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Maria Izabel Arismendi
Avaliação da timopoiese em crianças e
adolescentes saudáveis mediante determinação
dos níveis de círculos excisados do receptor de
linfócitos T (TRECs) em mononucleares do sangue
periférico
Dissertação apresentada à
Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em
Ciências Médicas
Área de Concentração: Pediatria
Orientadora: Dra. Cristiane Kayser
São Paulo
2011
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Arismendi, Maria Izabel Avaliação da timopoiese em crianças e adolescentes saudáveis mediante determinação dos níveis de círculos excisados do receptor de linfócitos T (TRECs) em mononucleares do sangue periférico / Maria Izabel Arismendi. -- São Paulo, 2011.
Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Programa de Pediatria.
Orientadora: Cristiane Kayser.
Descritores: 1.Genes codificadores dos receptores de linfócitos T 2.Linfócitos T 3.Foxp3 4.Timopoiese 5.Criança
USP/FM/DBD-296/11
iii
Dedico esta tese à minha mãe Susana que apesar de sozinha lutou muito
pela minha educação e valores.
À minha querida avó Beatriz (in memoriam).
Ao Manuel que como um pai me apoiou durante todos os meus estudos.
Ao meu noivo Leonardo pela dedicação, amor e respeito.
À minha querida irmã Karina e ao meu cunhado Elias.
iv
Este trabalho encontra-se inserido no projeto temático “Autoimunidade da
Criança” e recebeu apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo
(Projeto Tématico FAPESP nº2008/58238-4)
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo custeio pessoal durante toda a realização deste projeto
v
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora, Profa. Dra. Cristiane Kayser por seus
ensinamentos, atenção, carinho e paciência em meus primeiros passos como
pesquisadora.
À Profa. Dra. Magda Maria Sales Carneiro-Sampaio pela oportunidade de
trabalhar em conjunto com ICr e pela confiança depositada.
À Profa. Dra. Thelma Suely Okay por ter me recebido em seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Luis Eduardo Coelho Andrade e a Profa. Dra. Neusa Pereira da
Silva por me acolherem na disciplina de Reumatologia.
Ao Prof. Dr. Esper Kallás por ceder seu laboratório.
À Angela e Salma Bahkit por seu apoio e incentivo para a realização deste
Mestrado.
À Dra. Karina Carvalho Salmazi, Bianca Natali, Juliana Apostólico, Priscila e
Dra. Helena pela participação em toda a parte de Citometria de Fluxo.
A todos os meus queridos companheiros do laboratório de Reumatologia,
Átila, Gérson, Marina, Vanessa, Fernanda, Renata, Teresa, Edgar, Sandro,
Natalia, Rossana, Danilo, Silene, Rogério e Silvia pelo apoio, amizade e por
sempre estarem dispostos a me ajudar.
Aos meus colegas de grupo, Fernando, Cintia, Juliana, Thais e Pamela pelo
companheirismo e carinho.
A todos os colegas do LIM-36.
vi
Ao Valdecir Marvulle por seu apoio estatístico.
Aos funcionários da Varpa, pela ajuda na realização das coletas.
A todos os funcionários do ambulatório da Criança e do Adolescente do HSP.
Aos funcionários da ala de Cirurgia Pediátrica do HSP.
A todas as secretárias da Pediatria, em especial Adriana Bezerra da Silva.
vii
Normatização Adotada
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento
desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journal Editors
(Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Sueli Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.
viii
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas e siglas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de gráficos
Resumo
Summary
1 - INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1
1.1 Anatomia do Timo ..................................................................................... 2
1.1.2 Atrofia..................................................................................................... 3
1.2 Maturação e Ativação de Linfócitos T ....................................................... 5
1.2.1 Marcadores de Ativação Celular CD38 e HLA-DR ................................. 9
1.3 Células T Reguladoras ........................................................................... 10
1.4 Rearranjo Somático do Receptor de Linfócitos T (TCR) ......................... 12
1.5 Avaliação da Função Tímica ................................................................... 14
1.6 Imunodeficiências, Autoimunidade e Quantificação dos Níveis de TREC em Patologias Relacionadas à Disfunção de Células T na Infância ............. 16
2 - OBJETIVOS ............................................................................................. 19
3 - MÉTODOS ............................................................................................... 21
3.1 Casuística ............................................................................................... 22
3.2 Dosagem dos níveis de TREC em células mononucleares do sangue periférico ....................................................................................................... 23
3.2.1 Isolamento de células mononucleares ................................................. 23
3.2.2 Extração do DNA genômico ................................................................. 24
3.2.3 Avaliação qualitativa e quantitativa de DNA ......................................... 25
3.2.4 Detecção e quantificação de TREC por PCR quantitativo em tempo real ...................................................................................................................... 26
3.3 Citometria de Fluxo ................................................................................. 30
3.3.1 Congelamento das células mononucleares ......................................... 30
3.3.2 Descongelamento Celular .................................................................... 32
ix
3.3.3 Marcação de superfície para painel de ativação CD3 (ECD), CD4 (APC Cy7), CD8 (PE.Cy7), HLA-DR (PerCP) e CD38 (Pe) .................................... 32
3.3.4 Marcação de intracelular (Foxp3) ........................................................ 34
3.4 Análise Estatística ................................................................................... 36
4 - RESULTADOS ........................................................................................ 37
4.1 Características da Amostra ..................................................................... 38
4.2 Quantificação dos níveis de TREC em células mononucleares do sangue periférico ....................................................................................................... 38
4.2.1 Análise do número de cópias de TREC/µg de DNA de crianças e adolescentes saudáveis ................................................................................ 41
4.2.2 Analise de Correlações entre Valores de TREC e idade ..................... 42
4.3 Análise da expressão de Linfócitos T ..................................................... 44
4.3.1 Analise da Expressão de Linfócitos T CD4+CD38+HLA-DR+, CD8+CD38+HLA-DR+ e CD4+CD25+Foxp3+ .................................................. 47
5 - DISCUSSÃO ............................................................................................ 52
6 - CONCLUSÕES ........................................................................................ 63
7 – ANEXOS ................................................................................................. 65
8 - REFERÊNCIAS ....................................................................................... 70
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
TCR - Receptor de célula T
TREC - Círculos excisados do receptor de células T
MHC - Complexo de histocompatibilidade principal
HIV - Vírus da imunodeficiência humana
Foxp3 - Forkhead box P3
DAIs - Doenças autoimunes
RTEs - Células T recém egressas do timo
IL - Interleucina
APC - Célula apresentadora de antígeno
IPEX - Desregulação imune poliendocrinopatia enteropatia ligada ao X
AIJ - Artrite idiopática juvenil
APECED - Poliendocrinopatia autoimune candidíase distrofia ectodérmica
AIRE - Regulador autoimune
LESJ - Lúpus eritematoso sistêmico juvenil
T1DM - Diabetes mellitus tipo 1
Treg - Células T reguladoras
HLA - Antígeno leucocitário humano
SCID - Deficiência imune severa combinada
rpm - Rotações por minuto
TA - Temperatura ambiente
PBS - Solução salina fosfato
xi
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Imagem microscópica do timo (Setas amarelas: trabéculas fibrosas; setas vermelhas: córtex; seta azul: medula; seta branca: corpúsculos de Hassal). ...................................................................................... 2 Figura 2: Cortes histológicos de (a) timo infantil, e (b) timo de um adulto indicando a substituição da maior parte do tecido tímico por tecido adiposo. .... 3 Figura 3: Redução do volume tímico durante o envelhecimento. ...................... 4 Figura 4: Seleção positiva e negativa de células T.. .......................................... 7 Figura 5: Esquema ilustrativo demonstrando a formação do TREC ................ 13 Figura 6: Gráfico de uma curva padrão com exemplo de regressão linear. A intersecção é igual ao valor hipotético de Ct quando a quantidade de cópias for igual a 0. A inclinação corresponde ao ângulo formado pelo eixo do y e a reta da curva padrão. ........................................................................................ 28 Figura 7: Gráfico de uma reação em tempo real para amplificação do plasmídeo contendo a sequencia do TREC (curva-padrão). A linha horizontal vermelha representa o limiar a partir do qual se estabelece o ciclo de limiar (Ct) .................................................................................................................... 39 Figura 8: Reação de PCR em tempo real para amplificação do TREC em crianças e adolescentes saudáveis, cada linha representa a curva de amplificação de uma amostra. .......................................................................... 40 Figura 9: Curva de dissociação térmica derivada dos produtos de PCR de TREC mostrando Tm com pico único, sem contaminação ou formação de dímeros de primer. ............................................................................................ 40 Figura 10: Análise de Citometria obtida de uma da amostras utilizando o software FlowJo a) seleção de linfócitos CD3+ b) gate de células CD4+ e CD8+ c) - d) seleção de células CD8+ co-expressando HLA-DR e CD38 e) - f) seleção de células CD4+ co-expressando HLA-DR e CD38. ............................ 47 Figura 11: Análise de Citometria obtida de uma das amostras utilizando o software FlowJo a) seleção de linfócitos CD3+ b) gate de células CD4+CD25+ c) histograma demonstrando a % de células CD4+CD25+ expressando Foxp3.48
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Dados demográficos das crianças e adolescentes saudáveis inseridos no estudo. .......................................................................................... 38 Tabela 2: Níveis de TREC/µg DNA de acordo com a faixa etária (média ± desvio padrão): ................................................................................................. 41 Tabela 3: Média e desvio padrão da expressão de CD3, CD4 e CD8 de acordo com a faixa etária em anos. .................................................................. 46 Tabela 4: Média e desvio padrão da expressão de células T ativadas e de células T reguladoras de acordo com a faixa etária em anos. .......................... 48
xiii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Gráfico demonstrando a média dos níveis de TREC/µg DNA conforme a faixa etária. .................................................................................... 42 Gráfico 2: Distribuição dos níveis de TREC/µg DNA conforme a idade........... 42 Gráfico 3: Distribuição dos níveis de TREC/µg DNA em crianças de 0 a 9 anos (n = 47). .................................................................................................... 43 Gráfico 4: Distribuição dos níveis de TREC/µg DNA em crianças e adolescentes de 10 a 18 anos (n = 48). ............................................................ 44 Gráfico 5: Gráfico de dispersão demonstrando a proporção de células T CD3+ por idade (n = 63). ................................................................................... 45 Gráfico 6: Gráfico de dispersão demonstrando a proporção de células T CD4+ por idade (n = 63). ................................................................................... 45 Gráfico 7: Gráfico de dispersão demonstrando a proporção de células T CD8+ por idade (n = 63). ................................................................................... 46 Gráfico 8: Gráfico de dispersão entre células T ativadas (CD4+CD38+HLA-DR+) e idade (n = 63). ....................................................................................... 49 Gráfico 9: Gráfico de dispersão entre células T ativadas e cópias de TREC/µg DNA .................................................................................................. 50 Gráfico 10: Gráfico de dispersão entre células T reguladoras e idade (n = 19). .................................................................................................................... 51 Gráfico 11: Gráfico de dispersão entre células T reguladoras e cópias de TREC/µg DNA (n = 19). .................................................................................... 51
xiv
RESUMO
Arismendi MI. Avaliação da timopoiese em crianças e adolescentes saudáveis mediante determinação dos níveis de círculos excisados do receptor de linfócitos T (TRECs) em mononucleares do sangue periférico [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2011. Introdução: O timo é um órgão linfóide especializado responsável por criar um microambiente propício para a diferenciação e maturação de células T. A quantificação dos níveis de TRECs (círculos excisados durante o rearranjo do TCR) vem sendo utilizada para avaliação e quantificação da função tímica em células do sangue periférico. Estudos que tenham realizado a quantificação dos níveis de TREC em crianças e adolescentes saudáveis brasileiros são escassos na literatura. Objetivo: No presente estudo, avaliamos os níveis de TREC em células mononucleares do sangue periférico associado à análise da expressão de linfócitos T CD3, CD4, CD8, de linfócitos T ativados co-expressando CD38 e HLA-DR e linfócitos T reguladores co-expressando CD25 e Foxp3 em crianças e adolescentes saudáveis em diferentes faixas etárias. Material e métodos: A quantificação dos níveis de sjTREC de DNA genômico em células mononucleares de sangue periférico foi realizada pelo método de PCR quantitativo em tempo real. A concentração de TREC foi expressa em número de cópias de TREC/µg de DNA. A análise da expressão dos marcadores CD3, CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD25 e Foxp3 foi realizada por citometria de fluxo. Resultados: Foram avaliadas 95 crianças e adolescentes, 46 do sexo feminino e 49 do sexo masculino com idades entre 1 e 18 anos. A média do número de cópias de TREC foi de 8,9 ± 3,6 x 104 TRECs/µg DNA. Não encontramos diferença significativa nos valores de TREC entre o sexo feminino e masculino (8,2 ± 3,3 x 104 TRECs/µg DNA vs 9,5 ± 3,9 x 104 TRECs/µg DNA, respectivamente, p = 0,085). Houve uma correlação inversa e significativa entre idade e os níveis de TREC (r = -0,846; p < 0,001), refletindo a já conhecida queda da função tímica com a idade. A expressão de CD3, CD4 e CD8 variou de 45 a 62%, 60 a 65% e 14 a 26%, respectivamente. Não houve correlação significativa entre a proporção de CD3, CD4 e CD8 e a idade dos indivíduos avaliados. Houve uma correlação inversa fraca entre os níveis de linfócitos T ativados expressando CD4+CD38+HLA-DR+ e idade (r = -0,286; p = 0,023), porém não encontramos correlação entre linfócitos T CD8+CD38+HLA-DR+ e idade (r = -0,229; p = 0,072). Houve uma correlação inversa entre os valores de linfócitos T expressando CD4+CD25+Foxp3+ e idade (r = -0,467; p = 0,04). Adicionalmente, encontramos correlação positiva entre a expressão de linfócitos T reguladores e o número de cópias de TREC/µg DNA (r = 0,529; p = 0,02). Conclusão: No presente estudo encontramos uma queda da função tímica com a idade, avaliada pela quantificação dos níveis de TREC em
xv
sangue periférico, que se correlacionaram positivamente com a proporção de células T reguladoras em crianças e adolescentes saudáveis.
