UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Ivana M. Jovanović

Antimikrobna i antioksidativna aktivnost alkoholnih napitaka dobijenih od autohtonih predstavnika flore Srbije

(Malus sylvestris, Fragaria vesca, Sambucus nigra)

Master rad

Niš, 2012.

UNIVERZITET U NIŠU Prirodno-matematički fakultet

Departman za biologiju i ekologiju

Antimikrobna i antioksidativna aktivnost alkoholnih napitaka dobijenih iz autohtonih predstavnika flore Srbije

(Malus sylvestris, Fragaria vesca, Sambucus nigra)

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Ivana M. Jovanović dr Tatjana Mihajilov-Krstev

Br. indeksa 14

Niš, decembar 2012.

Zahvala

Srdačno se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Tatjani Mihajilov-Krstev na jako lepoj saradnji, na njenoj nesebičnoj pomoći, što je bila puna razumevanja i dovela ovaj rad do savršenstva.

Takođe, zahvaljujem se laborantu Jovani Jović na pomoći u laboratoriji za vreme izvođenja eksperimentalnog dela izrade ovog master rada.

Zahvaljujem se i profesorima i asistentima sa Departmana za hemiju, PMF-a u Nišu koji su pomogli u izvođenju eksperimentalnog dela ovog master rada.

Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici koja mi je omogućila studije, što su sve vreme mog studiranja bili moja najveća podrška i imali razumevanja za sve moje probleme.

SADRŽAJ

LISTA SLIKA ............................................................................................................................. i

LISTA TABELA ........................................................................................................................ ii

LISTA GRAFIKONA ............................................................................................................... iii

1. UVOD .................................................................................................................................... 9

2. OPŠTI DEO .......................................................................................................................... 11

2.1. Rakija ............................................................................................................................. 11

2.1.1. Pečenje rakije .......................................................................................................... 11

2.1.1.1. Priprema voća za fermentaciju ......................................................................... 11

2.1.1.2. Vrenje – akoholna fermentacija kljuka ............................................................ 11

2.1.1.3. Destilacija – pečenje rakije ............................................................................... 12

2.1.1.4. Odležavanje i sazrevanje pića .......................................................................... 12

2.1.2. Kazani za destilaciju ............................................................................................... 12

2.1.2.1. Srpski domaći kazan ......................................................................................... 13

2.1.3. Rakija kao hrana i lek .............................................................................................. 14

2.1.4. Rangiranje i podela rakije ....................................................................................... 14

2.1.5. Jačina rakije ............................................................................................................. 14

2.2. Plodovi samoniklog bilja koji se mogu koristiti za proizvodnju rakija ......................... 15

2.2.1. Rod Malus ............................................................................................................... 15

2.2.2. Rod Fragaria .......................................................................................................... 16

2.2.3. Rod Sambucus ......................................................................................................... 17

2.3. Mikroorganizmi - uloga i značaj mikroorganizama u proizvodnji rakije i izazivanju oboljenja ............................................................................................................................... 18

2.3.1. Pozitivna uloga mikroorganizama – fermentacija .................................................. 19

2.3.1.1. Alkoholna fermentacija (alkoholno vrenje) ..................................................... 21

2.3.1.2. Mikroorganizmi koji učestvuju u alkoholnoj fermentaciji ............................... 21

2.3.2. Mikroorganizmi zdravog čovečijeg tela ................................................................. 23

2.3.3. Patogeni mikroorganizmi ........................................................................................ 23

2

2.3.4. Patogeni mikroorganizmi i bolesti koje izazivaju ................................................... 25

2.3.4.1. Rod Clostridium ............................................................................................... 25

2.3.4.2. Rod Bacillus ..................................................................................................... 26

2.3.4.3. Rod Streptococcus ............................................................................................ 26

2.3.4.4. Rod Staphylococcus ......................................................................................... 28

2.3.4.5. Rod Salmonella ................................................................................................ 29

2.3.4.6. Rod Shigella ..................................................................................................... 30

2.3.4.7. Rod Pseudomonas ............................................................................................ 31

2.3.4.8. Rod Escherichia ............................................................................................... 31

2.3.4.9. Rod Klebsiella .................................................................................................. 33

2.3.4.10. Rod Enterobacter ........................................................................................... 34

2.4. Mehanizam antimikrobnog delovanja ........................................................................... 34

2.5. Antioksidativna aktivnost .............................................................................................. 35

2.5.1. Slobodni radikali ..................................................................................................... 35

2.5.2. Antioksidansi .......................................................................................................... 36

2.5.3. Mehanizam delovanja antioksidanasa ..................................................................... 38

2.5.3.1. Primarna antioksidativna zaštita ....................................................................... 38

2.5.3.2. Sekundarna antioksidativna zaštita .................................................................. 39

3. MATERIJAL I METODE .................................................................................................... 41

3.1 Prikuplanje plodova i dobijanje rakije ............................................................................ 41

3.2. Metode određivana antimikrobne aktivnosti ................................................................. 41

3.3. Izolovanje aroma-mirisnih sastojaka rakija ................................................................... 42

3.4. Gasna hromatografija (GC) i gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS) . 43

3.5. Identifikacija aroma-mirisnih sastojaka rakija ............................................................... 43

3.6. Antimikrobna aktivnost ................................................................................................. 43

3.6.1. Kulture mikroorganizama ....................................................................................... 43

3.6. Testiranje antimikrobne aktivnosti rakija ...................................................................... 44

3.7. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti ............................................................. 44

3.7.1. Elektron – transfer metode ...................................................................................... 46

3.7. Statistička obrada podataka ........................................................................................... 48

3

4. REZULTATI I DISKUSIJA………………………………………………….....................49

4.1. Hemijski sastav rakija .................................................................................................... 50

4.2.Antimikrobna aktivnost rakija ........................................................................................ 56

4.3. Antioksidativna aktivnost rakija .................................................................................... 60

4.3.1. Ukupna redukciona moć (Ekvivalenti askorbinske kiseline µg/mL) ...................... 60

4.3.2. Određivane „scavening“ antioksidativnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazin (DPPH) radikalu ................................................................... 61

4.3.3. Određivanje antioksidativne aktivnosti primenom ABTS metode ......................... 63

5. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 65

6. SUMMARY ......................................................................................................................... 67

7. LITERATURA ..................................................................................................................... 69

i

LISTA SLIKA

Slika 2.1. Izgled domaćeg srpskog kazana ............................................................. 6 Slika 2.2. Malus sylvestris....................................................................................... 8 Slika 2.3. Cvast, list i plod divlje jabuke-Malus sylvestris...................................... 9 Slika 2.4. Cvet, list i plod divlje jagode-Fragaria vesca......................................... 10 Slika 2.5. Sambucus nigra........................................................................................ 10 Slika 2.6. List, plod i cvast zove-Sambucus nigra..................................................... 11 Slika 2.7. Mesta na bakterijskoj ćeliji i mehanizmi antibakterijskog delovanja rakije.. 28 Slika 2.8. Nastajanje slobodnih radikala.................................................................... 29 Slika 2.9. Najpoznatiji prirodni antioksidansi (vitamin C, vitamin E, β-karoten, ubihinon,

polifenoli, rutin, kvercetin)........................................................................ 30 Slika 3.1. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom

razblaženja uzoraka................................................................................... 37

ii

LISTA TABELA

Tabela 3.1. Prikaz testiranih mikroorganizama........................................................... 36 Tabela 3.2. Glavne metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta.................... 38 Tabela 4.1. Hemijski sastav rakija.............................................................................. 43 Tabela 4.2. Antimikrobna aktivnost rakija i suvih ostataka dobijenih iz plodova divlje

jagode (Fragaria vesca L.), kao i dominantnog jedinjenja 3-metil-1-butanol, etanol (negativna kontrola) i antibiotika hloramfenikola (pozitivna kontrola (MIC/MBC izražene u µL/mL)................................................................ 49

Tabela 4.3. Antimikrobna aktivnost rakija i suvih ostataka dobijenih iz plodova divlje jabuke (Malus sylvestris), kao i dominantnog jedinjenja 1-heksanol, etanol (negativna kontrola) i antibiotika hloramfenikola (pozitivna kontrola (MIC/MBC izražene u µL/mL)................................................................ 50

Tabela 4.4. Antimikrobna aktivnost rakija i suvih ostataka dobijenih iz plodova zove (Sambucus nigra), kao i dominantnog jedinjenja 3-metil-1-butanol, etanol (negativna kontrola) i antibiotika hloramfenikola (pozitivna kontrola (MIC/MBC izražene u µL/mL)................................................................ 51

Tabela 4.5. Ukupna redukciona moć ispitivanih suvih ostataka................................. 53 Tabela 4.6. Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema DPPH radikalu ispitivanih

suvih ostataka......................................................................... 54 Tabela 4.7. Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema ABST radikalu...... 55

iii

LISTA GRAFIKONA

Grafikon 4.1. Ukupna redukciona moć.............................................................................. 53 Grafikon 4.2. Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema DPPH radikalu........ 55 Grafikon 4.3. Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema ABTS radikalu........ 56

1.UVOD

9

1. UVOD Još u 4. veku pre nove ere Aristotel je zapisao da bi morska voda kao i vino i druge

tečnosti mogli da se pretvore u pijaću vodu kada bi se podvrgli pocesu destilacije. Ovakav zaključak nije korišćen sve do 8. i 9. veka nove ere, kada su arapski alhemičari osmislili „alambike“ koje su koristili za dobilanje osnova parfema.

Znanje o procesu destilacije brzo se širilo Evropom i u mnogim zemljama započela je proizvodnja destilovanih alkoholnih pića koji su nazvani „Voda života“. Otkrivanje pravog porekla alkoholnog pića nije nimalo lako pošto su recepti postali deo nacionalnog ponosa.

U 15. veku počinje proizvodnja „nacionalnih pića“ u zemljama Evrope i to džina u Engleskoj, šnapsa u Nemačkoj, vodke u Rusiji i Poljskoj i rakije na Balkanu.

Reč rakija je arapskog porekla i potiče od reči „al-rak“ (znoj). U naše krajeve stigla je sa Turcima u 14. ili 15. veku i označavala je piće arak koje se proizvodilo u dalekoistočnim zemljama.

U Srbiji se rakija proizvodila od različitog voća, najčešće šljive i to tek krajem 19. veka, nakon uništenja vinograda i smanjenja proizvodnje vina.

U srpskom narodu rakija je oduvek imala poseban značaj kako u svakodnevnom životu, svečanim trenucima, prilikom obreda, tako i kaoprevencija i lek. Smatra se da jedna čašica rakije deluje preventivno na mnoge bolesti kao što su stres, depresija, dijabetes, angina pektoris, hepatitis A, kamen u bubregu, reumatični artritis, osteoporozu, kod poboljšanja pamćenja, ali i otvara apetit.

U ovom radu je vršeno ispitivanje antimikrobne i antioksidativne aktivnosti rakije divlje jabuke (Malus sylvestris), šumske jagode (Fragaria vesca) i zove (Sambucus nigra) kao potencijalnih prirodnih izvora antimikrobnih i antioksidativnih materija za prevenciju i lečenje infektivnih i kancerogenih bolesti.

Ciljevi istraživanja:

- Prikupljanje polodova divlje jabuke (Malus sylvestris), šumske jagode (Fragaria vesca) i zove (Sambucus nigra), fermentacija i destilacija rakije prema tradicionaalnoj proceduri;

- Ispitivanje hemijskog sastava dobijenih rakija;

- Ispitivanje antimikrobne aktivnosti dobijenih uzoraka protiv odgovarajućih izolata iz patološkog materijala pacijenata;

- Ispitivanje antioksidativne aktivnosti;

- Interpretacija dobijenih rezultata u skladu sa objavljenim rezultatima u naučnoj literaturi u fitoterapeutske svrhe.

2. OPŠTI DEO

11

2. OPŠTI DEO

2.1. Rakija

Rakija je žestoko alkoholno piće koje se dobija jednostrukom ili dvostrukom destilacijom mase koja se dobija alkoholnim vrenjem voća, raži, krompira i sličnog. Rakija je reč arapskog porekla i potiče od reči „al-rak“. U naše krajeve je stigla sa Turcima. U početku je označavla piće arak koje se proizvodilo u dalekoistočnim zemljama, a dobijalo se destilacijom prevrelog soka ili vina specijalnih vrsta palmi. Tek u 15. veku počinje proizvodnja nacionalnih pića u Evropi, a samim tim i rakija na Balkanu.

2.1.1. Pečenje rakije

Pečenje rakije se odvija u četiri koraka: priprema voća za fermentaciju, vrenje-alkoholna fermentacija kljuka, destilacija-pečenje rakije i odležavanje-sazrevanje pića.

2.1.1.1. Priprema voća za fermentaciju

Za proizvodnju voćnih rakija mogu poslužiti sve voćne sirovine koje imaju dovoljnu količinu šećera koji će se tokom procesa fermentacije transformisati u alkohol. Procenat ukupnog šećera u voću je direktno proporcionalan količini etil-alkohola koji će nastati. Pored šećera, jednako važne su i organske i neorganske materije koje voću, a kasnije i rakijama daju specifičan miris, ukus i boju. Vreme berbe plodova je karakteristično za svaku sortu, ali zajedničko je da se berba obavlja kada su plodovi potpuno zreli. Berba se obavlja po suvom danu i vrši se ručno ili mehanički. Prilikom berbe potrebno je da se prostor ispod stabala obezbedi folijama kako bi se izbego prljanje plodova. Posle završene berbe, prezrele i plesnive plodove ukloniti, kao i koštice iz koštičavog voća, zbog prevencije nastajanja toksične cijano-vodonične kiseline i kancerogenog etil-karbamata. U vrioni sud se nikako ne stavljau celi plodovi jer bi proces fermentacije trajao isuviše dugo. Plodovi se usitnjavaju dok ne nastane kaša i tek onda stavljaju u vrione sudove.

2.1.1.2. Vrenje – akoholna fermentacija kljuka Posle pripreme plodova tj. muljanja i pasiranja, voćni kljuk se ubacuje u sudove za fermentaciju. Nakon toga se ubacuju selekcionisani kvasci koji iniciraju i ubrzavaju proces vrenja tako što uzimaju glavnu ulogu u pretvaranju šećera u alkohol putem sopstevnog metabolizma. Sudovi za vrenje se zatvaraju, ali se mora voditi računa da ostane oko 25-30% otpražnjenog prostora. Alkoholna fermentacija se odvija u uslovima bez prisustva kiseonika (anaerobni uslovi) po formuli:

C6H12O6(šećer) → 2C2H5OH(etanol)+2CO2(ugljen-dioksid) + 22kcal

U ovom procesu se stvara ugljen-dioksid koji ukoliko se ne ukloni može da izazove eksploziju. Ustaljeni način je otvaranje vrionih sudova pri čemu se vrši i dodatno mešanje sadržaja. U ovom slučaju masa koja fermentiše dolazi u kontakt sa kiseonikom i nepoželjnim mikroorganizmima koji mogu dovesti do nepoželjnih promena. Bolji način je postavljanje

12

vranjeva na poklopcu ili se na poklopac montira gumeno crevo čiji se izlazni deo uranja u čašu napunjenu vodom. Ovako dolazi do sigurnog ispuštanja ugljen-dioksida, pri čemu je ulazak kiseonika u vrioni sud onemogućen. U kljuku koji predstavlja slabo kiselu sredinu mogu se razviti nepoželjni sojevi mikroorganizama, kao što su acetobacter, lactobacilli, bakterije buterne kiseline. Iz tog razloga se preporučuje korekcija kiselosti do pH=3.2 uz pomoć sumporne ili fosforne kiseline. Pri ovoj kiselosti dolazi do stvaranja 30% manje metanola bez gubitka etil alkohola.

Alkoholna fermentacija se odvija u tri faze i to početak vrenja, glavno vrenje i tiho vrenje. U početnoj fazi se kvasac razmnožava i stvara se mala količina alkohola i ugljen-dioksida. U fazi glavnog (burnog) vrenja se stvara velika količina alkohola i ugljen-dioksida, usled čega dolazi do podizanja kljuka i stvaranja pene, a obzirom da se oslobađa toplota, temperatura kljuka se povećeava. U fazi tihog vrenja fermentišu i poslednje količine šećera, a količina nagrađenog ugljen-dioksida je veoma mala. Indikator završetka vrenja je prestanak stvaranja ugljen-dioksida i spuštanje nastalog „klobuka“ ili se može odrediti pomoću Ekslovog širomera. Prevreli voćni kljuk bi trebalo što pre destilisati, a ukoliko se želi čuvati određeni period do pečenja, potrebno ga je konzervisati i zaštititi.

2.1.1.3. Destilacija – pečenje rakije

Nakon završene fermentacije, kada je sav šećer pretvoren u alkohol, pristupa se procesu destilacije. Jako je bitno da se destilacija izvrši u pravo vreme, jer ukoliko nije sav šećer provreo dobiće se manje rakije, a ako se sa destilacijom zakasni, može doći do kvarenja kljuka. Cilj destilacije je odvajanje isparljivih komponenata od sirovine koja se destiliše i putem isparavanja i kondenzacije njihovo prevođenje u tečnost, tj. rakiju. Alkoholno-vodenu paru koja nastaje zagrevanjem, prate i ostala isparljiva jedinjenja iz sirovine koja je značajna za formiranje arome destilata, jer ukoliko bi smeša bila sastavljena samo od vode i etanola destilat bi bio neutralnog ukusa i mirisa. Zato je bitno na pravilan način izvesti proces destilacije kako bi se jedinjenja koja daju specifičnu aromu i kvalitetna svojstva što više našla u dobijenoj rakiji, a ona štetna uklonila ili smanjila na najmanju moguću meru. Posle prve destilacije dobija se tzv. „meka“ rakija sa manjim procentom alkohola, a ponovnom destilacijom „meke“ rakije dobija se „prepečenica“.

2.1.1.4. Odležavanje i sazrevanje pića Tokom procesa odležavanja i sazrevanja svežeg destilata dolazi do niza reakcija koje dovode do formiranja jedinstvene arome voćne rakije, koja je kao takva spremna za konzumiranje.

2.1.2. Kazani za destilaciju

Domaći kazani vode poreklo od primitivnih mongolskih kazana. Oni su se zagrevali otvorenom vatrom. Kapak im je od drveta sa dužom lulom preko koje se vrši kondenzacija usled vazdušnog hlađenja. Kasnije je uveden hladnjak. Naši domaći kazani se razlikuju po konstukciji i mestu postanka. Delimo ih na srpske, bosanske i makedonske. Oni pripadaju grupi primitivnih kazana

.

13

2.1.2.1. Srpski domaći kazan

Srpski domaći kazan je izrađen od bakra, zapremine 75-150 l. Dno kazana je izrađeno od debelog lima, a debljina je srazmerna zapremini kazana. Kazan je oblika zarubljene kupe. Na otvoru se nalazi proširenje za držanje kapka. Zagreva se ogrevnim drvetom. Kapak je izrađen od drveta i ima oblik zarubljene kupe od masivnih duga. Jedna duga ima lulak koji se izrađuje od rakljastog drveta u kome se nalazi prostran otvor za prolaz para u lulu. Tabarka je kaca u vidu obrnuto zarubljene kupe, zapremine 250-350 litara, kroz koju prolazi prava lula koja je koso postavljena. Širi deo se nalazi više i bliže kazanu kapku, a uži niže i suprotno od njih. Voda treba da pokriva lulu i da se tokom destilacije meša i topla zamenjuje hladnom vodom. Na gornjem dancetu se nalaze dva otvora. Kroz srednji ulazi destilat iz lule, a kroz otvor sa strane se uzima uzorak za probu. Suprotno otvorima nalaze se dve duže duge sa većim otvorima za prenos suda.

Slika 2.1. Izgled domaćeg srpskog kazana

Rad sa ovim kazanom je jednostavan, ali je naporan i prljav. Kazan se naleže prevrelom kominom sa dovoljno tečnosti. Kapak se tako postavi da se lulak zavuče u lulu. Između kapka i kazana se nabije tanak sloj umešane gline, kao i između lule i lulka.Vatra se naloži, u početku tiha, kasnije življa i na kraju destilacije opet tiha. Destilacija na ovom kazanu traje 5-6 časova. Kada se završi destilacija i dobije rakija željene jačine, kapalica se stavi, a destilacija nastavlja do nule. Destilat se hvata u posebnu posudu sve dok u destilatu ima alkohola. Vatra se zagasi tako što se žar delimično izbaci, a pod kazan se ubace deblja drva. Sa spoljnih mesta se skine džibra i spojni materijal. Pažljivo se skine kapak. Pomoću "kašike" se džibra izbacuje, jer gustina pada na dno i brzo se zagreva. Potom se isperu kazan, kapak i lula. U kazan se ubaci poslednji tok - patoka, pa se nastavi sa nadgledanjem komine kao i na početku rada.

Zbog prave lule i male površine za hlađenje alkohol se dosta gubi. Kvalitet destilata je

solidan i verovatno zbog ravnomerne destilacije, kraćeg puta alkoholnih para i malog dodira sa bakrom, budući da se koristi drveni kapak i drugo, lako isparljivi sastojci se ne kondenzuju. Otuda je rakija sa njih meka, pitka i prijatna, ako je komina zdrava i dobra.

14

2.1.3. Rakija kao hrana i lek

Rakijom se nazdravlja u najsrećnijim trenucima i leči duša u najtežim. Pored toga što se nalazi na trpezi, rakija je našla primenu i u medicinske svrhe.

Rakija je korišćena u medicinske svrhe još u davna vremena. Još na početku 20. veka uočena je veza između umerenog konzumiranja alkohola i smanjenja rizika od kardiovaskularnih oboljenja. Ljudi koji povremeno piju, po nekim istraživanjima zdraviji su i duže žive od onih koji nikada ne piju ili od alkoholičara. Takođe, umereno konzumiranje alkoholnih pića smanjuje mogućnost visokog pritiska, odoljenja perifernih arterija, Alchajmerove bolesti ili srčanog udara. Jedna čašica rakije dnevno deluje preventivno na dijabetes, reumatični artritis, osteoporozu, kamen u bubregu, stres i depresiju, Parkinsonovu bolest, hepatitis A, anginu pektoris, a dobra je i za pamćenje.

