來展望………..………………………………….………….92

第六章參考文獻…………………………………….…………..….....93

V

圖目錄

圖ㄧ、革蘭氏陽性菌的胜醣層結構。…...………...……………....……2

圖二、革蘭氏陽性菌的細胞壁結構。…...………...………...………….3

圖三、革蘭氏陰性菌的細胞壁結構。……………...……….…………. 4

圖四、微生物與人類細胞膜的結構比較。………...…………….……. 5

圖五、抗菌胜肽對多細胞生物膜上分子的辨別。....………..….…….13

圖六、抗微生物胜肽的作用模式。……………..……..….……….…..14

圖七、抗微生物胜肽在細菌細胞內的抗菌機轉。……………………16

圖八、實驗流程圖。………………………………………………..…..24

圖九、抗微生物胜肽之螺旋輪狀（helical wheel）圖。………...……26

圖十、Piperidine去除胺基酸N端保護基Fmoc之反應機構。…….…..30

圖十一、以TFA裂解胜肽之反應機構。…………….…….………..…30

圖十二、固相胜肽合成法流程圖。……………….…………………..31

圖十三、環狀胜肽合成法流程圖。…………………...………………36

圖十四、Ninhydrin反應機制。……………………..………………..37

圖十五、Ninhydrin實驗結果圖。……..………………………….…..37

圖十六、MALDI-TOF MS之作用原理簡圖。…….………………..42

圖十七、劃碟方式。……………………………………………..……52

圖十八、菌液的稀釋。……..…………………………………….…...54

圖十九、Nitrocefin 之反應機制。………………………………….....60

圖二十、ONPG 之反應機制。………………………………………..61

圖二十一、圓二色光譜標準曲線圖。…..….…….….……………..…63

圖二十二、濃度 5 μM 之不同胜肽的動力學分析結果圖。………….72

圖二十三、MAP-0403 之動力學分析結果圖。……….……...…….73

圖二十四、MAP-0404 之動力學分析結果圖。….…………………73

圖二十五、MAP-0404-01 之動力學分析結果圖。…………………74

圖二十六、MAP-0404-02 之動力學分析結果圖。………………....74

圖二十七、MAP-0405-L 之動力學分析結果圖。............................75

圖二十八、MAP-0405-C 之動力學分析結果圖。………………....75

圖二十九、濃度 5 μM 之不同胜肽的動力學分析結果圖。…...…...77

圖三十、MAP-0403 之動力學分析結果圖。…….…….………….78

圖三十一、MAP-0404 之動力學分析結果圖。…………..…..…..…78

圖三十二、MAP-0404-01 之動力學分析結果圖。………….………79

圖三十三、MAP-0404-02 之動力學分析結果圖。………………....79

圖三十四、MAP-0405-L 之動力學分析結果圖。………….………..80

圖三十五、MAP-0405-C 之動力學分析結果圖。……….……..…..80

圖三十六、MAP-04-03 之圓二色光譜圖。…………….…………...84

VI

圖三十七、MAP-04-04 之圓二色光譜圖。…………..…………..84

圖三十八、MAP-04-04-01 之圓二色光譜圖。……….....………...85

圖三十九、MAP-04-04-02 之圓二色光譜圖。…………………...85

圖四十、MAP-04-05-L 之圓二色光譜圖。……………………...86

圖四十一、MAP-04-05-C 之圓二色光譜圖。…………………….86

VII

表目錄

表一、α-螺旋的抗菌胜肽之結構及抗菌活性…………….……………8

表二、β-褶板的抗菌胜肽之結構及抗菌活性……….………………..10

表三、環狀抗菌胜肽之結構及抗菌活性……………….…….………..11

表四、已經被開發至臨床研究階段的抗微生物胜肽………………..18

表五、抗微生物胜肽之胺基酸序列…………………………………..26

表六、固相胜肽合成之藥品...………………………………………...32

表七、固相胜肽合成之胺基酸試劑…………………………….........33

表八、環狀胜肽合成實驗材料、試劑、儀器設備和購買廠商….....35

表九、Ninhydrin 材料、試劑…………………………….……....38

表十、逆相高效能液相層析法所需耗材與設備……….…...….….41

表十一、基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀操作參數設定

………………………………………………….…………..45

表十二、基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀，所需之試劑…46

表十三、細菌培養相關實驗之藥品、試劑、設備及購買廠商….47

表十四、細菌之菌株………………………………………….…...51

表十五、溶血性分析相關實驗之藥品、試劑、設備及購買廠商...57

表十六、E. coli ML-35p相關實驗之藥品、試劑、設備及購買廠商

………………………………………………………...……..59

表十七、合成的抗微生物胜肽之物理化學性質………………….….65

表十八、抗微生物胜肽的最小抑制濃度（MIC）…………….…….67

表十九、抗微生物胜肽的最小殺菌濃度（MBC）………………….68

表二十、抗微生物胜肽的溶血性百分比…………………….……….70

表二十一、K2D2軟體預估胜肽二級結構的比例…………….……....83

VIII

附錄

附錄一、MAP-04-03 的 RP-HPLC 層析圖。…………………..…..99

附錄二、MAP-04-04 的 RP-HPLC 層析圖。……………………..100

附錄三、MAP-04-04-01 的 RP-HPLC 層析圖。…………………101

附錄四、MAP-04-04-02 的 RP-HPLC 層析圖。…………………102

附錄五、MAP-04-05-L 的 RP-HPLC 層析圖。……………….…..103

附錄六、MAP-04-05-C 的 RP-HPLC 層析圖。…..………………104

附錄七、MAP-04-03 純化後的 MALDI-TOF MS 質譜圖。….....105

附錄八、MAP-04-04 純化後的 MALDI-TOF MS 質譜圖。….....105

附錄九、MAP-04-04-01 純化後的 MALDI-TOF MS 質譜圖。....106

附錄十、MAP-04-04-02 純化後的 MALDI-TOF MS 質譜圖。....106

附錄十一、MAP-04-05-L 純化後的 MALDI-TOF MS 質譜圖。..107

附錄十二、MAP-04-05-C 純化後的 MALDI-TOF MS 質譜圖。..107

附錄十三、MAP-04-03在 K2D2線上比對之CD 結構預測圖。…..108

附錄十四、MAP-04-04在 K2D2線上比對之CD 結構預測圖。…..109

附錄十五、MAP-04-04-01在K2D2線上比對之CD結構預測圖。..110

附錄十六、MAP-04-04-02在K2D2線上比對之CD結構預測圖。..111

附錄十七、MAP-04-05-L在K2D2線上比對之CD結構預測圖。...112

附錄十八、MAP-04-05-C在K2D2線上比對之CD結構預測圖。...113

IX

名詞縮寫對照表

ACN Acetonitrile

AMPs Antimicrobial peptides

AM resin Phenoxyacetamido-norleucylaminomethyl resin

CD Circular Dichroism

CFU Colony forming unit

α-CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

CL Cardiolipin

DCM Dichloromethane

DDW Distilled deionized water

DIEA N,N-Diisopropylethylamine

DMF N,N-Dimethylformamide

EDT 1,2-Ethanedithiol

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

HBTU 2-（1H-Benzotriazole-1-yl）-1,1,3,3-tetramethyluronium

hexafluorophosphate

HOBT 1-Hydroxybenzotriazole

HPLC High performance liquid chromatography

IM Inner membrane

LB Luria-Bertani

LPS Lipopolysaccharide

MALDI-TOF Matrix assisted laser desorption ionization - time of flight

MS Mass Spectrometry

MBC Minimum Bactericidal Concentration

MIC Minimum Inhibitory Concentration

MH Mueller-Hinton

NAG N-acetylglucosamine

NAM N-acrtylmuramic acid

Nitrocefin 3-（2,4-Dinitrostyryl）-（6R, 7R）-7-（2-thienylacetamido）

-ceph-3-em-4-carboxylic Acid, E-isomer

NMM N-methylmorpholine

NMR Nuclear Magnetic Resonance

OD Optical density

ONPG O-Nitrophenyl-β-galactoside

PA Phosphatidic acid

X

PBS Phosphate buffered saline

PC Phosphatidylcholine

PE Phosphatidylethanolamine

PG Phosphatidylglyceral

PI Phosphatidylinositol

PMX Polymyxin B sulfate

PS Phosphatidylserine

Rink amide 4 -（2,4 - Dimethoxyphenyl）

RBC Red blood cell

Rt Retention time

RP-HPLC Reverse phase - high performance liquid chromatography

SDS Sodium dodecyl sulfate

SPPS Solid phase peptide synthesis

SM Sphingomyelin

TA Teichoic acids

TFA Trifluroroacetic acid

UV Ultraviolet

1

第一章研發抗微生物胜肽之重要性

1-1 前言

近年來因為抗生素的濫用，醫院已經成為培養許多致命細菌的溫

床。例如：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）可存活於許多

醫療器材，在靜脈內導尿管（intravenous cathetertubes）中，發現有

約一半的細菌對青黴素（methicillin）具有抗藥性1；另外，萬古黴素

抗藥性腸球菌（vancomycin-resistant enterococci, VRE）也是醫院院內

感染常見的病原菌2。這些具有抗藥性的細菌可透過質體將抗-抗生素

之基因傳遞，使得抗生素對這些細菌失去抗菌功效。因此，新一代的

抗生素之開發是刻不容緩的。

相較於傳統的抗生素，抗微生物胜肽（antimicrobial peptides,

AMPs）具有廣泛及迅速之抗菌功效、殺菌所需劑量少、不易造成微

生物的抗藥性..等優勢，因此很適合開發成為具潛力的抗微生物藥

物。抗微生物胜肽主要的功能是幫助生物體抵禦或撲殺外來的病原

體，也可能經由刺激免疫細胞，而增強生物體對抗疾病的免疫力，例

如：抗微生物胜肽對於細菌、真菌、病毒及寄生蟲具有去活性、直接

殺死細胞或抑制細胞生長等作用。

2

1-2 細菌的種類及結構特性

1-2-1 細菌的種類及其細胞壁的結構

依照細胞壁結構組成的不同，可利用革蘭氏染色法將細菌區分為

革蘭氏陽性菌（ Gram-positive bacteria ）與革蘭氏陰性菌

（Gram-negative bacteria）。

細胞壁是原核細胞中最重要的結構之一，不但有支持與保護細胞

的作用，還可以幫助細胞膜決定進出細胞的物質。細胞壁中主要是由

N-acetylglucosamine（NAG）與 N-acrtylmuramic acid（NAM），並和

一群由胺基酸形成的四胜肽鏈及六甘胺酸鏈交互連結而形成網狀的

胜醣層（peptidoglycan）結構 3（圖一）。

圖一、革蘭氏陽性菌的胜醣層結構。

（Copyright © 2010 Pearson Education, Inc.）

（資料來源：http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap04/lecture4.htm）

https://zh.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%A9%E5%85%B0%E6%B0%8F%E9%98%B4%E6%80%A7%E8%8F%8Chttps://zh.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%A9%E5%85%B0%E6%B0%8F%E9%98%B3%E6%80%A7%E8%8F%8Chttps://zh.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%A9%E5%85%B0%E6%B0%8F%E9%98%B3%E6%80%A7%E8%8F%8Chttp://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap04/lecture4.htm