Descritores: Genes codificadores dos receptores de linfócitos T. Linfócitos
T. Foxp3. Timopoiese. Criança.
xvi
SUMMARY
Arismendi MI. Assessment of thymopoesis in healthy children and
adolescents by the determination of t cell receptor excision circles (TRECs) in
peripheral blood mononuclear cells [thesis]. São Paulo: Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo; 2011.
Introduction: The thymus is a specialized lymphoid organ that is responsible for providing an exclusive microenvironment for T cell maturation and differentiation. The quantification of TREC (T cell receptor excision circle) has been widely used to evaluate and quantify thymic function in peripheral blood cells. Studies that evaluated TREC levels in Brazilian healthy children and adolescents are scarce in the literature. Objective: In the present study, we evaluated the TREC levels in peripheral mononuclear cells associated with the analysis of CD3, CD4, CD8 T cell markers, and activated T cells co-expressing CD38 and HLA-DR, and regulatory T cells co-expressing CD25 and Foxp3 in healthy children and adolescents in different age groups. Material and Methods: The quantification of sjTREC levels in genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was performed by real time quantitative PCR. TREC concentration was expressed as the number of copies of TREC/µg DNA. The analysis of CD3, CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD25 and Foxp3 expression was performed using flow cytometry methodology. Results: Ninety-five healthy children and adolescents were analyzed, 46 girls and 49 boys. The mean TREC count in PBMC in all individuals was 8.9 ± 3.6 x 104 TRECs/µg DNA. There was no significant difference in the number of TRECs/µg DNA between female and male gender (8.2 ± 3.3 x 104 TRECs/µg DNA vs 9.5 ± 3.9 x 104 TRECs/µg DNA, p = 0.085). There was an inverse correlation between age and TREC counts in PBMC in the 95 individuals (r = -0.846, p < 0.001), reflecting the well-known decrease of thymic function that occurs with age. The expression of CD3, CD4 and CD8 surface markers ranged between 45-62%, 60-65% and 14-26%, respectively. There was no significant correlation between CD3, CD4 and CD8 proportion and age. There was a weak correlation between activated T cells expressing CD4+CD38+HLA-DR+ and age (r = -0.286; p = 0.023), however there was no significant correlation between T cells expressing CD8+CD38+HLA-DR+ and age (r = -0.229; p = 0.072). There was an inverse correlation between T cells expressing CD4+CD25+Foxp3+ and age (r = -0.467; p = 0.04). Additionally, we also found a positive correlation between CD4+CD25+Foxp3+ values and numbers of TREC/µg DNA in all studied individuals (r = 0.529, p = 0.02). Conclusion: In the present study we found a decrease in the thymic function with age, accessed by the quantification of the TREC level in peripheral blood, which was positively associated with the proportion of regulatory T cells.
xvii
Descriptors: T cell receptors encoder genes. T lymphocytes. Foxp3.
Thymopoesis. Child.
1 - Introdução
2
1.1 Anatomia do Timo
Repleto de componentes específicos, o timo é um órgão linfóide
especializado responsável por criar um microambiente propício para a
diferenciação e maturação de células T funcionais1. Localiza-se atrás da
extremidade superior do esterno, na porção anterior do mediastino, próximo
ao coração e grandes vasos da base2. Plenamente desenvolvido, o timo é
uma estrutura lobulada envolta por uma cápsula fibrosa3,4. Cada lóbulo
consiste em duas regiões diferentes: o córtex, caracterizado pela grande
quantidade de linfócitos T imaturos, e a medula, que contém células T em
diferentes estágios de maturação e células epiteliais (Figura 1). Outros tipos
celulares como células B, células do plasma e eosinófilos estão em minoria,
com exceção dos macrófagos que se localizam predominantemente no
córtex, e células dendríticas que podem ser encontradas apenas na medula e
junção cortico-medular. Corpúsculos de Hassal, estruturas formadas por alta
queratinização, repletas de células epiteliais maduras também estão
localizadas na medula do orgão5.
Figura 1: Imagem microscópica do timo (Setas amarelas: trabéculas
fibrosas; setas vermelhas: córtex; seta azul: medula; seta branca:
corpúsculos de Hassal) (Em: www.umdnj.edu).
3
1.1.2 Atrofia
No ser humano, o timo encontra-se plenamente desenvolvido ao
nascimento pesando aproximadamente 10g. A proporção diária de células
que deixam o timo é de 1x109 células em um recém-nascido e 8x106 em uma
criança com 10 anos de idade, já a porcentagem de tecido tímico com
timopoiese ativa em recém-nascidos é de 95% caindo para 80% em uma
criança de 10 anos6.
A partir da puberdade o tecido tímico é lentamente substituído por
tecido fibroso e adiposo. Este processo denominado involução tímica resulta
em quantidades mínimas de tecido medular e cortical no timo adulto7.
(Figura 2).
Figura 2: Cortes histológicos de (a) timo infantil, e (b) timo de um adulto
indicando a substituição da maior parte do tecido tímico por tecido adiposo.
(Rodewald et al. The thymus in the age of retirement. Nature,1996).
Steinmann et al.8, em 1985 apresentaram um estudo sugerindo que a
involução tímica inicia-se ao nascimento e permanece em uma frequência de
3% ao ano até aproximadamente 30 anos, quando diminui para 1% por ano,
estando predisposto a desaparecer totalmente aos 105 anos de idade. Esta
teoria baseia-se na hipótese de que o verdadeiro espaço epitelial
4
responsável pela timopoiese inicia a sua involução a partir do nascimento e
seria outro compartimento, o estroma perivascular, que entraria em processo
de atrofia somente a partir dos 20 anos de idade (Figura 3).
Figura 3: Redução do volume tímico durante o envelhecimento. (Steinmann
et al. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of
puberty. A morphometric study. Scand J Immunol,1985).
Uma característica importante no processo de involução do epitélio
tímico é que o tecido remanescente exibe características histológicas
idênticas no que diz respeito à maturação e proliferação de células T. Bertho
et al.11, em 1997 realizaram análises comparando o epitélio tímico de idosos
e de crianças. Os autores observaram que a proporção de subtipos celulares
era igual nos dois grupos, porém o número total de células T estava reduzido
nas amostras de idosos9-10.
Experimentos realizados principalmente em murinos tentam elucidar
os mecanismos imunológicos associados à atrofia tímica. Tyan ML12, em
1976 apresentou um estudo pioneiro demonstrando que a medula óssea de
camundongos idosos repopulava de forma menos eficiente o timo do que
camundongos jovens, sugerindo que a atrofia tímica pode estar relacionada à
redução de progenitores de células T da medula óssea com o avançar da
5
idade. Nos anos subsequentes, estudos in vitro demonstraram que o número
de precursores celulares comuns da medula óssea de camundongos jovens
era significantemente maior (2.0x103 células) que o número encontrado em
camundongos idosos (1.2x103 células)13.
Alguns fatores envolvidos no processo de involução tímica são:
envelhecimento da população de células T progenitoras; perda da expressão
de determinados peptídeos pelo epitélio tímico; defeitos no rearranjo dos
genes TCRβ; e diminuição na produção de citocinas pelo microambiente
tímico, como a IL-7. A involução tímica pode também ocorrer
secundariamente a outros fatores como quimioterapia, irradiação antes de
transplante, uso de corticorteróides, choque séptico e outras formas de stress
agudo14.
1.2 Maturação e Ativação de Linfócitos T
Os precursores de células T se originam na medula óssea e migram
para o timo, onde ocorrerá a sua maturação. O timo oferece um ambiente
único que produz células capazes de responder a antígenos estranhos no
contexto do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) próprio. Este
microambiente é estabelecido através da integração entre os vários tipos
celulares do estroma e dos timócitos. As células do estroma tímico
constituem um grupo celular diverso, que inclui endotélio, epitélio,
fibroblastos reticulares, macrófagos, células dendríticas e células
neuroendócrinas15. Todas estas células oferecem moléculas de superfície,
6
citocinas e componentes que são fundamentais para o desenvolvimento das
células T16.
A maturação inicial de células T é caracterizada por uma alta atividade
mitótica, resultando em aumento significativo do número de células. A
expressão dos genes do receptor de células T (TCR) é o evento central na
maturação dos linfócitos, indispensável para a geração de um repertório
diversificado e para os processos que asseguram a sobrevivência seletiva
dos linfócitos com especificidades úteis17. Simultaneamente ao rearranjo dos
genes dos receptores, outras proteínas de superfície são expressas, dentre
elas, CD3, CD4 e CD818.