Po medicinskim istraživanjima alkoholna pića ne utiču na povećanje telesne mase. Sam alkohol sadrži kalorije, ali po mnogim dugogodišnjim istraživanjima dovodi čak do malog smanjenja težine kod žena koje povremeno konzumiraju alkoholna pića. Unošenjem alkohola primetno se ubrzava metabolizam i uzrokuje sagorevanje više kalorija nego što se zadržava u organizmu u obliku masti. Alkoholna pića ne sadrže masti ni holesterol, ali naravno, različita pića imaju različite nutritivne vrednosti.

Preterivanje u piću izaziva cirozu jetre, povećava mogućnost malignih oboljenja. Umereno konzumiranje po mnogim studijama poboljšava zdravlje i produžava život.

2.1.4. Rangiranje i podela rakije

Rakije se rangiraju na osnovu nekoliko kriterijuma: boje, bistrine, tipičnosti mirisa i ukusa.

Postoji više vrsta rakija. Rakija od krompira-vodka, od pirinča-sake i druge. U Srbiji, međutim najpopularnije su tzv. voćne rakije kao što su:

• Lozovača • Kajsijevača • Viljamovka • Dunjevača • Klekovača • Šljivovica i druge

2.1.5. Jačina rakije

Jačina rakije određuje se po količini alkohola koji se izražava u zapreminskim delovima ili volumnim procentima, koji se obeležava kao vol%. Volumni procenat je broj litara čistog etanola (čistoće 100%) koji se nalazi u 100 l alkoholnog pića, odn. u vodeno alkoholnoj smeši koja to piće čini.

15

Ponekad se u svakodnevnom životu jačina rakije izražava u gradima. Preračunavanje se može izvršiti prema jednakosti:

1 grad = 2,46 vol%

Najpraktičnije i najbrže jačina rakije se određuje pomoću alkohometra.

2.2. Plodovi samoniklog bilja koji se mogu koristiti za proizvodnju rakija

2.2.1. Rod Malus

Rod Malus broji oko 25 vrsta u severnoj umerenoj zoni. U pitanju su drvenaste biljke iz familije Rosaceae, čiji se plodovi koriste u ishrani.

Slika 2.2. Malus sylvestris

Drveće je visine od 4 – 12 m, sa gustom krošnjom. Listovi su dugi 3 – 10 cm, jednostavni, naizmenični sa nazubljenim ivicama. Cvetovi imaju 5 kruničnih listića, koji su beli, roze ili crveni, sa crvenim prašnicima koji proizvode dosta polena. Cvetovi su sakupljeni u cvast gronju. Plod je specijalan oblik koštunice – pomum, do 8 cm u prečniku.

Osnovne karakteristike vrste Malus sylvestris

Morfolološke osobine: Malus sylvestris (divlja jabuka) je listopadno drvo do 10 m visine, široke, nepravilne i dosta guste krošnje ili žbun do 4 m visine. Grane su dlakave, a listovi elipsastog do srcastog oblika, 3-10 cm dužine. Mladi listovi su vunasto dlakavi. Cvetovi su ružičasti ili beli, pojedinačni ili 2-3 zajedno. Cveta od aprila do maja. Plod je loptastog oblika, varira u veličini od 6-8 cm u prečniku kod većine divljih vrsta. Raste u šumama i šikarama, međama, od nizijskog do brdskog regiona. Razmnožava se semenom i izdancima, a u voćarstvu se koristi kao podloga za kalemljenje plemenitih sorti jabuka.

Vreme cvetanja: cveta od aprila do maja.

16

Slika 2.3. Cvast, list i plod divlje jabuke – Malus sylvestris

Stanište: Raste u šumama, šikarama, po međama, od nižeg do brdskog regiona.

Opšta rasprostranjenost: Rasprostranjena je u čitavoj Evropi, Aziji i Severnoj Americi.

U Srbiji široko rasprostranjena.

2.2.2. Rod Fragaria

Obuhvata oko 10 vrsta uglavnom u severnoj hemisferi, ali i u suptropskim predelima. To su zeljaste biljke iz familije Rosaceae. Donji listovi biljaka su složeni, sastavljeni od 3 liske. Cvetovi poseduju bele krunične listiće. Plod je zbirni–u mesnatoji razrasloj cvetnoj loži nalaze se brojne orašice.

Osnovne karakteristike vrste Fragaria vesca

Morfološke osobine: Fragaria vesca (divlja jagoda, šumska jagoda, jagodnjak) je višegodišnja zeljasta biljka sa dugačkim poleglim stolonama koji se ukorenjuju na nodusima. Vršni deo rizoma je pokriven ostacima starih listova i zalistaka. Prizemni listovi su na dugačkim drškama, tročlani, prstasti. Sakupljeni su u rozetu, dlakavi, sa donje strane prileglo svilasto dlakavi. Listovi su rombični, testerasto nazubljeni 1-6 cm dužine. Zalisci su crvenosmeđi, lancetasti i ušiljeni. Stabljika je uspravna, u donjem delu sa stršećim, a u gornjem delu sa prileglim dlakama. Cvetovi su grupisani u cimozne cvasti na drškama. Čašičnih listića i listića spoljne čašice ima po 5. Kruničnih listića ima 5, beli su, retko ružičasti sa nokatcem. Prašnika ima više, a gineceum je izgrađen od velikog broja karpela, apokarpan, nadcvetan. Plod je zbirna orašica. Male orašice se nalaze po površini kupastog ili jajastog sočnog dela koji je nastao od proširene cvetne lože. U odnosu na gajene jagode mnogo je sitnija i nije toliko slatka, ali su joj miris i ukus mnogo jači.

Vreme cvetanja: Cveta krajem aprila.

Stanište: Raste uglavom po obodu šuma i na proplancima.

17

Slika 2.4. Cvet, list i plod divlje jagode – Fragaria vesca

Opšta rasprostranjenost: Rasprostranjena je u umerenom pojasu Evrope i Azije, a u toplijim predelima zastupljena je samo sa jednom vrsto i to u Čileu. U Srbiji široko rasprostranjena.

2.2.3. Rod Sambucus

Rod Sambucus u narodu poznatiji kao zova broji oko 25 vrsta. U pitanju su drvenaste biljke iz familije Caprifoliaceae, čiji se plodovi mogu koristiti u ishrani. Vrste ovog roda rastu severnoj hemisferi, Južnoj Americi, Australiji i Novoj Gvineji.

Slika 2.5. Sambucus nigra

Rod obuhvata žbunasto i nisko drveće do 10 m visine, uglavnom listopadno sa neparno perastim listovima kojih ima 5 – 9, dužine 5 – 30 cm, koji imaju listiće pretvorene u rašljike. Cvetovi su mali, bele do žute boje, mirisni, grupisani u velike i guste štitaste cvasti. Cveta u kasno proleće. Plod je sočnakočtunica, crna, plava ili crvena (retko žuta ili bela).

Osnovne karakteristike vrste Sambucus nigra Morfološke osobine: Sambucus nigra je višegodišnja drvenasta biljka. To je nisko

drvo li žbun do 10 m visine sa ispucalom, sivosmeđom korom. Mlade grane su zelene, prošarane svetlim crticama, na kojima se uočavaju lenticele. Unutrašnjost mladih grana ispunjena je belom srži. Listovi su neparno perasti, naspramni sa listićima čiji je obod testerasto nazubljen. Cvetovi su žućkastobeli, sitni, mirisni, sakupljeni u guste štitaste cvasti. Plod je okrugla, u početku zelena, a kasnije crna koštunica sa 3 – 4 semena.

18

Vreme cvetanja: Cveta od maja do jula.

Stanište: Dobro uspeva u uslovima tople klime i na humusnom zemljištu. Najviše je ima na svetlim i toplim mestima, zapuštenim terenima, po obodu šuma i šumskim procepima.

Opšta rasprostranjenost: Raste po celoj Evropi i Aziji. U Srbiji je široko rasprostranjena.

Slika 2.6. List, plod i cvast zove – Sambucus nigra

2.3. Mikroorganizmi - uloga i značaj mikroorganizama u proizvodnji rakije i izazivanju oboljenja

Mikroorganizmi su veoma velika i raznovrsna grupa organizama koja obuhvata jednoćelijske, višećelijske organizme, ali i organizme bez ćelijske građe. U ovu grupu se ubrajaju virusi, bakterije, alge, gljive, lišajevi i protozoe. Pored velike heterogenosti, ove organizme karakteriše nekoliko zajedničkih osobina, kao što su, mikroskopska razmera, brz metabolizam, velika brzina razmnožavanja, ali i velika raznolikost enzima i biohemijskih procesa.

Od svih mikroorganizama bakterije su najzastupljenije u prirodi. Mogu imati loptast, štapićast, izvijen i nitast oblik, a po načinu ishrane su uglavno paraziti i saprofiti, mada ima i autotrofnih predstavnika. One su kosmopolitski organizmi koji naseljavaju sve životne sredine. Ima ih u vodenoj, vazdušnoj sredini, zemljištu, pa čak i u sredinama gde drugi organizmi ne bi opstali (sredine sa visokim salanitetom, termalni izvori, jako kisele ili bazne sredine). Kao kosmopoliti igraju važnu ulogu u stvaranju, održavanju i funkcionisanju različitih ekosistema. U svim sredinama koje naseljavaju njihova aktivnost se odvija u stalnoj interakciji sa različitim biotičkim i abiotičkim faktorima.

U lancu kruženja materije na našoj planeti mikroorganizmi igraju važnu ulogu. Biljke u toku fotosinteze stvaraju ogromnu količinu organske materije koju u svojoj ishrani koriste životinje i ljudi. Uginućem biljaka i životinja organska materija dospeva na zemljište i u zemljište. Transformaciju mrtve organske materije do mineralnih oblika mogu da vrše samo mikroorganizmi. Na taj način omogućena je ishrana biljaka i stvaranje nove organske materije, čime je omogućeno neprekidno kruženje materije u prirodi. Kada ne bi bilo mikroorganizama, mrtva organska materija bi se nakupljala na površini zemljišta, postojeće

19

rezerve biljnih asimilativa bi se vremenom istrošile, nestalo bi biljaka, a nakon toga životinja i čoveka.

Mikroorganizmi su značajni za stvaranje i održavanje plodnosti zemljišta, pošto iz žetvenih ostataka vrše sintezu humusa, a iz humusa mineralizacijom oslobađaju biljne asimilative. Selekcionisani sojevi mikroorganizama se koriste za đubrenje i zaštitu biljaka..

Važnu ulogu imaju i u stočarstvu. Kod domaćih životinja su značajni u procesima varenja hrane jer omogućuju transformaciju celuloze i drugih polisaharida, pomažu varenju proteina, proizvode vitamine. Na ovaj način se organizmu obezbeđuje izgradnja tkiva, neophodna energija koja se troši na razne sinteze, održavanje temperature i mehanički rad, kao i stvaranje hranljivih materija koje imaju fiziološku ulogu, jer organizmu služe za kontrolu i regulaciju procesa metabolizma.

Izučavanje prirodnih procesa dovelo je do toga da aktivnosti mikroorganizama kao što su fermentacija, antimikrobno delovanje, uticaj na poboljšanje senzornih svojstava i probiotski učinak, zauzima značajno mesto u prehrambenoj industriji i to u proizvodnji hleba, mlečnih proizvoda, alkoholnih pića. U mikroorganizme sa ovakvom aktivnošću se ubrajaju Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus casei, Streptococcus thermophilus, Saccharomices cerevisiae, Torulopsis elipsoides, itd.

Pored brojnih korisnih uloga mikrorganizama u farmaceutskoj, poljoprivrednoj i prehrambenoj industriji, oni mogu biti i jako štetni jer predstavljaju rizik po zdravstevenu bezbednost ljudi, životinja i biljaka. Spontana aktivnost mikroorganizama izaziva pojavu biogenih amina i kvarenja, a samim tim i smanjenja upotrebne vrednosti hrane, može dovesti i do produkcije raznih toksičnih materija u zemljištu što negativno utiče na ostvarenje prinosa u poljoprivrednoj proizvodnji.

U mikroorganizme koji izazivaju pojavu biogenih amina i kvarenje hrane ubrajaju se bakterijski rodovi Microccocus, Pseudomonas, Xantomonas, Achomobacter, Aerobacter, Bacillus, Seratia, Streptococcus, Clostridium i plesni: Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Mucor, Rhizopus, Alterneria, Monilia, Oidium, i dr.

Poznavanjem aktivnosti mikroorganizama čovek ima mogućnost da njihovu primenu i kontrolu usmeri prema svojim potrebama čime bi korisnu ulogu pojedinih sojeva iskoristio u praktičnoj primeni, a ujedno sprečio razvoj štetnih mikroorganizama koji dovode do neželjenih posledica.

2.3.1. Pozitivna uloga mikroorganizama – fermentacija

Bakterije kao mikroorganizmi poseduju tri vrste metaboličkih procesa pri kojima

dolazi do oslobađanja energije, a to su: respiracioni procesi, fermentativni procesi i fotosinteza. Kod ovih metaboličkih grupa postoje mnogi putevi i mehanizmi koji dovode do oslobađanja i dobijanja energije. Iako su putevi u načelu isti, oni se ipak međusobno razlikuju, pre svega što su to enzimski procesi, a svaka vrsta mikroorganizma ima svoj specifičan enzimski sastav. Tako će te različite grupe mikroorganizama i enzima koristiti različite supstrate za svoj energetski metabolizam i formiraće intermedijarne i krajne produkte toga metabolizma koji se međusobno razlikuju. Supstrat takođe, može na različite načine biti razgrađen i odati iz sebe energiju. Svi ti procesi mogu dovesti do odavanja manje ili veće količine energije, a pri tim procesima mogu se obrazovati različiti međuprodukti i krajnji produkti koji će se međusobno razlikovati.

20

Jedan od energetskih procesa bakterija je i proces fermentacije ili vrenja. U ovom procesu se određenim oksido–redukcionim reakcijama obrazuju nestabilni molekuli čija fosfatna grupa sadrži mnogo slobodne energije. Ta grupa se pomoću odgovarajućih fermenata prenosi na molekul ADP-a što dovodi do obrazovanja molekula ATP-a (Petrović et al., 2007).

Fermentacija ili vrenje predstavlja jedan od načina dobijanja energije kod nekih prokariota. Proces se ostvaruje u anaerobnim uslovima oksido–redukcionim transformacijama organskih jedinjenja. Kod anaerobnih fermentacija, tj. pri anaeroboj razlaganji oksidacija nikad nije potpuna. Krajnji proizvodi koji nastaju mogu ponovo da se oksiduju uz oslobađanje energije, ako se u sistem uvede slobodni kiseonik. Sam termin fermentacija ili vrenje označava nepotpunu oksidaciju jedinjanja u anaerobnim uslovima, pod dejstovm mikroorganizama. Međutim, bakterijsko dejstvo može biti i aerobno, ukoliko ima dovoljno kiseonika, razlaganje ugljenih hidrata se može vršiti krajnjih proizvoda – CO2 i H2O.

Proces fermentacije može biti aeroban i anaeroban.

- Anaerobne fermentacije se odvijaju u odsusutvu kiseonika. To su prave fermentacije, jer se oksidacija supstrata zaustavlja do nekog organskog jedinjenja, a ATP se formira na nivou supstrata. Neke od anaerobnih fermentacija su alkoholna, mlečno – kiselinska, buterna, propionska i aceton – butilna.

- Aerobne fermentacije se odvijaju u prisustvu kiseonika. Kod fermentacije ovog tipa ATP se formira na respiratornom lancu u toku oksidativne fosforilacije. Proces oksidacije se zaustavlja do nekog organskog jedinjenja i nikad ne ide do kraja do CO2 i H2O, pa se ove fermentacije označavaju kao nepotpune oksidacije. Poznate aerobne fermntacije su sirćetna, limunsko–oksalna, fumarno–ćilibarna i glukonska.

Pri vrenju dolazi do razgradnje ugljeničnog skeleta molekula substrata. Hemijska jedinjenja koja mogu biti fermentisana su brojna. Prvenstveno su to ugljeni hidrati, ali i alkoholi, organske kiseline, aminokiseline, itd. Krajni produkti razlaganja ovih organskih jedinjenja imaju veliki industrijski značaj. Produkti fermentacije mogu biti različite organske kiseline (mlečna, buterna, mravlja, sirćetna), alkoholi (etil, butil, propil), aceton, ali i CO2 i H2. Prilikom fermentacije obrazuje se nekoliko proizvoda, a u zavisnosti od toga koji se osnovni produkt nakuplja u sredini postoje mlečno-kiselinska, alkoholna, buterna, sirćetna fermentacija.

Hemijske materije mogu biti podvrgnute fermentaciji ako sadrže nepotpuno oksidisane ili redukovane ugljenične atome. Tada može doći do oksidaciono-redukcionog preobražaja među molekulima koji potiču iz supstrata. Prilikom vrenja jedan deo produkta biće više redukovan, a dugi više oksidovan u poređenju sa supstratom. Fermentacija predstavlja metabolički proces u kome se proizvodi energija, a organska jedinjenja služe kao davaoci i kao primaoci elektrona. Najčešći davaoci elektrona su razni šećeri i to glukoza. U fermentaciji se iz supstrata formira veliki broj intermedijernih jedinjenja, da bi se na kraju procesa obrazovala mešavina raznih krajnjih produkata. Svaka fermentabilna supstanca ima granicu do koje može da fermentiše, ona nije ni snažno oksidovana, ni snažno redukovana i zbog toga krajnji produkti fermentacije sadrže znatne količine energije.

Glavni energetski značaj fermentacije je u obezbeđivanju 2 molekula ATP-a, što se u ovom procesu vrši na nivou supstrata, pa je takav način sinteze ATP-a označen kao supstratna fosforilacija. To je proces gde se u toku oksidacije organskog supstrata u prisustvu NAD-a i

21

neorganskog fosfora (Pi) stvara fosfatna veza bogata energijom koja se u daljoj razgradnji prenosi na ADP i dolazi do sinteze ATP-a (Petrović et al., 2007). Najveći broj mikroorganizama koji se snabdeva energijom putem fermentacije su striktni anaerobi, mada mogu biti i fakultativni anaerobi. Ovi organizmi žive bez kiseonika i energijom se snabdevaju putem fermentacije. Međutim, ukoliko se izlože vazduhu, menjaju način snabdevanja energijom i prelaze na aerobni metabolizam, tj. aerobnu respiraciju. Ova pojava je poznata kao Pasterov efekat. Naime, kvasci u anaerobnim uslovima imaju anaerobni tip katabolizma u toku koga sporo rastu, ali stvaraju velike količine etil alkohola iz glukoze, dok prelaskom na aerobnu respiraciju se smanjuje ili potpuno odsustvuje proizvodnja etil alkohola.

Bakterije pokazuju veliku raznolikost i vrsnu individualnost u korišćenju najrazličitijih supstrata za svoje kataboličke procese (Petrović et al., 2007). Zato se fermentacije supstrata i međuprodukti koji se pri tome formiraju često koriste za identifikaciju i diferencijaciju raznih bakterijskih vrsta. Bakterije za svoje energetski metabolizam najčešće koriste glukozu. Put razgradnje glukoze (C6H12O6) do ključne metaboličke komponente–pirogrožđane kiseline–je zajednički za procese disanja i fermentacije.

Veliki broj bakterija se snabdeva energijom i putem fermentacije i respiracije različitih ili istih jedinjenja. Koji će od ta dva tipa energetskog metabolizma bakterije koristiti, zavisi prvenstveno od raspolozivih krajnih akceptora elektrona i raspoloživih enzima, ali i od mnogih drugih činilaca. Među njima najvažnija je koncentracija respirabilnog ili fermentabilnog supstrata. Ukoliko bakterijama stoji na raspolaganju visoka koncentracija takvog supstrata, one će fermentirati taj supstrat, iako je prisutan kiseonik. Rezultat fermentacije supstrata biće niz terminalnih produkata fermentacije, kao što su kiseline i alkoholi, koji se nakupljaju u ćeliji. Ako bakterijama ne stoji na raspolaganju glukoza, ona prelazi na snabdevanje energijom putem respiracije. Tada će kao supstrat koristiti terminalne razgradne produkte fermentacije, alkohol i kiseline, koji su se nakupili tokom fermentacije.

2.3.1.1. Alkoholna fermentacija (alkoholno vrenje)

Alkoholno vrenje predstavlja fermentisanje ugljenih hidrata po uticajem

mikroorganizama do etil alkohola i CO2, sa obrazovanjem manjih količina nekih međuprodukata. Centralni intermedijer je pirogrožđana kiselina, tj. njen aktivan oblik piruvat-jon. Dekarboksilacijom pirogrožđane kiseline formiraju se CO2 i acetaldehid, koji se potom redukuje do etanola. Ovaj tip fermentacije ostvaruju kvasci, mukorne gljive i neke bakterije. Divlji sojevi kvasca imaju slaba fermentativna svojstva, dok kulturelni kvasci imaju visoku fermentativnu aktivnost i primenjuju se u industriji (pivski, vinogradarski, pekarski kavsci).

Vrenje se odigrava u kiseloj sredini (pH=4.0 – 4.5), zato što kisela sredina ugušuje i sprečava razvitak prateće mikroflore. Optimalna temperatura je oko 30° C, a koncentracija šećera 10 – 15%, jer povećan sadržaj šećera otežava vrenje, a pri 30 – 35% ono se i prekida.

Alkoholna fermentacija se koristi za proizvodnju alkohola, glicerina, raznih vina, piva konjaka, ali i u pekarskoj industriji. Ishodna sirovina za dobijanje alkohola su ugljeni hidrati različitok porekla (krompir, žitarice). Proces alkoholnog vrenja ide po EMP putu.

2.3.1.2. Mikroorganizmi koji učestvuju u alkoholnoj fermentaciji

Alkoholna fermentacija se vrši korišćenjem kvasaca roda Saccharomyces i roda Zimomonas. Ovi kvasci i ove bakterije se koriste zbog svog jednostavnog metabolizma.