3

革蘭氏陽性菌的細胞壁中有革蘭氏陰性菌沒有的磷壁酸

（teichoic acids, TA）和醣醛酸磷壁酸質酸（teichuronic acid），其中兩

者的組成都是透過磷酸基團相互連接甘油或核糖醇的聚合物 3（圖

二）。

圖二、革蘭氏陽性菌的細胞壁結構。



革蘭氏陰性菌的細胞壁雖然比革蘭氏陽性菌還要薄，但在其細胞

壁外多了一層由磷脂（phospholipids）雙層、脂蛋白及脂多醣

（lipopolysaccharide, LPS）組成的外膜 3（圖三）。

4

圖三、革蘭氏陰性菌的細胞壁結構。



1-2-2 原核生物及真核生物之細胞膜的組成

細胞膜基本上都是由雙層磷脂質所組成，且都擁有親水性

（hydrophilic）及疏水性（hydrophobic）區域的雙性（amphipathic）

結構。然而原核和真核細胞之間的細胞膜組成卻有明顯的差異。

在革蘭氏陽性菌（例如：枯草桿菌）中，其細胞膜主要由帶負電

荷的磷脂醯甘油（phosphatidylglyceral；PG）及少量的兩性磷脂醯乙

醇胺（phosphatidylethanolamine；PE）和雙磷脂酸甘油（cardiolipin；

CL）組成。4,5

在革蘭氏陰性菌（例如：大腸桿菌）中，其細胞膜主要由兩性磷

脂醯乙醇胺（phosphatidylethanolamine；PE）和帶負電荷的磷脂醯甘

油（phosphatidylglyceral；PG）組成。4,5,6

在哺乳類細胞（例如：人類紅血球）中，其外膜主要是由無電荷

5

的磷脂醯膽鹼（ phosphatidylcholine ； PC ）和神經鞘磷脂

（sphingomyelin；SM）組成，而內膜則主要由兩性磷脂質的磷脂醯

乙醇胺（phosphatidylethanolamine；PE）及其他少量帶負電荷的磷脂

醯絲胺酸（phosphatidylserine；PS）、磷脂醯肌醇（phosphatidylinositol；

PI）和磷脂酸（phosphatidic acid；PA）組成。6,7

根據（圖四）可以發現在原核或真核細胞中細胞膜的組成有所差

異8，而這些差異可以提供設計抗微生物胜肽在對微生物或宿主細胞

具有選擇性時一個重要的依據。

圖四、微生物與人類細胞膜的結構比較8。

比較細菌（E. coli, S. aureus 或 B. subtilis）及真菌（C. albicans）病原體和人類

紅血球細胞膜之間磷脂質的組成及膜內外葉的分布情形。圖中細胞膜的組成範圍

從帶負電荷（左邊）至帶兩性離子或不帶電荷（右邊）的磷脂質依序為 CL、PG、

PE、PC、SM 和固醇類（如：膽固醇或麥角固醇等, ST）。由圖中結果可以得知，

微生物病原體和人類紅血球之間磷脂質組成的差異，而這些差異說明為何抗菌胜

肽對微生物的親和性選擇會優先於宿主細胞。圖中白色柱狀為 E. coli；水平線

柱狀為 S. aureus；灰色柱狀為 B. subtilis；方格柱狀為 C. albicans；黑色柱狀為

人類紅血球。

6

1-3 抗微生物胜肽之簡介

抗微生物胜肽是廣泛地分布在自然界中，最早發展出的先天性免

疫系統。生物體內有許多非專一性的抵抗系統，對未曾遇過的外來物

具有類似免疫反應的功能，但不像後天免疫系統具有記憶性。抗微生

物胜肽的種類很多，可以從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、

脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物及人類中發現能夠有效抑制細菌生

長的胜肽，其中以昆蟲的抗微生物胜肽之種類最多9,10,11。

目前發現的抗菌胜肽絕大多是陽離子抗菌胜肽，因為胜肽中存在

帶正電荷胺基酸 arginine 及 lysine 比例較高，而且若將C端修飾為

醯胺基（amide），可加強胜肽之陽離子特性。除此之外，以螺旋輪

狀（helical wheel）圖來看，抗菌胜肽通常會形成雙性（amphipathic）

的結構，以一側為親水性區域，另一側為疏水性區域的方式存在。兼

具陽離子和雙性的特性，使得胜肽更容易和帶有陰離子的細胞膜或磷

脂雙層膜交互作用甚至嵌入到膜中。已經有許多的機制可以用來說明

胜肽作用的模式，如：桶狀穿鑿（barrel stave）、地毯狀吸附（carpet）

或是超環面孔洞機制（toroidal pore）等。12,13,14

1-3-1 抗微生物胜肽的結構與特性

普遍抗微生物胜肽大約由12～50個胺基酸所組成，疏水性

（hydrophobic）占50 %以上，親水性（hydrophilic）大多數是帶正電

7

（一般約帶2～7個正電荷），主要由精胺酸（arginine）和離胺酸（lysine）

組成，而且若將C端修飾為醯胺基（amide），可加強胜肽之陽離子特

性。

抗微生物胜肽的種類很多、分布很廣，大部分的類型都是由疏水

性的胺基酸和帶正電的胺基酸所組成，通常以其二級結構來做分類。

第一類是具有雙極性的α-helix（螺旋）結構的胜肽；第二類是具有

β-sheet（摺板）結構的胜肽，包含2～4個雙硫鍵以穩定其結構（通常

這類胜肽含有一小段 α-helix結構）；第三類是富含有色胺酸

（tryptophan）、脯胺酸（proline）且形成延展（extend）結構的胜肽；

第四類是具有loop結構的胜肽。第三及第四類之胜肽較不常見10，而

帶負電的抗微生物胜肽目前被發現的很少，因此未被分類。

1-3-1-1 α-螺旋（α-helix）結構之抗菌胜肽

大多數帶正電抗微生物胜肽都會形成雙性結構（amphipathic

structure），在螺旋兩側將帶正電的親水性面和疏水性面分開，或者分

别集中在螺旋的N端或C端，形成明顯的親水端及疏水端和細胞膜結

合。此種抗菌胜肽可藉由親水性端的靜電相互作用聚集於帶負電的微

生物細胞膜上15；且藉由疏水端嵌入細胞膜內的醯基鏈區域16，造成

微生物細胞膜產生穿透性的孔洞，使得細胞膜內外的膜電位改變或是

細胞膜內外的離子濃度失去平衡而導致細菌的死亡。

8

從動物、植物、真菌至微生物等都會發現線性螺旋抗菌胜肽的存

在17（如表一）。例如：Cecropins是從惜古比天蠶（Hyatophora cecropia）

的蛹中發現由37個胺基酸所組成的抗菌胜肽18；Melittin是從蜜蜂的毒

液中發現由27個胺基酸所组成的抗菌胜肽19。LL-37是從人類（Homo

sapiens）的白血球中發現由37個胺基酸所组成的抗菌胜肽20。

表一、從脊椎和無脊椎動物中發現α-螺旋的抗菌胜肽之結構及抗菌活

性17。

活性代號：B：抗細菌；C：細胞毒素；F：抗真菌；H：溶血性；I：殺蟲劑；L：

類凝集素（胜肽與脂多醣結合）；T：trypanolytic activity；Y：造成酵母細胞的

溶解。*代表胜肽C端為醯胺基（amide）。1、2、3和4分別代表6-bromotryptophan、

dihydroxyresidues、3,4-dihydroxyphenylalanine 和5-hydroxylysine。三維結構部分，

分別為廄刺蠅（Stomoxys calcitrans）和非洲爪蟾（Xenopus laevi）身上所發現到

的抗菌胜肽Stomoxyn和Magainin。螺旋輪（helical wheel）狀圖是由惜古比天蠶

（Hyalophora cecropia）身上所發現到的抗菌胜肽Cecropins來呈現雙性結構的特

性。

9

1-3-1-2 β-摺疊（β-sheet）結構之抗菌胜肽

此類結構的抗菌胜肽通常含有數個成對的胱氨酸（cysteine）並

以雙硫鍵方式來幫助穩定結構，且結構中會含一小段α-helix；而雙硫

鍵會使胜肽呈現環狀結構或骨架環化來增加構造的剛性，並配合適當

比例的親水性及疏水性胺基酸來促使胜肽穿膜進而達到抗菌效果。

從自然界的生物中都可以發現到此種結構的抗菌胜肽存在17（如

表二和表三）。例如：Brevinins是從兩棲類動物（frog, Rana brevipoda）

皮膚上發現由24個胺基酸所組成的α-helix及一個雙硫鍵形成的

β-sheet之混和結構21；Defensins是從動物、植物、昆蟲的組織中發現

22，在哺乳類動物中可以分成α、β及θ-defensin三種，都是由三個雙硫

