Pristupi utvrdjivanja genetiPristupi utvrdjivanja genetiččke osnove sloke osnove složženih fenotipovaenih fenotipova

•• 1.1. indirektno,metodeindirektno,metode kvantitativnekvantitativne genetikegenetike

•• 2.2. mmapiranjem genoma – otkrivanjem relevantnih lokusa

• Porodične studije vezanosti• Populacione studije asocijacije association

preko kandidat gena

• Asocijacije variranja odreñenih lokusa za koje se zna da imaju ulogu u nastanku i razvoju fenotipa

podsećanje…• mejoza• nezavisno rasporeñivanje

hromozoma (alela)• set lokusa (sekvenci)na

istom hromozomu -haplotip

• vezano nasledjivanje alela, segregacija hromozoma

• rekombinacija (krosing over)

• rekombinantni potomci• nerekombinantni potomci

rekombinaciono mapiranje otkriva redosled gena na hromozomima, ali daje samo grubu sliku pravog rastojanja izmeñu njih.

– Genetičke mape se baziraju na učestalosti c.o. – Razmak oslikava vezanost lokusa (verovatnoću zajedničke

segregacije).– jedinica razdaljine izmeñu lokusa je cM (centi Morgan) ili m.u (map unit),

1cM = 1m.u. =1% rekombinacije.

• neki regioni hromozoma su podložniji rekombinacijama, pa razdaljine na genetičkom mapama ne odgovaraju u potpunosti stvarnim rastojanjima mapama.

• regioni u kojima je c.o. češći su “izduženi” na genetičkim mapama.

• Razlika je izmeñu učestalosti rekombinacija i stvarne razdaljine izmeñu gena.

• Ne uočavaju se sve rekombinacije. Multipli c.o. se mogu desiti izmeñu jako udaljenih gena, i neki od njih ne vode pojavi rekombinantnih hromozoma.

• U slučaju jako udaljenih lokusa prava genetička distanca, koja zavisi od prosečnog broja c.o. na hromozomu, može biti veća nego uočena učestalost rekombinacije.

• Za gene udaljenije od 20cM sve je veće odstupanje jer je sve veća verovatnoća multiplih c.o.

• Odnos izmeñu učestalosti rekombinacija i razdaljine izmeñu gena.

• Za mala rastojanja postoji linearni odnos. Za veća rastojanja procenat rekombinacija potcenjuje pravu razdaljinu.

• Fizičko mapiranje predstavlja potpunu sekvencu DNK hromozoma sa razdaljinama i lokacijama gena merenabrojem nukleotida (bp)

1 m.u.= 1cM = 106bp = 1Mb

otisak restrikcionim fragmentima, hromozomsko „šetanje“, in situ hibridizacija, itd..

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/genomes-maps/

genetički markeri

• Genetički markeri su mesta u genomu pomoću čijih alela možemo pratiti nasledjivanje odreñenog hromozoma ili regiona hromozoma kroz generacije

• Genetički marker mora biti polimorfan – da se nalazi u više varijanti alelskih, u populacijama– fenotipski – ograničen broj i polimorfnost– citogenetički – posebne tehnike (npr. bojenja hromozoma),

hibridizacija– biohemijski – malobrojni..izoenzimi, posebne tehnike– molekularni

• RFLP, AFLP, RAPD, STS, SNP

Genetička vezanost markera i lokusa (linkage)

• Ako je na primer, A lokus uzročno vezan sa osobinom, a B i C su markeri pomoću kojih odredjujemo A:….veća je verovatnoća da će se rekombinacija desiti izmedju A i C nego A i B, pa marker B češće segregira zajedno sa A

na osnovu učestalosti pojave rekombinanata odredjuje se razdaljina lokusa

mapiranje lokusa za složene (kvantitativne) osobine - QTL

• Genomske sekvence koje označavaju lokacije i funkcije gena odreñuju gene kandidate, čiji aleli mogu doprinositi genetičkoj varijabilnosti.

• Svaki gen kandidat mora se testirati pojedinačno jer neki doprinose malo ili nimalo nekom tipu varijabilnosti, a mogu imati i plejotropni efekat itd., što je ograničavajuće.

• Polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (SNP) ili kratkih ponovaka -mikrosatelita mogu poslužiti kao genetički markeri u ukrštanjima i omogućiti genetičko mapiranje lokusa čiji aleli utiču na neku kvantitativnu osobinu.

• Ovako identifikovani regioni genomase zovu lokusi kvantitativnih osobina (eng. Quantiative Trait Loci - QTL).