O próximo evento importante na maturação dos linfócitos T é o
reconhecimento de antígenos próprios. Este reconhecimento do antígeno
refere-se ao momento em que os timócitos expressando TCR entram em
contato com o complexo peptídeo-MHC. A seleção positiva refere-se aos
eventos que levam a sobrevivência de linfócitos T que reconhecem
moléculas do MHC I e II próprias19. Os linfócitos que não reconhecem o
complexo apresentado pelo MHC ou os que reconhecem com baixa avidez
sofrem o processo de negligência, enquanto linfócitos T que reconhecem o
complexo com alta avidez passam pela seleção negativa. Somente linfócitos
T que reconheçam o complexo peptídeo MHC de forma intermediária
continuam o processo de maturação20. (Figura 4).
7
Figura 4: Seleção positiva e negativa de células T. (Adaptado de Klein et al.
Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance
induction. Nat Rev Immunol, 2009).
Após a seleção positiva e a formação das linhagens de células T
fenotipicamente maduras, restritas por moléculas de classe II do MHC
(linfócitos CD4+) e classe I do MHC (linfócitos CD8+), os linfócitos T vão para
a medula, onde permanecem durante quatro ou cinco dias, antes de
povoarem a periferia21.
Ao povoarem a periferia os linfócitos T virgens circulam continuamente
pelos órgãos linfóides periféricos. Aqueles que entram em contato com um
antígeno especifico expresso pela superfície de uma célula apresentadora de
antígeno iniciam o processo de expansão clonal, diferenciando-se em células
efetoras capazes de secretar citocinas inflamatórias17. A ativação completa
dos linfócitos ocorre por dois mecanismos, o primeiro pela ativação entre o
contato do TCR e complexo peptídeo-MHC e a segunda estimulação ocorre
8
devido a sinais adicionais produzidos por moléculas acessórias encontradas
na superfície das células apresentadoras de antígenos22.
A ativação dos linfócitos T ocorre em dois contextos diferenciados: por
um lado tem-se a exposição de uma célula T virgem entrando em contato
com um antígeno pela primeira vez e por outro lado a ativação de células T
de memória.
Tratando-se de linfócitos T virgens a ativação estimula a proliferação,
que em seguida promove a produção de IL-2 e por último as células passam
por mecanismos de polarização, transformando-as em células efetoras
capazes de produzir citocinas como IFN-γ e IL-4. Quando células de
memória são ativadas, a produção de citocinas se dá de forma rápida e
eficaz23.
Dependendo da natureza do antígeno encontrado e do impacto de
outras variáveis, as células T CD4+ podem se diferenciar em diversas
linhagens, algumas dessas linhagens mais bem caracterizadas são as
células auxiliadoras tipo 1 (Th1), tipo 2 (Th2) e tipo 17 (Th17)24.
Os linfócitos T que são ativados apenas pelo TCR entram em estado
de anergia, e é imprescindível um segundo sinal mediado pela ligação de
outros receptores de superfície, chamados de moléculas co-estimuladoras. A
via co-estimuladora mais bem caracterizada na ativação das células T
envolve o CD28, que se liga às moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86,
expressas nas APCs ativadas25. Apesar de estudos demonstrarem a
importância da co-estimulação pelo CD28, outros receptores de superfície
9
também possuem função co-estimuladora, dentre eles o CD2, CD5, CD30 e
ICOS (co-estimulador induzível)26,27.
1.2.1 Marcadores de Ativação Celular CD38 e HLA-DR
A glicoproteína CD38 é considerada um marcador de ativação celular.
O CD38 é expresso em células hematopoiéticas jovens, sendo perdido
durante o processo de maturação celular e re-expresso no momento em que
a célula é ativada28. Recém-nascidos expressam altos níveis de CD38,
portanto é esperado que os níveis de CD38 diminuam com o avançar da
idade, indicando o amadurecimento do sistema imune29.
O HLA-DR encontra-se expresso em linfócitos B, monócitos,
macrófagos e células dentríticas em níveis basais, e em linfócitos T e células
NK durante estágios tardios de ativação e por isso tem sido utilizado como
um marcador de ativação de expressão tardia. Níveis aumentados de HLA-
DR em linfócitos T têm sido encontrados em diversas condições inflamatórias
crônicas como o LES30,31. Outro fator importante das moléculas HLA-DR é
sua expressão nas células T reguladoras (Treg), sendo que uma parcela
significativa das células T CD4+CD25+ expressam essa molécula32. Essas
células têm sido recentemente descritas como uma população distinta,
madura e altamente ativa de Treg, caracterizada por uma elevada expressão
de Foxp3. Vale ressaltar que a expressão de HLA-DR é um sinal de ativação
clonal e enquanto está expressa na superfície celular, ela continua tendo a
capacidade de apresentar antígenos33.
10
A marcação dupla para CD38 e HLA-DR tem sido utilizada
principalmente no estudo de crianças com HIV. O aumento da expressão de
marcadores de ativação nos linfócitos reflete uma hiperativação do sistema
imune, e em crianças HIV+ este aumento parece preceder uma depleção
mais importante de linfócitos T CD4+34.
1.3 Células T Reguladoras
A tolerância imunológica aos antígenos próprios é um processo ativo,
regulado por mecanismos centrais e periféricos35. Em meados dos anos 90,
Sakaguchi et al.36, apresentaram um estudo descrevendo uma subpopulação
de células T CD4+ com alta expressão do receptor de superfície IL-2Rα
(CD25), com capacidade de prevenir a autoimunidade.
As células T reguladoras (Treg) fazem parte de um grupo especifico
de células que tem a função de imunoregulação, tanto em humanos, quanto
em animais. Estas células possuem um papel fundamental na regulação da
auto-reatividade, tendo a capacidade de modular respostas autoimunes e
função importante na manutenção da auto-tolerância periférica37,38.
Até o presente momento, não foi identificado um marcador de
superfície único e específico para as células T reguladoras. O CD25 apesar
de ser encontrado nas células Treg pode ser também expresso em células T
CD4+ virgens após rearranjo dos receptores39.
No entanto, juntamente com o CD25, o fator de transcrição Foxp3 tem
sido considerado um marcador intracelular altamente especifico para células
Treg. Em conjunto, o fator de transcrição Foxp3, a citocina IL-2 e o marcador
11
CD25 são essenciais para o desenvolvimento, função e sobrevivência das
Treg40.
Em murinos as Treg constituem uma população distinta de células
CD25high, que compreendem 5-10% das células CD4+. Em humanos, pouco
mais de 10% da linhagem de CD4+ expressam CD25, mas somente 1-2%
expressam CD25high,que são as células com função supressora41. As Treg
exercem função supressora em repostas imunes contra vários antígenos
externos, aloantigenos, além de antígenos tumorais42.
A contribuição das células Treg no controle da auto-imunidade pode
ser ilustrada pelo desenvolvimento de doenças autoimunes após a depleção
de Treg em murinos, e em humanos, os quais desenvolvem doenças
autoimunes graves na presença de mutação do gene Foxp3, como a
síndrome autoimune denominada IPEX (desregulação imune,
poliendocrinopatia, enteropatia, síndrome ligada ao X)2,43.
Outros estudos demostram que essa população de células é capaz de
suprimir a proliferação de células T CD4+ e CD8+ impedindo a produção de
citocinas tais como a IL-2, importantes para o crescimento e proliferação de
células T. Além disso, as células Treg expressam também a molécula CTLA-
4 (controlada pelo gene Foxp3), que é responsável por inibir a ativação de
células T41,43.
O possível potencial das células Treg de manterem a homeostase do
sistema imunitário e dessa forma se tornarem uma alternativa no tratamento
de doenças auto-imunes, é a principal motivação para estudos com células
Treg32.
12
1.4 Rearranjo Somático do Receptor de Linfócitos T (TCR)
Na maioria das células T, o TCR é um heterodímero, composto de
duas cadeias polipeptídicas, transmembrânicas, designadas de α e β ligadas
covalentemente entre si por pontes dissulfeto. Estas cadeias tem como
função reconhecer os complexos peptídicos ligados as moléculas do MHC44.
Os genes do TCR estão em uma configuração germinativa não-funcional que
se caracteriza pela separação espacial dos segmentos gênicos variável (V),
juncional (J), constante (C) e de diversidade (D) do cromossomo e passam
por um rearranjo gênico para que fiquem devidamente ordenados.
Primeiramente ocorre o rearranjo dos segmentos Dβ a Jβ, e em seguida o
rearranjo Vβ a DJβ.As sequências de DNA que se encontram entre os
elementos que sofreram o rearranjo são eliminadas e o primeiro transcrito
incorpora o gene responsável pelo domínio constante. Tem-se como
resultado a formação do segmento Vβ–Dβ-Jβ–Cβ. O rearranjo da cadeia α
ocorre após o rearranjo da cadeia β, gerando por fim o gene do TCRαβ,
expresso na maioria dos linfócitos T17.
13
Figura 5: Esquema ilustrativo demonstrando a formação do TREC (Kayser
C. Análise quantitativa de círculos excisados pelo rearranjo dos genes do
receptor de linfócitos T (TREC) no Lúpus Eritematoso Sistêmico, 2007).
O segmento δ que se localiza dentro do locus do TCR-α é excisado
durante o rearranjo gênico, formando círculos epissômicos chamados TRECs
(círculos excisados durante o rearranjo do TCR). Os dois eventos sucessivos
de rearranjo que ocorrem durante este processo são idênticos em
aproximadamente 70% das células Tαβ, o primeiro produzindo o chamado
“signal-joint” (sjTREC) e o segundo gerando o “coding-joint” (cjTREC)45. A
figura 5 mostra de forma esquemática a produção do sjTREC e cjTREC.
O TREC é relativamente estável e não se duplica durante a mitose,
sendo, portanto, diluído durante a proliferação e morte celular. A proporção
de células portadoras de TREC na periferia é influenciada pelo influxo de
células do timo e por eventos periféricos no pool de células T46.
O influxo de emigrantes tímicos recentes do timo é responsável por
manter o equilíbrio das células T na periferia e a perda da função tímica
14
decorrente do envelhecimento parece ser um fator importante para que
ocorra uma desregulação imune47,48.
1.5 Avaliação da Função Tímica
Diversos métodos podem ser utilizados para o estudo do timo. A
avaliação do volume tímico pelo raio-x simples ou tomografia
computadorizada são ferramentas que fornecem dados sobre a anatomia do
órgão, mas a sua função imunológica não pode ser avaliada desta maneira.
A análise de células T que expressam em sua superfície o fenótipo de
células T virgens (CD4+CD45RA+) pode ser utilizada como uma forma
indireta de se quantificar a função tímica, mas esta é considerada uma
medida imprecisa, pois estas células possuem a capacidade de se converter
rapidamente em células de memória. A avaliação da função tímica mediante
quantificação dos círculos excisados dos receptores de linfócitos T (TREC)
permite a avaliação nos níveis de emigrantes tímicos recentes no pool
periférico de linfócitos, auxiliando no estudo da fisiopatogenia de patologias
auto-imunes e imunodeficiências49,50.