22

Prilikom fermentacija javljaju se sojevi koji direktno iz obnovljenih skrobnih i celuloznih sirovina proizvode etanol.

Kvasci

Njihova uloga je da pokrenu alkoholnu fermentaciju gde se putem njihovog metabolizma šećer pretvara u alkohol. Nalaze se svuda u prirodi pa razni proizvodjači puštaju da se fermentacija obavi spontano uz pomoć takozvanih divljih kvasaca. U zavisnosti od tipa i koncentracije koja je dospela u voćni kljuk, manje će šećera prevreti u alkohol i mogu nastati nepoželjna jedinjenja koja mogu ukvariti aromu naše rakije. Da bi alkoholna fermentacija što pre otpočela i odvijala se što efikasnije u sud koji je napunjen izmuljanim i ispasiranim voćem, ubacuju se selekcionisani sojevi kvasaca. To praktično znači da se vrši izbor kulture kvasaca koji je za vrenje odredjenog voćnog kljuka najpogoniji. U laboratorijskim uslovima se prihranjuje, namnožava i priprema za upotrebu. Prilikom korišćenja selekcionisanih sojeva bitno je uzeti u obzir različit sastav voća u pogledu količine mineralnih materija, vitamina (B-kompleks), fosfornih i azotnih jedinjenja koja su potrebna kvascima za normalan razvitak. Iz ovog razloga je bitno dodavanje preparata za njihovo prihranjivanje. Prednosti upotrebe selekcionisanog kvasca su brzo razmnožavanje i brz početak alkoholne fermentacije, visok stepen fermeabilnosti tj. moć previranja velike količine šećera u alkohol, otpornost na SO2, tolerantnost prema višim i nižim temperaturama, produkcija aromatičnih estara.

Rod Saccharomyces

Vrste ovog roda imaju sferične ili ovalne jednojedarne ćelije sa tankom membranom. Protoplazma je zrnaste strukture i sadrži jedro, mitohondrije, vakuole koje su centralno postavljene, kao i rezervne materije (zrnca glikogena, masti i volutin).

U procesu razmnožavanja pupljenjem, na površini ćelije obrazuje se sferičan izraštaj koji se, kada dovoljno poraste odvaja pregradom od majke. Nekada se na ćeliji obrazuje pupoljak pre odvajanja od majke ćelije i na taj način nastaje niz labavo vezanih ćelija koja se naziva psudomicelija.

U polnom procesu obrazuju askuse sa loptastim askosporama.

Saccharomyces cerevisiae ima sposobnost da aktivno izazviva šećerno vrenje i produkujue najviše alkohola od svih kvasaca (10 – 15%). Pored etil alkohola i CO2, u procesu vrenja obrazuju se i druge materije koje od kojih zavisi ukus i aroma rakija.

Bakterije

Bakterije se zbog svoje fermentativne sposobnosti koriste u proizvodnji hrane (jogurt, sir, turšija, itd), proizvodnji alkoholnih pića, neke se čak koriste i u proizvodnji antibiotika.

Rod Zimomonas

Bakterije ovog roda su štapićastog oblika sa zaobljenim krajevima, javljaju se obično u parovima, gramnegativni su, poseduju 1-4 polarnih flagela, fakultativni anaerobi, neki sojevi su obligatni aerobi, hemorganotrofi su i zahtevaju faktore rasta kao što su biotin i pantotenat. Vrste ovog roda primenjuju se u fermentisanju agavinog i palminog soka.

Zimomonas mobilis je poznata po sposobnosti proizvodnje alkohola. Razlaže šećere do piruvata po Entner – Dudorf putu. Piruvat se zatim fermentiše do etanola i CO2.

23

Prednosti Z. mobilis u odnosu na S. cerecisiae su:

- daje veći prinos etanola;

- oko 2.5 puta veću brzinu potrošnje šećera;

- toleranrnije su na osmotski pritisak i etanol;

- optimum pH širi, a temperatura fermentacije je visa.

Nedostatak Z. mobilis je što fermentiše samo glukozu, fruktozu i sharozu.

2.3.2. Mikroorganizmi zdravog čovečijeg tela

Mikroorganizmi mogu naseljavati različite delove čovekovog tela boraveći na njemu privremeno ili stalno. Tako se mikroorganizmi mogu naći na površini kože, u usnoj duplji, u digestivnom traktu gde postoji stalna flora mikroorganizama koja produkuje enzime, vitamine, kiseline i tako omogućava normalno funkcionisanje digestivnog trakta čoveka, takođe, mikroorganizama ima i u respiratornom i urogenitalnom traktu čoveka.

Mikroorganizmi svojom aktivnošću doprinose fiziološkom i zdravstvenom stanju čoveka tako što:

– čiste organizam od nepotrebnih produkata metabolizma čoveka koristeći ih kao nutrijente;

– produkuju biološki aktivne materije tipa vitamina, aminokiselina, koje doprinose aktivnosti domaćina;

– metaboličkom aktivnošću negativno deluju na patogene te igraju važnu ulogu u zaštiti od njih.

Pored niza pozitivnih efekata koje imaju, mikroorganizmi predstavljaju jedan od medicinskih problema, jer su većina patogeni za čoveka.

2.3.3. Patogeni mikroorganizmi

Uzroci oboljenja ljudi i životinja su mnogobrojni, a jedan od njih su svakako mikroorganizmi.

Patogenost mikroorganizama u širem smislu predstavlja sposobnost mikroorganizma da prodre u organizam domaćina, da se u njemu održava, razmnožava i izaziva bolest. U užem smislu bila bi, sposobnost infektivnog agensa da izaziva oboljenje.

Pojedine ili sve kvalitativne osobine mikroorganizama, koje su odgovorne za njegovu patogenost, mogu biti različito izražene. Sposobnost mikroorganizma da uzrokuje oboljenje je virulencija, odnosno kvantitativno izražen stepen patogenosti. Virulencija je rezultat mogućnosti mikroorganizma da adherira za domaćina, izvrši invaziju i luči toksine. Virulentnost zavisi od genetskih predispozicija za patogenost određene vrste mikroorganizma, faktora i mehanizama odbrane domaćina, ali i od spoljašnjih faktora.

Patogenost mikroorganizama je genetski determinisana, postojana osobina date vrste mikroorganizma, a virulentnost je kvantitet tih kvaliteta kod pojedinih sojeva određene vrste.

24

Među patogenima se mogu uočiti dve velike grupe mikroorganizama, a to su patogeni paraziti i patogeni saprofiti. Patogeni paraziti za svoju ishranu koriste žive ćelije ili esencijalne metabolite svoga domaćina, od koga su stalno ili povremeno potpuno zavisni. Patogeni saprofiti žive u okolnoj sredini i u organizam domaćina dospevaju pasivnim putem, najčešće u vidu spora preko rana ili konzumiranjem zaražene vode ili hrane. Neki od njih kao što je Clostridium botulinum, Clostridium tetani, produkuju veoma jake toksine, i zbog toga se oboljenja koja izazivaju patogeni saprofiti nazivaju intoksikacije.

Tokom evolucije, patogeni mikroorganizmi su razvili različite mehanizme putem kojih deluju na domaćina, a to su:

– obrazovanje spora (tetanusni i antraksni bacili), kapsula (pneumokoke, diplokoke i dr.), organela za kretanje (enterobakterije, vibrionikolere, spirohete i dr.);

– izlučivanje enzima (streptokinaza – protiv fibrinske barijere, hijaluronidaza – protiv hijaluronske kiseline vezivnih tkiva, neurominidaza – razgrađuje mukopolisaharide ćelijskog omotača epitela disajnih puteva, hemolizini, fibrinolizini, plazmokoagulaza i dr.);

– izlučivanje toksičnih materija – ekzotoksina, sa afinitetom za određena tkiva (tetanusni, difterijalni, botulin toksin), i endotoksina, koji prouzrokuju opštu intoksikaciju i alergijske reakcije (endotoksini enterobakterija, šigela, salmonela, rikecija i dr.). egzotoksini se izlučuju pri životnim procesima bakterija, a endotoksini prilikom njihovog liziranja (Radev et al., 1988).

Svi navedeni faktori patogene aktivnosti mikroorganizama se mogu grupisati u dve grupe, jedna grupa im obezbeđuje invazivnost, a druga toksičnost.

Invazivnost je mogućnost organizma da prodre u tkivo domaćina, umnoži se u velikom broju, inhibira njegovo funkcionisanje i širi se dalje u organizmu. Faktori invazivnosti mikroorganizama su enzimi koji oštećuju tkivo i antifagocitni faktori, koji sprečavaju efikasnost odbrambenih mehanizama domaćina (Petrović et al., 2007).

Faktori olakšavaju invazivnost su:

– kapsula – površinska stuktura koju produkuje bakterijska ćelija, a koja je štiti od štetnih uticaja sredine, a u tkivima domaćina od fagocitoze. Kapsule ometaju adherenciju fagocita za bakteriju, npr. kod S .pneumoniae, K. pneumoniae, B. antracis, itd. Fagociti mogu da fagocitiraju intrakapsularne bakterije, ali ne mogu da ih razgrade. Oni ih putem krvi raznose do ostalih delova tela domaćina, tako da pospešuju širenje patogenih bakterija;

– kinaze – bakterije ih luče u cilju lize ugrušaka fibrina koji nastaju kao reakcija organizma na mestu infekcije sa funkcijom lokalizacije i sprečavanja daljeg širenja mikroorganizma;

– koagulaza – prevode fibrinogen u fibrin i stvaraju krvne ugruške, u cilju zaštite bakterije od odbrambenih snaga domaćina (Staphylococcus aureus);

– hijaluronidaza – razara hijaluronsku kiselinu koja je vezivna komponenta tkiva domaćina i omogućava prodor mikroorganizma u dublje slojeve tkiva (Streptococcus, Staphylococcus, Clostridium);

– kolagenaza – luče je uzročnici gasne gangrene (rod Clostridium), razara kolagen vezivnog tkiva.

25

Toksičnost je sposobnost mikroorganizma da produkuje toksine koji oštećuju ili ubijaju ćelije domaćina. U zavisnosti od toga da li ih izlučuje u spoljašnju sredinu ili ih čuvaju vezane za ćelijsku supstancu, toksini bakterija dele se na egzotoksine i endotoksine.

Egzotoksini su proteinske supstance koje bakterije luče u spoljašnju sredinu, a koje imaju toksičan efekat na ćelije domaćina. Zajednička karakteristika egzotoksina je da su termolabilni, veoma toksični i imunogeni. Dezintegraciju egzotoksina vrše svi oni faktori koji vrše denaturaciju proteina, visoka temperatura, UV zračenje, jake kiseline ili baze, proteolitički enzimi. Oni su odlični antigeni, jer u organizmu domaćina stimulišu produkciju veliku količinu specifičnih antitoksina. Ukoliko se egzotoksini podvrgnu delovanju visoke temperature, oni gube toksičnost, ali zadržavaju antigenost. Detoksikovani egzotoksini se označavaju kao toksoidi, a značajni su za veštačku imunizaciju protiv nekih zaraznih bolesti, npr. difterija, tetanus.

Prema načinu delovanja, egzotoksini şe mogu podeliti na citotoksine (hemolizini, leukocidin, itd), neurotoksine (toksini vrsta Cl. botulinum i Cl. tetani) i enterotoksine.

Endotoksini predstavljaju spoljašnji sloj spoljašnje membrane bakterija. Ovi toksini su sastavni deo ćelije i oslobađaju se tek nakon smrti i lize bakterija. Endotoksini su kompleksna jedinjenja velikih molekula koji su termostabilni, slabo toksični i slabo imunogeni. Toksični efekat se ispoljava pojavom groznice, smanjenjem broja belih krvnih zrnaca i trombocita, oslobađanjem citokina, generalizovanom inflamacijom, a u nekim slučajevim i hemoragičnim šokom i nekrozom tkiva. Endotoksini ne pokazuju izrazit afinitet prema pojedinim vrstama tkiva i zbog toga ne izazivaju specifične kliničke simptome. (Petrović et al., 2007).

2.3.4. Patogeni mikroorganizmi i bolesti koje izazivaju

U odnosu na ukupan broj do sada opisanih mikroorganizama, uzročnici oboljena čoveka i životinja čine relativno mali broj. U daljem tekstu biće opisane pojedine vrste čiji su sojevi poznati kao glavni uzročnici velikog broja bolesti od značaja za humanu i veterinarsku medicinu.

2.3.4.1. Rod Clostridium

Bakterije ovog roda su anaerobni, grampozitivni štapići koji formiraju endospore. Pretežno su mezofilni mikroorganizmi. Važna karakteristika u okviru ovog roda jeste mogućnost razgradnje šećera i proteina.

Clostridium perfrigenens

Morfološke osobine: To je, grampozitivna, anaerobna, nepokretna, štapićasta bakterija koja formira endospore klostridijalnog tipa.

Toksičnost: ova bakterija može produkovati α – toksin (odgovoran za gasne gangrene) koji se inkorporira u ćelijske plazma membrane izazivajući promene u njenoj strukturi i funkciji. Zatim θ – toksin koji ima slične hemolitičke i nekrotičke efekte, DNAze i hijaluronidaze, kao i kolagenaze koje razlažu kolagen u potkožnim tkivima i mišićima. Klostridijalni termostabilni enterotoksin je čest uzrok alimentarnih intoksikacija (prisutan je u kontaminiranoj hrani i fecesu) i dovodi do dijareje za 6 – 8 sati. On izaziva hipersekreciju u jejnumu i ileumu sa gubitkom tečnosti i elektrolita (Jawetz et al., 2007).

26

Rasprostranjenost: Cl. perfrigenes je široko rasprostranjen u prirodi. Može se naći kao normlna komponenta vegetacije, morskog sedimenta, zemljištu, ali i u intestinalnom traktu čoveka, insekata.

Patogenost: Cl. perfrigenes može izazvati nekrozu tkiva, bakteremije, alimentarne toksikoinfekcije, nekrotičnu upalu creva, gasne gangrene (poznate kao mionekroze). Zbog sposobnosti da produkuje enterotoksin ova bakterija je čest uzročnik trovanja kontaminiranom hranom koja se manifestuju kao povišena temperatura, dijareja i abdominalni bol.

2.3.4.2. Rod Bacillus

U ovaj rod spadaju krupne grampozitivne, štapićaste bakterije koje se javljaju pojedinačno, u parovima ili u vidu lanca. Veoma su pokretne i formiraju endospore, a neke i kapsulu. Vrste ovog roda su aerobi ili fakultativni anaerobi. Mnoge vrste imaju sposobnost da sintetišu ekstracelularne enzime i antibiotike. Većina vrsta roda Bacillus su saprofini, rasprostranjeni u zemljištu, vazduhu, vodi i na biljkama. Izuzetak je Bacillus anthracis koji je patogen, mada i rodovi B. cereus i B. subtilis mogu biti uslovno patogeni. B. thuringiensis je patogen insekata i koristi se u njihovoj kontroli.

Bacillus subtilis je bakterija koja se najčešće nalazi u zemljištu, zbog čega je ovaj bakterijski soj poznat kao „travni bacil“. Štapićastog je oblika i u ekstremnim uslovima formira zaštitne endospore, što mu omogućava da podnese razne uslove sredine. Takođe, ovaj bakterijski soj u periodu stresa izazvanog nedostatkom hrane formira endospore kako bi uspeo da istraje u takvom okruženju, sve dok uslovi ne postanu povoljniji.

Bacillus subtilis proizvodi proteolitički enzim subtilisin koji može izazvati kontaminaciju hrane, ali veoma retko izaziva trovanje hranom, tako da se slobodno može reći da nije izazivač bolesti kod ljudi. Spore ovog bakterijskog soja mogu da prežive ekstremne toplote tokom termičke obrade namirnica. Kod namirnica sa visokim sadržajem polisaharida stvara karakteristične končaste lepljive forme.

2.3.4.3. Rod Streptococcus

1874. godine bečki hirurg Bullroth ih je prvi pronašao u iscedku gnojnih rana. Streptokoke su veoma heterogena grupa bakterija. To su grampozitivne bakterije, loptastog oblika, koke, najčešće grupisane u parove i lance. Nepokretne su, a neke vrste poseduju kapsulu. Mnogi bakteriolozi su pokušali da ih sistematizuju. Prvi je 1891. godine Lingelshelm sistematizovao na osnovu izgleda kolonija i morfologije. U periodu od 1902. do 1905. Hiss i Gordon su izvršili podelu streptokoka na osnovu fermentativnih sposobnosti. 1919. Brown je na osnovu hemolize na krvnom agaru, podelio streptokoke u tri grupe: α, β, γ hemolitičke streptokoke.

Sherman je izvršio podelu streptokoka na osnovu njihovih fizioloških osobina i to na osnovu rasta u alkalnoj sredini i u hipertoničnom rastvoru NaCl, rasta u različitoj koncentraciji žuči, prema osetljivosti na razne temperature i prema njihovim fermentativnim osobinama. Sherman je formirao 4 grupe streptokoka: Streptococcus pyogenus, Streptococcus viridans, Streptococus lactis i Enterococcus.

Rebeka Lancefield je 1933. godine izvršila novu podelu streptokoka u serološke grupe. Podela je izvršena na osnovu sastava ćelijskog i njegovog antigena. Mnoge streptokoke u

27

ćelijskom zidu poseduju polimere ugljenih hidrata tzv. C – supstanca, čija se građa razlikuje kod različitih streptokoka.

Streptococcus pneumoniae (pneumokok)

1881. godine, nezavisno jedan od drugog Stenberg i Paster su izolovali ovu bakteriju. Nešto kasnije su Frankel i Weishselbaum ustanovili da je taj diplokok ustvari uzročnik pneumonije. Raniji nazivi ove bakterije bili su Micrococcus pneumoniae, micrococcus lanceolatus i Diplococcus pneumoniae.

Morfološke osobine: grampozitivne bakterije, ovalnog ili kružnog oblika, raspoređene u parovima od po dve ili u vidu kratkih lanaca. Obavijene su kapsulom polisaharidnog sastava. Nepokretne su i asporogene. Kapsulu poseduju virulentni sojevi (S – oblici). Prilikom gajenja na hranljivu podlogu kapsula se gubi i tako nastaju avirulentni R – oblici. Pripada grupi aerobnih i fakultativno anaerobnih bakterija.

Biohemijske osobine: fermentiše veliki broj ugljenih hidrata, ali samo do kiseline. Za ovu vrstu je takođe značajna fermentacija inulina, koga ostale streptokoke ne razgrađuju.

Otpornost: veoma su osetljive bakterije, tako da ih temperatura od 50° C ubija za kratko vreme. Osetljivi su prema fenolu, solima teških metala, a posebno prema sublimatu, kalijum permanganatu i dezinfikacionim sredstvima. Produkuju i veće količine peroksida, a kako ne poseduju katalazu, pri dužoj inkubaciji, kulture pneumokoka podležu autosterilizaciji.

Toksičnost: ne luči pravi egzotoksin, već produkuje pneumolizin koji je sličan O – hemolizinu Streptococcus pyogenes. Takođe, produkuju leukocidine, hijaluronidazu i supstancu sličnu proteazi koja izaziva purpuru. Kapsula pneumokoka nije toksična, ali ima ulogu u njihovoj patogenosti i virulentnosti, zato što ih štiti od fagocitoze.

Antigena struktura: poseduje kapsularne i somatske antigene. Kapsularni antigeni su specifična solubilna supstanca SSS, izgrađena od polisaharida. Postoji preko 90 kapsularnih antigena i oni su specifični za različite serotipove pneumokoka. Somatski antigeni su C – supstanca (antigen građen od polisaharida), M – antigeni su proteini i R – antigen (imaju ga samo R – oblici pneumokoka).

Patogensot za čoveka: pneumokoke nastanjuju sluzokožu gornjih disajnih puteva, gde pripadaju normalnoj bakterijskoj flori. Usled drugih infekcija, kao što su grip ili slabost odbrambenog sistema, može doći do njihovog preteranog razmnožavanja i širenja, tako da nastaje infekcija. Mogu izazvati pneumonije (zapaljenje pluća), zapaljenje uva, sinuzitis, meningitis, sepsu. Pneumokoknim pneumonijama često prethodi septikemija, a kasnije se često javljau komplikacije kao što su perikarditis, endokarditis, meningitis, artritis.

Streptococcus pyogenes (piogeni streptokok)

Morfoloske osobine: grampozitivna bakterija, loptastog od ovalnog oblika, povezane u kraće ili duže lance. Asporogene, nepokretne, neke imaju kapsulu, a sve u zavisnosti iz kog supstrata su izolovane.

Biohemijske osobine: svi sojevi fermentišu glukozu, trehalozu i redukuju metilensko plavo.

Otpornost: osetljiv je na spoljašnje faktore, a na temperaturi od 45° C ne opstaje. U sasušenom stanju može dugo ostati virulentan.

28

Toksičnost: pored M – proteina za patogensot ove bakterije odgovorni su toksini i enzimi koje luči:

- streptolizini O, S uništavaju ćelijsku membranu enterocita i druge ćelije organizma. Streptolizin O deluje kao antigen i izaziva odgovor odbrambenog sistema u vidu stvaranja antitela. Streptolizin S je polipeptid, stabilan je prema kiseoniku i ne deluje antigenski. Veoma je toksičan.

- piogeni toksini streptokoka A, B, C, deluju kao superantigeni, tako što izazivaju preteranu reakciju imuniteta uz preteranu reakciju imuniteta uz oslobađanje mnoštva medijatora zapaljenja.

- streptokinaza je enzim koji razlaže fibrin.

- hijaluronidaza razlaže međućelijske supstance kao što su glikozaminoglikani u koje spada i hijaluronska kiselina.

- dezoksiribonukleaza je enzim koji razlaže DNK.

Antigenska struktura: na površini ćelije se nalazi kapsula sa kapsularnom supstancom, koja sadrži hijaluronsku kiselinu. U sastavu njihovog zida ulaze specifični proteinski antigeni M, T, R. Od antigena je najvažniji M, koji predstavlja faktor virulencije koja sprečava fagocitozu. Ispod ćelijkog zida nalazi se C – supstanca – grupno specifičan ugljeni hidrat (hapten), zatim sloj mukopeptida i na kraju citoplazmatska membrana. U centru ćelije nalazi se nukleoproteini niske serološke specifičnosti koji predstavljaju P – supstancu.