鍵組成的β-sheet環狀結構，其中θ-defensin是N端和C端相連的環狀結

構，而在植物或昆蟲中有些defensin是由雙硫鍵組成的β-sheet環狀結

構或α-helix/β-sheet混和的結構23。

10

表二、從脊椎和無脊椎動物中發現由一個或兩個雙硫鍵來形成β-褶板

的抗菌胜肽之結構及抗菌活性17。

活性代號：B：抗細菌；F：抗真菌；H：溶血性；Irh：鐵質調節激素；P：抗寄

生蟲；V：抗病毒；Y：造成酵母細胞的溶解。*代表胜肽C端為醯胺基（amide）。

Z代表N端的胺基酸為pyroglutamic acid。圖中以黑線相連代表雙硫鍵。灰色區域

代表 Thanatin 的 insect box, 以及 Brevinin-1 和 Esculentin-1 的 Ranabox。三

維結構部分，分別為斑腹刺蝽（Podisus maculiventris）和野猪（Sus scrofa）的

白血球中所發現到含有雙硫鍵的抗菌胜肽 Thanatin 和 Protegin-1。

11

表三、從脊椎和無脊椎動物中發現末端封閉的環化和末端開放的環狀

抗菌胜肽之結構及抗菌活性17。

紅線代表頭-尾相連。*代表胜肽C端為醯胺基（amide）。三維結構部分，分別為

伏蠅（Phormia terranovae），菸蚜夜蛾（Heliothis virescens），紫貽貝（Mytilus

galloprovincialis），穴兔（Oryctolagus cuniculus）和人類（Homo sapiens）身上

所發現到含有雙硫鍵的抗菌胜肽defensin-A、Heliomicin、defensin-1、α-defensin-1

和β-defensin-2。

1-3-1-3 延展結構（Extended-structure）之抗菌胜肽

此類結構的抗菌胜肽通常是某一種或幾種胺基酸比例特別多的

線性胜肽（arginine, glycine, histidine, proline或tryptophan），且會因不

同的胺基酸而有不同的抑制途徑，相對也會有不同程度的抗菌效果。

此種結構的抗菌胜肽在自然界的生物中鮮少被發現。例如：

Apidaecin24及Drosocin25是從胡蜂及果蠅的淋巴液中發現由大量的

12

proline所組成之18和19個胺基酸的短鏈胜肽26。Prophenin27及PR-3928

是從猪的嗜中性白血球中發現由大量的 proline/phenylalanine和

proline/arginine所組成之79和39個胺基酸的短鏈胜肽29。Indolicidin是

從牛（Bos Taurus）的嗜中性白血球中發現由大量的tryptophan所組成

之14個胺基酸的短鏈胜肽29。

1-3-1-4 環型結構（Loop-structure）之抗菌胜肽

此類結構的抗菌胜肽通常會含有一個雙硫鍵來形成環型結構，且

可以藉由搭配正電荷胺基酸來達到不錯的抗菌效果。

在自然界中，此種結構的抗菌胜肽存在較為稀少(如表二)。例

如：Thanatin是從斑腹刺蝽（Podisus maculiventris）上發現由21個胺

基酸所組成之高比例正電荷胺基酸arginine, lysine及C端醯胺基且一

個雙硫鍵形成的環型結構30。Bactenecin是從哺乳類動物（Bovine, Bos

Taurus）上發現由12個胺基酸所組成，其序列裡含有四個正電荷胺基

酸arginine及一個雙硫鍵形成的環型結構31。

1-3-2 抗微生物胜肽的殺菌機制

現今抗菌胜肽的殺菌機制相當複雜且繁多，許多與抗菌活性或選

擇性相關之胜肽因素如：長度、親水性、疏水性、電荷數、結構等都

可能影響其抗菌能力。

13

抗菌胜肽的作用機轉基本上是針對微生物或多細胞生物的細胞

膜進行破壞，其作用結果會隨著細胞膜上的組成而有差異 32（圖五）。

圖五、抗菌胜肽對多細胞生物膜上分子的辨別 32。

然而抗菌胜肽的殺菌機制主要分成細胞膜上抑制和細胞膜內抑

制兩種型式。抗菌胜肽在細胞膜上的眾多機制中33（圖六），以pore

formation為最常見的作用方式，其中以桶狀穿鑿模式（barrel stave

mode）34和地毯狀吸附模式（carpet mode）35,36兩種方式形成的pore

機制為主：

14

圖六、抗微生物胜肽的作用模式33。

1. 桶狀穿鑿之模式（barrel stave mode）

抗菌胜肽首先藉由靜電作用方式接近細胞膜並受到膜誘導成

α-helix的結構，並將數個胜肽結合起來垂直插入膜內，以疏水性面和

膜接觸，親水性面則是暴露在外，而形成圓桶狀的孔洞，使得細菌膜

內外壓力失去平衡而死亡。

2. 地毯狀吸附之模式（carpet mode）

抗菌胜肽首先藉由靜電作用方式接近細胞膜表面，在利用胜肽中

疏水性區域與細菌細胞膜表面磷脂質的部份結合，此時抗菌胜肽像地

毯一樣將細菌細胞膜表面覆蓋住，而當胜肽濃度累積到一定程度時，

15

便開始擾亂細菌細胞膜中磷脂質的結構，並藉由形成微胞的形式而造

成孔洞來破壞細菌細胞膜，使得細菌體內物質的流失而造成死亡。

抗菌胜肽除了在細胞膜上作用之外，還有另一種在細胞膜內的作

用機制，範圍包括細菌細胞壁、外膜、內膜、細胞質及核酸...等10(圖

七)，其抗菌機轉介紹如下：

1. 抑制細胞壁合成（Inhibit cell-wall synthesis）

胜肽會跟lipid II結合而抑制胜醣層前導物的形成，使細菌無法合成完

整的細胞壁。例如：Mersacidin37。

2. 改變細胞膜（Alter cytoplasmic membrane）

胜肽抑制跟細菌細胞膜間隔組成有關的蛋白質，使細胞無法正常分裂

而導致細胞膜的改變。例如：PR-3938, PR-2638, indolicidin39, microcin

2540。

3. 活化自溶素（Activation of autolysin）

胜肽會誘導Staphylococcus simulans自溶素產生而去抑制細胞膜對脂

磷壁酸（lipoteichoic acids, LTA）及醣醛酸磷壁酸質酸（teichuronic

acids）的利用。例如： N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase41。

4. 與DNA結合（Bind to DNA）

胜肽與 DNA 小凹槽（minor groove）結合而導致不能順利進行細胞

16

內正常代謝。例如：Buforin II42, tachyplesin43。

5. 抑制 DNA, RNA和蛋白質的合成

胜肽會進入大腸桿菌跟胸腺嘧啶（thymidine）、尿嘧啶（uridine）及

白胺酸（leucine）結合，使吸收受到阻礙而達到抑制 DNA 及 RNA

合成。例如：Pleurocidin44, dermaseptin44, PR-3938, HNP-145, HNP-245,

indolicidin39。

6. 抑制酵素活性（Inhibit enzymatic activity）

胜肽與真菌細胞膜上的受體結合並進入細胞質，使得在非裂解週期

（nonlytic）失去ATP而擾亂細胞週期（cell cycle）的進行。例如：

Histatins46

, pyrrhocoricin47

, drosocin47

, apidaecin47。

圖七、抗微生物胜肽在細菌細胞內的抗菌機轉10。

17

1-3-3 抗微生物胜肽的臨床應用

由於抗生素的過度使用，長時間下來造成細菌突變而產生抗藥

性，因此產學界致力於尋找並研發新型抗微生物藥物來解決抗藥性問

題。抗微生物胜肽分子量小容易被代謝吸收，且除了具有抗細菌活性

外，對寄生蟲、真菌、病毒、癌细胞也都有一定殺傷作用，甚至不易

使細菌產生抗藥性突變等優點，因而被認為具有開發成為抗菌藥物的

價值。

至今有多種抗微生物胜肽已經被開發到臨床應用的階段（表四）

48，例如：Omiganan（MX-226/ MBI-226）被用於治療插管相關的感

染, 已進入Phase III臨床試驗；Iseganan（IB-367）被用於治療接受放

射治療患者的口腔黏膜炎，已進入Phase III臨床試驗；hLF1–11被用

於治療幹细胞移植手術中的细菌和真菌感染，已進入Phase II臨床試

驗。

18

表四、已經被開發至臨床研究階段的抗微生物胜肽 48

19

1-4 研究動機