Douek et al.51, em 1998 apresentaram um estudo pioneiro no qual os
níveis de TREC foram analisados em pacientes com HIV e indivíduos
saudáveis. Os pacientes com HIV apresentaram níveis de TREC diminuídos
em sangue periférico em comparação aos indivíduos saudáveis. O estudo
também demonstrou que após terapia com anti-retrovirais os níveis de TREC
aumentaram significantemente, indicando que o timo pode contribuir para a
reconstituição do sistema imune após tratamento.
15
Mais recentemente diversos autores vem utilizando o método de
quantificação dos níveis de TREC para avaliação da função tímica no sangue
periférico em diferentes condições. Além da utilização como marcador da
função tímica durante infecção e tratamento pelo HIV a dosagem dos níveis
de TREC tem sido utilizada para avaliação da reconstituição de células T
após transplante alogênico de células tronco, de medula óssea e de cordão
umbilical52-55. Além disso, estudos realizados em adultos com doenças auto-
imunes como o lúpus eritematoso sistêmico demonstram uma diminuição dos
níveis de TREC em sangue periférico desses pacientes em comparação com
adultos saudáveis56.
Poucos estudos avaliaram os níveis de TREC em sangue periférico de
crianças saudáveis. Esses estudos mostram que os níveis de TREC
encontram-se aumentados nos primeiros anos de vida, refletindo uma
elevada timopoiese na infância, e sofrem declínio progressivo com a
idade53,57,58. Em um estudo realizado com 532 pessoas saudáveis desde o
nascimento até os 95 anos de idade os autores demonstraram que os níveis
de TREC sofrem um declínio gradual durante os 15 primeiros anos de vida e
um declínio mais importante após os 20 anos de idade53.
Observa-se ainda, algumas diferenças entre os níveis de TREC em
indivíduos saudáveis da mesma idade, demonstrando que fatores genéticos
e individuais podem influenciar na função tímica59.
Deve-se lembrar também que a frequência do TREC em linfócitos
periféricos pode ser afetada não só pela produção do timo, mas também por
processos como ativação e proliferação periférica de linfócitos T e apoptose
16
celular. Neste sentido, é aconselhável que alguns fatores sejam levados em
consideração e analisados juntamente com o número de cópias de TREC,
como a ativação e proliferação celular, que diluem os níveis totais de TREC
no pool periférico de linfócitos T46,60.
1.6 Imunodeficiências, Autoimunidade e Quantificação dos Níveis de
TREC em Patologias Relacionadas à Disfunção de Células T na Infância
Durante as duas primeiras décadas da vida, as doenças autoimunes
(DAIs) mais comumente identificadas são as tireoidopatias, diabetes mellitus
tipo 1, artrite idiopática juvenil (AIJ), doença celíaca, púrpura
trombocitopênica imune, lupus eritematoso sistêmico juvenil (LESJ) e
hepatite autoimune.
Conceitos mais atuais sugerem que as doenças autoimunes não são
causadas por um único autoantígeno e sim como resultado da disfunção do
sistema imunológico periférico em seus mecanismos de tolerância e de
homeostase. Admite-se também que a interação entre fatores genéticos e
ambientais constitua a base da patogenia das DAIs60.
O diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) é uma doença autoimune crônica
que envolve células T auto-reativas que acabam por agredir células
produtoras de insulina das ilhotas de Langerhans no pâncreas. Estudos
mostram que a etiologia da doença parece estar relacionada à seleção
positiva de células T auto-reativas durante o seu desenvolvimento no timo61.
Recentemente Hofer et al.62, em 2009 quantificaram os níveis de cópias de
TREC e de células T virgens em crianças com T1DM de início recente e de
17
longa duração. Os autores encontraram níveis diminuídos de células T CD4+
CD45RA+ em todos os pacientes. Já os níveis de TREC apresentaram-se
diminuídos em crianças com T1DM de inicio recente e curiosamente mais
elevados em crianças com doença de longa duração. Uma hipótese para
explicar estes resultados seria a de que a insulina poderia induzir a produção
de células T pelo timo em pacientes com T1DM. Estudos realizados em
murinos demonstraram que a insulina pode ser um fator de estimulação e
crescimento extremamente importante do timo63.
Já Horvath et al.64, em 2010 avaliaram o número de cópias de TREC
em pacientes com artrite idiopática juvenil (AIJ) em atividade e em controles
saudáveis. Os níveis de TREC nos pacientes com AIJ (4,90 x 104 TRECs/µg
de DNA) foram significantemente menores do que nos controles saudáveis
(10,45 x 104 TRECs/µg de DNA).
Em outro estudo realizado na Áustria, Prelog et al.65, em 2008 também
demonstraram níveis reduzidos de cópias de TREC em pacientes com AIJ
quando comparados a controles saudáveis da mesma idade, além de
diminuição acelerada dos níveis de CD4+, CD45RA+, CD62L+ com a idade,
refletindo a diminuição da capacidade do timo de produzir RTEs.
Uma grande variedade de mecanismos moleculares parece ter
participação no desenvolvimento de imunodeficiências. Comumente os
defeitos moleculares presentes em quadros de imunodeficiências resultam
em depleção dos linfócitos T circulantes, com envolvimento ou não de
linfócitos B e/ou células NK66,67.
18
Destacam-se como exemplos, a Síndrome de DiGeorge, uma doença
que envolve a deleção do cromossomo 22q.11, resultando em alterações na
embriogênese do timo e a APECED que está relacionada a defeitos na
expressão do gene AIRE e resulta de um defeito no processo de indução de
tolerância central aos auto-antígenos2,68.
Recentemente em nosso serviço Fomin et al.58, em 2010,
quantificaram o número de cópias de TREC em sangue periférico de 12
crianças e adolescentes portadores da síndrome de DiGeorge em
comparação com controles saudáveis. O número de cópias de TREC estava
reduzido (3272,5 TRECs/µg de DNA) em relação aos indivíduos saudáveis
(25691,6 TRECs/µg de DNA). Além disso, observou-se maior expressão de
marcadores de ativação linfocitária no grupo de pacientes com síndrome de
DiGeorge em comparação com os controles58.
Apesar de alguns estudos avaliarem os níveis de TREC em crianças e
adolescentes, entendemos que estudos mais amplos, avaliando os níveis de
TREC e de determinadas subpopulações de linfócitos T em crianças
brasileiras, principalmente nos primeiros anos de vida, fazem-se necessários.
No presente estudo, pretendemos quantificar o número de cópias de TREC
em células mononucleares do sangue periférico em crianças e adolescentes
de várias faixas etárias associado à avaliação de marcadores de ativação
celular e de células T reguladoras. Destacamos que este projeto encontra-se
inserido em um estudo mais amplo sobre a Autoimunidade da Criança
(Projeto Tématico FAPESP nº2008/58238-4).
2 - Objetivos
20
- Avaliar a timopoiese em crianças e adolescentes saudáveis mediante
a determinação dos níveis de TREC no pool de células mononucleares de
sangue periférico em crianças e adolescentes saudáveis de diversas faixas
etárias.
- Realizar a determinação da proporção de linfócitos T CD3, CD4, e
CD8, de linfócitos T ativados (CD4+CD38+HLA-DR+ e CD8+CD38+HLA-DR+),
e de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+), explorando possíveis
correlações com os níveis de TREC.
3 - Métodos
22
3.1 Casuística
Foram inseridas neste estudo 95 crianças e adolescentes clinicamente
saudáveis de 0 a 18 anos. Os participantes eram provenientes do
ambulatório de Puericultura do Hospital São Paulo ou estavam realizando
exames pré-operatórios para cirurgias de baixa complexidade, como
postectomia ou hérnia inguinal. Também foram incluídos filhos de
funcionários do Hospital. Os responsáveis pelos participantes assinaram o
Termo ético livre e esclarecido, previamente aprovado pelo Comitê de Ética
do Hospital das Clínicas (ANEXOS 1 e 2).
� Critérios de Inclusão:
• Crianças e adolescentes com idade entre 0 e 18 anos;
• Assinatura do representante legal no termo de consentimento.
� Critérios de Exclusão:
• Timectomia prévia;
• Infecções virais ou bacterianas intercorrentes;
• Uso de medicações;
• Positividade em alguma das respostas do questionário “10 Warning
Signs of Primary Immunodeficiency”, Jeffrey Modell Foundation
(ANEXO 3).
23
3.2 Dosagem dos níveis de TREC em células mononucleares do sangue
periférico
3.2.1 Isolamento de células mononucleares
As células mononucleares do sangue periférico foram isoladas por
gradiente de centrifugação em Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Bio-
Sciences, Uppsala, Suécia) na densidade de 1.077g/mL. A técnica baseia-se
na separação celular dependente da densidade mediante centrifugação.
Após a centrifugação os linfócitos, monócitos e plaquetas formam uma
camada com aspecto de “nuvem” entre o plasma sanguíneo e o Ficoll-Paque
Plus. A técnica foi realizada mediante o seguinte protocolo:
- Coletar 10 mL de sangue em tubo com anticoagulante EDTA (ácido
etilênico tetra acético);
- Homogeneizar o sangue e diluí-lo em PBS estéril (solução salina
tamponada com fosfato, pH: 7,4) utilizando tubo cônico com capacidade para
50 mL, na concentração de 1:2;
- Colocar cuidadosamente 10 mL da diluição em um novo tubo cônico
com capacidade para 15 mL contendo 3 mL do reagente de separação
celular Ficoll Paque-Plus;
- Centrifugar a 1.800 rpm durante 30 minutos em temperatura
ambiente (TA);
- Verificar a formação da nuvem de células mononucleares, coletá-la
com pipeta Pasteur estéril transferindo-a para um novo tubo cônico (15 mL);
- Realizar dois procedimentos de lavagem, completando o volume do
tubo para 10 mL com PBS, com as condições de 2.000 rpm durante 10
24
minutos em TA, em todos os procedimentos de lavagem o sobrenadante foi
descartado e o pellet desfeito;
- Armazenar o pellet celular em 2 alíquotas, a primeira em um tubo
cônico (1,5 mL) para posterior extração de DNA em freezer -20ºC
- Armazenar o segundo pellet para realização dos procedimentos de
Citometria de Fluxo. As etapas preparatórias de contagem celular e
congelamento serão posteriormente descritas.
3.2.2 Extração do DNA genômico
A técnica foi realizada mediante protocolo “salting-out” disponível no
Laboratório de Investigação Médica LIM-36:
- Descongelar e ressuspender o pellet obtido durante a separação de
células mononucleares em 3 mL do reagente núcleo lysis (10 mM Tris-HCl,
0.4 M NaCl, 2 mM EDTA, pH 8.2)
- Submeter o tubo (15 mL) à agitação vigorosa em vortex para lise
nuclear;
- Acrescentar 5 µL de proteinase K (Life Technologies, Gaithersburg,
MD, EUA ) e 300 µL de SDS 10% (Life Technologies, Gaithersburg, MD,
EUA) a parede do tubo;
- Misturar o tubo cônico cuidadosamente por inversão e vedá-lo com
microfilme;
- Transportar e manter o tubo em banho Maria durante 24 horas a
37ºC;
25
- Após tempo apropriado acrescentar 1 mL de NaCl 6M (Cloreto de
Sódio 6M) ao tubo;
- Agitar vigorosamente para lise nuclear durante 15 segundos ou até
que a solução adquira aspecto leitoso;
- Centrifugar o tubo em centrifuga refrigerada, nas condições de 4ºC
durante 20 minutos a 2.500 rpm;
- Transferir o sobrenadante para outro tubo cônico (15 mL) e realizar
nova centrifugação nas mesmas condições, porém durante 15 minutos;
- Transferir o sobrenadante para outro tubo cônico (15 mL) contendo
duas vezes o volume de etanol absoluto, onde um emaranhado viscoso pode
ser observado;
- “Pescar” o DNA com o auxilio de uma pipeta e transferi-lo para um
tubo cônico de 1,5 mL;
- Acrescentar 500 µL de etanol 70% ao tubo (1,5 mL);
- Realizar centrifugação a 13.500 rpm durante 5 minutos a 4ºC;
- Ao término da centrifugação deixar os tubos abertos para secagem;
- Após secagem acrescentar 300 µL de TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM
EDTA, pH 7.5) para armazenamento.