•Geni nije prikladan izraz jer se najčešće ne radi o pojedinačnim genima, pa je bolje koristiti lokus, ili region

• U genetici čoveka koriste se rodoslovi i polimorfizmi DNK kao markeri za odredjivanje pozicije QTL

• Sa životinjama i biljkama, npr. u poljoprivredi, linije koje se razlikuju u fenotipskoj vrednosti osobine se koriste u ukrštanjima, prati se segregacij marker lokusa i fenotipskih vrednosti u F2 ili povratnom ukršzanju i identifikuju se QTL.

• Ukrste se linije koje se razlikuju u prisustvu markera i QTL, • Ako je QTL blisko vezan za marker gen, različiti marker genotipovi i

QTLovi će se nasledjivati zajedno,a različiti marker genotipovi u F2 će imati različite srednje fenotipove

• Ako je marker blizu QTL, dobiće se razlika u srednjim vrednostima fenotipova medju marker genotipovima

• Primer: dve selekcionisane linije se razlikuju prema nekoj osobini, prema QTL i marker lokusu

– Linija sa najvećom fenotipskom vrednošću je homozigot +/+ za odreñeni QTL i marker M/M udaljen 10 krosing-over jedinica.

– Linija sa najmanjom fenotipskom vrednošću je homozigot –/– za QTL i m/m za marker lokus.

• ukrste se

• Svaki alel na ovom QTL odreñuje 5 jedinica ukupne razlike izmeñu linija.

• Izmeñu prosečnog gameta koji nosi alel M i koji nosi m alel razlika je 4 jedinice u segregirajućoj F2.

• Razlika izmeñu proseka F2 M/M homozigota i proseka F2 m/m homozigota je prema tome 8.

• Tako je nañena prosečna razlika izmeñu početnih selektovanih linija 8, a u stvari QTL nosi 10% različitosti, pošto razlika dolazi iz rekombinacije izmeñu marker lokusa i QTL.

• Proces se može ponoviti uzimanjem marker lokusa na drugim pozicijama dužhromozoma i na različitim hromozomima da bi se odredili i ostali činioci diferencijacije izmeñu linija.

Prosečan fenotipski efekat M =5(0,9)+0(0,1) = 4,5Prosečan fenotipski efekat m =5(0,1)+0(0,9) = 0,5

Razlika izmeñu gameta koji nose M i gameta koji nose m = 4,5-0,5 = 4Razlika izmeñu proseka F2 M/M homozigota i proseka F2 m/m homozigota = 8

Genetička epidemiologija

• Složene osobine (oboljenja, poremećaji) pokazuju

varijabilnost meñu jedinkama (u odgovoru na terapiju, na agense, na ispoljavanje osobine...)

• Pitanje: da li je variranje složenog fenotipa pod

genetičkom kontrolom?– Primer: identifikovati genetičke faktore kod domaćina

koji doprinose riziku za infektivno oboljenje

• Populaciono pitanje: Ima li asocijacije izmedju varijabilnosti u DNK sekvencama (učestalosti) i fenotipa – oboljenja?

�napraviti najbolji dizajn studije

�ispitati uzročnu medjusobnu vezu više gena, gena i sredinskih faktora,

sa fenotipom

studije familija / studije populacija

Ima li zna čajne porodi čne agregacije fenotipa• ako ima značajne asocijacije medju rodjacima za neko

oboljenje, a ne javlja se medju supružnicima, znači visoka je Vg (npr. za infekciju nekim patogenom) i ne može se pripisati zajedničkoj sredini kojom seprenosi infekcija

Da li je marker na hromozomu vezan za nepoznatiregion koji kontroliše fenotip?

• Linkage studije, upotrebom molekularnih markera– Otkrivanje lokusa za kvantitativne osobine (QTL)– obično brojne sekvence (na primer STR) asocirane sa

fenotipom i imaju plejotropni efekat, uz epistaze, uticaj pola, populaciono specifični su itd.