根據 Liu 等人報導的抗菌胜肽 Ixosin-B49 （胺基酸序列為

QLKVDLWGTRSGIQPEQHSSGKSDVRRWRSRY ）對大腸桿菌

（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及白

色念珠球菌（Candida albicans）均具有不錯的抗菌效果，因此本實驗

室對此胜肽進行構效關係研究（ structure activity relationship

studies ）；而實驗室在 2012 年發表的 MAP-04-0450 胜肽

（KRLRRVWRRWR）即為Ixosin-B之小分子衍生物，具有抑制大腸

桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌生長之功效及極低的溶血性；因

此，選擇MAP-04-04作為研發抗菌試劑之先導物（lead compound）。

本研究之目的為：（1）設計並合成MAP-04-04之胜肽類緣物；（2）

建立評估抗微生物活性之測試；（3）探討抗菌作用機制之實驗。根

據本研究之實驗結果，未來可以大量合成抗菌功效最佳之胜肽衍生

物，進行構形研究（conformational studies），提出具有生物活性之抗

菌胜肽的模型，以期研發胜肽類緣物成為治療用的抗菌試劑。研究成

果將有助於研發低副作用、高選擇性之抗菌藥物，以廣泛地應用於治

療致病菌引起的疾病。

20

1-5 國內外相關研究之情況及重要參考文獻之評述

自然產生的抗微生物胜肽可作為真核細胞對抗細菌、原生動物、

真菌和病毒的第一道化學的防禦32。抗微生物胜肽存在於細菌、真菌、

植物和動物中；許多從自然界分離出的抗菌胜肽或合成的抗菌胜肽已

被發現具有廣泛的抗菌活性。大多數抗菌胜肽證實可殺死革蘭氏陽性

和革蘭氏陰性菌，有些抗菌胜肽則被證實具有抗癌和抗病毒的活性51。

Oren等人（2000）研究一系列具有相同序列、包含疏水性和帶正

電荷的胺基酸之胜肽類似物，探討其線性對螺旋形成、生物功能、膜

結合性和膜滲透性之影響52。研究發現環化反應提高了胜肽在溶液或

在SDS中形成低聚肽的可能性。此研究建議可能還有其他的因素會造

成線性（直鏈）和環狀胜肽的抗菌活性之差異。結果證實線性並不是

影響兩性、螺旋狀胜肽之細胞溶解活性的先決條件；而是影響其對革

蘭氏陽性和陰性細菌及細菌和哺乳動物細胞之間的選擇性。此研究證

明：環化反應提供了開發新的抗菌胜肽之方式，有助於研發治療感染

性疾病的抗菌胜肽。

Unger等人（2001）發表線性（直鏈）和環狀的magainin 2及melittin

胜肽類似物的合成，以及結構、生物功能和胜肽與膜相互作用的研

究，並探討胜肽之線性對其作用機制之影響53。環化改變了magainin 2

及melittin胜肽類似物與磷脂膜之結合；然而，線性和環狀類似物都保

21

留了高度的膜滲透性。此外，當環狀類似物結合到膜上仍保留75 %

線性胜肽的螺旋結構。生物活性研究證明，環化增加了melittin類似物

的抗菌活性，但降低其血溶活性，而magainin 2的抗菌和溶血性則顯

著地降低。研究結果證明：干擾目標磷脂膜沒有必要胜肽一定是線性

的；線性只是提供胜肽與磷脂膜接觸的一種手段，疏水性及靜電作用

力亦可影響胜肽與磷脂膜之結合53。

Dathe等人（2004）報導含有R-和W-的胜肽經過環化反應後，明

顯地增強其活性及對細菌的選擇性。結果證明：應用環化反應來設計

抗菌胜肽的策略是極具有潛力的54。Wessolowski等人（2004）報導環

化反應可誘導一些線性、富含R / W之胜肽的高抗菌活性；而效果最

明顯的是具有三個相鄰的芳香族殘基之胜肽55。

Rosengren等人（2004）報導pyrrhocoricin胜肽之環狀衍生物並證

實其在活體內之藥物特性，此環狀衍生物成為研發抗菌藥物之先導化

合物56。Leonard等人（2010）研究一些短的、富含色氨酸和精氨酸的

抗微生物胜肽類似物之血清穩定性57，研究發現環化方式對胜肽有不

同的影響，雙硫鍵之環化產生更具抗菌活性的胜肽，而骨幹之環化則

產生對蛋白質水解作用更安定的胜肽。

Shang等人（2012）報導中國林蛙皮膚的分泌物中一個富含有

Arg/His的陽離子抗菌胜肽chensinin-1與細胞膜的作用及其抗菌特性

22

58。Chensinin-1之胺基酸組成、序列以及非典型的結構與其他兩棲動

物的皮膚中已知的抗菌胜肽不同。Chensinin-1對革蘭氏陽性菌具有選

擇性的抗菌活性，對革蘭氏陰性菌則不具活性，且對人類紅血球不具

溶血性。圓二色光譜圖顯示其結構會隨環境不同而有所改變。革蘭氏

陽性菌-仙人掌桿菌之殺菌動力學（time-kill kinetic）研究結果顯示：

當其濃度為最小抑制濃度（MIC）的兩倍時，具有快速殺菌之效果。

Chensinin-1之後抗生素效應（PAE）大於5小時。研究與膜之交互作

用機制，偵測到chensinin-1造成帶負價的模型囊快速及大量的染色滲

漏；膜滲透測試結果亦證實chensinin-1促使仙人掌桿菌的細胞膜在一

分鐘內會被去極化，且使完整的細胞膜損壞造成細胞質流出。此外，

chensinin-1的主要作用目標為細菌的細胞膜，但卻無法克服革蘭氏陰

性菌外膜的脂多醣層，因為脂多醣層會促使chensinin-1產生寡聚作用

（oligomerization），防止此胜肽的移位（translocation）通過細菌外

膜。

抗微生物胜肽除了能直接撲滅病原菌外，也可應用於研發抗癌新

型用藥。但是目前發展抗微生物胜肽成為臨床藥物，所面臨的瓶頸及

挑戰是：專一性不高、容易有副作用及因穩定性不高，造成半衰期短；

因此，本研究針對這些特性，設計並合成一系列的胜肽衍生物以期提

高胜肽之抗菌活性、專一性和穩定性，並降低副作用。

23

第二章實驗材料與方法

本實驗之研究方法及流程如圖八所示：第一階段為胜肽之設計：

首先根據先導胜肽MAP-04-04之胺基酸序列設計一系列胺基酸置換

的線性胜肽以及環狀的胜肽；第二階段為胜肽之合成、純化及鑑定：

應用固相胜肽合成法研發最佳之反應條件以合成胜肽，再藉由

RP-HPLC純化及MALDI-TOF MS確認胜肽之純度及分子量；第三階

段為生物活性測試：細菌培養、抗菌活性測試、溶血性測試以評估胜

肽之抑菌功效；第四階段則為抗菌作用機制之探討：分析胜肽破壞細

菌內外膜之情形，並應用圓二色光譜法探討胜肽與膜作用之二級結構

變化。

24

圖八、實驗流程圖。

胜肽之設計：線性及環狀的胜肽

利用固相胜肽合成法及其他化學方法合成胜肽

利用 RP-HPLC 將胜肽進行純化分離

以 MALDI-TOF MS 鑑定純化後胜肽的分子量

探討胜肽與膜作

用之結構變化

進行一系列的生物活性測試

抗菌機制之分析

人類細胞

溶血性測試

抗微生物

活性測試

25

2-1 抗微生物胜肽之設計

胜肽的設計是根據本實驗室發表 Ixosin-B 類似物之 MAP-04-0450

(KRLRRVWRRWR-amide)為模板來作一系列胺基酸的置換並合成線

性與環狀胜肽。 (表五 )文獻報導指出胜肽序列中如富含精胺酸

(arginine, R)及色胺酸(tryptophan, W)的話則具有抗微生物之潛力，因

為精胺酸具有陽離子及氫鍵之特性，能夠藉由靜電作用與帶有陰離子

成分之細菌細胞膜反應，而色胺酸具有苯環結構且明顯偏愛脂質雙

層，因此能夠藉由擾亂細菌細胞膜並形成孔洞來達到抑制微生物生長

的效果 59。以 MAP-04-04(K1R2L3R4R5V6W7R8R9W10R11-NH2)線性胜肽

為設計模板將 R2 及 R9 分別置換成 W2 及 W9 而得到

MAP-04-04-01(K1W

2L

3R

4R

5V

6W

7R

8R

9W

10R

11-NH2) 及

MAP-04-04-02(K1R

2L

3R

4R

5V

6W

7R

8W

9W

10R

11-NH2) 線性胜肽，而

MAP-04-05-L(K1R

2L

3R

4R

5V

6W

7R

8R

9W

10R

11C

12-NH2) 線性胜肽及

MAP-04-05-C(Cyclic-(CH2CO-K1R

2L

3R

4R

5V

6W

7R

8R

9W

10R

11C

12)-NH2)