3.2.3 Avaliação qualitativa e quantitativa de DNA
Para quantificação e verificação do grau de pureza do DNA foi
utilizado o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies,
Wilmington, Delaware, USA) em comprimento de onda de 260nm e 280nm.
26
Todas as amostras apresentaram grau de pureza adequado, estabelecido
pela relação da leitura a 260nm e 280nm, entre 1,8 e 2,0.
3.2.4 Detecção e quantificação de TREC por PCR quantitativo em tempo
real
A quantificação da concentração do TREC foi determinada pelo
método de PCR quantitativo em tempo real, utilizando o equipamento
RotorGene-3000 (Corbett Research Pty Ltd, Sydney, Austrália).
O princípio do método de PCR em tempo real está baseado na
detecção da fluorescência da amostra enquanto o DNA alvo é amplificado. O
agente fluorescente SYBR Green é incorporado às cadeias de dupla fita de
DNA à medida que estas vão sendo geradas. As moléculas de SYBR Green
são irradiadas por diodos (LEDs) sendo capazes então de emitir
fluorescência. Durante as fases iniciais da PCR tem-se o denominado “ruído
de fundo”; trata-se da emissão de baixa fluorescência não específica. A partir
do momento em que a fluorescência da amostra ultrapassa o ruído de fundo
temos a fase exponencial da reação e o acúmulo do produto de PCR
denominado Ct (threshold cycle) ou “ciclo limiar”. O Ct é determinado durante
a fase exponencial da reação de PCR, pois nesta fase os reagentes não se
encontram limitados e a amplificação ocorre de forma uniforme e
reprodutível. O aumento exponencial do número de cópias ocorre até um
determinado número de ciclos, que será padronizado e variável de reação
para reação.
27
Para a quantificação do número de cópias de TREC/µg DNA, uma
curva-padrão foi construída utilizando um fragmento de 376bp da sequência
do sjTREC clonado no plasmídeo pCR II-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, USA)
(gentilmente cedido por Ephraim Hochberg, Harvard Medical School, Boston,
Massachussetts). Os plasmídeos liofilizados foram ressuspendidos em água
e utilizados para transformar células competentes (E. coli DH5a) de acordo
com o protocolo descrito por Kayser et al. (2004).
A curva-padrão incluiu sete concentrações sucessivas do número de
cópias do plasmídeo contendo a sequencia do sjTREC (1x108 a 1x102
cópias/µL). A média dos valores de Ct obtida em escala logarítmica foi
correlacionada com o número de cópias de plasmídeos sjTREC de cada
diluição.
O número de cópias de TREC/µg DNA para cada amostra foi obtido
pela interpolação linear dos valores de Ct da amostra na curva de valores de
Ct obtidos com a série de diluições padrão, calculado a partir da seguinte
fórmula:
y = Ax+B
Onde:
y = Ct da amostra
A = Inclinação (slope)
B = Intersecção
28
A intersecção é igual ao valor hipotético de Ct quando a quantidade de
cópias for igual a 0. A inclinação corresponde ao ângulo formado pelo eixo do
y e a reta da curva-padrão, conforme abaixo (Figura 6).
Intersecção = 34,797
Figura 6: Gráfico de uma curva padrão com exemplo de regressão linear. A
intersecção é igual ao valor hipotético de Ct quando a quantidade de cópias
for igual a 0. A inclinação corresponde ao ângulo formado pelo eixo do y e a
reta da curva padrão.
A PCR em tempo real foi realizada utilizando-se, para um volume total
de 25µL: 60ng de DNA de cada amostra, 500nM de cada primer (senso e
anti-senso) e 12,5µL de reagente SYBR Green (DyNAmo SYBR Green qPCR
Kit F400L – Finnzymes, Finlândia). Os primers utilizados para a reação de
PCR para sjTREC foram; senso 5’-CCCTTTCAACCATGCTGACA-3’, anti-
senso 5’-AGGTGCCTATGCATCACCGT-3’. O tamanho do produto gerado foi
de 74bp.
29
As condições de ciclagem da PCR foram: 10 minutos a 95ºC, seguidos
de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC, e 30 segundos a 72ºC por 45
ciclos consecutivos. Os ensaios foram realizados em duplicata em um rotor
de 36 cavidades incluindo a série de diluições do padrão do TREC
plasmidial.
Reações utilizando primers para a ß-actina (400nM para cada primer e
50ng de DNA) foram realizadas com todas as amostras, nas mesmas
condições que as reações para TREC. Os primers utilizados foram: senso 5’-
AAGATGACCCAGGTGAGTGG-3’,anti-senso 5’-GGCAGAGAAGAGAACCA-
3’.
Ao término de toda reação uma curva de dissociação do produto de
PCR foi analisada. A curva consiste em variações crescentes de temperatura
(de 72ºC a 95ºC), de grau em grau, por 20 segundos em cada temperatura,
com monitoramento da fluorescência. A temperatura de dissociação (Tm) do
produto de PCR é um dado fundamental para avaliação da qualidade e
especificidade da reação.
30
3.3 Citometria de Fluxo
A citometria de fluxo propicia a análise de células de forma rápida e
multiparamétrica, a informação obtida pode ser tanto qualitativa quanto
quantitativa como no PCR Real Time. O método fornece características
ópticas e fluorescentes de uma única célula (ou outras partículas como
beads de látex). As propriedades físicas da célula, como tamanho e
complexidade interna podem diferenciar a população celular a ser estudada.
Anticorpos conjugados com partículas fluorescentes se ligam a diferentes
proteínas de superfície ou intracelulares.
Para que sejam analisadas pelo citômetro de fluxo, as células
conjugadas são mantidas em um meio aquoso isotônico e passam
individualmente por fontes de luz, os fluorocromos são então excitados e
quando retornam ao seu estado basal liberam energia em forma de cor. O
uso de diversos fluorocromos emitindo diferentes cores propicia a análise de
inúmeros parâmetros ao mesmo tempo.
Todos os procedimentos de citometria de fluxo, exceto o isolamento
de células mononucleares foram realizados no Laboratório LIM-60. O
aparelho utilizado para aquisição foi o FACS Canto II da BD com 8 cores e
10 parâmetros. As análises foram realizadas utilizando o software FlowJo.
3.3.1 Congelamento das células mononucleares
O congelamento celular das células mononucleares de sangue
periférico (CMSP) foi realizado mediante protocolo disponível no Laboratório
LIM-60 com algumas modificações:
31
- Desprender o pellet obtido durante a separação celular em 2 mL de
PBS;
- Preparar em um tubo cônico (1,5 mL) 90 µL de azul de tripan (0,1%);
- Acrescentar ao tubo cônico (1,5 mL) 10 µL da suspensão celular;
- Realizar contagem celular;
- A contagem foi realizada em quatro quadrantes e foi obtida uma
média de células de cada amostra. Para tal os seguintes cálculos foram
realizados:
- Média da contagem de quatro quadrantes (soma dos 4 quadrantes e
divisão pelos 4) x 10 (valor da diluição do Azul de Tripan) x 2 (volume onde
as células foram ressuspendidas) x 104 (valor de correção da Câmara de
Neubauer). A concentração de células padrão para PBMC é de 1 x 106
células por 1 mL de meio de congelamento.
- Enquanto as células estão sendo contadas, centrifugar novamente a
suspensão celular a 2.000 rpm durante 10 minutos em TA;
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de
congelamento, na proporção de 1 mL de meio para cada milhão de células.
- Foram armazenados 2 criotubos com capacidade para 2 mL
contendo 1 x 106 de células. Os criotubos foram armazenados primeiramente
em freezer -20ºC durante 24 horas, depois foram transferidos para freezer -
80ºC durante 1 semana e posteriormente para N2 (Nitrogênio líquido) até a
realização dos procedimentos.
32
3.3.2 Descongelamento Celular
O descongelamento celular foi realizado mediante protocolo disponível
no Laboratório LIM-60:
- Descongelar rapidamente o criotubo com a amostra selecionada
mediante agitação gentil em banho Maria a 37ºC;
- Gotejar 1 mL de meio de cultura R10 (Meio de cultura RPMI 1640
Gibco suplementado com Soro Fetal Bovino, tampão Hepes, L-glutamina
200mM, Penicilina/Stretopmicina 100x, Mercaptoetanol 55mM, Piruvato de
Sódio 100mM, Life Technologies, Invitrogen) ao criotubo e transferir todo o
conteúdo para um tubo cônico (15 mL) contendo 10 mL de R10 gelado;
- Centrifugar o criotubo em 2.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos;
- Após obtenção do pellet, ressuspendê-lo em 2 mL de R10 e realizar
contagem celular com os mesmos parâmetros descritos no protocolo de
congelamento celular;
- Partindo da concentração celular encontrada, calcular a quantidade
da suspensão que será utilizada durante a marcação celular.
3.3.3 Marcação de superfície para painel de ativação CD3 (ECD), CD4
(APC Cy7), CD8 (PE.Cy7), HLA-DR (PerCP) e CD38 (Pe)
A técnica foi realizada mediante protocolo do Laboratório LIM-60. Para
o painel de ativação foram utilizados os seguintes anticorpos: CD3 (ECD –
Beckman Coulter), CD4 (APC.Cy7 – BD Pharmigen), CD8 (PE.Cy7 - BD),
HLA-DR (PerCP - BD) e CD38 (Pe - BD).
33
- A marcação foi realizada em placas de fundo “V”. Foram utilizadas
500.000 células por amostra de controle;
- Foram transferidos 100 µL da suspensão celular para cada cavidade
da placa (o número de cavidades depende da quantidade de amostras);
- Centrifugar a placa com as seguintes condições, 1.500 rpm a 4ºC
durante 5 minutos para formação do pellet;
- Descartar o sobrenadante;
- Acrescentar 170 µL de MACS Buffer (0,5% Albumina Soro Bovina e
EDTA 2mM);
- Realizar nova centrifugação para lavagem e obtenção do pellet;
- Os monoclonais foram pipetados de acordo com a padronização
ideal obtida no laboratório LIM-60, sendo que o volume total de cada
cavidade foi estabelecido em 50 µL. Foram pipetados: 1 µL de CD3 ECD, 2
µL de CD4 APC Cy7, 2 µL de CD8 PE Cy7, 5 µL de HLA-DR PerCP, 5 µL de
CD 38 Pe, totalizando 15 µL;
- Adicionar a cada cavidade 35 µL de MACS Buffer para obtenção do
volume final de 50 µL;
- Ao término da pipetagem manter a placa em geladeira ao abrigo da
luz durante 30 minutos;
- Centrifugar a 1.500 rpm a 4ºC durante 30 minutos para
sedimentação;
- Adicionar 170 µL de MACS Buffer em todas as cavidades;
- Realizar homogeneização manual em cada cavidade e em seguida, 2
lavagens a 1.500 rpm a 4ºC durante 30 minutos;
34
- Ao término do procedimento acrescentar 100 µL de Paraformoldeído
a 1%
- Transferir o conteúdo de todas as cavidades para microtubos de
citometria, a caixa foi mantida em geladeira ao abrigo da luz até a leitura.