• WGAS (whole genome association studies)-vezepolimorfizama - SNPs i fenotipa

• GEIs (gene-environment interactions) –kako genotipovi u specifičnoj sredini menjaju fenotip

• GWIS (genome-wide interaction studies)

• Porodične studije vezanosti (linkage)– mere ko-segregaciju u familijama, malim

rodoslovima – ne treba kontrolna grupa jer testiraju specifični model

mendelovske segregacije unutar familije

• Populacione studije asocijacija– mere ko-segregaciju u populacijama– koriste neravnotežu vezanosti (LD) koja se meñu

populacijama razlikuje

Porodične studije vezanosti

• parametarske analize vezanosti– podrazumeva se da je poznat tip nasledjivanja, učestalost alela,

penetrabilnost– pogodno za kvalitativne, mendelovske osobine,– dobre za mapiranje gena, ali zavise od informativnih rodoslova– koriste rekombinacione učestalosti, LOD skor metod– teže primeniti na složene osobine

• neparametarske analize vezanosti– za nespecifične genetičke modele (tipove nasledjivanja)– ne računa se rekombinaciona frakcija nego komponente varijanse– statističkim testovima se utvrdjuje posledica vezanosti– koriste se parovi srodnika istog fenotipa i računa distribucija IBD

(identical by decent) alela, koja bi se očekivala ako nema vezanosti izmedju markera i alela (nulta hipoteza)

– Koristi se Allele sharing metod– Moguće za studije složenih osobina

• "NEINFORMATIVNA MEJOZA„i rekombinantni i nerekombinantni gameti su isti

• A1 B1 A1 B1

ili• A2 B1 A2 B1

• "INFORMATIVNA MEJOZA„A1 B2

A1 B1 rekombinantni gameti su: A2 B1

A2 B2 nerekombinanti gameti su: A1 B1

A2 B2

za utvrdjivanje vezanosti potrebne "informativne mejoze„:veliki rodoslovi i potomstvo kod koga možemo, praćenjem pojave dve osobine za koje pretpostavljamo da se zajedno -vezano nasledjuju, prepoznati rekombinaciju, tj pojavu nastanka osobina odvojeno

DNK polimorfizam - RFLP i rekombinaciono mapiranje

• Jedinka A je heterozigot za odredjeno restrikciono mesto:

• Jedinka B je homozigot za dugi fragment:

• Jedinke A i B mogu u medjusobnom ukrštanju dati polovinu potomstva sa 3 fragmenta, a drugu samo sajednim

• Ako je neko heterozigotno restrikciono mesto vezano za neki gen D u heterozigotnom stanju, u spregnutoj konformaciji, krosing-over izmedju ova dva mesta daće rekombinantne gamete kao D-3 i d-2-1.

•RF je moguće izračunati izmedju različitih marker lokusa i izmedju marker lokusa i gena sa poznatim fenotipskim efektom.

• Primer: Muškarac koji ima neko oboljenje, heterozigot za lokus D/d i za molekularni marker M1/M2, žena homozigot za oba.

• Pedigre na slici daje genotipove dece u odnosu na gamete koji dolaze od oca. Dvoje su rekombinanti, RF = 33%

• parametarski -"LOD skor" metod • „logaritam odnosa ishoda”

• izražava vezanost 2 lokusa• poredi verovatnoću da će odredjeni rezultati rodoslova da se dobiju

ukoliko su 2 lokusa vezana (L) i ukoliko nisu vezana (NL)

• LOD = log10 L/NL= (1- θθθθ)NRx θθθθR

• 0,5NR+R

(θθθθ) je rekombionaciona frakcija=R/NR+Rθθθθ = 0,5 se očekuje ako je nazavisno rasporedjivanje - potpuna nev ezanost

LOD scor ≥ 3, ukazuje na vezanost log101000=3, znači da je šansa 1000:1 da dobijena

vezanost nije nastala slučajno

Procenjivanje rekombinacione frakcije

• Direktan metod:– prebrojavanje rekombinanata

– poznavanjem gametske faze

• Metod maksimalne verovatnoće:– Kada je nepoznata gametska faza

– Kada je nekompletna penetrabilnost

– Kada postoji heterogenost lokusa

BD BCAC BC

BE AF

AB CD

AD AD

Rodoslov poznate gametske faze (poznatog haplotipa)

L(θθθθ) = (θθθθ/2)r ((1-θθθθ)/2) n-r

r: broj rekombinanata

n: sve mejoze

Zna se koja je kombinacija alela nasleñena od kogroditelja i svaka mejoza se može označiti kao rekombinantnaIli nerekombinantna

BD BCAC BC

AB CD

AD AD

Rodoslov nepoznate gametske fazealel kod obolelog je mogao poticati od bilo kog hromozoma

roditelja-nepoznat je genotip praroditelja

L(θθθθ) = 1/2 (θθθθ/2)r [(1-θθθθ)/2]n-r + 1/2 (θθθθ/2)n-r[(1-θθθθ)/2]r

r: broj rekombinanatan: sve mejoze

Imamo dvosmisleno rešenje kod potomaka što se tiče odnosa R:NR...zato je Lod skor sa obe mogućnosti

• Ako je nadjeno da je jedinka heterozigot za dva vezana SNP mesta A/a i B/b, zašto na osnovu samo ove informacije nije poznata gametska faza vezanosti SNP alela?