Patogenost za čoveka: izazivaju bolesti označene kao streptokokoze. Bolest se prenosi kapljičnim putem sa bolesnika. Moguće su eksplozivne epidemije streptokokne angine ili šarlaha nakon konzumiranja zagađene hrane, prvenstveno mleka i mlečnih proizvoda. Kao neposredna posledica infekcije streptokokom su streptokokna upala nosa i ždrela, streptokokna angina, šarlah, upala bronhija i pluća, crveni vetar, gnojne infekcije kože i babinja groznica. Takođe, mogu izazvati upalu moždanih ovojnica i negnojne komplikacije u obliku reumatske groznice i glomerulonefritisa.

2.3.4.4. Rod Staphylococcus

Bakterije iz ovog roda su široko rasprostranjene u prirodi. Mnoge od njih su paraziti ljudi i životinja. Stafilokoke su nepokretne, loptaste, dele se binarnom deobom i nakon deobe ostaju zajedno gradeći nepravilne, grozdaste skupine ćelija. Fakultativnu su anaerobi. U anaerobnim uslovima ne sintetišu citohrome i energiju stvaraju isključivo fermentisanjem šećera. Najčešće su uzročnici gnojnih procesa, pa se zbog toga svrstavaju u grupu tzv. piogenih koka ( pios – gnoj). Izazivaju oboljenja stafilokokoze. Za humanu medicinu najznačajnije su Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus

Morfološke osobine: grampozitivne koke, loptastog oblika. U preparatima iz kultura poređani su u nepravilne grupe u vidu grozdova. Nepokretne su i ne formiraju endospore, a samo neke od njih poseduju kapsulu. Fakultativni su anaerobi.

Biohemijske osobine: stafilokoke fermentišu samo neke ugljene hidrate, i to glukozu i maltozu. Iz glukoze obrazuju aceton. Poseduju enzim ureazu, a većina patogenih sojeva fermentiše manitol, hidrolizuju želatin, a poseduju i fofatazu.

29

Otpornost: stafilokoke spadaju u grupu veoma otpornih bakterija. Većina gine na temperaturi od 60° C tek posle jedan sat, a neke mogu izdržati duže vreme i na 80° C. Otporne su i prema sušenju i visokim koncentracijama šećera i soli.

Toksičnost: patogeni stafilokoki luče brojne toksine i enzime, mnoge toksine genetički kontrolišu plazmidi, takođe se smatra da su i pod hromozomalnom i ekstrahromozomalnom kontrolom. Patogene stafilokoke produkuju sledeće toksine: hemolizin (vrši lizu životinjskih eritrocita), leukocidin (uništava ljudske leukocite), dermotoksin, eritrogeni toksin, enterotoksin. Od enzima produkuju koagulazu, hijaluronidazu, fibrinolizin (stafilokinaza), proteaze, lipaze, fosfataze i beta laktamaze.

Patogenost za čoveka: najčešća su gnojna oboljenja kože koja se manifestuju kao apces, furunkula, itd. Ukoliko stafilokoke prodru iz ovih žarišta u razne druge lokacije, mogu se javiti znaci teških oboljenja kao što su meningitis, artritis, stafilokokne sepse (prodor stafilokoka u krv).

Rasprostranjenost: široko rasprostranjene u prirodi. Mogu se naći u vodi, vazduhu, prašini, na razmin prdmetima i namirnicama. Vrste Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus pyogenus se mogu naći na koži zdravih ljudi.

Staphylococcus aureus (zlatni stafilokok)

Široko rasprostranjena bakterija i može biti prisutna kod zdravih osoba. Obzirom da S. aureus ispoljava veliku tolerantnost prema visokim koncentracijama kuhinjske soli i šećera, često se javlja kao kontaminent slanih i slatkih namirnica. Jedan od najčešćih izvora kontaminacije jeste kada osobe koje su zaražene, dolaze u dodir sa hranom koja nije adekvatno čuvana. Najčešći izvor trovanja hranom kod kojih su prisutne stafilokoke jesu kolači sa šlagom, mlečni proizvodi uključujući i krem, živinsko meso, kuvano meso. Na idealnoj temperaturi i na visokim nivoima kontaminacije, stafilokoke se mogu dovoljno brzo razmnožiti da izazovu trovanje hranom bez vidljivih promena njenih senzornih karakteristika, kao što su boja, ukus i miris.

Staphylococcus aureus je producent ekstracelularnih, termostabilnih enterotoksina. Svi stafilokokni entertoksini su proteini relativno male molekulske mase. Kad su uslovi, kao što su aktivnost vode, temperature, pH, prisustvo i odsustvo kiseonika, razlikuju od optimalnih koji pogoduju za rast S. aureus, onda ova bakterija stvara enterotoksine. Stafilokokni enterotoksini predstavljaju specifičan soj, tako da i proizvedeni soj istovremeno može stvarati jedan ili više enterotoksina (Samardžija et al., 2007).

Često naseljavaju kožu, naročito kod bolničkih pacijenata. Bolesti koje izaziva ovaj stafilokok mogu biti invazivne (prodorom bakterije u organizam), intoksikacije (izlučuje toksine koji su odgovorni za poremećaje, npr. konzumiranje pokvarenih namirnica), i kombinacijom ove dve grupe.

2.3.4.5. Rod Salmonella

Rod je dobio ime u čast istraživača Salmona. Skoro svi predstavnici roda salmonela su patogeni za čoveka, a mnogi i za životinje. Aerobne i anaerobne bakterije su.

Morfološke osobine: Salmonele su gramnegativni štapići, pokretne peritrihalnim flagelama (izuzev S. gallinarum i S. pullorum), bez kapsule.

30

Otpornost: osetljive su na različite faktore. U ledu i zamrznutoj zemlji ostaju žive preko cele zime, ali temperatura od 56° C ih ubija nakon 20 – 30 minuta. Osetljive su na hlor, natrijum, dezoksiholat, jedinjenja selena.

Biohemijske osobine: Za ove bakterije je karakteristično da fermentišu glukozu uz oslobađanje gasa. Ne fermentišu laktozu, ne vrše likvefakaciju želatina, ne razlažu ureu, a većina stvara H2S.

Toksičnost: Salmonele sintetišu endotoksin koji je po sastavu glicido – lipido – polipeptidni kompleks, a koji je ujedno i somatski antigen salmonela.

Antigenska struktura: Salmonele imaju somatske (O – antigeni koji su termostabilni, označavaju se arapskim brojevima) i flagelatne antigene (proteinske prirode i termolabilni, specifični H – antigeni faze I koji se označavaju malim latinskim slovom i nespecifični H – antigeni faze II koji se označavaju arapskim brojevima). Mnoge salmonele imaju i ovojni ili Vi – antigen koji se nalazi na površini bakterijske ćelije (Felix i Pitt su smatrali da su salmonele sa tim antigenom virulentne –Virulence factor). Svaki od tih antigena je kompleksan i sastavljen od više antigena. Vrsta S. enterica je na osnovu pomenutih antigena podeljena na preko 1500 serotipova (Strohl at al. 2001).

Patogenost za ljude: Sve vrste ovog roda su patogene za ljude, bolesti koje izazivaju poznate su pod imenom salmoneloze. Salmoneloze se mogu podeliti u tri grupe:

- alimentarne intoksikacije – započinju kao intoksikacije jer se endotoksin oslobađa iz raspadnutih ćelija u digestvnom traktu. Ova oboljenja se najčešće manifestuju akutnim gastroenteritisom (dijareja, blaga groznica)

- enteritisi – razvijaju se sporo, sa prolivom koji liči na dizenterične. Izazivač je S. enterica.

- Ciklična zarazna oboljenja – izazivaju ih S. typhi, S. paratyphi (A, B, C), koje su patogene samo za ljude I uzrokuju trbušni tifus, odn. paratifusni sindrom.

2.3.4.6. Rod Shigella

Rod je dobi ime po naučniku Shiga, koji ih je prvi otkrio1898. godine.

Morfološke osobine: to su gramnegativne bakterije, štapićastog oblika, koje su nepokretne i ne formiraju spore. Nemaju flagele i bez kapsule su, mada neki sojevi poseduju ovojnicu. Neki sojevi Sh. flexneri imaju fimbrije. Aerobne i fakultativno anaerobne bakterije.

Biohemijske osobine: vrste ovog roda ne fermentišu laktozu, za razliku od ostalih šećera, pri čemu stvaraju kiselinu bez gasa (Sh. flexneri stvara i gas). Vrše redukciju nitrata u nitrite. Prema razgradnji manitola dele se na manitol – (Sh. dysenteriae) i manitol + (Sh. flexneri, Sh. boydii i Sh. sonnei).

Toksičnost: Sve šigele produkuju endotoksin (identičan O – antigenu) koji je polisaharidno –lipidno – peptidni komleks i otporan je na visoke temperature. Shigella shiga i neki drugi sojevi šigela produkuju egzotoksin – šiga toksin, koji je proteinske prirode i termolabilan je. Primarno dejstvo mu je na sitne krvne sudove CNS – a, izazivajući paralize i neurološke lezije.

31

Antigena sruktura: Šigele sadrže termostabilne somatske O – antigene koji su smešteni na površini ćelija i sastoje se od repetetivnih sekvenci heksoza, termostabilne 1F, C – i ovojnice K – antigene, zatim beta, gama i fimbria-antigene. Na osnovu antigena, građe i biohemijskih osobina sve šigele su podeljene u četiri podgrupe:

A: Sh. dysentericae (15 serotipova);

B:Sh. flexneri (8 serotipova);

C: Sh. bydii (19 serotipova);

D: Sh. sonnei (1 serotip).

Patogenost: Svi serotipovi Shigella su patogeni za čoveka i izazivaju oboljenja bacilarnu dizenteriju i šigelozu. To je infektivno oboljenje koje može imati akutni, subakutni i hronični oblik. Najčešći način izazivanja zaraze ovim bakterijskim sojem je preko neispravne vode za piće ili namirnicma koje su kontaminirane neispravnom vodom, kao što su krompir, riba, testenine, živinsko meso, mlečni proizvodi i dr. Bolest šigelom manifestuje se bolom u stomaku, grčevima, dijarejom, groznicom, povraćanjem i krvavom i sulznom stolicom. Vreme inkubacije bolesti je od 12 – 50 sati i može biti vrlo neugodno, a u nekim slučajevima i sa smrtnim ishodom.

2.3.4.7. Rod Pseudomonas

Rod obuhvata gramnegativne štapiće sa jednom ili više polarnih flagela, stvaraju spore. Ove bakterije su aerobi, katalaza i oksidaza su pozitivni i ne fermentišu ugljene hidrate.

Najveći broj vrsta su saprofiti. Patogene vrste izazivaju bolesti ljidi i životinja-pseudomonijaze.

Sve vrste ovoga roda podeljene su u tri grupe: fluorescentna grupa, grupa pseudomale i grupa ostalih psudomona (Petrović et al., 2007)

Pseudomonas aeruginosa je gramnegativni, aerobni štapić sa unipolarnom pokretljivošću. Široko je rasprostranjena. Luči endotoksine, egzotoksine, enzime i druge biološki aktivne materije koje povećavaju njenu toksičnost. Uz pomoć pila (fimbrija) pričvršćuje se za ćelije domaćina. Njihovi lipopolisaharidi su odgovorni za endotoksične sposobnosti organizma. Većina P. aeruginosa izolovanih iz kliničkog materijala produkuje ekstracelularne enzyme-elastaze i proteaze i dva hemolizina-termolabilnu fosfolipazu C i termostabilni glikolipid (Jawetz et al., 2007).

Patogeneza: P. aeruginosa je oportunistički patogen kod imuno deficijentnih osoba (naročito nakon operacija i povreda). Izaziva meningitis, infekcije pluća, urinarnog i gastrointestinalnog trakta, kože (dermatitis), oka i infekcije rana.

2.3.4.8. Rod Escherichia

Rod je dobio ime u čast Teodora Ešerihia, pedijatra i bakteriologa koji ih je prvi otkrio i opisao 1919. godine. Vrste ovog roda su pravi stapići, aerobi i fakultativni anaerobi, nepokretne ili pokretne pomoću peritriha. Rastu na temperaturi od 37° C.

32

Escherichia coli

Morfološke osobine: gramnegativne bakterije, štapićastog oblika, u paru ili nepravilnim grupama, asporogene. Veličina ćelije je 2 – 6 µ x 0.4 – 0.7 µ. Većina je pokretna peritrihalnim flagelama, a mnogi imaju fimbrije. Neki sojevi poseduju kapsulu. Ova bakterija je fakultativno anaerobna i aerobna.

Biohemijske osobine: raspolaže velikom respiratornom (oksidativnom) i fermentativnom aktivnošću. Razlaže šećere, a neki sojevi fermentišu laktozu. Produkuju kiselinu i gas.

Otpornost: prilično je otporna bakterija. Mesecima može živeti u vodi i zemlji, a na različitim namirnicama se vrlo brzo razmnožava. Otporna je na temperature ispod nule, a toplota od 60° C ih ubija za 15 – 20 minuta. Osetljiva je na hlor i hlorna jedinjenja.

Toksičnost: produkuje više toksićnih materija, endotoksin, enterotoksin koji je termolabilan i hemolizine (alfa-hemolizin koji je termolabilan i rastvorljiv i beta-hemolizin koji je vezan za ćeliju).

Antigenska struktura: bakterijske vrste E. coli imaju tri antigena – O – antigen (termostabilan), flagelatni H – antigen (termolabilan) i kapsularni K – antigen. O – antigen je povezan sa ćelijskim zidom kao polisaharidna komponenta lipopolisaharida i prisutna je kod većine rodova familije Enterobacteriaceae. Na osnovu njega se razlikuju serotipovi mnogih enteričnih gramnegativnih bakterija. H – antigen je asociran sa flagelama, te ga poseduju samo pokretne bakterije ove familije kao što je E. coli. K – antigen je asociran sa kapsulama ili ređe sa fimbrijama. U okviru E. coli vrsta se na osnovu O, H, K – antigena razlikuje se veliki broj serotipova koji su povezani sa različitim oboljenjima. Na primer, serotip koji ima O157 i H7 antigen izaziva nekoliko oblika hemoragičnog kolitisa (Strohl et al., 2001).

Patogenost za ljude: E. coli naseljava creva čoveka i životinja. Predstavlja deo crevne flore i neophodna je za procese varenja i sinteze nekih supstanci (vitamini B12 i K). Glavni je uzročnika infekcija crevnog trakta, septikemije i meningitisa. Razlike u stepenu virulencije različitih sojeva E. coli potiču od individualnih plazmida i integrisanih profaga koji su asocirani sa svakim sojem.

I. Intestinalna oboljenja

Na osnovu mehanizma patogenih procesa razlikuju se pet tipova intestinalnih infekcija.

a) Enterotoksične E. coli (ETEC) – enterotoksični sojevi E. coli koloniziraju gornje delove tankog creva, bez penetracije crevne sluzokože i nisu invazivni. Izlučuju enterotoksine koji prouzrokuju gubitak tečnosti i elektrolita iz intestinalnih ćelija.

b) Enteroinvazivne E. coli (EIEC) – dizentriformni sindrom. Ne produkuju enterotoksine već penetriraju u epitelne ćelije sluzokože kolona i u njima se razmnožavaju. Infekcija se odlikuje tipičnim dizenteričnim krvavo – sluzavim stolicama.

c) Enteropatogene E. coli (EPEC) – ovi sojevi izazivaju akutni gastroenteritis kod odojčadi i male dece. Sojevi nisu invazivni, mada prouzrokuju patološko histološke promene crevnog epitela. Mehanizam patogenog dejstva nije dovoljno poznat.

33

d) Enterohemoragične E. coli (EHEC) – ovi sojevi su odgovorni za sindrom opisan kao hemoragični kolitis nastao usled alimentarne intoksikacije. Sojevi nisu invazivni, ali produkuju velike količine citotoksina (verotoksin) sličan šiga – toksinu, koji oštećuju intestinalne ćelije i dovodi do njihove nekroze.

e) Enteroadherentne E. coli (EAEC) – izazivaju akutnu i hroničnu dijareju. One produkuju toksin sličan ST – toksinu, kao i hemolizin.

II. Ekstraintestinalna oboljenja

Izvor infekcija je najčešće sopstvena E. coli koja nije patogena u intestinalnom sistemu, ali ako dospe u krvotok može izazvati oboljenja.

a) Infekcije urinarnog trakta – E. coli su normalno prisutne u crevima, zbog anatomske blizine one mogu dospeti u bešiku i tu izazvati infekciju. Nefropatogeni sojevi produkuju hemolizin. Kod žena izaziva cistitis i pijelonefritis. Za cistitis su odgovorni uropatogeni sojevi koji imaju P – fimbrije i hemolizin (kolicin V). Pijelonefritis, koga izazivaju sojevi sa specifičnim P – pilima predstavljaju opstrukciju urinarnog sistema i može biti izazvan i uropatogenim sojevima (Staphylococcus, Klebsiella, Proteus).

b) Sepsa – kada obrambeni mehanizam domaćina ne funkcioniše dobro E. coli se može širiti putem krvi i izazvati sepsu. Sepsa se može javiti i kao sekundarna pojava nakon infekcije urinarnog trakta.

c) Neonatalni meningitis – E. coli i streptokoke grupe B zahvaljujući kapsularnom K1 – antigenu mogu izazvati meningitis. Ovaj antigen reaguje sa B grupom kapsularnih polisaharida, kod N. meningitidis. Mehanizam virulencije nije dovoljno poznat.

2.3.4.9. Rod Klebsiella

Rod je dobio ime prema Edvinu Klebsu koji ih je prvi opisao kao grupu bakterija.

To su ravni, inkapsularni, nepokretni, gramnegativni štapići koji pripadaju grupi fakultativnih anaeroba. Ima ih u ljudskom izmetu, vodi, voću, povrću i zemljištu.

Izazivaju infekcije respiratonog, urogenitalnog trakta, a kod dece mogu izazvati infekciju digestivnog trakta. Glavni predstavnik je Klebsiella pneumoniae.

Klebsiella pneumoniae

Morfološke osobine: bakterije imaju kokobacilarni oblik i obavijene su polisaharidnom kapsulom. Često se javlja u parovima, nepokretna je i ne obrazuje spore. Pripada grupi gramnegativnih bakterija, mada može biti i grampozitivna i gramvijabilna.

Biohemijske osobine: sve loze fermentišu laktozu, glukozu, saharozu i neke druge ugljene hidrate, produkujući kiselinu igas.

Otpornost: ova bakterija je prilično otporna prema raznim spoljašnjim faktorima. Temperatura od 56° C je ubija brzo, ali je otporna na isušivanje.

Antigena struktura: sadrži somatski O – antigen.

34

Patogenost za ljude: izaziva oboljena respiratornog i urogenitalnog trakta. Ove infekcije se javljaju kod imunodeficijentnih osoba. Takođe, izaziva infekcije i baktermije urinarnog trakta, naročito kod hospitalizovanih osoba. Kod dece često dovodi do enteritisa ili enterokolitisa.

2.3.4.10. Rod Enterobacter

Ovaj rod obuhvata prave gramnegativne štapiće koji su pokretni peritrihama, asporogene bakterije. Mogu biti aerobne i fakultativno anaerobne. U okviru roda opisane su vrste E. georgoviae, E. sakazaki, E. amnigenus, E. cancerogenus, E. cowanii, E. kobei, E. nimipressulalis, E. pyrinus.

Vrste iz roda Enterobacter izazivaju oportunističke infekcije u slučaju prolazne i trajne imunodeficijencije domaćina kolonizacija tkiva i porasta virulencije. Najčešće izazivaju infekcije urinarnog trakta, mada nisu retke ni primarne ili sekundarne infekcije respiratornog sistema. Bakterije ovog roda se najčešće izoluju iz fecesa, urina, brisa rane, materijal se zasejava na Endo agaru, krvnom agaru. Kao antibiotska terapija koriste se cefalosporini i aminoglikozidi, ali se u novije vreme zbog razvoja rezistencije upotrebljavaju imipenem i cefepim.

2.4. Mehanizam antimikrobnog delovanja

Antibakterijska aktivnost rakije je konstatovana, ali nije detaljno objašnjen njen mehanzam delovanja. Može se predpostaviti da se njen aktivnost ne bazira na jednom specifičnom mehanizmu vć da postoje nekoliko ciljnih mesta delovanja. Ta mesta su prikazana na slici 2.7.

Slika 2.7. Mesta na bakterijskoj ćeliji i mehanizmi antibakterijskog delovanja rakije: degradacija ćelijskog zida; oštećenje citoplazmatske membrane; oštećenje membranskih proteina; curenje ćelijskog sadržaja; koagulacija citoplazme i promena protka protona (Burt, 2004)

35

2.5. Antioksidativna aktivnost

Istraživanje antioksidativne aktivnosti u različitim uzorcima veoma je značajno radi brzog i efikasnog utvrđivanja delotvornosti određenog antioksidansa u borbi protiv mnogih oboljenja izazvanih slobodnim radikalima.

U literaturi se pojam „antioksidans“ definiše na više načina. Reč antioksidans, kao što i sam naziv pokazuje, znači „ono što se suprostavlja oksidaciji“. Antioksidans se suprostavlja oksidaciji ili inhibira reakcije izazvane kiseonikom ili peroksidima. Mnoge od ovih supstanci se koriste za konzervisanje prirodnih proizvoda: masti, ulja, hrane, itd. Sa biološkog aspekta antioksidans je prirodna ili sintetska supstanca, koja se dodaje proizvodima i sprečava ili odlaže njihovo propadanje uzrokovano kiseonikom iz vazduha. U biohemiji i medicini antioksidansi su enzimi ili organske supstance, kao što je vitamin E ili beta-karoten, koje su sposobne da reaguju u slučajevima štetnog uticaja oksidacije u ljudskom i životinjskom tkivu.