環狀胜肽則是分別將MAP-04-04胜肽序列增加C12並且將此胜肽進行

環化而得到。(圖九)

26

MAP-04-05-01, KRLRRVWRRWRC

MAP-04-03, KWLRRVWRWWR MAP-04-04, KRLRRVWRRWR

圖九、抗微生物胜肽之螺旋輪狀（helical wheel）圖。

MAP-04-04-02, KRLRRVWRWWR

Group Coloring Key

Nonpolar：

Polar, Uncharged ：

Acidic ：

Basic ：

MAP-04-04-01, KWLRRVWRRWR

表五、抗微生物胜肽之胺基酸序列

Peptide Amino acid sequence

MAP-04-03 H- K W L R R V W R W W R -NH2

MAP-04-04 H- K R L R R V W R R W R -NH2

MAP-04-04-01 H- K W L R R V W R R W R -NH2

MAP-04-04-02 H- K R L R R V W R W W R -NH2

MAP-04-05-L H- K R L R R V W R R W R C -NH2

MAP-04-05-C Cyclic-(CH2CO- K R L R R V W R R W R C )-NH

2

27

2-2 固相胜肽合成法原理

本實驗採用Rink amide AM resin當作起始胺基酸的固相支撐

物。首先將樹脂（ resin）上的 Fmoc-保護基（ 9-fluorenylmethyl

oxycarbonyl, Fmoc-protecting group）於鹼性條件下去除，因為Fmoc-

保護基不耐鹼。樹脂去除保護基後能夠與活化後胺基酸的C端形成胜

肽鍵鍵結（peptide bond）而使胺基酸固著於樹脂上。當第一個胺基

酸固著於樹脂上後，再次於鹼性條件下將第一個胺基酸N端的Fmoc

保護基（Nα-protection）去除後，使用耦合試劑（coupling reagents），

使第二個胺基酸的C端被活化，那麼第二個胺基酸才能被合成上去。

重覆上述步驟依序接上所有組成的胺基酸。最後利用化學裂解

（chemical cleavage）的方法以三氟醋酸（trifluoroacetic acid, TFA）

將胜肽從樹脂上分離60以及切除掉所有胺基酸上支鏈的保護基團後，

即可得到胜肽的粗產物。

2-2-1 固相胜肽合成法的實驗流程

首先將濾片粗糙面朝上放入 PD-10 column 中，把已退冰過的

Rink amide AM resin 樹脂秤取 0.125 mmole 置入 PD-10 column 中，再

將此 PD-10 column 放入 50 mL 的 polypropylene conical tube 中，以

免 PD-10 column 中的液體外漏。加入 5mL DCM 兩次，每次五分鐘。

每加入一次新試劑時都需利用真空抽氣裝置將前次溶劑抽乾，加入新

28

試劑後，放入離心管中，再利用自動旋轉機混合均勻。DCM 作用時

會產生氣體（DCM 為高揮發性氣體，樹脂上含有水氣，會與水反應，

因共沸點效應使沸點降低易揮發），故搖晃後需開蓋洩氣，DCM 其作

用為擴大 resin 孔洞以增加其反應性，另外還有去水的功能，若實驗

過程中含有水氣或者沒有添入能去水的試劑，胺基酸會因為水解而胜

肽鍵被切斷、去 Fmoc 的 N 端與水作用，造成實驗上的失敗；然後加

入 5 mL DMF 三次，每次五分鐘。DMF 在此作為溶劑可用來沖洗多

餘的反應物跟副產物，以及能使 resin 膨脹；之後則以 20 % Piperidine

5mL 三次，每次十五分鐘進行去 N 端保護基（Fmoc）的程序（圖十）。

DMF 與 Piperidine 以八比二的比例配置 20 %的溶液，Piperidine 用來

去除樹脂上-CONH2 端的 Fmoc，此步驟一旦開始則不能停止因為其

Fmoc 已被去除，N 端的氮帶負電荷反應能力高，所以需接上待接的

胺基酸；再加入 DMF 5mL 五次，每次五分鐘。洗去不需要的副產物

與溶劑準備接上胺基酸；製備胺基酸溶液並加入樹脂中開始

coupling，依合成長度不同，時間 1.5 hr 至 overnight 不等。胺基酸溶

液為先將管子以 DMF 清洗再依序加入 0.25 mmole 的胺基酸粉末、

0.25 mmole能活化胺基酸C端以利與樹脂NH-反應的HOBT和HBTU

粉末，並以 5 mL DMF 混合均勻，最後加入 87 μL 催化樹脂與胺基酸

反應的 DIEA（resin：amino acid：HOBT：HBTU：DIEA = 1：2：2：

29

2 ： 4 ），迅速倒入 PD-10 column 。 Coupling 完成後，

為了確保胺基酸有成功接上，我們利用Ninhydrin test 來檢驗。加入

DMF 5 mL 三次，每次五分鐘，可繼續進行耦合反應直到欲合成胜肽

完成。依序接上欲合成的胺基酸序列，序列若超過十個以上時，

coupling 的時間需加長、Piperidine 多一次，避免因為立體阻礙大而無

法接上胺基酸；若合成步驟未做完，以 DMF 沖洗和 DCM 去水之後

用石蠟膜將 PD-10 column 封口放入冰箱中，欲繼續合成，拿出冰箱

後需加入 DCM 去除水份在進行合成步驟。

合成完所需的序列之後則進行下一階段的去除樹脂「Cleavage」

（圖十一），加入 5 mL DCM 兩次，每次五分鐘；加入 5 mL DMF 三

次，每次五分鐘；20 % Piperidine 5 mL 三次，每次十五分鐘將最後一

次接上的胺基酸去掉保護基 Fmoc；加入 DMF 5 mL 三次，每次五分

鐘；加入裂解液，反應 24 小時。裂解液組成為 5 mL TFA、0.25 mL

DDW、0.25 mL thioanisole、0.125 mL EDT、還有一管加熱 75℃後的

1 mL phenol，TFA 的作用是將胜肽與樹脂的鍵結切斷以及切除胺基酸

的側鏈保護基；通入氮氣以去除 TFA。時間長短依體積不再變化和顏

色不再變淺而定；加入冰乙醚，加入後會產生白色沉澱，不以室溫下

乙醚反應的原因為溫度高會提高溶解度，不易發生沉澱作用；離心兩

次，3000 rpm，每次五分鐘。沉澱粉末經凍乾後回溶用 MALDL-TOF

30

MS 測其分子量，檢測是否成功合成，再利用 RP-HPLC 收集純化，

經 Mass 鑑定分子量後，最後經由冷凍乾燥機處理後即可獲得目標產

物。

NH

O

O

OCH3

OCH3

NH

O

O

HNH

NH

O

O

OCH3

OCH3

NH

CO2

圖十、Piperidine 去除胺基酸 N 端保護基 Fmoc 之反應機構。

NH

O

O

NH

OCH3

H3COHN

O

O

OO

H

HH2N

HN

O

O

OHO

圖十一、以 TFA 裂解胜肽之反應機構。

31

圖十二、固相胜肽合成法流程圖。

DCM to let resin swell for 5 mins

Fmoc-Rink amide AM Resin

DMF to remove DCM for 5 mins

20% Piperidine/DMF to let Fmoc deprotect for 15 mins

DMF to remove 20% Piperidine/DMF for 5 mins

Coupling the Fmoc-Cys(Trt)-OH withHOBT/HBTU/DIEA for 2 hours

H2N-Rink amide AM Resin

Fmoc-Cys(Trt)-NH-Resin

H2N-Lys-Arg-Leu-Arg-Arg-Val-Trp-Arg-Arg-Trp-Arg-Cys-NH2 乾燥



Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-Trp-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Trp-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-NH-Resin

H2N-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-Trp-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Trp-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-NH-Resin

repeat

deprotection

Using TFA/DDW/Thioansole/EDT/Phenol to cleavage the peptide from resin for 24 hours

32

表六、固相胜肽合成之藥品

使用時機英文縮寫結構用途購買來源

Preparation

Rink amide AM resin

[4-(2’,4’-dimethoxyphenyl-F

moc-aminomethyl)-phenoxya

cetamido-norleucylaminometh

yl resin]

NH

O

HNOCH3

H3CO

O

O

O

做為固相支撐物

讓胺基酸能夠依

序接連起來

NOVA

Biochem,

Xexman

DCM

(Dichloromethane)

去除水氣、

使樹脂膨脹

TEDIA,

USA

DMF

(N,N-Dimethylformamide)

沖洗樹脂上

的溶劑

TEDIA,

USA

Piperidine

去除 N 端

Fmoc 保護基

TEDIA,

USA

Coupling

Fmoc-a.a. (PG)-OH HNO

O

OH

O

R (PG)

胜肽序列

合成

Ana Spec,

USA

HOBT

(1-Hydroxybenzotriazole)