Para cada amostra foram adquiridos 500 mil eventos.
3.3.4 Marcação de intracelular (Foxp3)
Para a marcação intracelular foi utilizado o kit da empresa eBioscience
(Treg Kit) contendo PE Foxp3 PCH101, FITC CD4 e APC CD25. O protocolo
utilizado foi o recomendado pelo fabricante:
- A marcação foi realizada em placas de fundo “V”. Foi utilizado o valor
de 1.000.000 células por amostra de controle;
- Adicionar 20 µL do coquetel CD4/CD25 em cada cavidade;
- Incubar a placa em geladeira durante 30 minutos ao abrigo da luz;
- Realizar procedimento de lavagem com MACS Buffer;
- Ressuspender o pellet e acrescentar 1 mL do tampão de
permeabilização fornecido pelo kit a cada cavidade;
- Homogeneizar em vortex e levar novamente para incubação durante
60 minutos em geladeira ao abrigo da luz;
- Realizar dois procedimentos de lavagem a 1.500 rpm a 4ºC durante
30 minutos;
- Acrescentar 100 µL da solução de bloqueio fornecida pelo kit em
cada cavidade durante 15 minutos;
- Acrescentar 20 µL do marcador intracelular Foxp3;
35
- Armazenar a placa em geladeira ao abri da luz durante 30 minutos;
- Realizar novo procedimento de lavagem a 1.500 rpm a 4ºC durante
30 minutos;
- Realizar leitura, sendo que para cada amostra foram adquiridos
1.000.000 de eventos.
36
3.4 Análise Estatística
A análise descritiva foi feita por gráficos e tabelas com dados isolados,
média, mediana e desvio padrão. A averiguação de possível distribuição
normal do número de cópias de TREC/µg DNA foi feita pelo teste de
Kolmogorov-Smirnov. Para comparação entre variáveis quantitativas foi
utilizado o teste de Mann-Whitney. O método de correlação de Spearman foi
utilizado para avaliar a correlação entre o número de TREC/µg DNA e
expressão dos diversos marcadores de linfócitos T estudados e variáveis
quantitativas. Para todas as análises o valor de significância menor que 0,05
foi considerado.
4 - Resultados
38
4.1 Características da Amostra
Foram incluídas 95 crianças e adolescentes saudáveis, de ambos os
sexos (46 do sexo feminino e 49 do sexo masculino), com 1 a 18 anos de
idade. Como pode ser apreciado na Tabela 1 a maioria das crianças
encontrava-se na faixa etária dos 4 aos 12 anos de idade.
Tabela 1: Dados demográficos das crianças e adolescentes saudáveis
inseridos no estudo.
Controles Meninos Meninas
1-3 anos 6 5 1
4 – 6 anos 17 10 7
7 – 9 anos 24 13 11
10 – 12 anos 27 13 14
13 -15 anos 9 4 5
16 -18 anos 12 4 8
Sexo (♂/♀) 95 49 46
4.2 Quantificação dos níveis de TREC em células mononucleares do
sangue periférico
Na figura 6 podemos observar a curva de amplificação de 7 diluições
sucessivas do plasmídeo contendo a sequência de TREC (1x102, 1x103,
1x104, 1x105, 1x106, 1x107 e 1x108 cópias/µL) em uma das reações.
39
Figura 7: Gráfico de uma reação em tempo real para amplificação do
plasmídeo contendo a sequencia do TREC (curva-padrão). A linha horizontal
vermelha representa o limiar a partir do qual se estabelece o ciclo de limiar
(Ct)
para cada amostra.
Na figura 8 observamos uma curva de amplificação de uma das
reações e na figura 9 uma curva de dissociação térmica derivada de uma
reação para amplificação do TREC realizada com o DNA de crianças e
adolescentes saudáveis.
40
Figura 8: Reação de PCR em tempo real para amplificação do TREC em
crianças e adolescentes saudáveis. Cada linha representa a curva de
amplificação de uma amostra.
Figura 9: Curva de dissociação térmica derivada dos produtos de PCR de
TREC mostrando Tm com pico único, sem contaminação ou formação de
dímeros de primer.
A eficiência das reações de PCR em tempo real variou entre 0,90 e
0,98, a inclinação (slope) variou entre -3,379 e -3,593, com uma correlação
(R2) sempre superior a 0,99.
41
4.2.1 Análise do número de cópias de TREC/µg de DNA de crianças e
adolescentes saudáveis
A variável de TREC não foi considerada como tendo distribuição
normal (teste de Kolmogorov-Smirnov). A média do número de cópias de
TREC em células mononucleares do sangue periférico em crianças e
adolescentes saudáveis foi de 8,9 x 104 TRECs/µg DNA, mediana de 7,3x104
TRECs/µg DNA e desvio padrão de 3,6 x 104 TRECs/µg DNA.
Não encontramos diferença significativa nos valores de TREC entre o
sexo feminino e masculino (8,2 ± 3,3 x 104 TRECs/µg DNA versus 9,5 ± 3,9 x
104 TRECs/µg DNA, respectivamente) (p = 0,085).
Conforme os resultados apresentados na Tabela 2 e Gráfico 1 os
níveis de TREC foram maiores em crianças com 1-3 anos de idade (p <
0,001). Observamos uma queda contínua dos níveis de TREC nos indivíduos
estudados.
Tabela 2: Níveis de TREC/µg DNA de acordo com a faixa etária (média ±
desvio padrão):
Idade
TREC/µg DNA (Média±DP)
1-3 anos 183.883 ± 21.452
4-6 anos 125.236 ± 24.077
7-9 anos 82.218 ± 15.089
10-12 anos 70.437 ± 7.655
13-15 anos 69.430 ± 5.860
16-18 anos 53.506 ± 12.514
42
Gráfico 1: Gráfico demonstrando a média dos níveis de TREC/µg DNA
conforme a faixa etária.
4.2.2 Analise de Correlações entre Valores de TREC e idade
Como podemos observar no Gráfico 2 houve forte correlação inversa
entre a idade e os níveis de TREC em células LMNs (r = -0,846 p < 0,001),
refletindo a conhecida queda da função tímica com a idade.
Gráfico 2: Distribuição dos níveis de TREC/µg DNA conforme a idade (n =
95).
0
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
140.000
160.000
180.000
200.000
1 a 3 4 a 6 7 a 9 10 a 12 13 a 15 16 a 18
Mé
dia
de
có
pia
s d
e T
RE
C/µ
g D
NA
Faixa etária
-
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
0 5 10 15 20
Nú
me
ro d
e c
óp
ias
de
TR
EC
/µg
DN
A
Idade
43
Comparamos também os níveis de TREC/µg DNA entre controles com
até 9 anos de idade com os controles com 10 a 18 anos de idade. Os níveis
de TREC foram significantemente menores nas crianças e adolescentes com
mais de 9 anos de idade (6,5 x 104 TREC/µg DNA versus 11,2 X 104
TREC/µg DNA, respectivamente) (p < 0,001).
Conforme se observa no Gráfico 3 também houve forte correlação
entre idade e número de cópias de TREC quando avaliamos apenas as
crianças até 9 anos de idade, (n = 47) (r = -0,863 com p < 0,001).
Gráfico 3: Distribuição dos níveis de TREC/µg DNA em crianças de 0 a 9
anos (n = 47).
Entre crianças e adolescentes de 10 – 18 anos observou-se uma
correlação mais fraca entre idade e número de cópias de TREC (r = -0,439
com p = 0,002) (Gráfico 4).
-
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
0 2 4 6 8 10
Nú
me
ro d
e c
óp
ias
de
TR
EC
/µg
DN
A
Idade
44
Gráfico 4: Distribuição dos níveis de TREC/µg DNA em crianças e
adolescentes de 10 a 18 anos (n = 48).
4.3 Análise da expressão de Linfócitos T
Os linfócitos T foram quantificados pela análise da expressão dos
marcadores CD3, CD4 e CD8. A avaliação destas subpopulações nas
diferentes faixas etárias variou de 45 a 62% (CD3), 60 a 65% (CD4) e de 14
a 26% (CD8) (Tabela 3).
Não houve correlação significativa entre a proporção de CD3, CD4 e
CD8 e a idade dos indivíduos avaliados (p=0,424, r=0,103; p=0,908, r=0,015;
p=0,372, r=0,114, respectivamente) (Gráficos 5, 6 e 7).
-
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
9 11 13 15 17 19
Nú
me
ro d
e c
óp
ias
de
TR
EC
/µg
DN
A
Idade
45
Gráfico 5: Gráfico de dispersão demonstrando a proporção de células T
CD3+ por idade (n = 63).
Gráfico 6: Gráfico de dispersão demonstrando a proporção de células T
CD4+ por idade (n = 63).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20
%C
D3
+
Idade
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20
%C
D4
+
Idade
46
Gráfico 7: Gráfico de dispersão demonstrando a proporção de células T CD8+ por
idade (n = 63).
Tabela 3: Média e desvio padrão da expressão de CD3, CD4 e CD8 de
acordo com a faixa etária em anos.
Faixa etária % CD3 % CD4 % CD8
1 – 3 45,95 ± 5,35 63,4 ± 5,1 23,35 ± 0,65
4 - 6 50,25 ± 10,32 61,8 ± 5,3 16,8 ± 6,9
7 – 9 51 ± 8,8 61,3 ± 12 18 ± 9,5
10 – 12 54 ± 14,4 65 ± 10 14 ± 9
13 – 15 62 ± 0,4 62,3 ± 6,2 19,2 ± 7
16 – 18 52 ± 6 60,4 ± 1,6 26,4 ± 2,4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20
%C
D8
+
Idade
47
4.3.1 Analise da Expressão de Linfócitos T CD4+CD38+HLA-DR+,
CD8+CD38+HLA-DR+ e CD4+CD25+Foxp3+
Para quantificação dos números de células T ativadas foram
realizadas análises da co-expressão dos marcadores CD38 e HLA-DR em
células T CD4+ e CD8+ (Figura 10) e para avaliação de células reguladoras
foi realizada análise da expressão de células CD4+CD25+Foxp3+ (Figura 11)
(Tabela 4).
A análise da expressão de células T ativadas foi realizada em 63
amostras e a análise da expressão de células CD4+CD25+Foxp3+, em 19
amostras.
Figura 10: Análise de Citometria obtida de uma da amostras utilizando o
software FlowJo a) seleção de linfócitos CD3+ b) gate de células CD4+ e
CD8+ c) - d) seleção de células CD8+ co-expressando HLA-DR e CD38 e) - f)
seleção de células CD4+ co-expressando HLA-DR e CD38.