• Hint: koji su mogući genotipovi ove jedinke?• AB/ab ili Ab/aB

Razdaljina medju lokusima se računa iz rekombinacionih učestalosti koje daju najviši LOD

• prednosti LOD skor analize:– statistički je jači metod od neparametarskih– koristi sve genotipske i fenotipske informacije dostupnih članova porodica– pruža statistički test vezanosti i uvid u lokusne heterogenosti

• ograni čenja:– mora biti poznat tip nasledjivanja– rekombinaciona frakcija poznata– učestalosti alela za osobinu poznate– poznata penetrabilnost– poznate učestalosti marker alela

teško primenljivo za složene fenotipove

neparametarska analiza vezanosti – pogodna u analizi složenih osobina

Q: koliko često se odredjena kopija hromozomskog regiona javlja medju srodnicima, a nasledjena je od zajedničkog pretka? (IBD).

A: dokazati da srodnici istog fenotipa nasledjuju identične kopije nekog regiona češće nego što se očekuje

– sib analiza (Allele Sharing Method - ASM)– Neke studije: dijabetes tip I, HLA, angiotenzin, gustina

kostiju, IgE nivo u serumu

ASM - metod “šerovanja” alela• aleli dentični po stanju (identity by state -IBS) dva alela su ista po strukturi

ali su potomci različitih predačkih alela• aleli identični po poreklu (identity by decent -IBD) dva alela su potomci

istog predačkog alela

• Testira se da li oboleli srodnici nasledjuju neki region IBD (ili IBS) češće nego što se očekujepo mendelovskoj slučajnoj segregaciji

• sib-par sa istom osobinom može deliti 0,1, 2 IBD alela sa verovatnoćom 0.25, 0.5, 0.25,na bilo kom marker lokusu

• Ako je marker locus nezavisan od lokusa za osobinu, verovatnoće šerovanja medju sib-parovima 0,1, 2, IBD alela će ostati 0.25, 0.50, 0.25.

• Ako je marker lokus vezan (linked, blizak), sa lokusom za datu osobinu, očekuje se višak sib-parova sa datom osobinom koji dele dva IBD alela.

• Poredjenje dobijenog broja sib-parova koji dele 0, 1, 2 IBD alela sa očekivanim pod nultom hipotezom.

• Koristi se Pearson’ovaχ2 statistika

Alternativna hipoteza:IBD koji se šeruju: 0 1 2dobijeni n0 n1 n2N = n0 + n1 + n2

Nulta hipoteza:IBD koji se šeruju: 0 1 2 očekivani N/4 N/2 N/4

metod sib-parova(ASM)

• Nema potrebe za definisanjem tipa nasledjivanja ili genetičkih parametara

• Slabiji da detektuje linkageu poredjenju sa lod skormetodom

• Teško pruža preciznu lokacijugena povezanim sa oboljenjem

Prednosti i nedostaci ASM

Relativni rizik- najbitniji parametar genetičke epidemiologije (λr)

Rizik ponavljanja medju srodnicima (λ)

učestalost medju rodjacima obolelog

λr = -------------------------------------------------populaciona učestalost

r je tip srodstva - stoji u odnosu na konkordantno nasledjivanje kod parova srodnika koji su sa datom osobinom - analogno koeficijentu heritabilnosti

Genetičko mapiranje je lakše za osobine sa visokom vrednošću λ , (λ > 10) nego sa niskom (λ < 2).

oboljenje λλλλ r cisti čna fibroza 500 dijabetes tip I 15 šizofrenija 8.6 dijabetes tip II 3.5

Generalno....porodične studije vezanosti

Parametarske analize idealne na razdaljini 5-10 cM (1cM = 1 Mb)markera za detekciju vezanosti sa nekim lokusom– multialelni STR, mikrosateliti– bialelni SNP, ali gušće rasporedjeni u genomu (10 000 SNP u ~

3cM) bolje pokrivaju kraće regione – haplotipovi, pogodni za studije slučajeva

• snaga linkage studija vezanosti zavisi od:– polimorfnosti markera– veličine porodice– srodnosti jedinki

• ponovljivost studija vezanosti– teška sa složenim fenotipovima (infektivna oboljenja, npr)– variranje uzorka, porodica, dijagnostički kriterijumi, statistika– različite istorije populacija, različiti patogeni, rezultuju u

identifikaciji različitih gena koji utiču na rizik u različitim populacijama