活化胺基酸 C 端

以利耦合作用

Ana Spec,

USA

HBTU

(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-

1,1,3,3-teramethyluronium

hexafluorphospate)

活化胺基酸 C 端

以利耦合作用

Ana Spec,

USA

DIEA

(N,N-Diisopropylethylamine)

催化樹脂

與胺基酸

Sigma-

Aldrich,

St. Louis,

MO, USA

Cleavage

TFA

(Trifluoroacetic acid)

將胜肽與樹脂鍵

結打斷、胺基酸

側鏈保護機去除

Alfa Aesar-

Lancaster

EDT

(1,2-Ethanedithiol) 輔助切除

Merck,

Whitehouse

Station, NJ,

USA

33

Thioanisole

輔助切除

Sigma-

Aldrich,

St. Louis,

MO, USA

Phenol

輔助切除 SHOWA,

JAPAN

表七、固相胜肽合成之胺基酸試劑

胺基酸 Fmoc保護基分子量

Alanine（Ala, A） Fmoc-Ala-OH 311.30

Cysteine（Cys, C） Fmoc-Cys（Trt）-OH 585.70

Aspartic acid（Asp, D） Fmoc-Asp（tBu）-OH 411.50

Glutamic acid（Glu, E） Fmoc-Glu（tBu）-OH 425.50

Phenylalanine（Phe, F） Fmoc-Phe-OH 387.40

Glycine（Gly, G） Fmoc-Gly-OH 297.30

Histidine（His, H） Fmoc-His（Trt）-OH 619.70

Isoleucine（Ile, I） Fmoc-Ile-OH 353.40

Lysine（Lys, K） Fmoc-Lys（Boc）-OH 468.55

Leucine（Leu, L） Fmoc-Leu-OH 353.40

Methionine（Met, M） Fmoc-Met-OH 371.50

Asparagine（Asn, N） Fmoc-Asn（Trt）-OH 596.70

34

Proline（Pro, P） Fmoc-Pro-OH 337.40

Glutamine（Gln, Q） Fmoc-Gln（Trt）-OH 610.70

Arginine（Arg, R） Fmoc-Arg（Pbf）-OH 648.80

Serine（Ser, S） Fmoc-Ser（tBu）-OH 383.40

Threonine（Thr, T） Fmoc-Thr（tBu）-OH 397.50

Valine（Val, V） Fmoc-Val-OH 339.40

Tryptophan（Trp, W） Fmoc-Trp-OH 426.50

Tyrosine（Tyr, Y） Fmoc-Tyr（tBu）-OH 459.60

2-2-2 環狀胜肽合成法的實驗流程

在合成線性胜肽和環狀胜肽時，差別在於，首先合成一個天然胺

基酸Cys（Trt）為第一個合在樹脂上，並利用硫醚鍵架橋（thioether

bridge）方式在液相中合成環狀胜肽。

序列合成完後將 4 倍過量的 chloroacetic anhydride 溶於 DMF 5

mL 和胜肽反應 24 小時，接下來加入裂解試劑（5 mL TFA、0.25 mL

DDW、0.25 mL thioanisole、0.125 mL EDT、1 mL phenol）反應 24 小

時讓胜肽自樹脂上切下，經由減壓過濾後，取得濾液，以氮氣吹除

TFA 直到體積不再變化為止，再加入 5 倍體積的冰乙醚幫助胜肽沉

澱，以 3000 rpm 離心兩次，每次五分鐘，去除乙醚層並加入少許的

35

ACN 和 DDW 回溶後進行冷凍乾燥後得到氯乙醯化線狀胜肽粗產

物。氯乙醯化線狀胜肽為環狀胜肽的前驅物，它在液相中弱鹼的條件

下（pH=8~11），可自行以硫醚鍵架橋方式環化成環狀胜肽。故將氯

乙醯化線狀胜肽粗產物經 RP-HPLC 純化後的稀釋液至於 10 mL 注射

筒中，以微量注射幫浦控制滴定速度（1 mL/h）滴入裝有 50 mL 二次

水之錐形瓶中，滴定前先加入 NMM（N-methylmorpholine）使水溶

液的 pH 值大於 10，滴定開始後固定時間以 pH meter 監控 pH 值，並

陸續以 NMM 調整錐形瓶中反應溶液之 pH 值，維持大於 8.5（Cys pKR

約等於 8.24），持續攪拌 24 小時，當反應完成後進行冷凍乾燥以得

到環狀胜肽粗產物。環狀胜肽粗產物以 RP-HPLC 進行分析確認純度

及滯留時間，純化並經 Mass 鑑定分子量後，再由冷凍乾燥機處理後

即可獲得目標產物。

表八、環狀胜肽合成實驗材料、試劑、儀器設備和購買廠商

材料、試劑、設備購買廠商

NMM（N-methylmorpholine） Acros Organics, Geel, Belgium

塑膠注射針（23 G × 1.25 R.B.） Taiwan TOP

塑膠注射針筒（10 mL） Taiwan TOP

微量注射幫浦 Kdscientific

酸鹼測定儀（pH meter） SUNTEX

加熱攪拌器 PANTECH

36

圖十三、環狀胜肽合成法流程圖。



Chloroacetylation by chloroacetic anhydride for 24 hours

Lyophilization and purification by RP-HPLC

Putting the peptide liquid to drop by drop in pH >8.5 solution with NMM

CH2

CH

NH

ArgTrpArg

Arg

Trp

Val

Arg

Arg

Leu

ArgLys N

H

C

CH2

S

O

C

O

NH2

Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-Trp-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Trp-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-NH-Resin

H2N-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-Trp-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Trp-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-NH-Resin

Cl-CH2-CO-NH-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-Trp-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Trp-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-NH-Resin

Cl-CH2-CO-NH-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Val-Trp-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Trp-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-NH2

Using TFA/DDW/Thioansole/EDT/Phenol to cleavage the peptide from resin for 24 hours

37

2-3 Ninhydrin test 原理

茚三酮（Ninhydrin）廣泛用於檢測一級和二級胺的結構。本實驗

利用茚三酮來檢測樹脂和胺基酸上的 N 端保護基 Fmoc 是否去除 61，

進而可得知胺基酸耦合反應有無成功。當茚三酮試劑加入含一級胺的

溶液中會呈現藍紫色；加入含二級胺溶液中呈現黃色。若胺基酸未接

上去保護基的-CONH2 端，即-CONH2 未被保護亦即-NH2 裸露，使溶

液成藍紫色。反應機制如圖十四，實驗結果如圖十五。

圖十四、Ninhydrin 反應機制。

（資料來源：http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/32/Ninhydrin_Reaction_Mechanism.svg）

圖十五、Ninhydrin 實驗結果圖。左邊透明為成功合上胺基酸；右邊

為失敗，未合上胺基酸的微量離心管。

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/32/Ninhydrin_Reaction_Mechanism.svg