U ljudskom organizmu se u svakom momentu odigravaju oksidacioni procesi koji su osnova za normalno funkcionisanje organizma. Za vreme odvijanja oksidacionih procesa nastaju veoma reaktivne čestice- slobodni radikali. Za neutralisanje nagomilanih slobodnih radikala potrebna je određena količina antioksidanasa. Efikasnost datog antioksidansa se ogleda u njegovoj sposobnosti da “hvata” slobodne radikale i da prekine lančane reakcije koje se dešavaju između kiseonika i supstrata, a uzrokuju autoksidaciju ciljnih molekula u organizmu, kao što su proteini, nukleinske kiseline, lipidi, itd. i dovode do promene njihove strukture i funkcije, a samim tim i do pojave oboljenja (Huang et al., 2005).

2.5.1. Slobodni radikali

Slobodni radikali su neutralne intermedijerne čestice visoke reaktivnosti, koje nastaju

homolitičkim raskidanjem kovalentnih veza (termički i fotolitički) i tako sadrže barem jedan nespareni elektron. Mogu da reaguju međusobno (radikal-radikal interakcija) ili sa drugim molekulima (radikal-molekul interakcija).

Velika reaktivnost slobodnih radikala ogleda se u njihovoj težnji ka sparivanju svojih elektrona zbog čega lako stupaju u reakcije i prisvajaju elektrone sa bilo kog mesta. Posledica takvog vezivanja je deficit elektrona u napadnutom molekulu, tj. stvaranje novog radikala. Slobodno radikalske reakcije se ne zaustavljaju na jednom koraku već su lančanog karaktera, pokreću niz složenih i nekontrolisanih reakcija koje najčešće dovode do oštećenja ćelijskih zidova, DNK ili drugih delova ćelije.

Iako se smatra osnovnim molekulom i simbolom života na planeti, kiseonik je ujedno i najtoksičniji prirodni polutant (Emsley, 2001). Kiseonik koriste svi aerobni organizmi u procesu respiracije za dobijanje energije, pri čemu se on redukuje do vode, a složeni organski molekuli (lipidi, ugljeni hidrati, proteini) podležu oksidativnoj degradaciji. Od ukupne količine kiseonika u ćeliji, jedan mali deo (2–3%) se transformiše u toksične oblike koji se nazivaju reaktivnim oblicima kiseonika (ROS).

Reaktivni oblici kiseonika (ROS) predstavljaju metabolite nastale iz molekulskog kiseonika (Mimić et al., 1999), koji sadrže atome kiseonika i poseduju veću reaktivnost od kiseonika u osnovnom molekulskom stanju (Hu, 2001).

Kiseonik može biti toksičan i u sledećim oblicima:

36

- redukovani kiseonični radikali koji nastaju u ćeliji u toku mnogobrojnih metaboličkih procesa, - aktivirani oblici kiseonika, nastaju u fotohemijskim ili termičkim reakcijama - molekulski kiseonik (Cadenas et al., 2000)

Nekoliko snažnih oksidanasa se formira u toku odvijanja metaboličkih procesa, u krvnim i drugim ćelijama oranizma: superoksidni anjon radikal (O2

•-), vodonik peroksid (H2O2), peroksil radikal (ROO•) i hidroksil radikal (OH•).

Slika 2.8. Nastajanlje slobodnih radikala

2.5.2. Antioksidansi

Antioksidansi su prirodne ili veštačke supstance koje imaju sposobnost da se suprotstave oksidaciji ili da inhibiraju reakcije koje iniciraju reaktivne vrste (slika 2.9).

Tokom višegodišnjeg istraživanja otkriveno je da različiti oblici reaktivnih kiseoničnih (ROS) i azotnih vrsta (RNS) učestvuju u oksidativnoj degradacijiprehrambenih proizvoda i u patogenezi nekih humanih oboljenja: ateroskleroza, dijabetes melitus, hronične upale, neurodegerativni poremećaji i određene vrste raka.

Zaštitni efekti antioksidanata u odnosu na oksidacijom izazvane reakcije, danas se ispituju sa velikom pažnjom, naročito u medicini, biologiji, hemiji, prehrambenoj tehnologiji, itd. Istraživanje obuhvata postojanje jednostavne, pogodne i pouzdane analitičke metode (in vitro) za brzo određivanje antioksidativnog kapaciteta čistog jedinjenja ili kompleksa u hrani ili u biološkim uzorcima. Neke od najčešće korišćenih metoda za in vitro određivanje antioksidativnog kapaciteta biće opisane u tekstu.

37

Vitamin C Vitamin E (α- tokoferol)

β- karoten Koenzim Q10 (ubihinon)

Polifenoli Rutin Kvercetin

Slika 2.9. Najpoznatiji prirodni antioksidansi (vitamin C, vitamin E, β-karoten, ubihinon, polifenoli, rutin, kvercetin)

U zavisnosti od oblasti primene, mete koje antioksidansi štite su različite. Na primer u hemijskoj industriji to su najčešće proizvodi od plastike i gume. Efikasan antioksidans je onaj koji interaguje sa reaktivnim vrstama i prekida autooksidaciju. Sterno zaklonjeni fenoli i amini pokazuju takve osobine i često se koriste kao antioksidansi u proizvodnji plastike i gume. Naročito su značajni antioksidansi u prehrambenoj industriji, jer sprečavajući neželjene reakcije i omogućavaju normalno odvijanje mnogih procesa u organizmu.

Antioksidans je supstanca koja može efikasno da smanji štetno dejstvo pro-oksidansa, a da istovremeno dovede do formiranja proizvoda bez ili sa niskim nivoom štetnosti. Oni uspevaju da zaštite biloške mete od lošeg uticaja.

Zaštita bioloških meta se zasniva na sledećim mehanizmima (Magalhaes et al., 2007):

- inhibicija stvaranja i hvatanje ROS i RON - redukcioni kapacitet - metal-helatni kapacitet - aktivnost antioksidativnih enzima (superoksid dismutaze, katalaze, glutation peroksidaze)

38

- inhibicija oksidativnih enzima (NOS sintaze, ksantin oksidaze, ciklooksigenaze)

Biološki antioksidansi podrazumevaju enzimske antioksidanse i neenzimske antioksidanse (Huang et al., 2005).

Prema načinu delovanja u ljudskom organizmu antioksidansi su podeljeni na:

1. preventivne antioksidanse– antioksidansi koji sprečavaju nastanak slobodnih radikala i iniciranje lančane reakcije peroksidacije dekompozicijom vodonik peroksida i lipidnih hidroperoksida, kompleksiranjem jona metala i eliminacijom ROS.

2. "skevindžer" antioksidanse– antioksidansi koji poseduju sposobnost da "hvataju" slobodne radikale i tako inhibiraju inicijaciju i prekidaju propagaciju reakcije lipidne oksidacije, pa se nazivaju i "prekidači" lančanih radikalskih reakcija. Prema rastvorljivosti ovi antioksidansi dele se na:

- hidrosolubilne- rastvorljive u vodi (vitamin C, mokraćna kiselina, bilirubin, albumin, glutation, neki polifenoli)

- liposolubilne- ne rastvorljive u vodi a rastvorljivi u lipidima (vitamini E i A, karotenoidi, neki polfenoli) (Vaya, 2001).

3. "reparacione" antioksidanse– ovi antioksidansi deluju posebnim mehanizmima, obnavljajući ili uklanjajući oštećene vitalne biomolekule koji nastaju u uslovima oksidativnog stresa.

Antioksidansi značajni za ljudski organizam dele se na endogene i egzogene. Endogeni antioksidansi predstavljaju antioksidanse koji nastaju u ljudskom organizmu i izgrađuju sistem antioksidansne zaštite organizma. Tu spadaju: enzimski sistemi (superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza), mokraćna kiselina, bilirubin, tioli (glutation, lipolna kiselina, N-acetil cistein), koenzim Q10 (ubihinon), proteini koji kompleksiraju jone metala.

Antioksidansi koji se u organizam unose putem hrane ili lekova predstavljaju egzogene antioksidanse (vitamin C, vitamin E, karotenoidi (β-karoten), oksikarotenoidi (likopen), polifenolna jedinjenja (flavonoidi, fenolne kiseline, proantocijanidoli), itd (Percival, 1998).

2.5.3. Mehanizam delovanja antioksidanasa

2.5.3.1. Primarna antioksidativna zaštita

Enzimski sitemi koji učestvuju u primarnoj antioksidativnoj zaštiti su superoksid dismutaza, glutation peroksidaza i katalaza. Superoksid dismutaza (SOD) katalizuje dismutacije među superoksid anjon radikalima uz produkciju H2O2 i kiseonika. Neutralizaciju nastalog H2O2 vrše glutation peroksidaza ili katalaza.

Pored ovih enzima, postoji i niz drugih sa sličnom funkcijom kao što su selennezavisna GSHPx, glutation reduktaza, redukovani glutation (GSH) i glukozo-6-fosfat dehidrogenaza.

U sistem primarne antioksidantne zaštite ubrajaju se i neenzimske supstance kao što su proteini transferin i ceruloplazmin koji imaju bitnu ulogu u transportu metalnih jona, zatim albumin, mokracna kiselina i bilirubin (Primiano, 1997).

39

2.5.3.2. Sekundarna antioksidativna zaštita Sistem sekundarne antioksidativne zaštite čine brojna niskomolekularna jedinjenja

razlicitog porekla i karaktera, kao što su ubihinon, L-askorbinska kiselina, tokoferoli, karotenoidi, fenoli i njihove kiseline, flavonoidi, derivati hidroksicinamata i dr.(Mimica-Dukic, 1997; Arora., 1998; Powers, 1999; Draper, 2000). Kako je struktura ovih jedinjenja veoma raznovrsna, tako su različiti i mehanizmi kojima ona ostvaruju svoju aktivnost u sistemu antioksidantne zaštite. Najčešće su to hvatači (“skevindžeri” ) slobodnih radikala, donori protona, inhibitori enzimskih sistema, helatori jona prelaznih metala, itd. (Hoult, 1996; Packer, 1999; Lebeau, 2000). U sistem sekundarne antioksidantne zaštite mogu se ubrojiti i enzimi koji aktivno učestvuju u otklanjanju oksidativnih oštećenja nukleinskih kiselina, lipida i proteina, kao što su: endo- i egzonukleaze, DNK polimeraze i ligaze, fosfolipaza A2, GSHPx i fosfolipid-zavisna GSHPx, glikozilaze, kao i brojni proteolitički enzimi. Ovi enzimi “popravljaju” oštećene molekule DNK, uklanjaju oksidovane masne kiseline membranskih lipida i kroz procese resinteze obnavljaju oksidovane aminokiseline i proteine (Božin, 2009).

3. MATERIJAL I METODE

41

3. MATERIJAL I METODE

3.1 Prikuplanje plodova i dobijanje rakije

Plodovi divlje jagode (Fragaria vesca) brani su tokom juna meseca 2011. godine kada su potpuno zreli.

Plodovi zove (Sambucus nigra) brani su tokom avgusta meseca 2011. godine kada su potpuno zreli.

Plodovi divlje jabuke (Malus sylvestris) brani su tokom oktobra meseca 2011. godine kada su potpuno zreli.

Determinacija sve tri vrste izvršena ja klasičnim metodama. Nakon toga po 100 g plodova od svake vrste je posebno izgnječeno u avanu i isceđeni su sokovi koji su profiltrirani kroz gazu i čuvani u frižider do daljih analiz. Od novih 100 g voća, napravljen je metanolni ekstrat za svaku vrstu. Za pripremu rakije po 4 kg jagoda, zove i divlje jabuke ostavljeno je da fermentiše, a zatim je od te fermentisane smeše ispečena rakija.

3.2. Metode određivana antimikrobne aktivnosti

Svi testovi antimikrobne aktivnosti mogu biti podeljeni na: disk-difuzioni, dilucioni i bioautografski metod (Rios et al., 1988). Za ispitivanje antmikrobne aktivnosti koriste se disk difuzioni metod, diluciona, metoda bunarčića, mikrodiluciona metoda.

Rezultati dobijeni ovim metodama nazivaju se antibiogram. Oni se ne mogu u potpunosti ekstrapolirati na žive organizme u kojima su prisutni drugačiji uslovi nego u hranljivom medijumu. Ipak, ova ispitivanja su neophodna i koriste se kao preliminarna, jer samo one supstance koje pokazuju izrazito delovanje in vitro, ima smisla ispitivati u in vitro uslovima.

Disk – difuzioni metod

Ova metoda se bazira na primeni celuloznih diskova, na kojima se nanosi uzorak i koji se zatim stavljaju na inokulisani agar u petri kutiji. Uzorak difunduje sa mesta nanošenja u podlogu u svim pravcima. Do sprečavanja rasta testiranog mikroorganizma dolazi ukoliko je on osetljiv na dejstvo ispitivanog uzorka. Širina zone inhibicije (inhibicioni prečnik), srazmerna je stepenu osetljivosti mikroorganizma na primenjeni agens, odnosno antimikrobnom učinku ispitivanog uzorka. Nakon inkubacije na 37°C u termostatu u trajanju od 24-48 časova, rezultati se vrednuju merenjem prečnika zone inhibicije rasta mikroorganizma u mm ili cm. Ako nema zone inhibicije, znači da je mikroorganizam otporan na dejstvo ispitivane supstance. Eksperiment je neophodno izvoditi u replikatu, ponavljajući analizu dva do sedam puta. Takođe, potrebno je koristiti dve vrste kontrole: pozitivnu i negativnu. Negativna kontrola podrazumeva da se na disk umesto uzorka u određenom razblaženju nanosi ili voda ili rastvarač, kojim je uzorak razblaživan. Pozitivna kontrola podrazumeva primenu standardnih antibiotika.

Ova metoda se koristi za preliminarni skrining antibakterijske aktivnosti.

42

Metoda bunarčića

Kod ove metode uzorak se nanosi u otvorima koji su uz pomoć aplikatora izdubljeni u agaru. Ova metoda, kao i disk-difuziona, može biti korišena kao preliminarna skrining metoda. Da bi bakterijski rast bio uočljiviji u hranljivom medijumu se može dodati trifenil-tetrazolijum-hlorid.

Dilucioni metod

Dilucioni metod se sastoji u dodavanju sve manje količine neke supstance odgovarajućoj tečnoj podlozi. Svakoj epruveti se zatim dodaje određena količina tečne kulture ispitivanog mikroorganizma i sve zajedno se inkubira u termostatu. Nakon 18-20 časova, očitava se rezultat. Podloge u kojima je došlo do inhibicije rasta (bakteriostatsko delovanje), ili smrti ispitivanog mikroorganizma (baktericidno delovanje), ostaće bistre. Epruveta sa najmanjom količinom supstance u kojoj nema zamućenja, odnosno porasta ispitivanog mikroorganizma pokazuje koncentraciju supstance koja deluje na mikroorganizam i naziva se minimalna inhibitorna koncentracija (MIC). Da bi se odredila minimalna mikrobicidna koncentracija potrebno je da se sadržaj poslednje 4 epruvete, u kojima nema zamućenja, zaseje na čvrstu hranljivu podlogu u petri kutiji. Na ploči, na kojoj ima manje od 99,9 % porasta kolonija ispitivanog mikroorganizma posle 24 časa inkubacije, koncentraija supstance je mikrobicidna i naziva se minimalna baktericidna/fungicidna koncentracija (MBC/MFC).

Mikrodiluciona metoda

Ova metoda je modifikacija dilucione metode. Razlika je u tome što se umesto epruveta koriste mikrotitarske ploče sa 96 konusnih udubljenja. Udubljenja ploče se pune inokulisanim tečnim hranljivim medijumom u kome se zatim dodaje serija raređenja uzoraka. Nakon inkubacije mikrobiološki rast se određuje ili golim okom ili uz pomoć univerzalnog čitača mikrotitarskih ploča na absorbanci on 620nm.

Nova modifikacija mikrodilucione metode je da se za određivanje MIC-a koristi se redoks indikator resazurin koji poboljšava vizuelizaciju.

U dilucionoj metodi (za tečnu podlogu) postoje mnoge metode za determinaciju završne tačke (end point). Najčešće korišćene metode su: merenje optičke aktivnosti (OD) tj. turbiditeta ili određivanje broja kolonija. Očitane OD vrednosti za suspenziju i kontrolu mogu biti upotrbljene za izračunavanje inhibitornig indeksa preko koga se procenjuje dužina perioda koja mora proći pre nego što rast može biti detektovan tj. vreme detekcije (DT) nakon tretiranja ćelija uzorkom.

3.3. Izolovanje aroma-mirisnih sastojaka rakija

Osamdeset mililitara rakije pomešano je, u erlenmajeru od 300 mL, sa 80 mL destilovane vode i 40 mL CH2Cl2. Dodato je 8 g NaCl, a zatim je smeša 30 minuta mešana na magnetnoj mešalici. Slojevi su razdvojeni u levku za razdvajanje i organski sloj je sušen iznad anhidridovanog MgSO4. Ekstrakt je na vakuum uparivaču ukoncentrovan do 1 mL i direktno

43

analiziran gasnom hromatografijom i kombinacijom gasne hromatografije i masene spektrometrije (GC-MS).

3.4. Gasna hromatografija (GC) i gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS)

Sve GC-MS analize (3 injektovanja) su vršene na aparatu Hewlett-Packard 6890N, na kapilarnoj koloni 30 m x 0,25 mm, sa stacionarnom fazom DB-1 (100% dimetilpolisiloksan, Agilent Technologies, USA), debljine filma 0,25 μm. Gasni hromatograf je bio direktno kuplovan sa masenim detektorom MSD 5975B iste kompanije. Temperatura injektora i detektora su održavane na 250 i 300 °C, dok je temperatura peći programirana linearno od 50 do 300 °C brzinom od 5 °C/min, a u toku poslednjih 10 min temperatura je održavana na 300 °C. Helijum je korišćen kao noseći gas, a brzina protoka je bila 1 mL/min. Uzorci, pripremljeni kako je prethodno opisano, su injektovani u split modu (split ratio je bio 40:1). Jonizacija je vršena u EI modu, elektronima energije 70 eV, a maseni spektri su beleženi za m/z u opsegu od 35 do 500 (vreme skeniranja 0,32 s). GC (FID) analiza je rađena pod istim eksperimentalnim uslovima koristeći kolonu iste polarnosti koja je bila opisana za GC-MS. Procentualni sastav je dobijen integraljenjem hromatograma bez korišćenja korekcionih faktora.

3.5. Identifikacija aroma-mirisnih sastojaka rakija

Sastojci rakija su identifikovane na osnovu poređenja njihovih masenih skenova, nakon dekonvolucije programom AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2002), sa masenim spektrom standarda i/ili masenim spektrima iz Wiley 6, NIST02, MassFinder 2.3 biblioteka i iz MS biblioteke napravljene na osnovu čistih supstanci. Identifikacija je takođe ostvarena poređenjem njihovih linearnih retencionih indeksa, računatih po Van Den Doolu i Kratzu, a na osnovu retencionih vremena homologe serije n-alkana C6-C36 na DB-1 koloni, sa literaturnim vrednostima. Kada je god to bilo moguće, identifikacija je potvrđivana koinjektiranjem sa standardom.

3.6. Antimikrobna aktivnost

3.6.1. Kulture mikroorganizama

Za ispitivanje in vitro antimikrobnr aktivnosti dobijenih rakija korišćrni su izolati iz patološkog materijala (tabela 3.1.).

Tabela 3.1. Prikaz testiranih mikroorganizama Patogeni mikroorganizmi

Izolati iz urina Izolati iz fecesa Izolati iz rana Klebsiella pneumoniae Morganella sp. Proteus mirabilis Enterobacter faecalis

Salmonella enteritidis Shigella sonnei Listeria moncytogenes Enetobacter faecalis Escherichia coli Candida albicans

Acinetobacter sp. Enterobacter sp. Pseudomonas aeruginosa Klebsiella oxytoca Staphylococcus aureus Proteus mirabilis Escherichia coli

44

3.6. Testiranje antimikrobne aktivnosti rakija

Mikro-diluciona metoda

Za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne koncentracije (MBC) rakije korisćena je mikrodiluciona metoda. Od prekonoćnih kultura ispitivanih test-sojeva mikroorganizama uzgajanih na hranljivom agaru je, u sterilnom fiziološkom rastvoru, napravljena suspenzija turbiditeta (zamucenosti) 0,5 McFarlanda koja sardži 1,5x108 CFU /ml bakterija (NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003). Zatim je napravljena serija duplih razređenja uzoraka (pripremljeno u mikrotitar ploči sa 96 udubljenja, slika 6.) u rasponu od 500 - 0,02 µl/ml. Ukupna zapremina u bunariću je iznosila 100 µl, a gustina suspenzije 2x106 CFU/ml. Mikrotitarske ploče su inkubirane na 37 0C u trajanju od 24 h. Postupak je izveden u dva ponavljanja.

Slika 3.1. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom razblaženja uzoraka

Mikrobiološki rast je očitavan uz pomoć 20 μL 0,5 % vodenog rastvora trifenil tetrazolijum hlorida (TTC) (Sartoratto et al., 2004). Koncentracija u kojoj nema vidljivog rasta (nema crveno obojenih kolonija bakterija) predstavlja minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIC). Da bi se odredila minimalna baktericidna koncetracija (MBC) iz svih bunarića u kojima nije bilo rasta, tj. iz onih koji se nalaze do bunarića sa minimalnom inhibitornom koncentracijom, sadržaj je prenesen na nove petri-ploče sa odgovarajućim čvrstim MH podlogama (Miler-Hinton agar). Nakon toga ploče su inkubirane na 24 časa na 37 °C. Nakon inkubacije vršeno je brojanje poraslih kolonija.

MBC/MFC se definiše kao najniza koncentracija aktivne supstance koja ubija 99,5% bakterija (NCCLS standard – National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003).

3.7. Metode određivanja antioksidativne aktivnosti

In vitro analitičke metode za određivanje antioksidantnog kapaciteta oslanjaju se na dva različita pristupa: konkurentna i nekonkurentna reakcija.