48
Figura 11: Análise de Citometria obtida de uma das amostras utilizando o
software FlowJo a) seleção de linfócitos CD3+ b) gate de células CD4+CD25+
c) histograma demonstrando a % de células CD4+CD25+ expressando Foxp3.
Tabela 4: Média e desvio padrão da expressão de células T ativadas e de
células T reguladoras de acordo com a faixa etária em anos.
Faixa
etária
% CD4+ CD38+
HLA-DR+
% CD8+ CD38+
HLA-DR+
% CD4+ CD25+
Foxp3+
1 – 3 2,95 ± 0,5 1,4 ± 1 5,3 ± 2,6
4 – 6 5,02 ± 1,7 2,2 ± 2,3 4,8 ± 2,7
7 – 9 3,92 ± 3,6 1,51 ± 2 4,8 ± 3
10 - 12 4,55 ± 7 1,81 ± 1 5,36 ± 2
13 - 15 4,57 ± 1 2,51 ± 0,3 4,96 ± 1,5
16 - 18 3,75 ± 1,1 2,2 ± 0,2 2,8 ± 1,1
Houve uma correlação inversa fraca entre o número de células T CD4+
co-expressando CD38 e HLA-DR e idade (r = -0,286; p = 0,023) (Gráfico 8).
Não encontramos correlação significativa entre a proporção de células T
CD8+ co-expressando CD38 e HLA-DR (r = -0,229; p = 0,072) e idade.
49
Gráfico 8: Gráfico de dispersão entre células T ativadas (CD4+CD38+HLA-
DR+) e idade (n = 63).
Como demonstrado no gráfico 9, encontramos uma correlação positiva
fraca entre as células T ativadas CD8+CD38+HLA-DR+ e número de cópias
de TREC/µg DNA (r = 0,258; p = 0,04) e uma tendência a correlação entre a
proporção de células T ativadas CD4+CD38+HLA-DR+ e número de cópias de
TREC/µg DNA (r = 0,241; p = 0,05).
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20
% C
D4
+C
D3
8+
HLA
-DR
+
Idade
50
Gráfico 9: Gráfico de dispersão entre células T ativadas CD8+CD38+HLA-
DR+ e cópias de TREC/µg DNA.
Como demonstrado no gráfico 10, evidenciamos uma correlação
inversa entre a expressão de células CD4+CD25+Foxp3+ e idade (r = -0,46
com p = 0,04), demonstrando que a expressão de células T reguladoras
tende a diminuir com a idade.
Adicionalmente, encontramos correlação positiva entre a expressão de
células CD4+CD25+Foxp3+ e número de cópias de TREC/µg DNA nos
controles estudados (r = 0,52 com p = 0,02) (Gráfico 11).
0
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
0 2 4 6 8 10
Nú
me
ro d
e c
óp
ias
de
TR
EC
/ µµ µµg
DN
A
% CD8+CD38+HLA-DR+
51
Gráfico 10: Gráfico de dispersão entre células T reguladoras e idade (n = 19).
Gráfico 11: Gráfico de dispersão entre células T reguladoras e cópias de
TREC/µg DNA (n = 19).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20
%C
D4
+C
D2
5+F
ox
p3
+
Idade
0
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Nú
me
ro d
e c
óp
ias
de
TR
EC
/µg
DN
A
% CD4+CD25+Foxp3+
5 - Discussão
53
A contribuição do timo nas disfunções imunológicas tem elevado o
interesse sobre seu funcionamento normal e patológico. No presente estudo,
avaliamos a proporção de células recém-egressas do timo no pool de células
mononucleares periféricas, mediante a determinação dos níveis de TREC/µg
de DNA em crianças e adolescentes brasileiras saudáveis. Adicionalmente,
avaliamos de forma inédita, a expressão de linfócitos T ativados e de células
T reguladoras na mesma população.
Confirmando achados de estudos anteriores, encontramos níveis
elevados de TREC em sangue periférico de crianças com 1 a 3 anos de
idade e queda progressiva de seus níveis com a idade53,57. Houve uma
diminuição discreta da proporção de células CD4+CD38+HLA-DR+ e uma
diminuição mais significativa das células T reguladoras com a idade.
Interessantemente, encontramos correlação positiva entre os níveis de TREC
e a proporção de células T reguladoras na periferia.
A medida dos níveis de TREC em sangue periférico é um método
utilizado para fornecer uma estimativa da produção de linfócitos T pelo timo e
principalmente, para avaliar a proporção de RTE em relação ao pool de
linfócitos T periféricos49. Estudos realizados previamente em controles
demonstram que os níveis de TREC apresentam-se elevados em células de
cordão umbilical e no sangue periférico de recém-nascidos sadios, podendo
ser encontrados em maior quantidade nas primeiras duas décadas de
vida53,55,57.
54
Observamos também de forma interessante certa variabilidade no
número de cópias de TREC em crianças e adolescentes com a mesma
idade. Alguns autores atribuem esta variabilidade a fatores genéticos ou a
presença de proporções diferentes de tecido tímico em controles da mesma
idade49,51. Corroborando os achados de estudos prévios, não encontramos
diferença significativa quando comparamos os níveis de TREC entre o sexo
masculino e feminino53,64.
Especialmente na população pediátrica, a metodologia de
quantificação de TREC em mononucleares do sangue periférico vem sendo
empregada no estudo de diversas patologias autoimunes e em
imunodeficiências primárias e secundárias. Em doenças autoimunes como a
artrite idiopática juvenil, estudos mostraram níveis diminuídos de TREC em
sangue periférico em comparação a crianças saudáveis64,65.
Em imunodeficiências primárias como na síndrome de DiGeorge,
diferentes graus de acometimento do timo acarretam uma série de alterações
na função imunológica. A síndrome de DiGeorge caracteriza-se por
hipoplasia ou até mesmo aplasia tímica. Em um estudo apresentado por
Lima et al.69 não foi encontrada correlação significativa entre número de
cópias de TREC e o tamanho de tecido tímico verificado por ultrassom. Em
outro estudo, pacientes que não possuíam tecido tímico detectável,
apresentaram números de cópias de TREC detectáveis em sangue
periférico, indicando a possível existência de sítios de maturação
extratímicos ou de tecido tímico não detectável, mas capaz de gerar RTE
mesmo que em pequenas quantidades58. Mais recentemente alguns autores
55
utilizaram a dosagem dos níveis de TREC em sangue periférico para
avaliação do grau de disfunção imunológica e da recuperação do sistema
imunológico após transplante tímico70.
Em imunodeficiências secundárias como o HIV, o papel do timo
também tem despertado grande interesse. Em adultos, McCune et al.71
apresentaram um estudo no qual o tamanho do timo determinado por
tomografia computadorizada, encontrava-se aumentado em pacientes
infectados pelo HIV, indicando possível hipertrofia do órgão como tentativa
de manutenção da homeostase de linfócitos T. Em crianças e adultos, a
dosagem dos níveis de TREC tem sido utilizada como ferramenta para
averiguação do reestabelecimento da função imunológica após terapia
antirretroviral72.
Mostrando outra utilização potencial do método e a importância da
dosagem de TREC em imunodeficiências, recentemente alguns autores
propuseram a dosagem dos níveis de TREC como teste de triagem para
diagnóstico de Imunodeficiência Severa Combinada (SCID) em recém-
nascidos, uma grave imunodeficiência que pode levar ao óbito se não
detectada precocemente. Em estudos do mesmo grupo, recém-nascidos com
SCID, apresentavam número de cópias de TREC indetectáveis73,74.
Ao interpretarmos os resultados obtidos no presente estudo devemos
lembrar, entretanto, que os níveis de TREC em sangue periférico são
influenciados não apenas pela timopoiese, mas também por outros fatores
como proliferação e apoptose celular, que podem causar diluição periférica
de células contendo TREC em relação ao pool total de células T48,75.
56
Utilizando um modelo matemático, Ye e Kirschner76 analisaram a influência
da idade no número de RTEs gerados diariamente e no número de cópias de
TREC. O estudo demonstrou que tanto os RTEs quanto a proliferação celular
afetam a concentração periférica de TREC da mesma maneira em todas as
idades e a morte celular parece influenciar a concentração de TREC de
modo menos importante.
Além da pesquisa dos níveis de TREC em crianças e adolescentes
saudáveis, nosso estudo também abordou outros subtipos celulares
envolvidos na homeostase do sistema imunológico. O sistema imunológico
de crianças possui diversas particularidades em relação a um adulto,
podendo reagir de maneira diferente a situações como desequilíbrio entre
diferentes subtipos de células T ou até mesmo frente a patógenos externos.
Por isso, avaliamos outros subtipos celulares não comumentemente
avaliados em crianças e adolescentes saudáveis77.
A imunofenotipagem básica de linfócitos T em crianças foi
amplamente explorada durante os anos 90, quando diversos trabalhos
buscavam valores de normalidade e a melhor metodologia para ensaios de
citometria de fluxo. Em nosso estudo, esta marcação já bem estabelecida foi
o passo inicial para avaliar a proporção de células T ativadas e reguladoras.
Comparando nossos resultados a outros estudos, encontramos grande
similaridade na média da proporção de células T CD3+, CD4+ e CD8+ e não
encontramos correlação entre a proporção destes subtipos celulares e
idade28.
57
O CD38 é expresso em precursores da medula óssea e em células T
ativadas, podendo ser considerado um marcador de ativação celular ou de
imaturidade celular.28 O HLA-DR é uma das proteínas pertencentes ao grupo
MHC de classe II e tem sido considerado um marcador de ativação celular
tardio33. Como em outros estudos, não consideramos somente o CD38 como
marcador de ativação celular devido a sua alta expressão em células
imaturas provenientes da medula óssea principalmente em crianças, nas
quais o sistema imune está sendo estabelecido. Associando o CD38 a um
marcador considerado um marcador de ativação tardia, podemos estimar de
uma maneira mais precisa a proporção de células T ativadas.
A co-expressão de CD38 e HLA-DR como marcador de células T
ativadas vem sendo utilizada principalmente para acompanhamento de
crianças infectadas pelo vírus do HIV. O aumento na co-expressão de CD38
e HLA-DR em crianças com HIV também está relacionada à progressão de
doença e maior risco de morte78.
Estudos em crianças saudáveis demonstraram que a porcentagem de
células CD8+ que co-expressam CD38 e HLA-DR são baixas, girando em
torno de 3%. Já em células T CD4+ esses níveis sobem para
aproximadamente 7%. 28,79. Em nossa pesquisa encontramos uma média de
2% de células CD8+ co-expressando CD38 e HLA-DR e 5% de células CD4+
co-expressando CD38 e HLA-DR.
No presente estudo, observamos uma correlação inversa fraca entre
os níveis de linfócitos T ativados expressando CD4+CD38+HLA-DR+ e idade
(r = -0,286; p = 0,023), e uma tendência à correlação inversa entre linfócitos
58
T CD8+CD38+HLA-DR+ e idade (r = -0,229; p = 0,072). Estudos realizados
previamente demonstram aumento na proporção de células CD8+CD38+HLA-
DR+ com a idade 28,80. Também não encontramos uma correlação relevante
entre expressão de linfócitos T ativados e níveis de TREC. Acreditamos que
este fato pode ser mais bem elucidado em um estudo com uma população
maior de crianças e adolescentes.
Outro subtipo celular de grande interesse atualmente são as células T
reguladoras (Treg). As células Treg exercem um papel central na
manutenção da auto-tolerância e controle da homeostase do sistema imune.