38

實驗步驟

Coupling 完成後，利用 DMF 洗去殘留於樹脂上的副產物，並以

真空過濾裝置將 DMF 去除，挖取極少量的樹脂放入 eppendorf 中，

並加入各 2 μL 的 A、B、C 三種 Ninhydrin test 試劑後放在加熱盤上

以 95℃加熱三至五分鐘後觀察其顏色，若難判斷可以顯微鏡進一步

觀察，當樹脂顆粒呈黃色或無色時表示成功合上胺基酸。

Ninhydrin test 試劑：

A 液：茚三酮 500 mg 溶於 10 mL 正丁醇（n-butanol）

B 液：酚（Phenol）8 g（7.55 mL）溶於 2 mL 正丁醇

C 液：取 200 μL 濃度為 0.01 M 的氰化鉀（KCN），加入 9.8 μL 的吡

啶（pyridine）

表九、Ninhydrin 材料、試劑

材料、試劑購買廠商

Ninhydrin Alfa Aesar, UK

pyridine Riedel-de Haen, Germany

KCN 科成化學臺偉實業有限公司

n-butanol J.T.Baker, USA

Phenol SHOWA, JAPAN

39

2-4 高效能液相層析法原理

逆相高效能液相色譜層析法（reverse phase - high pressure liquid

chromatography, RP-HPLC）的原理是經由移動相（mobile phase）溶

劑的攜帶，將待測物（胜肽混合物）中複雜的胜肽成份，通過帶有非

極性官能基之固定相（stationary phase）管柱，不同胜肽的成分在非

極性固定相管柱間的差異（疏水性交互作用力的不同），達到分離的

效果。

逆相高效能液相色譜層析法的固定相管柱表面的填充材質通常

是鍵結很強的非極性官能基團，如由C4、C8、C18所組成的長烷鏈等。

由長烷鏈官能基團所組成的固定相管柱適用的pH值範圍為2～10。移

動相沖堤液則是極性強度偏中等的溶劑，如乙腈（氰甲烷）、甲醇等

與水所組成的混合物等。分離機制是利用胜肽混合物與固定相管柱間

的疏水性作用力（hydrophobic interaction）不同，而不同的胜肽成份

於移動相溶劑的沖堤下，各成分之滯留時間不同而加以分離出來，極

性最大的胜肽成份與管柱填充物表面間作用力最小，故最早被沖堤出

來；極性越小的胜肽成份與管柱填充物表面間作用力越強，故越晚被

沖堤出來。

40

2-4-1 材料與方法

管柱使用 C18 之半製備及分析型管柱；UV detector 為 D2燈，偵

測波長為 225 nm，此波長可偵測到蛋白質的胜肽鍵；半製備管柱的

固定移動相為 4 mL/min，分析型管柱的固定移動相為 1 mL/min；移

動相溶液組成分別為 A、B 液，其中溶液 A：4 L 的 DDW（distilled

deionized water）與 2 mL 的 TFA（trifluoroacetic acid）；溶液 B：4 L

的 ACN（acetonitrile）與 2 mL 的 TFA。移動相溶液皆含 0.05 %的 TFA

是利用共同離子效應防止胜肽解離及增加待測物的溶解度；起初以等

位梯度流洗的方式找出欲分析物質的滯留時間之移動相比例，時間總

長 30 分鐘，在此時間內移動相比例先由 A：B 為 90：10 至 10：90，

接著維持約為 1~3 分鐘的時間在 10：90 的比例中，將還殘留於管柱

中的樣品干擾物沖堤出來，之後用 7~10 鐘使 10：90 的比例回到 90：

10，使管柱回到起初的平衡狀態。逆相高效能液相層析法所需耗材與

設備如表十。

41

表十、逆相高效能液相層析法所需耗材與設備

實驗試劑、材料、儀器購買廠商

ACN（Acetonitrile） ECHO, Chemicals Co., Ltd

TFA（Trifluoroacetic acid） Lancaster

0.22 μm filter Millipore

玻璃過濾裝置 KONTES

Translucent Buchner Flasks KIMBLE

微量注射針（500 μL, 25 μL） HAMILTON

C18 column VYDAC

RP-HPLC（Pump L-2130、

UV detecter L-2400） HITACHI

2-4-2 實驗步驟

以 ACN 和 DDW 回溶經冷凍乾燥機凍乾的胜肽粗產物，再以針

筒吸取溶液，利用孔徑 0.22 μm 過濾器過濾粗產物溶液，將雜質去除

避免破壞管柱；進行逆相高效能液相層析儀的開機程序：分別由 DDW

+ 0.05 % TFA 和 ACN + 0.05 % TFA 當作移動相以梯度流洗方式沖堤

胜肽樣品，移動相亦需經過濾將雜質去除。最後收集欲收集之滯留時

間層析峰即可。

42

2-5 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜法簡介及原理

基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜法（Matrix assisted laser

desorption ionization - time of flight mass spectrometry；MALDI-TOF

MS）於1985年由德國科學家Michael Karas和Franz Hillenkamp共同提

出，其基質輔助雷射脫附游離法是藉由基質吸收雷射光的能量，將無

法吸收雷射光之分析物，利用基質的功能將雷射光能量傳遞給分析

物，讓分析物脫附為氣相離子，進入質量分析器，而這些氣相離子經

由外加電壓得到了相同的動能，進入無場區域飛行管中，依據分析物

離子到達偵測器的不同而達到質量分析的目的，基質所扮演的角色，

可使一些熱不穩定的分析物，因直接得到大量能量而產生熱裂解現

象，屬於軟性離子化法，現今常被應用於生化樣品的分析。（圖十六）

圖十六、MALDI-TOF MS之作用原理簡圖。（Bruker Daltonics）

43

2-5-1 MALDI-TOF MS的應用與優勢

MALDI-TOF MS 適用於各類型分子的分析，發展至今，廣泛的

使用於生物醫學的相關研究上，例如一般的胺基酸、胜肽、蛋白質、

DNA、RNA、高分子材料及碳水化合物等常利用MALDI-TOF MS 進

行分子量之確認。另外，質譜技術不僅應用在新藥研發上，還應用於

癌症的早期診斷、環境污染分析，未來可能協助醫藥界找到抗癌藥物。

MALDI-TOF MS具有一些其他質譜儀所沒有的優點，其主要的

優點如下：

（1）所需樣品量少

傳統的樣品製備，通常只需將等量基質溶液和分析物均勻混合，最後

取 1 μL混合液置於金屬盤上，在空氣中自然風乾即可進入

MALDI-TOF MS進行分析。

（2）操作簡單且分析快速

主要操作流程為將樣品盤放入MALDI-TOF MS中，等待真空抽至所

設定之值（通常為5×10-6 torr）後即可操作，從雷射轟擊樣品獲得一

張圖譜的時間僅需數秒鐘，因此適合用來鑑定各種生化分子。

（3）靈敏度高

MALDI是一個高靈敏度的分析方法，一般的生化分子其偵測極限可

低至fmole 左右，適合用來偵測真實樣品中含量較低的分析物。

44

（4）分子量偵測範圍廣

MALDI通常搭配TOF質量分析器，且導入以基質來輔助分析物脫附

游離之觀念，因此只要選擇適當之基質，便可偵測高分子量範圍之生

化分子。

（5）同時偵測多種分析物

MALDI可同時偵測多種分析物，因為其金屬盤通常能同時點數十至

數百個樣品，可同時將96個樣品點至金屬盤上進行分析。

2-5-2 MALDI-TOF MS的實驗材料、試劑和設備

本實驗之基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀（matrix assisted

laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry,

MALDI-TOF MS）裝置購自於Bruker Daltonics公司（Germany）產品，

型號：MicroFlex，具備一波長為337 nm的氮氣脈衝式雷射，其飛行

模式可分為直線型和反射型，飛行管長度分別為1.05 m和1.96 m，各

自有一偵檢器進行偵測，而本研究皆使用反射型模式進行操作，其質

譜儀操作參數設定（表十一）所示。應用基質輔助雷射脫附游離飛行

時間質譜儀偵測使用的基質溶液配製所需之試劑（表十二）。

45

表十一、基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀操作參數設定

操作參數設定 Reflector mode

Laser Frequency（Hz） 20

Ion Source 1（kV） 19.00

Ion Source 2（kV） 16.55

Lens（kV） 9.05

Reflector（kV） 20.00

Pulsed Ion Extraction（ns） 600

Laser shot 150

Laser energy（μJ/pulse） 71.0~71.5

2-5-3 MALDI-TOF MS的基質溶液與標準溶液配製方法

1. 飽和α-CHCA溶液：稱取10 mg的α-CHCA溶於1 mL的0.1 % TFA

溶劑中，其溶劑含50 %的ACN及50 %的純水。

2. seed-layer溶液：稱取2 mg的α-CHCA 溶於1 mL的0.1 % TFA溶劑

中，其溶劑含100 %的ACN。

3. 校正的標準溶液：取1 mg標準品，以去離子水配製成濃度為1.0

μM的水溶液作為校正的標準溶液。

46

表十二、應用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀偵測所需之試劑

藥品試劑購買廠商

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA

Acetonitrile ECHO, Chemicals Co., Ltd

質譜儀校正用標準品

Substance P

Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA Angiotensin I

Angiotensin II

Bradykinin

2-5-4 MALDI-TOF MS的待測樣品製備方法

一般傳統的製備方式，是將有吸光性質之有機酸溶於適合的有機

溶劑中當做基質溶液，基質溶液通常濃度皆趨於飽和狀態，先取1 μL

~ 2 μL的基質溶液於金屬盤上（air-dried），等待自然風乾，接著將基

質溶液以適當比例跟分析物溶液均勻混合後，再取1 μL ~ 2 μL混和液

置於剛剛風乾的基質固體上，形成雙層基質，利用雙層基質可以避免

胜肽受雷射轟擊片段碎裂。由於基質與分析物的莫爾濃度比大約在

1000：1以上，且混合液中含有大量的小分子有機酸與少量的分析物，

因此等溶液中的水與有機溶劑揮發後，在金屬盤上會形成共結晶

（co-crystallization），此時即可將金屬盤置入質譜儀中進行分析。

47

2-6 細菌培養之常用藥品試劑及設備

細菌培養相關實驗之常用藥品試劑及設備，分別購自於不同的廠

商，相關資料整理於（表十三）。

表十三、細菌培養相關實驗之藥品、試劑、設備及購買廠商

藥品、試劑、設備購買廠商

接種環

伸球企業有限公司 L 形玻璃棒

培養皿

酒精燈

LB broth培養基

Merck, Whitehouse

Station, NJ, USA MH broth培養基

Agar

96孔盤 GeneDirex

微量盤分光光譜儀

（VersaMax TM） Molecular Devices

McFarland Standard Creative Microbiologicals, Ltd.