U konkurentnoj reakciji ciljna vrsta- meta (biomolekuli koji mogu biti napadnuti in vivo) i antioksidansi se takmiče za reaktivno jedinjenje (radikal ili neradikal). Procena antioksidativne sposobnosti (kapacitata) se zasniva kvantifikaciji, tj. određivanju količine

45

jedinjenja koje olakšava analitičko merenje i definiše se kao proba. Kod konkurentnih testova proba je ciljna vrsta ili oksidovani oblik. Proba može biti i neka vrsta koja se dodaje nakon navedenih reakcija koje prate kvantifikaciju preostalih reaktivnih vrsta ili ciljnih molekula.

U ovim testovima, antioksidativni kapacitet testiranih jedinjenja zavisi od:

• brzine reakcije između njih i reaktivnih vrsta, • brzine reakcije ciljnih molekula i reaktivnih vrsta i • koncentracionog odnosa između antioksiadanasa i ciljnog molekula. Neophodno je ispuniti uslove za izvođenje ovih testova: - test proba mora biti reaktivna sa antioksidansom pri niskim koncentracijama - maksimalna osetljivost u spektroskopskom ispitivanju između polaznog i oksidovanog oblika - ne smeju postojati sporedne reakcije - antioksidans ne bi trebalo da reaguje sa ciljnim molekulom.

U nekonkurentnim testovima, navedena je reakcija između antioksidansa i reaktivne vrste u odsustvu ciljnih molekula, što, u početnoj smeši, uključuje dve kompenente, koje takođe mogu biti probe za praćenje reakcije. Preostale reaktivne vrste se mogu meriti dodatkom pogodnog reagensa (Magalhaes et al., 2007).

Metode koje se koriste za određivanje antioksidativnog kapaciteta mogu se podeliti u tri velike grupe (Tabela 3.1.):

- metode koje uključuju H- transfer reakcije - ET- metode (elektron transfer) - ostale metode

Tabela 3.2. Glavne metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta Metode in vitro određivanja antioksidatinog kapaciteta Metode koje uključuju H- transfer reakcije ROO• + AH → ROOH + A• ROO• +LH → ROOH + L•

ORAC (oxygen radical absorbance capacity)

TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) Crocin test izbeljivanja IOU (inhibited oxygen uptake) Inhibicija oksidacije linoleinske kiseline

Inhibicija oksidacije LDL

ET- metode M(n) + e- (iz AH) → AH• + M(n-1)

TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) FRAP (ferric ion reducing antioxidant parameter) Cu(II) redukcioni kapacitet

Određivanje ukupnih fenola FC reagensom

Ostale metode

TOSC (total oxidant scavenging capacity) 2. Hemiluminiscencija (CL)

46

Mnogi autori predlažu opšti protokol za testiranje (Huang et al., 2005):

1. odabir biološki relevantnih substrata 2. ispitivanje različitih oksidacionih uslova 3. merenje glavnih i sporednih produkata oksidacije 4. upoređivanje antioksidativne aktivnosti istih molarnih koncentracija kvantifikacija na osnovu indukcionog perioda, inhibicije (%) i drugih parametara

3.7.1. Elektron – transfer metode

ET- metode su veoma korišćene metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta in vitro. Ove metode podrazumevaju prisustvo dve komponente u reakcionoj smeši: oksidans (proba) i antioksidans, kao i odvijanje elektron- transfer reakcije:

Oksidans (proba) + e- (iz antioksidansa) → Redukovana oksidans + Oksidovani antioksidans

Proba, odnosno oksidans, uzima elektron iz antioksidansa i dovodi do promene boje rastvora. Promena intenziteta obojenosti rastvora je proporcionalna koncentraciji antioksidansa. Reakcija između antioksidansa i oksidansa je završena onda kada boja rastvora prestane da se menja. U svim metodama spektrofotometrijski se meri apsorbancija ispitivanog rastvora i prati njena zavisnost od molarne koncentracije. Zavisnost između promene asorbancije (ΔA) i koncentracije antioksidansa je linearna. Nagib krive daje kapacitet antioksidansa koji se predstavlja kao Trolox ekvivalent (TE) ili kao ekvivalent galne kiseline (GAE). Metode koje koriste elektron- transfer reakciju su:

- FCR- metoda (Folin-Ciocalteu Reducing Capacity Assay) - TEAC- metoda (Total Equivalent Capacity Assay) - FRAP- metoda (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power Assay) - DPPH- metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay) - Cu (II) redukcioni kapacitet

FCR- metoda (Folin-Ciocalteu Reducing Capacity Assay)

Ova metoda se često naziva metoda za određivanje ukupnih fenola. Ovom metodom se meri redukcioni kapacitet uzorka. U tu svrhu koristi se FC (Folinov) reagens žute boje čija hemijska struktura nije definisana. Poznato je da reagens menja boju iz žute u zelenu ukoliko dođe do kontaminacije. Dodatak nekog oksidansa, kao što je brom, reagensu vraća žutu boju.

Veruje se da se ET- reakcija, na kojoj se zasniva ova metoda, dešava između reduktora i Mo (VI) koga FC- reagens sadrži. U rekciji se Mo (VI) redukuje do Mo (V):

Mo (VI) + e- → Mo (V)

FC- reagens je nespecifičan za fenolna jedinjenja jer može biti redukovan od strane

mnogih nefenolnih jedinjenja kao što su aromatični amini, sumpor- dioksid, vitamin C, Cu(I), Fe(II), zbog čega nije pogodan za određivanje fenola. U tom slučaju treba ukloniti ometajuće supstance i podestiti pH rastvora (pH≈10). U baznoj sredini dolazi do prenosa elektrona sa

47

fenolne komponente na Mo. Najpre dolazi do deprotonovanja fenolnog jedinjenja uz nastajanje fenolatnog jona koji koji može da redukuje FC- reagens. Kao posledica redukcije nastaje plavi kompleks koji se detektuje spektrofotometrijski na λ= 750-765 nm. Kompleks nastaje kao posledica koordinativnog vezivanja fenolnih komponenata za metal.

Bez obzira na nedefinisanu strukturu FC-reagensa ova metoda je prihvaćena, jednostavna je i reproduktivna. Reagens je komercijalno dostupan, a apsorpcija od strane komponenata matriksa uzoraka je minimalna. Postoji odlična linearna korelacija između FC testa i drugih ET testova (TEAC, DPPH). FCR- metoda se danas koristi kao rutinska metoda u ispitivanju fenolnih antioksidanasa (Huang et al., 2005).

FRAP- metoda (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power Assay)

Metoda se zasniva se na sposobnosti antioksidanasa da redukuju gvožđe-2,4,6-

tripiridil-S-triazin kompleks [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ do intenzivno plavo obojenog kompleksa [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ u kiseloj sredini. FRAP vrednosti se izračunavaju merenjem rasta apsorpcije na =λ 593 nm i upoređivanjem istih sa standardnim rastvorom obojenih jona, ili standardnim rastvorom antioksidansa (npr. askorbinska kiselina).

Svako jedinjenje sa redoks potencijalom nižim od redoks potencijala para Fe(III)/Fe(II), teorijski može redukovati Fe(III) do Fe (II) i usloviti lažno visoke rezultate FRAP- vrednosti. Sa druge strane, mnogi antioksidansi ne mogu dovoljno brzo redukovati Fe(III) kako bi se brzina reakcije mogla meriti u posmatranom vremenskom intervalu (obično 4 minuta). U zavisnosti od vremena analize red njihove reaktivnosti se menja. Polifenoli sa takvim ponašanjem su: kvercetin, feruminska kiselina, kofeinska kiselina, taninska kiselina.

Antioksidansi koji deluju kao ‘’gasioci’’ radikala (transferi H-atoma) ne mogu se određivati ovom metodom.

FRAP-metoda određuje redukcionu moć na osnovu redukcije jona gvožđa. Produkcija Fe(II) jona, koji je veoma poznati pro-oksidans, može da dovede do stvaranja dodatnih radikala u reakcionom medijumu, kao što je OH• iz H2O2.

Jedinjenja koja apsorbuju na talasnoj dužini određivanja mogu interferirati i izazvati precenjivanje FRAP vrednosti, npr. neobično visoke vrednosti za bilirubin (duplo više od askorbinske kiseline i Troloxa), jer se oksiduje do biliverdina koji značajno apsorbuje na 593 nm. Niska vrednost pH, koja je neophodna za metodu, može da dovede do precipitacije nekih proteina, kao što je kazein iz mleka. Uprkos niskim pH vrednostima koje se primenjuju kada se porede sa fiziološkim uslovima (pH=7.4), sposobnost redukcije gvožđa indirektno izražava antioksidativni kapacitet (rezultate treba porediti sa onima koji su dobijeni HAT metodom) (Huang et al., 2005).

DPPH- metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil Radical Assay)

Određivanje „scavening“ antioksidansnog slobodno-radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikalu zasniva se na redukciji ljubičastog 2,2-difenilenil-1-pikrilhidrazil radikala (DPPH•) odgovarajućim oksidansima do bledo-žutog hidrazina. Antioksidativna aktivnost se određuje u organskom sistemu praćenjem promene apsorpcije na 515 do 528 nm, sve dok apsorpcija ne postane konstantna ili ESR-om (elektron-spin rezonancom).

48

Određivanje antioksidativnog kapaciteta se zasnivalo na amperometrijskoj redukciji DPPH• na staklastoj ugljenikovoj elektrodi (Milardović et al., 2006.). Rezultujuća struja je proporcionalna koncentraciji DPPH• posle reakcije sa antioksidansom. Biamperometrijski metod koristi par DPPH/ DPPH• i dve identične staklaste ugljenikove elektrode u obliku diska. Reakcioni mehanizam se bazira na elektron-transfer reakciji (ET). Antioksidativni kapacitet u odnosu na DPPH• je pod jakim uticajem rastvarača i pH reakcije . Stask je zaključio da je smeša vode i etanola u odnosu 1:1 (50%) dobar izbor za lipofilne i hidrofilne antioksidanse i brzina reakcije DPPH• i antioksidansa može značajno da raste sa povećanjem količine vode. (Stasko, 2007) Za sadržaj vode veći od 60% antioksidativni kapacitet opada, jer deo DPPH• koaguliše što otežava reakciju sa antioksidansima.

Rezultati su predstavljeni kao efiksna koncentracija (EC50): količina antioksidansa koja je smanjuje koncentraciju DPPH za 50%. Vreme potrebno da se postigne stabilno stanje sa efikasnom koncentracijom (EC50) je izračunato iz kinetičke krive i definiše se kao TEC50.

Antiradikalna efikasnost može biti određena izračunavanjem recipročne vrednosti od EC50 x TEC50, što znači da se efikasnost povećava sa smanjenjem EC50 x TEC50 vrednosti. Efikasnost hvatača (RSE) predstavlja odnos brzine reakcije (dobijene u prvom minutu) i efikasne koncentracije (EC50). Ograničenje ove metode predstavlja određivanje EC50 vrednosti. Iz ovog razloga bolje je koristiti utrošenu koncentraciju DPPH•.

Sterni prilaz DPPH• određuje reakciju, jer mali molekuli lakše prilaze ovom radikalu i imaju relativno veći antioksidativni kapacitet. Sa druge strane, veoma veliki antioksidansi, koji brzo reguju sa peroksil radikalom, u ovom slučaju reaguju sporo ili ne regauju.

Spektrofotometrijska merenja mogu biti pod uticajem jedinjenja, kao što su karotenoidi koji apsorbuju na talsnoj dužini određivanja, i pod uticajem zamućenosti uzoraka.

DPPH test nije pogodan za merenje antioksidativnog kapaciteta plazme, jer se proteini precipituju u alkoholnom reakcionom medijumu. DPPH reakcija je „vremenska“ i može da traje od 20 minuta do 6 sati (Magalhaes et al., 2008).

Cu (II) redukcioni kapacitet

U ovoj metodi antioksidativna aktivnost se određuje korišćenjem Cu(II) kao oksidansa i zasniva se na redukciji Cu(II) do Cu(I) dejstvom antioksidansa koji se nalazi u uzorku.

Hromogeni reagens batokuprion (2,9-dimetil-4,7-difenil-1,10-fenantrolin) formira 2:1 kompleks sa Cu(I) jonom koji ima maksimum apsorpcije na =λ 490 nm.

1 mol R-tokoferola može redukovati 2 mola Cu(II) do Cu(I). Apsorbanca apsorbensa raste sa redukcijom Cu(II) (Huang et al. 2005).

3.7. Statistička obrada podataka

Svi rezultati su statistički obrađeni analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od tj sa 95% (p≤0,05).

4. REZULTATI I DISKUSIJA

50

4. REZULTATI I DISKUSIJA

Nakon prikupljanja odgovarajućeg voća, njegove fermentacije i hidrodestilacije, dobijene su rakije jačine 30 gradi tj. 73,80 vol % (1 grad = 2,46 vol %). One nisu ponovo prepečene iz razloga što bi tada sadržaj alkohola bio jako visok i verovatno odgovoran za antimikrobnu aktivnost. Rakije su ostavljene šest meseci da ’’sazre’’ a zatim je vršeno njihovo dalje ispitivanje.

4.1. Hemijski sastav rakija Nakon odgovarajuće pripreme uzorka uz pomoć gasne hromatografije (GC) i

kombinacijom gasne hromatografije i masene spektrometrije je izvršena hemijska analiza. Dobijeni rezultati su prikazani u tabeli 4.1.

Tabela 4.1. Hemijski sastav rakija

RI1 Naziv jedinjenja Klasa Malus sylvestris

Sambucucs nigra

Fragaria vesca

612 2-Metil-1-propanol AL 0,7 / / 630 3-Metilbutanal AL tr tr / 639 1-Butanol AL 1,1 tr 1,5 639 2-Metilbutanal ALD tr 0,1 / 646 1-Etoksi-1-metoksietan AC tr / / 661 1-Penten-3-ol AL / 0,1 / 661 2-Pentanon K 2,2 / / 664 2,3-Pentadion K tr tr / 670 Pentanal ALD tr tr / 675 2-Hidroksi-3-butanon (syn.5 acetoin) HK / 1,1 / 680 3-Pentanol AL / tr / 684 2-Pentanol AL 4,4 / tr 693 Etil-propanoat E 0,3 0,1 / 695 Propil-acetat E tr tr tr 698 Propanska kiselina KK tr tr tr 706 Metil-butanoat E 0,1 / / 712 3-Penten-2-on K tr / / 716 1,1-Dietoksietan AC tr / / 717 3-Metil-1-butanol AL 11,3 21,2 41,9 720 2-Metil-1-butanol AL 4,6 4,2 21,0 734 2,4,5-Trimetil-1,3-dioksolan AC / tr / 739 2-Metilpropanska kiselina KK / 0,3 0,3 739 Etil-2-metilpropanoat E 0,1 0,2 / 744 1-Pentanol AL 0,6 0,3 0,2 750 2-Metilpropil-acetat E tr tr tr 754 2-Metil-2-buten-1-ol AL tr 0,7 / 754 3-Etoksipropanal ALD tr / tr 757 2,2-Dietoksipropan AC tr tr tr 760 2-Etiltetrahidrofuran FD / / tr 763 2-Hexanon K 0,1 / / 771 Etil-2-oksopropanoat E tr / / 780 Etil-butanoat E 0,7 tr tr 782 2-Hexanol AL tr tr / 792 Etil-2-hidroksipropanoat (syn. etil-laktat) E tr 2,7 0,1 795 Butil-acetat E 0,3 / tr 802 2-Furankarbaldehid (syn. furfural) FD 0,5 0,2 0,3 810 Butanska kiselina KK 0,2 tr 0,3

51

815 3-Etoksi-1-propanol AL / / tr 819 Etil-(E)-2-butenoat E 0,2 / / 823 (E)-2-Heksenal ALD tr 0,1 / 825 3-Metil-1-pentanol AL tr 0,2 tr 826 3-Metilbutanska kiselina KK tr 0,3 1,1 829 Furfuril-alkohol FD / tr / 830 1-Metilbutil-acetat E tr / / 830 (E)-3-Heksen-1-ol AL tr tr / 831 Etil-2-metilbutanoat E 0,5 0,3 0,1 833 Etil 3-metilbutanoat E tr tr / 834 (Z)-3-Heksen-1-ol AL 0,2 7,3 tr 835 2-Metilbutanska kiselina KK 0,4 0,9 /

843 Metil-(E)-2-metil-2-butenoat (syn. metil-tiglat) T tr / tr

844 (E)-2-Heksen-1-ol AL / tr / 846 1,1-Dietoksi-2-metilpropan AC tr / tr 848 1-Heksanol AL 21,6 8 9,2 854 3-Metilbutil-acetat E / 1,4 0,7 856 γ-Butirolakton L / / / 857 2-Metilbutil-acetat E / 0,9 0,1 864 2-Heptanon K 1,2 tr tr 878 2-Butilfuran FD / tr / 880 Etil-pentanoat E 0,1 tr / 882 2-Heptanol AL 10,5 0,1 0,1 886 Pentanska kiselina KK tr / / 892 1,1-Dietoksibutan AC / / 0,1 895 Pentil-acetat E 0,1 / / 904 3-Metil-2-butenil-acetat (syn. prenil-acetat) T tr / / 904 Etil-3-metil-2-butenoat (syn. etil-senecioat) T / tr / 905 Metil-2-hidroksi-2-metilbutanoat E 0,1 / / 907 Metil-heksanoat E 0,1 0,3 / 911 Etil-3-hidroksibutanoat E tr / tr 912 (E)-3-Hepten-2-on K 0,1 / / 917 Etil-(Z)-2-metil-2-butenoat (syn. etil-angelat) T 0,1 / / 920 Etil-(E)-2-metil-2-butenoat (syn. etil-tiglat) T 0,1 / / 921 α-Tujen T tr / / 928 Benzaldehid C6C1 1,6 0,4 2,2 938 2-Metilpropil-butanoat E tr / / 942 1,1-Dietoksi-2-metilbutan AC / 0,2 tr 944 1,1-Dietoksi-3-metilbutan AC 0,1 / / 944 3,3-Dietoksi-2-butanon AC / tr / 944 (Z)-4-Hepten-1-ol AL / / 0,1 946 2-Metilpropil-2-hidroksipropanoat E tr 0,1 / 950 3-Metilbutil-propanoat E / / tr 951 1-Heptanol AL 0,6 0,1 0,3 960 1-(1-Etoksietoksi)-3-metilbutan AC tr tr / 960 6-Metil-5-hepten-2-on KD / / 0,5 961 1-Okten-3-ol AL / 0,3 tr 963 Sabinen T tr / tr 965 Heksanska kiselina KK tr 0,1 0,4 966 Metoksimetilbenzen C6C1 tr tr / 967 Metil-2-hidroksi-4-metilpentanoat E / 0,1 / 967 β-Mircen T tr / / 967 β-Pinen T / / tr 974 6-Metil-5-hepten-2-ol KD tr 0,4 1,1 974 Metil-2-hidroksi-3-metilpentanoat E 0,1 / / 980 Oktanal ALD tr / / 980 Etil-heksanoat E 0,7 0,6 0,9 984 Etil-(E)-3-heksenoat E / tr / 985 2-Oktanol AL 0,3 / tr

52

986 1,1-Dietoksipentan AC / / tr 986 (E)-3-Heksenil-acetat E / 0,2 / 992 (E)-3-Heksenska kiselina KK / tr / 994 Heksil-acetat E 1,4 0,1 0,1 997 3-Metilbutil-2-metilpropanoat E tr tr / 998 2-Butil-4-metil-1,3-dioksolan AC / / 0,3 1003 δ-3-Karen T tr tr 0,1 1005 Benzil-alkohol C6C1 tr 7,6 0,5 1006 γ-Heksalakton L tr / / 1008 2-Fenilacetaldehid C6C2 2,4 tr / 1010 p-Cimen T / / tr 1013 2-Etil-1-heksanol AL tr tr tr 1018 3-Metil-2-cikloheksenon KD tr / / 1019 Limonen T tr tr tr 1021 Etil-(E)-2-heksenoat E 0,1 / / 1022 Etil-furan-2-karboksilat FD tr tr tr 1025 Butil-2-metilbutanoat E / / tr 1026 2-Heptil-acetat E 0,3 / / 1027 Metil-3-hidroksiheksanoat E tr / / 1030 4-Metoksi-2,5-dimetil-3(2H)-furanon FD 0,4 / / 1031 (E)-2-Okten-1-al ALD / / tr 1033 Acetofenon C6C2 tr / / 1034 1-Feniletanol C6C2 tr tr / 1038 Dietil-propandioat (syn. dietil-malonat) E tr / tr 1038 Etil-2-hidroksi-4-metilpentanoat E / 0,7 / 1047 cis-Sabinen-hidrat T tr / / 1047 γ-Terpinen T / tr tr

1047 3-metilbutil-2-hidroksipropanoat (syn. 3-metilbutil-laktat) E tr 0,4 /

1050 (E)-2-Okten-1-ol AL / / tr 1053 1-Oktanol AL 3,9 tr 0,2 1055 cis-Linalool-oksid (furanoidni oblik) T / 1,5 0,1 1055 p-Krezol C6C1 / tr / 1060 o-Gvajakol C6C1 / tr / 1061 1,1,3-Trietoksipropan AC tr / tr 1067 Metil-benzoat C6C1 / tr tr 1070 trans-Linalool-oksid (furanoidni oblik) T / 1,6 0,1 1070 2-Nonanon K 0,4 / / 1073 Heptanska kiselina KK tr / / 1076 (E)-6-Metil-3,5-heptadien-2-on KD / / tr 1079 Etil-heptanoat E tr / tr 1081 Nonanal ALD tr / tr 1083 1,1-Dietoksiheksan AC tr / / 1083 Linalool T tr 3,9 / 1084 2-Fenil-1-etanol (syn. fenetil-alkohol) C6C2 1,5 7,8 5,7 1090 3-Metilbutil-2-metilbutanoat E / tr tr 1090 2-Nonanol AL 7,4 / / 1095 Heptil-acetat E tr / / 1096 cis-Ruža-oksid T / 0,3 / 1096 1-(1-Etoksietoksi)heksan AC / / tr 1098 endo-Fenhol T tr / / 1095 Mircenol T 1104 Etil-3-hidroksiheksanoat E 0,1 / / 1105 Butil-3-hidroksibutanoat E / / tr 1106 Metil-oktanoat E tr tr tr 1111 2,6-Dimetil-5-hepten-1-ol KD / / tr 1112 trans-Ruža-oksid T / 0,1 / 1113 2-Etilheksanska kiselina E / tr / 1114 2-Metilacetofenon C6C2 / / / 1118 1-Terpinenol T tr / /