Estas células fazem parte de uma população distinta com função
imunossupressora e podem ser divididas em dois subtipos: as células T
reguladoras naturais (nTreg) e células T reguladoras adaptativas (aTreg),
sendo que ambas expressam o Foxp3. As nTreg se desenvolvem
naturalmente no timo; já as aTreg são Foxp3- até o momento em que se
diferenciam em células com atividade imunossupressora, passando então a
expressar também o Foxp381.
Em nosso estudo optamos por considerar as Treg como sendo
CD4+CD25+Foxp3+, já que o fator de transcrição Foxp3 tem sido considerado
altamente especifico para células T reguladoras. Estudos em modelos
murinos demonstram que a expressão do Foxp3 é necessária para o
desenvolvimento de células CD4+CD25+ com função imunossupressora e
animais que apresentavam deficiência deste fator de transcrição
desenvolvem patologias autoimunes e inflamatórias82,83.
59
Estudos mais recentes sugerem que as células Treg naturais possam
ser diferenciadas pela alta expressão de um novo marcador, o Helios. O fator
de transcrição Helios encontra-se expresso em 100% dos timócitos T
CD4+CD8-Foxp3+ e em aproximadamente 70% das Treg encontradas em
órgãos linfóides periféricos84. Poderá ser um marcador utilizado em estudos
futuros para diferenciação de Tregs de origem tímica das células aTreg, que
não expressam o Helios.
Um aspecto sobre as Treg que vem sendo explorado atualmente diz
respeito a estudos envolvendo terapia celular. A possível alternativa de
expandir as células T reguladoras de um doador “in vitro” e de criopreservar
estas células para que sejam administradas em situações pós-transplante
ainda levanta inúmeras questões, porém estudos pioneiros demonstram
resultados satisfatórios85,86. Em nosso trabalho encontramos uma média de 4% de células Treg
CD4+ co-expressando CD25 e Foxp3, resultados compatíveis com outros
estudos que avaliaram a expressão de células T reguladoras em crianças.
Lorenzi et al.87 em um estudo comparando crianças acometidas com AIJ e
controles, encontrou uma proporção média de 6.9% de Treg nos controles
avaliados. Roat et al.88 apresentaram um estudo comparando a proporção de
células T reguladoras entre crianças com Síndrome de Down e controles
saudáveis; a proporção média de células Treg nos controles saudáveis foi de
2%. Em um estudo apresentado por Fuchizawa et al.89 a proporção média de
células Treg foi de 4,5%. Finalmente, Mold et al.90 encontraram uma média
de 7% de células Treg ao avaliarem recém nascidos saudáveis.
60
Encontramos também uma correlação inversa moderada entre a
expressão de células T CD4+CD25+Foxp3+ e a idade em 19 crianças e
adolescentes estudados. Diversos autores avaliaram o impacto da idade na
expressão de células Treg em crianças saudáveis com resultados
controversos. Estudos reportam maiores proporções de células Treg em
recém-nascidos, indicando que as células Treg podem ser estimuladas e
produzidas em maior quantidade no momento em que a criança é exposta a
antígenos externos89,91,92. Gridebacke et al.91 e Fichizawa et al.89,
encontraram aumento da expressão de células T CD4+CD25+Foxp3+ na
circulação periférica nos primeiros dias de vida, seguido de uma
estabilização de seus níveis nos primeiros anos de vida. Teran et al.92, ao
avaliarem uma população de crianças Latino Americanas, encontraram
queda da porcentagem de células Treg com a idade. Além disso, como em
nosso estudo, os autores também encontraram certa variabilidade nos níveis
de células Treg entre indivíduos da mesma faixa etária, indicando que fatores
como o meio ambiente ao qual a criança é exposta possa influenciar no
desenvolvimento de seu sistema imunológico.
Além disso, a proporção de células T CD4+CD25+Foxp3+ virgens
costuma diminuir com a idade à custa de um aumento na proporção de
células Treg de memória.93 Apesar da expressão do CD4+CD25+Foxp3+ ser
ainda considerado o melhor marcador para avaliação de células Treg na
periferia, atualmente diversos tipos de células T reguladoras com função
supressora têm sido descritos. Um aspecto interessante a ser explorado
seria a hipótese de que durante o avançar da idade outros subtipos de
61
células T reguladoras possam estar mais envolvidos nas respostas
imunológicas. Estudos futuros avaliando diferentes fenótipos de células Treg
e outras células com função reguladora são necessários para melhor avaliar
o impacto da idade em cada subtipo de célula T com função reguladora.
Um achado inédito e relevante do presente estudo, apesar do
pequeno número de amostras avaliadas, diz respeito à correlação positiva
encontrada entre a timopoiese, avaliada pelo número de cópias de TREC, e
a expressão de células T CD4+CD25+Foxp3+ na periferia. A homeostase dos
linfócitos T é finamente regulada. As células Treg exercem papel
fundamental na manutenção da auto-tolerância e controle da auto-imunidade.
Como já citado anteriormente, a ausência ou depleção de células Treg
resulta no desenvolvimento de uma série de doenças auto-imunes. Além
disso, uma diminuição na timopoiese está relacionada com expansão
oligoclonal de linfócitos T e também maior susceptibilidade a autoimunidade.
Os resultados encontrados indicam, portanto, que em crianças saudáveis, as
células Treg, um subtipo celular fundamental para a manutenção da
homeostase do sistema imunológico, são exportadas de maneira
proporcional pelo timo, correlacionando-se assim a um marcador de RTE.
É importante lembrar também que, apesar das células Treg serem
produzidas basicamente no timo, a manutenção e proliferação de células
Treg na periferia é um processo dinâmico e influenciado por diversos fatores
como: fatores genéticos, citocinas com capacidade de estimular a
proliferação e/ou a migração das células Treg a um sítio específico, por
células dendríticas, etc94. Os mecanismos envolvidos nesta complexa inter-
62
relação estão ainda sendo descobertos, e novos estudos poderão avaliar
melhor o papel de cada via na manutenção da auto-tolerância e
desenvolvimento de autoimunidade.
Estudos avaliando a timopoiese e a proporção de determinados
subtipos celulares em crianças saudáveis sem nenhuma evidência de
disfunção imunológica, são extremamente relevantes para a melhor
compreensão dos mecanismos que regulam o sistema imunológico. No
presente estudo, estabelecemos valores de normalidade dos níveis TREC no
pool de células mononucleares de sangue periférico em crianças e
adolescentes saudáveis de diversas faixas etárias, confirmando achados
anteriores de diminuição da função tímica com a idade. Além disso,
observamos correlação inversa moderada entre células T reguladoras
expressando CD4+CD25+Foxp3+ e a idade no grupo estudado, e uma
correlação positiva entre células T reguladoras e os níveis de TREC na
periferia. Tais achados indicam que apesar de ocorrer uma diminuição dos
níveis de TREC e de células Treg com a idade, a homeostase do sistema
imunológico permanece em equilíbrio, com manutenção da proporção de
células Treg na periferia. Novos estudos, correlacionando os achados aqui
apresentados com dados de crianças com imunodeficiências ou doenças
auto-imunes, poderão ser úteis para a melhor abordagem terapêutica desses
pacientes.
6 - Conclusões
64
• Os níveis de TREC em mononucleares de sangue periférico de crianças e
adolescentes saudáveis brasileiros com faixa etária de 1 a 18 anos, foram
maiores em crianças com 1-3 anos de idade. Houve uma diminuição
significativa dos níveis de TREC com a idade nos indivíduos estudados.
• A determinação da proporção de linfócitos T CD3, CD4, e CD8 mostrou
ausência de correlação de sua expressão com a idade.
• Os linfócitos T ativados CD4+CD38+HLA-DR+ apresentaram fraca
correlação inversa com a idade e os linfócitos T ativados
CD8+CD38+HLA-DR+ apresentaram tendência à correlação.
• Houve uma correlação inversa entre a proporção de células T reguladoras
(CD4+CD25+Foxp3+) e a idade.
• Houve correlação positiva significativa entre os níveis de TREC e a
proporção de células T reguladoras.
7 – Anexos
66
Anexo 1
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Dados de Identificação do sujeito da pesquisa e responsável legal
1- Controle Nome do paciente:_ ___________________________________ Documento de Identidade nº: ____________ Sexo: __________ Data de Nascimento: __/__/____ Endereço: ________________________ Nº: _____ Apto: _____ Bairro: __________ Cidade: _________ CEP: __________ Telefone: (___)_____-_____ 2 - Responsável Legal Nome:______________________________________________ Natureza (Grau de Parentesco): ___________ Documento de Identidade nº: ____________ Sexo: __________ Data de Nascimento: __/__/____ Endereço: ________________________ Nº: _____ Apto: _____ Bairro: __________ Cidade: _________ CEP: __________ Telefone: (___)_____-_____
Dados sobre a pesquisa cientifica
1 - Título do protocolo de pesquisa: AVALIAÇÃO DA TIMOPOIESE EM CRIANÇAS E ADOLESCENTES SAUDÁVEIS EM DIVERSAS FAIXAS ETÁRIAS MEDIANTE DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE CÍRCULOS EXCISADOS DO RECEPTOR DE LINFÓCITOS T (TRECs) EM MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO Pesquisadora: Maria Izabel Arismendi de Oliveira CRBM: 13.748 Cargo - Função: Biomédica / Aluna Pós-Graduação Unidade do HCFMUSP: Instituto da Criança 2 – Avaliação da pesquisa: Probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como conseqüência imediata ou tardia do estudo: Mínima Duração de pesquisa: 1 ano e meio
67
3 - Essas informações estão sendo fornecidas para a participação voluntária de seu (sua) filho (a) neste estudo cujo objetivo é avaliar a função do timo que é um órgão localizado perto do seu coração e que é responsável pela produção e desenvolvimento de um tipo de célula do sangue importante no reconhecimento de substâncias estranhas ao organismo e na sua defesa. Para a execução do estudo coletaremos 10ml de sangue da veia periférica de 100 crianças saudáveis que passaram por procedimentos simples no Instituto da Criança – HCFMUSP e no Laboratório Central da Universidade Federal de São Paulo. Seu filho será submetido a uma única punção venosa. Isto não trará nenhum risco à saúde da criança, podendo apenas causar um desconforto durante a coleta de sangue. Não há nenhuma despesa pessoal em qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à participação de seu (sua) filho (a). As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros pacientes, sendo que o nome de nenhum participante do estudo será divulgado. Os dados e o material coletado serão utilizados somente para esta pesquisa. O responsável fica livre também para retirar o seu consentimento a qualquer momento. Se decidir não participar mais da pesquisa não será prejudicado quanto ao tratamento e acompanhamento da criança neste hospital. Durante qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O principal investigador é a Cristiane Kayser, que pode ser encontrada no Laboratório de Reumatologia da UNIFESP, localizado na Rua Botucatu, 740, 2º andar, Vila Clementino. São Paulo - SP - Brasil. Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi explicado, consinto que meu filho(a) participe do presente Protocolo de Pesquisa. Assinatura do representante legal: __________________________________ Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste representante legal para a participação desta criança neste estudo. Assinatura do pesquisador: _____________________________________________ São Paulo, ___/___/____.
68
Anexo 2
69
Anexo 3
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