48

2-6-1 細菌培養基的配製

1. 1.5 % Agar plate：將8 g LB（Luria-Bertani）粉末和6 g agar粉末溶

於400 mL去離子水中，攪拌溶解後放入滅菌釜中經高溫高壓滅菌

後再冷卻至40~60℃便可倒入plate（可倒20個plate），待凝固冷卻

後即可儲存於4℃冰箱備用。如欲配置含有ampicillin之1.5 % agar

plate的話，可待冷卻至40~60℃時添加100 μg/mL之ampicillin溶液。

2. LB培養溶液：將5 g LB粉末溶於250 mL去離子水中，攪拌溶解後

放入滅菌釜中經高溫高壓滅菌後，冷卻至室溫即可儲存於4℃冰箱

備用。

3. MH培養溶液：將11.5 g MH（Mueller-Hinton）粉末溶於500 mL去

離子水中，攪拌溶解後放入滅菌釜中經高溫高壓滅菌後再冷卻至

室溫即可儲存於4℃冰箱備用。

2-6-2 無菌操作台及容器的滅菌方法

無菌操作台未使用時會以紫外燈照射，保持操作台處於無菌的狀

態，使用之前會關閉紫外燈，以75 %的酒精（酒精能滲入細菌體內，

使組成細菌的蛋白質凝固。當高濃度的酒精與細菌接觸時，能使菌體

表面迅速凝固，形成一層包膜，阻止了酒精繼續向菌體內部滲透，而

使用70 %～75 %的酒精，既能使組成細菌的蛋白質凝固，又不會形

49

成包膜，能使酒精繼續向內部滲透，使其徹底消毒殺菌）由內往外擦

拭無菌操作台的檯面，並開啟無菌操作台風扇運轉10分鐘後，才開始

實驗操作。所有進入無菌操作台的器物均需先噴灑75 %酒精，有瓶蓋

的容器在旋開瓶蓋之前，需先經過以火燒烤的動作後，再行使用。使

用完畢之實驗器物皆需噴灑75 %酒精，並把不需要之器物丟入細菌專

用的垃圾桶或滅菌釜進行滅菌。

2-6-3 細菌冷凍保存的方法

細菌培養至半對數生長期（mid-log phase）在冷凍保存，可使細

菌處在於生長良好且增生率高之狀態。平均小量體積分裝於數個冷凍

保存管中，勿大量裝在一起，否則反覆冷凍、解凍及接種的過程，均

會增加污染或菌株死亡的機會。

首先把甘油及去離子水以1：4的比例混合，配製成100 mL甘油溶

液，經滅菌釜高溫高壓滅菌後，冷卻至室溫備用。將細菌液態培養於

2 mL LB broth培養液至半對數生長期。再把細菌懸浮液平均分裝於十

個已標示完全之冷凍保存管中，以3000 rpm離心5分鐘，去除上清液

後，每管加入1 mL 20 %甘油溶液（避免冷凍保存時，冰晶形成太快

破壞細菌），混合均勻並保存於-80℃冰箱，隔日再拿出來畫菌於agar

plate上以37℃培養，確認是否保存成功。

50

2-6-4 冷凍細菌活化的方法

冷凍細菌之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細菌

造成傷害，導致細菌之死亡。由於-80℃保存的細菌需較長的時間活

化，約需數日或繼代一至二代，其細菌生長或特性表現才會恢復正常。

首先把冷凍保存管由-80℃冰箱取出，立即放入 37℃水槽中快速

解凍，輕搖冷凍保存管使其在 1 分鐘內全部融化。以 75 %酒精擦拭

保存管的外部，移入無菌操作臺內。用接種環將細菌懸浮液劃線分離

於 agar plate 中，置入 37℃培養箱培養，隔日取活性較强的菌落用 LB

液態培養至半對數生長期，並繼代一至二代使細菌恢復活性。

2-6-5 紅血球冷凍保存及使用方法

取人體血液在 4℃下離心（3000 rpm）10 分鐘後去除上清液（血

清的部份），使用冰的 PBS（pH=7.4）清洗紅血球三次，在 4℃下離

心（3000 rpm）一分鐘後去除上清液，並將人體血液平均小量體積分

裝於數個冷凍保存管中，每管加入 1 mL 20 %甘油溶液，混合均勻並

保存於-80℃冰箱。

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2-7 細菌之培養及抗菌功效測試方法之建立62

細菌培養之方法首先將購買的菌（表十四），至洋菜膠培養基上，

作畫線分離培養或做成一系列之稀釋，或用無菌L型玻棒均勻塗抹，

以檢驗菌種之純度及活化情形，剩餘的菌株則全部移入其它培養基

內，並在37℃培養箱中培養菌株。細菌的培養及抗菌功效測試方法之

建立將主要分為5個步驟：一、細菌的接種（劃碟法）；二、細菌的

培養（液態培養）；三、細菌數目的測量；四、抗微生物胜肽的粗篩

方法；五、抗微生物活性的評估方法（MIC90、MBC）。實驗條件是

根據本實驗室王凱宣學長所建立的方法來進行測試。

表十四、細菌之菌株

菌株購買廠商

Escherichia coli（ATCC 25922）

財團法人食品工業發展研究所 Staphylococcus aureus（ATCC 25923）

Pseudomonas aeruginosa（ATCC 27853）

2-7-1 細菌的接種（劃碟法）

適用於細菌的純系培養、短暫保存純系細菌於培養基上。

方法與步驟：

1. 接種環使用前需以酒精燈火焰燒紅，在培養基空白處上輕搓數次

以達到冷卻接種環的效果。

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2. 以接種環輕刮單一菌落（colony forming unit, CFU），接種於新的

培養皿，並在上頭來回劃數條線，之後再將接種環用酒精燈燒紅，

每次劃線之前都需要經過酒精燈燒紅滅菌。

3. 將培養皿轉約90度劃第二次線，如圖十七所示直到第四條線為止。

4. 接種環需再次用酒精燈燒紅滅菌。

5. 將培養皿倒置（避免水氣聚集於蓋面，再滴到agar上，干擾細菌分

離效果），置於37℃培養箱中培養至隔夜。

圖十七、劃碟方式。

2-7-2 細菌的培養（液態培養）

適用於細菌的大量培養、菌液的稀釋及長久保存。

方法與步驟：

1. 將接種環燒紅後冷卻並刮下單一菌落。

2. 打開裝有1 mL的培養液（LB broth）的試管管蓋，管口需過火。將

沾有菌落的接種環伸入培養液中並敲管壁（使菌落脫離），再次

將管口過火，並蓋上管蓋。

3. 接種環再次用酒精燈燒紅才可放置。

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4. 於37℃培養箱中培養至隔夜。

2-7-3 細菌數目的測量

（一）稀釋平板法（Dilution plate method）：

1. 以接種環取單一菌落，加入LB培養基製備成母液（Stock solution）

培養至隔夜。

2. 利用微量吸管吸取0.1 mL之母液，加至0.9 mL之無菌水中，充分混

合後，製備成10-1的稀釋液。

3. 再由10-1的稀釋液中吸取0.1 mL，加至0.9 mL之無菌水中，充分混

合後，製備成10-2的稀釋液。（圖十八）

4. 依照上述方法，將母液連續稀釋成為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7

及10-8之稀釋液。

5. 利用微量吸管分別由10-3、10-4、10-5、10-6、10-7及10-8之稀釋液中，

吸取0.1 mL加至LB培養基平板內，並以L型玻棒均勻塗抹，處理三

重複。

6. 於37℃下，培養16～24小時。

7. 計算細菌菌落形成單位（colony forming unit, CFU）。

8. 求出母液之菌數（CFU/mL）。

母液菌數=平板之平均菌數×10×稀釋之次方數

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（二）混濁度測定法光電比色計（Spectrophotometer）測定法

1. 利用微量吸管吸取3 mL之上述母液，加至3 mL之無菌水中，充分

混合後，製備成1/2之稀釋液。

2. 再由1/2的稀釋液中吸取5 mL，加至5 mL之無菌水中，充分混合

後，製備成1/4之稀釋液。

3. 依照上述方法，將母液連續稀釋成為1/8、1/16、1/32 及1/64之稀

釋液。

4. 利用光電比色計於595 nm下測定各稀釋液之光學密度OD595值。

5. 將母液之菌數求出後，再算出各稀釋液之菌數。即母液之菌數×1/2。

6. 依不同稀釋度之OD595值及菌數，製作標準曲線（Standard curve），

以定出光學密度OD595值與菌數之關係。

7. 將來測定菌數時，只需測定其OD595值，再以內插法，即可求出相

對應之菌數。

圖十八、菌液的稀釋。

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2-7-4 抗微生物胜肽的粗篩方法

1. 培養隔夜的菌液（約109 CFU/mL）

2. 菌液稀釋103倍（約106 CFU/mL）

3. 取199 μL的稀釋菌液加入1 μL抗微生物胜肽，最後胜肽濃度為

100 μM，在37℃下培養。

4. 隔天培養液為透明澄清則有抑制效果，繼續做MIC90測試。

5. 若為混濁表示沒有抑制作用。

2-7-5 抗微生物胜肽活性的評估方法MIC, MBC的制定

1. 細菌液態培養於2 mL LB broth培養液至半對數生長期（mid-log

phase）。

2. 根據McFarland Standard 0.5的OD595值為0.08～0.09，菌數為1×108

CFU/mL，用無菌水稀釋菌液與McFarland Standard 0.5一樣的OD595

值。

3. 再將菌數1×108 CFU/mL稀釋成5×105 CFU/mL，最後菌液濃度5×105

CFU/ mL於MH broth培養液。

4. 取199 μL稀釋菌液於96孔盤，分別加入1 μL的不同的濃度抗微生物

胜肽，之後在37℃培養箱培養16小時。

5. 使用微量盤分光光譜儀測菌液OD595值，正調控組（positive control,

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PC）為未加入抗微生物胜肽的菌液，負調控組（negative control,

NC）為無菌液的 MH broth 培養液，制定最小抑制濃度（Minimum

Inhibitory Concent

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Master Thesis, Department of Chemistry Tung-Hai University ...thuir.thu.edu.tw/retrieve/22391/101THU00065016-001.pdf · vrrwrsry)之類似物，具有抑制微生物生長之功效及極低的溶血性。