53

1121 trans-Pinokarveol T 0,6 / / 1124 Jorgovan-aldehid B T / tr / 1132 Benzil-acetat C6C1 tr 0,3 tr 1134 (E)-2-Nonen-1-al ALD tr / tr 1136 Pinokarvon T tr / / 1136 4-Metilacetofenon C6C2 1136 Nerol-oksid T / 0,1 / 1136 (Z)-3-Nonen-1-ol AL tr / / 1143 Etil-benzoat C6C1 tr 0,2 0,1 1146 Borneol T tr / / 1147 4-Etilfenol C6C2 0,1 1,3 / 1149 Dietil-butandioat (syn. dietil-sukcinat) E 0,1 / / 1149 cis-Linalool-oksid (piranoidni oblik) T / 7,9 / 1153 trans-Linalool-oksid (piranoidni oblik) T / 0,7 / 1154 1-Nonanol AL tr tr 0,5 1159 4-Terpineol T 0,4 / / 1160 Oktanska kiselina KK tr tr 2,1 1165 2-Metoksi-4-metilfenol C6C1 / 1 / 1166 Mirtenal T 0,7 / / 1167 Metil-salicilat C6C1 / 1,1 tr 1169 α-Terpineol T / 0,2 tr 1171 β-Fenhil-alkohol T 0,5 / / 1172 Šafranal KD / tr / 1173 Metil-čavikol FP / / 0,2 1179 Mirtenol T 6,7 tr / 1179 Etil-oktanoat E tr 0,1 2,0 1183 α-Kamfolenol T 0,1 / / 1186 Heksil-2-hidroksipropanoat E / tr / 1193 Oktil-acetat E tr / / 1194 2,3-Dihidrobenzofuran C6C2 / tr / 1194 1-(4-Metilfenil)etanol C6C2 / / tr 1196 trans-Karveol T tr / / 1199 3-Fenil-1-propanol FP 0,4 0,2 / 1201 3,7-Dimetiloct-1-en-3,7-diol T / tr / 1207 (Dietoksimetil)benzen AC / / tr 1209 β-Citronelol T 0,1 0,2 / 1212 Etil-2-fenilacetat C6C2 tr 0,4 0,2 1220 Heksil-2-metilbutanoat E / / 0,6 1221 2-Nonanil-acetat E 0,2 / / 1224 2-Feniletil-acetat C6C2 0,2 0,5 0,3 1226 Karvenon T tr / / 1231 Metil-3-hidroksioktanoat E tr / / 1235 (E)-2-Decenal ALD / / 0,1 1238 cis-Mirtanol T 0,1 / / 1238 (Z)-4-Decen-1-ol AL / / tr 1243 Etil-salicilat C6C1 / 0,2 / 1246 Felandral T 0,1 / / 1251 p-Etilgvajakol C6C1 0,1 0,1 / 1255 1-Dekanol AL 0,5 tr 0,1 1256 Nonanska kiselina KK / tr tr 1262 p-Cimen-7-ol T tr / / 1264 trans-Linalool-oksid-acetat (piranoidni oblik) T / 0,1 / 1266 Vitispiran KD tr / 0,1 1266 (Z,Z)-2,4-Decadienal ALD / / tr 1268 Benzil-2-metilpropanoat C6C1 / tr / 1270 Metil-(Z)-cinamat FP tr / / 1271 2-Hidroksi-2-fenilacetonitril C6C2 / / / 1271 Metil-mirtenat T 0,2 / / 1272 2-Undekanon K tr / / 1274 Perila-alkohol T tr / /

54

1275 Undekan-4-ol AL tr / / 1277 trans-Pinokarvil-acetat T tr / / 1278 Etil-nonanoat E / / tr 1280 Dihidroedulan I KD / 0,4 / 1286 2-Undekanol AL 0,3 tr / 1287 (E,E)-2,4-Dekadienal ALD tr / tr 1291 4-Etil-1,2-dimetoksibenzen C6C2 0,1 / / 1292 Nonil-acetat E / / / 1300 1,1-Dietoksi-2-feniletan AC 0,1 0,1 / 1302 (E)-2-Undecen-4-one K tr / / 1303 Mirtenil-acetat T 0,2 / / 1303 Heksil-3-hidroksibutanoat E / / tr 1303 Metil-antranilat C6C1 tr / / 1305 Etil-3-hidroksioktanoat E 0,1 / / 1306 Metil-dekanoat E / / tr

1309 Heksil-(E)-2-metil-2-butenoat (syn, heksil-tiglat) E / / tr

1315 γ-Nonalakton L tr tr tr 1326 Eugenol FP 0,2 2,2 0,5 1335 Geranil-kiselina T / 0,1 / 1339 Dihidroeugenol FP / tr / 1345 Butil-benzoat C6C1 / / tr 1347 (E)-Metil-cinamat FP tr / / 1356 Dekanska kiselina KK 0,8 0,3 1,0 1359 (E)-β-Damascenon KD tr 1 tr 1359 2-Metilpropil-2-fenilacetat C6C2 / / tr 1366 Etil-(E)-4-decenoat E / / tr 1369 Metil-eugenol FP 0,1 / / 1373 1,1-Dietoksinonan AC tr / tr 1377 Etil-antranilat C6C1 tr / / 1378 Etil-dekanoat E tr 0,1 0,5 1391 Decil-acetat E / / / 1405 Etil-2-hidroksi-3-fenilpropanoat FP / tr / 1411 trans-Kariofilen T / / tr 1417 Hidroksidihidroedulan KD / 0,1 / 1428 2-Metilbutil-oktanoat E / / tr 1429 Etil-(E)-cinamat FP 0,1 tr / 1434 2,6-Dimethyl-2,6-undecadien-10-ol KD / / tr 1436 Metil-3-hidroksidekanoat E tr / / 1446 δ-Dekalakton L / tr / 1457 1-Dodekanol AL tr / / 1457 3-Metilbutil-2-fenilacetat C6C2 / / tr 1461 2-Metilbutil-2-fenilacetat C6C2 / / tr 1461 2-Feniletil-3-metilbutanoat C6C2 / tr / 1468 10,11-Epoksicalamenen T 1474 2-Tridekanon K tr / / 1477 3,4-Dimetil-5-pentil-5H-furan-2-on FD / tr / 1487 2-Tridekanol AL tr / / 1494 (E,E)-α-Farnezen T / / 0,1 1509 Etil-3-hidroksidekanoat E tr / / 1545 (E)-Nerolidol T / / 0,2 1548 Kariofilen-oksid T / 0,2 / 1551 Dodekanska kiselina KK tr / tr 1574 3-Hidroksi-β-damaskon KD / tr / 1577 Etil-dodekanoat (Etil-laurat) E tr tr 0,1 1608 γ-Dodekalakton L / tr / 1611 1-Metiletil-dodekanoat E tr / / 1620 epi-α-Murolol T / / / 1630 Intermedeol T tr tr / 1633 δ-Dodekalakton L / 0,2 /

55

1683 2-Octil benzoat C6C1 tr / / 1698 (Z,E)-2,6-Farnezol T / tr 0,1 1906 Metil-heksadekanoat (syn. metil-palmitat) E / / tr 2135 Etil-(Z,Z)-9,12-oktadekadienoat E / / 0,1 2141 Etil-(Z,Z,Z)-9,12,15-oktadekatrienoat E / / tr 2146 Etil-(Z)-9-oktadecenoat (syn. etil-oleat) E / / tr 2400 Tetrakozan ALK / tr tr 2600 Heksakozan ALK tr 0,1 tr 2800 Octakozan ALK tr 0,1 tr 2900 Nonakozan ALK tr 0,1 tr 3000 Triakontan ALK tr tr tr 3100 Hentriakontan ALK tr tr / 3200 Dotrikontan ALK / tr / 3300 Tritriakontan ALK tr tr tr Ukupno [%] 97,5 98,2 98,9 Broj identifikovanih komponenti 188 156 133 Acetali (AC) 0,2 (10) 0,3 (6) 0,4 (10) Alkoholi (AL) 68,0 (26) 42,5 (22) 75,1 (20) Aldehidi (ALD) 0,4 (9) 0,3 (4) 0,1 (7) Alkani (ALK) tr (8) 0,4 (11) tr (8) Jedinjenja šikimatnog puta Fenil-propanoidi (FP) 0,9 (10) 2,8 (8) 0,9 (3) C6C1 1,7 (9) 10,9 (13) 2,8 (7) C6C2 4,3 (8) 10,0 (8) 6,2 (7) Estri (E) 5,9 (48) 8,3 (31) 5,5 (36) Etri (ET) / / / Derivati furana (FD) 0,9 (3) 0,2 (5) 0,3 (3) Ketoni (K) 4 (10) tr (2) tr (1) Hidroksi-ketoni (HK) / 1,1 (1) / Jedinjenja nastala iz karotenoida (KD) tr (4) 1,9 (6) 1,7 (7) Karboksilne kiseline (KK) 1,4 (10) 1,9 (10) 5,2 (9) Laktoni (L) tr (2) 0,3 (5) tr (1) Terpeni (T) 9,8 (31) 17,3 (24) 0,7 (14) 1Jedinjenja su navedena po redosledu eluiranja sa DB1 kolone (RI-eksperimentalno određeni retencioni indeksi na pomenutoj koloni koinjekcijom homologe serije n-alkana C6-C36); 2MI – metoda identifikacije jedinjenja: RI – poređenjem retetencionih indeksa sa literaturnim vrednostima, MS – poređenjem njihovih masenih spektara sa spektrima iz Wiley 6, Nist 02, MassFinder 2.3 i interne MS biblioteke, CoI – koinjekcijom odgovarajućeg standarda; 3tr – trag; 4; 5 syn.- sinonim; 6 u zagradi je dat broj komponenti koje pripadaju određenoj klasi.

U rakiji dobijenoj od divlje jabuke identifikovano je 188 različitih jedinjenja, od čega su najzastupljeniji bili različiti alkoholi, estri i terpeni. Najzastupljenija su bila jedinjenja: 1-heksanol sa 21,6%, 3-metil-1-butanol sa 11,3%, 2-heptanol sa 10,5%, 2-nonanol 7,4% i mirtenol sa 6,4%. U rakiji dobijenoj od zove identifikovano je 156 različitih jedinjenja od čega su najzastupljeniji bili alkoholi, estri, terpeni i karbonske kiseline. Najzastupljenija su bila jedinjenja 3-metil-1-butanol sa 21,2%, 1-heksanol sa 8%, cis-linalool-oksid (piranoidi oblik) sa 7,9% i 2-fenil-1-etanol (syn. fenetil-alkohol) sa 7,8%. U rakiji dobijenoj od šumske jagode identifikovano je 133 različitih jedinjenja od čega su najzastupljeniji bili različiti alkoholi, estri i karbonske kiseline. Dominantne komponente su bile: 3-metil-1-butanol sa 41,9%, 2-metil-1-butanol sa 21%, 1-heksanol sa 9,2 % i 2-fenil-1-etanol (syn. fenetil-alkohol) sa 5,7%.

56

4.2.Antimikrobna aktivnost rakija

U našoj zemlji se tradicionalno koristi rakija za ispiranje i dezinfekciju rana i kao preventiva za gastrointestinalne i urinarne infekcije. Iz tog razloga su u ovom radu ispitivane antimikrobne aktivnosti dobijenih rakija na patogene bakterije koje su izolovane iz urina, fecesa i iz rana pacijenata koji su usled bolničkog lečenje i dugotrajnog ležanja dobili infekcije kože i pojavu rana (poznatih kao dekubitis). Svi testirani uzorci su pokazali antimikrobno delovanje na sve testirane sojeve bakterija.

Tabela 4.2. Antimikrobna aktivnost rakija i suvih ostataka dobijenih iz plodova divlje jagode (Fragaria vesca L.), kao i dominantnog jedinjenja 3-metil-1-butanol, etanola (negativna kontrola) i antibiotika hloramfenikola (pozitivna kontrola (MIC/MBC izražene u μL/mL)

Test mikroorganizmi

Fragaria vesca rakija

Fragaria vesca

suvi ostaci

3-metil-1-butanol (dominantno jedinjenje)

100 %-ni etanol

Antibiotik

Izolati iz urina

Proteus mirabilis 125/250 6,25/6,25 0,3/0,6 62,5/62,5 16,0/16,0

Klebsiella pneumoniae 250/250 6,25/6,25 nigde 62,5/125 16,0/16,0

Morganella sp 250/250 6,25/6,25 12,5/12,5 62,5/62,5 4,0/2,0

Enterobacter faecalis 250/250 12,5/12,5 25,0/25,0 62,5/62,5 4,0/2,0

Izolati iz fecesa

Escherichia coli 500/500 6,25/6,25 25,0/25,0 62,5/62,5 8,0/16,0

l.isteria monocytogenes 125/125 12,5/50 1,56/1,56 62,5/62,5 8,0/8,0

Shigella sonnei 250/250 6,25/6,25 12,5/>50,0 62,,5/62,5 8,0/16,0

Salmonella enteritidis 250/500 12,5/12,5 3,125/3,125 62,5/125 4,0/8,0

Staphylococcus aureus 250/500 6,25/6,25 6,25/>50,0 125/125 1,0/8,0

Candida albicans 250/>500 6,25/>50 50,0/50,0 125/500 16,0/16,0

Izolati iz rana

Acinetobacter sp 250/500 12,5/12,5 3,125/3,125 62,5/125 25,0/25,0

Klebsiella oxytoca 125/250 6,25/6,25 0,20/0,20 62,5/125 12,5/12,5

Enterobacter sp 250/500 12,5/50 nigde 62,5/125 25,0/25,0 Staphylococcus aureus 250/500 12,5/12,5 1,56/1,56 62,5/125 12,5/12,5

Pseudomonas aeruginosa 125/500 6,25/6,25 12,5/12,5 125/500 >100/>10

0

Proteus mirabilis 250/250 6,25/12,5 6,25/6,25 62,5/125 >100/>100

Escherishia coli 250/500 12,5/50 3,125/3,125 125/125 >100/>100

57

Tabela 4.3. Antimikrobna aktivnost rakija i suvih ostataka dobijenih iz plodova divlje jabuke (Malus sylvestris Mill.), kao i dominantnog jedinjenja 1-heksanol, etanola (negativna kontrola) i antibiotika hloramfenikola (pozitivna kontrola (MIC/MBC izražene u μL/mL)

Test mikroorganizmi

Malus sylvestris rakija

Malus sylvestris suvi ostaci

1-heksanol (dominantno jedinjenje)

100 %-ni etanol Antibiotik

Izolati iz urina

Proteus mirabilis 250/500 12,5/12,5 0,30/1,20 62,5/62,5 16,0/16,0

Klebsiella pneumoniae 250/500 25,0/25,0 nigde 62,5/125 16,0/16,0

Morganella sp 250/500 25,0/25,0 25,0/25,0 62,5/62,5 4,0/2,0

Enterobacter faecalis 250/500 25,0/50,0 0,78/1,56 62,5/62,5 4,0/2,0

Izolati iz fecesa

Escherichia coli 500/500 25,0/25,0 3,125/12,5 62,5/62,5 8,0/16,0

l.isteria monocytogenes 250/250 25,0/>50,0 1,56/1,56 62,5/62,5 8,0/8,0

Shigella sonnei 250/500 25,0/25,0 6,25/12,5 62,,5/62,5 8,0/16,0

Salmonella enteritidis 500/250 25,0/25,0 3,125/3,125 62,5/125 4,0/8,0

Staphylococcus aureus 250/250 12,5/12,5 3,125/12,5 125/125 1,0/8,0

Candida albicans 250/500 25,0/25,0 3,125/>50 125/500 16,0/16,0

Izolati iz rana

Acinetobacter sp 500/500 6,25/12,5 3,125/3,125 62,5/125 25,0/25,0

Klebsiella oxytoca 250/500 25,0/>50,0 1,56/0,20 62,5/125 12,5/12,5

Enterobacter sp 250/250 25,0/25,0 3,125/1,56 62,5/125 25,0/25,0

Staphylococcus aureus 250/500 25,0/25,0 1,56/1,56 62,5/125 12,5/12,5

Pseudomonas aeruginosa 250/500 12,5/12,5 3,125/12,5 125/500 >100/>100

Proteus mirabilis 125/500 12,5/50,0 3,125/3,125 62,5/125 >100/>100

Escherishia coli 250/500 25,0/25,0 1,56/1,56 125/125 >100/>100

58

Tabela 4.4. Antimikrobna aktivnost rakija i suvih ostataka dobijenih iz plodova zove (Sambucus nigra L.), kao i dominantnog jedinjenja 3-metil-1-butanol, etanola (negativna kontrola) i antibiotika hloramfenikola (pozitivna kontrola (MIC/MBC izražene u μL/mL)

Uzorci rakija testirani su u koncentracijama od 0,2-500 µL/mL, dok su suvi ostatci rakija

(kojima je uklonjen alkohol i šećer), rastvoreni u 0,10 %-ni DMSO (dimetilsulfoksid) i testirani u koncentracijama od 0,02-50µL/mL

. Rakija divlje jagode delovala je u opsegu od 125-500 µL/mL, pri čemu je najbolju aktivnost

pokazala na izolate iz urogenitalnog trakta. Izolati iz gastrointestinalnog trakta su pokazali

Test mikroorganizmi

Sambucus nigra rakija

Sambucus nigra suvi ostaci

3-metil-1-butanol (dominantno jedinjenje)

100 %-ni etanol Antibiotik

Izolati iz urina

Proteus mirabilis 250/500 6,25/6,25 0,3/0,6 62,5/62,5 16,0/16,0

Klebsiella pneumoniae 250/500 12,5/12,5 nigde 62,5/125 16,0/16,0

Morganella sp 250/500 12,5/25,0 12,5/12,5 62,5/62,5 4,0/2,0

Enterobacter faecalis 250/500 25,0/25,0 25,0/25,0 62,5/62,5 4,0/2,0

Izolati iz fecesa

Escherichia coli 250/500 25,0/50,0 25,0/25,0 62,5/62,5 8,0/16,0

l.isteria monocytogenes 250/500 25,0/25,0 1,56/1,56 62,5/62,5 8,0/8,0

Shigella sonnei 250/500 12,5/12,5 12,5/>50,0 62,,5/62,5 8,0/16,0

Salmonella enteritidis 250/500 25,0/25,0 3,125/3,125 62,5/125 4,0/8,0

Staphylococcus aureus 250/500 12,5/12,5 6,25/>50,0 125/125 1,0/8,0

Candida albicans 250/500 12,5/25,0 50,0/50,0 125/500 16,0/16,0

Izolati iz rana

Acinetobacter sp 250/250 12,5/25,0 3,125/3,125 62,5/125 25,0/25,0

Klebsiella oxytoca 250/250 12,5/>50,0 0,20/0,20 62,5/125 12,5/12,5

Enterobacter sp 250/500 12,5/25,0 nigde 62,5/125 25,0/25,0

Staphylococcus aureus 250/500 25,0/25,0 1,56/1,56 62,5/125 12,5/12,5

Pseudomonas aeruginosa 125/>500 12,5/25,0 12,5/12,5 125/500 >100/>100

Proteus mirabilis 250/250 12,5/25,0 6,25/6,25 62,5/125 >100/>100

Escherishia coli 250/500 25,0/>50,0 3,125/3,125 125/125 >100/>100

59

slično antimikrobno delovanje na rakiju kao i izolati iz urogenitalnog trakta, gde je najosetljiviji bio soj C. Albicans. Grupa izolata iz rana bila je najosetljivija na delovanje rakije.

Suvi ostaci su delovali u koncentracijama od 6,25-50µL/mL, što ukazuje na delovanje

sastojaka rakije i nakon uklanjanja etanola. Suvi ostaci pokazali su slično antibakterijsko delovanje na izolate iz urogenitalnog trakta kao i rakija. Što se tiče izolata iz gastrointestinalnog trakta, suvi ostaci su pokazali dobru aktivnost pri čemu je najosetljiviji bio soj L. monocytogenes. Izolati iz rana i na dejstvo suvih ostataka bili su najosetljiviji i to E. coli i Enterobacter.

Testirano je i antimikrobno dejstvo dominantnog jedinjenja 3-metil-1-butanol na izolate iz

urogenitalnog, gastrointestinalnog trakta i na izolate iz rana. Najbolju aktivnost 3-metil-1-butanol pokazao je na izolate iz gastrointestinalnog trakta, pri čemu su najosetljiviji bili sojevi Sh. sonnei i S. Aureus.

Rakija divlje jabuke delovala je u koncentracijama od 125-500 µL/mL na izolate iz

urogenitalnog, gastrointestinalnog trakta i na izolate iz rana. Najbolju aktivnost rakija je pokazala na izolate iz rana, pri čemu je najosetljiviji bio soj P. mirabilis. Rakija je bila aktivna i na izolate iz gastrointestinalnog trakta, gde je najosetljiviji bio soj C. albicans. Dobru aktivnost rakija je pokazala i na izolate iz urogenitalnog trakta.

Suvi ostaci su delovali u sličnom opsegu, od 6,25–50 µL/mL. Najosetljiviji soj iz

urogenitalnog trakta na delovanje suvih ostataka bio je E. faecalis. Suvi ostaci najbolju aktivnost pokazali su na izolate iz rana, gde je najosetljiviji bio soj P. mirabilis. Na izolate iz gastrointestinalnog trakta suvi ostaci su nešto slabije delovali u odnosu na izolate iz rana.

Dominantno jedinjenje rakije dobijene od divlje jabuke je 1-heksanol. Antimikrobna

aktivnost ovog jedinjenja ispitivana je na izolate iz rana, urogenitalnog i gastrointestinalnog trakta. Najbolju aktivnost 1-heksanol ispoljio je na izolate iz gastrointestinalnog trakta, a nešto slabiju aktivnost na izolate iz urogenitalnog trakta.

Rakija dobijena od zove delovala je u koncentracijama od 125-500 µL/mL na izolate iz rana,

urogenitalnog i gastrointestinalnog trakta. Dejstvo rakije na sve tri grupe izolata bilo je slično, pri čemu je na izolate iz rana aktivnost bila nešto bolja u odnosu na izolate iz urogenitalnog i gastrointestinalnog trakta, a kao najosetljiviji soj pokazao se P. aeruginosa.

Delovanje suvih ostataka bilo je u opsegu od 6,25-50 µL/mL. Svi testirani sojevi su pokazali

antimikrobno delovanje. Najbolju aktivnost su imali izolati iz rana, gde je najosetljiviji soj bio K. oxytoca, dok je nešto slabija aktivnost suvih ostataka bila na izolate iz gastrointestinalnog trakta.

Dominantno jedinjenje zove je 3-metil-1-butanol i njegova antimikrobna aktivnost testirana

je na izolate iz gastrointestinalnog, urinarnog trakta i na izolate iz rana. Najbolju aktivnost ovo jedinjenje je pokazalo na gastrointestinalni trakt, gde su najosetljiviji bili sojevi Sh. sonnei i S. aureus, kao i kod divlje jagode.

Ispitivane su i dve kontrole, negativna kontrola je bio rastvarač-100 %-ni etanol koji nije

pokazivao nikakvu aktivnost u koncentracijama u kojima se nalazio. Kao pozitivna kontrola korišćen je antibiotik hloramfenikol koji je delovao inhibitorno i baktericidno.

60

Na izolate iz urogenitalnog trakta nešto bolje dejstvo imale su rakije od divlje jabuke i od zove u odnosu na rakiju od divlje jagode. To je izuzetna aktivnost kada se uporedi sa 100 %-nim etanolom jer u rakijama ima mnogo manje alkohola (destilacija se prekida na 30º).

Na izolate iz gastrointestinalnog trakta rakija od zove je delovala neznatno bolje u odnosu

na rakiju od divlje jagode i rakiju od divlje jabuke. Na izolate iz rana najbolje je delovala rakija od divlje jagode. Na izolate iz urogenitalnog trakta suvi ostaci zove i divlje jabuke su pokazali neznatno bolje dejstvo u odnosu na suve ostatke divlje jagode. Na izolate iz gastrointestinalnog trakta suvi ostaci jagode su pokazali nesto bolje delovanje u odnosu na suve ostatke zove i divlje jabuke. Grupa izolata iz rana je bila najosetljivija sa boljim delovanjem suvih ostataka dobijenih od zove.

Dobijeni rezultati pokazuju da je antimikrobna aktivnost rakije bazirana na jedinjenjima koja ulaze u njihov sastav, a ne na prisutnom etanolu. Buduća istraživanaja bi trebalo izvršiti na čistim komponentama koje su dominantne u uzorcima ina njihovom sinergističkom delovanju u cilju traženja prirodnih neškodljivih antimikrobnih materija za prevencju u lečenje urogenitalnih i gastrointestinalnih infekcija, kao i infekcije rana.

4.3. Antioksidativna aktivnost rakija

4.3.1. Ukupna redukciona moć (Ekvivalenti askorbinske kiseline µg/mL)

Redukciona moć svih ekstrakata je izažena preko redukcione moći askrobinske kiseline kao pozitivne kontrole (AEAC- Ascorbate Equivalent Antioxidant Capacity). Reakcione smeše su pripremljene mešanjem 10 µL pripremljenog ekstrakta sa po 1ml 1%-tnog rastvora K3[Fe(CN)6] i 1mL pufera NaH2PO4-Na2HPO4. Smeše su inkubirane na 50°C 30 minuta i nakon toga je dodato 1mL 10%-tne trihlorsirćetne kiseline. Smeše su zatim centrifugirane na 3000 rpm 10 minuta. Nakon centrifugiranja uzimano je po 1mL frakcija suplimenata i mešana sa 1mL destilovane vode i 0,2 mL 0,1%-tnog rastvora FeCl3. Apsorbancije tako dobijenih smeša merene su na talasnoj dužini od 700 nm. Povećane apsorbancije reakcionih smeša ukazuju na veću redikcionu moć. Ukupna redukciona moć ovih ekstrakata je računata primenom sledeće jednačine:

A

s

AAAEAC ⋅

= Ac

gde je:

cA- konačna koncentracija askorbinske kiseline u µg/mL

AS- apsorbancija uzorka

AA- apsorbancija askorbinske kiseline

61

Tabela 4.5. Ukupna redukciona moć ispitivanih suvih ostataka

Uzorci (rakije) Ukupna redukciona moć (Ekvivalent

askorbinske kiseline µg/mL) Malus sylvestris 71,82±0,69 Sambucus nigra 16,5±0,09 Fragaria vesca 82,87±1,06

Rezultati za ukupnu redukcionu moć ispitivanih suvih ostatka pokazuju sledeće: Rakija divlje jagode (Fragaria vesca) pokazuje najveću redukcionu moć, dok rakija zove (Sambucus nigra) ima najmanju redukcionu moć.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Malus sylvestris

Sambucus nigra

Fragaria vesca

Grafikon 4.1. Ukupna redukciona moć

4.3.2. Određivane „scavening“ antioksidativnog slobodno radikalskog kapaciteta prema 2,2-difenil-1-pikrilhidrazin (DPPH) radikalu

Po 10 µL ekstrakta (1,25-62,5 µg/mL) pomešano je sa 90 µmol/L DPPH u metanolu (1,0 mL) i dopunjeno je čistim metanolom do konačne zapremine od 4,0 mL. Smeše su mešane i ostavljene da stoje u mraku 1h. Ovaj postupak je izvođen u cilju postizanja ravnotežnog stacionarnog stanja reakcije. Posle inkubacije, merena je apsorbancija rastvora na talasnoj dužini od 515 nm.

Kao standard korišćen je komercijalni sintetički antioksidans BHT (butil hidroksi toluen).

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) „scavening“ aktivnost izražavana je kao radikalski „scavening“ kapacitet primenjujući sledeću jednačinu:

62

( )

−×=−

0

10100%A

AARSCDPPH

gde je:

A0 - apsorbancija slepe probe

A1 - apsorbancija rastvora u prisustvu aktivne komponente

Tabela 4.6. Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema DPPH radikalu ispitivanih suvih ostataka

Antioksidativne aktivnosti suvih ostataka su obrnuto proporcionalne EC50 vrednostima. U skladu sa tim, slobodno radikalski antioksidativni kapaciteti dobijeni za suve ostatke pokazuju sledeće:

Najveći antioksidativni kapacitet pokazuje divlja jagoda (Fragaria vesca), a najmanji antioksidativni kapacitet pokazuje divlja jabuka (Malus sylvestris).

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Malus sylvestris

Sambucus nigra

Fragaria vesca

Grafikon 4.2. Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema DPPH radikalu

Uzorci (rakije) Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet

prema DPPH radikalu (%) Malus sylvestris 2,69±0,04 Sambucus nigra 1,92±0,03 Fragaria vesca 1,54±0,02 BHT 38,46±0,08

63

4.3.3. Određivanje antioksidativne aktivnosti primenom ABTS metode

Prvo se priprema rastvor koji je 7 mM u odnosu na ABTS i 2,45 mM u odnosu na kalijum-persulfat. Rastvor se ostavi da stoji u mraku najmanje 16 h, a zatim se može koristiti u toku dva dana. Rastvor se pre upotrebe razblažuje pogodnim rastvaračem (etanol, metanol) do apsorbancije 0,700±0,0500 na =λ 734 nm. Zatim se odmerava po 1,9 mL razblaženog ABTS rastvora dodaje se po 50 μL analiziranog uzorka ili standarda, ostavi da stoji 6 minuta a zatim se meri apsorbancija na =λ 734 nm.

Rezultati se izražavaju kao µM ekvivalenti troloxa/g suvog uzorka.

Tabela 4.7. Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema ABTS radikalu

Rezultati antioksidativne aktivnosti različitih suvih ostataka primenom ABTS metode pokazuju sledeće:

Najveću antioksidativnu aktivnost pokazuje divlja jagoda (Fragaria vesca), a najmanju antioksidativnu aktivnost pokazuje zova (Sambucus nigra).

0

1

2

3

4

5

6

Malus sylvestris

Sambucus nigra

Fragaria vesca

Grafikon 4.3. Antioksidacioni slobodno radkalski aktivitet prema ABTS radikalu

Uzorci (rakije) Antioksidacioni slobodno radikalski aktivitet prema ABTS radikalu (Ekvivalent Troloxa

µmol/L) Malus sylvestris 2,89±0,05 Sambucus nigra 5,35±0,13 Fragaria vesca 0,21±0,03

5. ZAKLJUČAK

65

5. ZAKLJUČAK

U ovom radu je ispitivan hemijski sastav, antimikrobna aktivnost, antioksidativna aktivnost rakija i njenih suvih ostataka dobijenih fermentacijom plodova divlje jagode (Fragaria vesca), divlje jabuke (Malus sylvestris) i zove (Sambucus nigra) u cilju traženja potencijalnog prirodnog izvora antimikrobnih materija, ali i antioksidativnih materija za fitoterapiju infektivnih bolesti.

Hemijsko ispitivanje rakija izvršeno je uz pomoć GC i GC/MS analize. Ustanovljeno je da su u rakijama dominantna jedinjenja alkoholi, estri i karbonske kiseline. Izuzetak je divlja jabuka kod koje su pored alkohola i estra dominantni i terpeni.

U rakiji dobijenoj od divlje jabuke identifikovano je 188 različitih jedinjenja. Najzastupljenija su bila jedinjenja: 1-heksanol, 3-metil-1-butanol, mirtenol. U rakiji dobijenoj od zove identifikovano je 156 različitih jedinjenja od čega su najzastupljenija su bila jedinjenja 3-metil-1-butanol, 1-heksanol, cis-linalool-oksid (piranoidi oblik) i 2-fenil-1-etanol (syn. fenetil-alkohol). U rakiji dobijenoj od šumske jagode identifikovano je 133 različitih jedinjenja. Dominantne komponente su bile: 3-metil-1-butanol, 2-metil-1-butanol, 1-heksanol i 2-fenil-1-etanol (syn. fenetil-alkohol).

Antimikrobna ispitivanja su izvršena mikro dilucionom metodom protiv patogena gastrointestinalnog i urogentalnog trakta i patogena koji izazivaju nastanak i infekcija rana, poput dekubitis. Uzorci rakija su testirani u koncentracijama od 0,2-500 µL/mL, dok su suvi ostatci rakija rastvoreni u 0,10 %-ni DMSO (dimetilsulfoksid) testirani su u koncentracijama od 0,02-50 µL/mL.

Rakije dobijene iz divlje jagode i zove i divlje jabuke imaju sličan hemijski sastav. Najbolju antimikrobnu aktivnost pokazala je rakija i suvi ostaci dobijeni iz zove. Najosetljivija je bila grupa bakterija izolovanih iz rana pacijenata.

Antioksidativna aktivnost rađena je sa suvim ostacima, koji su rastvarani u rastvaraču, a potom ispitivani pomoću spektrofotometra. Za antioksidativnu analizu korišćene su tri metode: ukupna redukciona moć, DPPH metoda, ABTS metoda. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da najveću antioksidativnu sposobnost, odnosno sposobnost hvatanja slobodnih radikala ima divlja jagoda.

Dobijeni rezultati pokazuju da je kako antimikrobna tako i antioksidativna aktivnost rakije bazirana na jedinjenjima koja ulaze u njihov sastav a ne na prisutnom etanolu.

6. SUMMARY

67

6. SUMMARY In this paper was examinated chemical composition, antimicrobial activity and

antioxidant activity of rakija and it’s dry residue obtained by fermentation of fruits of wild strawaberry (Fragaria vesca), wild apple (Malus sylvetris) and elderberry (Sambucus nigra), to look for potential source of natural antimicrobial and antioxidant substances for phitotherapy of infectional diseases.

Chemical examination of the resulting rakija was performed using GC and GC/MS analyses. It was concluded that the dominant compounds in rakija were alcohols, esters and carboxylic acids. The exception was rakija made from wild apple that in addition to alcohol and esters contains terpens.

In wild apple rakija were identified 188 different compounds. The most abundant were 1-hexanol, 3-methyl-1-butanol and mirtenol. In rakija obtained from elderberry were identified 156 different compounds, of which most abundant were 3-methyl-1-butanol, 1-hexanol, cis-linalool oxide (pirinoidi form) and 2-phenyl-1-ethanol (syn.phenethyl alcohol). In wild strawaberry were identified 133 different compounds. Dominant compounds were 3-methyl-1-butanol, 2-methyl-1-butanol, 1-hexanol and 2-phenil-1-ethanol (phenethyl alcohol).

Antimicrobial tests were carried out with micro-dilution method against pathogens and gastrointestinal and genitourinary tract pathogens that cause the occurrence of wound infection, such as pressure sores. Samples of rakija were tested at concentrations of 0.2 to 500 ul/ml, while the dry remains of rakija dissolved in 0.10% DMSO (dimethylsulfoxide) tested at concentration ranging from 0.02 to 50 ul/ml.

Rakija derived from wild strawaberry, elderberry and wild apple has similar chemical composition. Best antimicrobial activity was showed by rakija and dry remains obtained from elderberry.

Antioxidant activity was carried out with dry remains which were dissolved in the solvent and then examinated with spectrophotometer. For antioxidant analyses were used three methods: total reducing power, DPPH-method and ABST-method. The results show that the greatest antioxidant ability has wild strawaberry.

The results show that the antimicrobial and antioxidant activity of rakija is based on compounds that make composition of rakija rather than the present ethanol.

7. LITERATURA

69

7. LITERATURA

Adams RP (2007): Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectrometry, 4th edition, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, IL.

Božin B. (2009): Biohemijska i farmakološka ispitivanja vrsta roda Allium L. (Sect. Allium),

Doktorska disertacija, Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematicki fakultet, Novi Sad.

Cadenas E., Davies, J.A.K. (2000): Mitochondrial free radical generation, oxidative stress

andaging. Free Radical Biology and Medicine, 29:222. Hu J. (2001): Oxidative Stress and Aging, Free Radical and Radiation Biology Program, The

University of Iowa. Huang D., Ou B., Prior R.L. (2005): The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays,

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53. Jawetz, Melnick, Adelberg (2007): Lange Medical Microbiology, 24th Edition: McGraw-Hill

Medical, 832. Jarak, M., Govedarica, M. (2003): Mikrobiologija. Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u

Novom Sad, Novi Sad, 9-10. Jović S. (2006): Priiručnik za spravljanje rakije. Karakašević, B. (1977): Mikrobiologija i parazitologija, Medicinska knjiga, Beograd-Zagreb. Magalhaes M.L., Segundo A. M., Reis S., Lima L.F.C.J. (2008): Analytica chimica acta,

613:1. Martinović E., Kojić M. (1998): Samonikle vrste voćaka Srbije. Milardović S., Iveković D., Rumenjak V., Grabarić B.S. (2005): Use of DPPH⋅|DPPH Redox

Couple for Biamperometric Determination of Antioxidant Activity, Electroanalysis, 17:1847.

Mimić-Oka J., Simić D., Simić T. (1999): Free radicals in cardiovascular diseases, Facta

Universitatis, Series: Medicine and Biology, 6, 11-22.

Mimić-Oka J., Simić T., Đukanović L., Reljić Z., Davičević Z. (1999): Alteration in plasma antioxidant capacity in various degrees of chronic renal failure, Clinical Nephrology, 51:233.

Mimica-Dukić N., Božin B., Soković M., Mihajlović B., Matavulj M. (2003): Antimicrobial

and antioxidant activities of three mentha species essential oils. Planta Medica, 69: 413-419.

70

NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2003): Performance

standards for anti-microbial susceptibility testing: eleventh informational supplement. Document M100-S11. National Committee for Clinical Laboratory Standard, Wayne, PA, USA.

Percival M. (1998): Antioxidants, Clinical nutrition insights, Advanced Nutrition

Publications. Petrović O., Knežević P., Simeunović J. (2007): Mikrobiologija, skripta za studente

biologije.

Radev, M., Radkov, M., Jočev, S. (1988): Infektiozni bolesti, Medicina i fizkultura, Sofia. Samardžija, D., Damjanović, S., Pogačić, T. (2007): Staphyloccocus aureus u siri.

Mljekarstvo/Dairy, 57: 31-48. Sartoratto, A., Machado, A.L.M., Delarmelina, C., Figueira, G.M., Duarte, M.C.T.,

Rehder, V.L.G. (2004): Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants used in Brazil. Braz J Microbiol. 35: 275–280.

Strohi, A.W., Rouse,H., Fisher, D.B. (2001): Microbiology. Lippincott Williams and

Wilkins, USA. Tadejević V., Jaković V. (1976): Poznavanje robe s osnovama nauke i tehnologije o ishrani. Tatić B., Blečić V. (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka. Tesević V., Nikičević N., Jovanović A., Djoković D., Vujisić Lj., Vučković I., Bonić M.

(2005): Volatile components from old plum brandies. Food Technol Biotechnol 43:367-372.

Van den Dool H, Kratz PD (1963): A generalization of the retention index system including

linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr 11:463-471.

Vitorović D. (1990): Hemijska tehnologija, Naučna knjiga, Beograd.

71

BIOGRAFIJA Ivana Jovanović, rođena je 20. oktobra 1988. u Prokuplju. U Kuršumliji je završila

osnovnu školu „Miloje Zakić“, zatim 2003. godine upisuje srednju školu Gimnaziju, društveno-jezički smer.

Nakon srednje škole, 2007. godine upisuje osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava u roku sa zvanjem „biolog“. Godine 2010. upisuje master akademske studije na smeru Biologija i uspešno ih završava 2012. godine.

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: 14 Document type, DT: Monograph Type of record, TR: Textual / graphic Contents code, CC: Master thesis Author, AU: Ivana Jovanović Mentor, MN: Tatjana Mihajilov-Krstev Title, TI: Antimicrobial and antioxidant activity of alcoholic beverage

obtained from indigenous representatives of flora in Serbia (Malus sylvestris, Fragaria vesca, Sambucus nigra)

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2012 Publisher, PB: Author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 64 p., 7 chapters, 10 photos, 9 tables, 3 charts, 27 literature

citations Scientific field, SF: Biology Scientific discipline, SD: Microbiology Subject/Key words, S/KW: Antimicrobial activity, antioxidant activity, alcoholic beverage,

Malus sylvestris, Fragaria vesca, Sambucus nigra

Holding data, HD: Library Note, N: No Abstract, AB: In this paper was examinated chemical composition, antimicrobial activity and

antioxidant activity of rakija and it’s dry residue obtained by fermentation of fruits of wild strawaberry (Fragaria vesca), wild apple (Malus sylvetris) and elderberry (Sambucus nigra), to look for potential source of natural antimicrobial and antioxidant substances for phitotherapy of infectional diseases. Chemical examination of the resulting rakija was performed using GC and GC/MS analyses. It was concluded that the dominant compounds in rakija were alcohols, esters and carboxylic acids. Antimicrobial tests were carried out with micro-dilution method against pathogens and gastrointestinal and genitourinary tract pathogens that cause the occurrence of wound infection, such as pressure sores. Best antimicrobial activity was showed by rakija and dry remains obtained from elderberry.For antioxidant analyses were used three methods: total reducing power, DPPH-method and ABST-method. The results show that the greatest antioxidant ability has wild strawaberry. The results show that the antimicrobial and antioxidant activity of rakija is based on compounds that make composition of rakija rather than the present ethanol.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Bojan Zlatković, docent, PMF, Niš Member: Nataša Joković, docent, PMF, Niš Member, Mentor: Tatjana Mihajilov-Krstev, docent, PMF, Niš

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: 14 Тип документације, ТД: Mонографска Тип записа, ТЗ: Tекстуални / графички Врста рада, ВР: Mастер рад Аутор, АУ: Ивана Јовановић Ментор, МН: Татјана Михајилов-Крстев Наслов рада, НР:

Антимикробна и антиоксидативна активност алкохолних напитака добијених из аутохтоних представника флоре Србије (Malus sylvestris, Fragaria vesca, Sambucus nigra)

Језик публикације, ЈП: Cрпски Језик извода, ЈИ: Eнглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Ниш Година, ГО: 2012 Издавач, ИЗ: Ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

64 стр., 7 поглавља, 10 слика, 9 табела, 3 графикона, 27 литературних навода

Научна област, НО: Биологија Научна дисциплина, НД: Микробиологија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Антимикробна активност, антиоксидативна активност, алкохолни

напитак, Malus sylvestris, Fragaria vesca, Sambucus nigra Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН: Нема Извод, ИЗ: In this paper was examinated chemical composition, antimicrobial activity and

antioxidant activity of rakija and it’s dry residue obtained by fermentation of fruits of wild strawaberry (Fragaria vesca), wild apple (Malus sylvetris) and elderberry (Sambucus nigra), to look for potential source of natural antimicrobial and antioxidant substances for phitotherapy of infectional diseases. Chemical examination of the resulting rakija was performed using GC and GC/MS analyses. It was concluded that the dominant compounds in rakija were alcohols, esters and carboxylic acids. Antimicrobial tests were carried out with micro-dilution method against pathogens and gastrointestinal and genitourinary tract pathogens that cause the occurrence of wound infection, such as pressure sores. Best antimicrobial activity was showed by rakija and dry remains obtained from elderberry.For antioxidant analyses were used three methods: total reducing power, DPPH-method and ABST-method. The results show that the greatest antioxidant ability has wild strawaberry. The results show that the antimicrobial and antioxidant activity of rakija is based on compounds that make composition of rakija rather than the present ethanol.

Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Бојан Златковић, доцент, ПМФ, Ниш Члан: Наташа Јоковић, доцент, ПМФ, Ниш Члан, ментор: Татјана Михајилов-Крстев, доцент, ПМФ, Ниш

Образац Q4.09.13 - Издање 1