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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
MARCELO DO NASCIMENTO COSTA
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS
AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA
TIENOPIRIDINA NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS
HERPES SIMPLES TIPO 1
NITERÓI 2007
Programa de Neuroimunologia
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
MARCELO DO NASCIMENTO COSTA
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS
AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA
TIENOPIRIDINA NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS
HERPES SIMPLES TIPO 1
Niterói
2007
ii
MARCELO DO NASCIMENTO COSTA
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS
AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA TIENOPIRIDINA
NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS HERPES SIMPLES TIPO 1
Trabalho desenvolvido no laboratório de Virologia Molecular do Departamento de
Biologia Celular e Molecular, Programa de Neuroimunologia, Instituto de Biologia
UFF.
Orientadora: Izabel Christina de Palmer Paixão Frugulhetti
Co-orientador: Davis Fernandes Ferreira
NITERÓI
2007
Dissertação de mestrado
submetida à Universidade Federal
Fluminense como requisito parcial
para obtenção do
grau de Mestre
em Neuroimunologia.
iii
C 387 Costa, Marcelo do Nascimento
Estudo do Mecanismo de Ação de Derivados
Aminoálcoois e de Derivados do Sistema Tienopiridina na
Replicação in vitro do Vírus Herpes Simples Tipo 1/Marcelo do
Nascimento Costa. Niterói: [s. n.], 2007.
88f.
Dissertação (Mestrado em Neuroimunologia)
Universidade Federal Fluminense, 2007.
1. Herpesvírus 1 Humano 2. Amino álcoois
3. Agentes Antivirais 4. Tienopiridina I. Título
CDD 616.52
iv
MARCELO DO NASCIMENTO COSTA
ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS
AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA TIENOPIRIDINA
NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS HERPES SIMPLES TIPO 1
Dissertação de mestrado submetida à Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Neuroimunologia
Niterói, 14 de março de 2007
BANCA EXAMINADORA
Dra. Helena Carla Castro Rangel UFF
Dra. Valéria Laneuville Teixeira UFF
Dr. Carlos Frederico Leite Fontes UFRJ
REVISORA E SUPLENTE
__________________________________________________________________ Dr. Elizabeth Giestal de Araújo
UFF
NITERÓI
2007
v
"O mais importante da vida não é a situação em que
estamos, mas a direção para a qual nos movemos .
Oliver W. Holmes
vi
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores: Izabel Frugulhetti e Davis Fernandes pela orientação,
paciência e amizade;
Aos professores Sérgio Pinheiro e Alice Bernardino, do Departamento de Química
Orgânica da UFF, e aos seus respectivos alunos, Ronaldo Júnior e Luís Pinheiro,
pela colaboração que nos permitiu o desenvolvimento deste trabalho;
À professora Gerlinde Teixeira do Departamento de Imunologia da UFF e sua
aluna Valéria Garrido Martins pela colaboração com os experimentos in vivo;
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Neuroimunologia pela grande
colaboração com a minha formação acadêmica;
Aos Professores Carlos Frederico Leite Fontes e Júlio Alberto Mignaco do Instituto
de Bioquímica Médica da UFRJ e a todos os seus alunos, pela ajuda nos
momentos de necessidade;
À banca desta dissertação por ter aceitado avaliar este trabalho;
À professora Elizabeth Giestal de Araújo pelo apoio e pela revisão desta
dissertação, e aos seus alunos pela amizade;
vii
À todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Neuroimunologia;
À todos os meus amigos;
Aos amigos do Laboratório de Virologia Molecular da UFF, Luciano Sant'Anna,
Thiago Moreno Lopes e Souza, Juliana Lourenço Abrantes, Milene Dias Miranda,
Tamara Fogel, Diego Queiroz , Silmara Souza, Priscila Born, Felipe Mateini
e.Viveca;
Aos meus parentes;
À minha namorada Amanda Delvizio pelo carinho;
E a minha família (Emilson, Nely e Michele) por ter me dado apoio e todo suporte
necessário para o desenvolvimento desta dissertação.
viii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ______________________________________ xi
LISTA DE FIGURAS ___________________________________________ xv
LISTA DE TABELAS __________________________________________ xvii
RESUMO __________________________________________________ xviii
ABSTRACT _________________________________________________ xix
1. INTRODUÇÃO __________________________________________ 1
1.1. Histórico _________________________________________ 3
1.2. Família Herpesviridae _______________________________ 4
1.3. HSV-1 ___________________________________________ 5
1.4. Ciclo de Multiplicação do HSV-1 _______________________ 7
1.4.1. Adsorção, Penetração e Transporte Intracelular ______ 7
1.4.2. Etapa de Replicação ___________________________ 10
1.4.3. Latência ____________________________________ 17
1.5. Algumas das Principais Drogas Utilizadas no Tratamento
de Infecções por HSV-1 _________________________________ 19
1.5.1. Aciclovir e Valaciclovir _________________________ 19
1.5.2. Penciclovir e Fanciclovir ________________________ 21
1.5.3. Foscarnet ___________________________________ 23
1.5.4. Cidofovir ____________________________________ 23
1.6. Substâncias Testadas neste Trabalho __________________ 25
1.6.1. Derivados 1,4 aminoálcoois contendo anel 1,2,3
triazólico (ou Derivados Aminoálcoois) _________________ 25
ix
1.6.2. Derivados 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-
carbonitrilas (ou Derivados Tieno-Piridina) ______________ 30
2. OBJETIVOS ___________________________________________ 32
2.1. Objetivos Gerais ___________________________________ 32
2.2. Objetivos Específicos _______________________________ 32
3. MATERIAL E MÉTODOS _________________________________ 33
3.1. Células e Drogas __________________________________ 33
3.2. Ensaio para Avaliação da Citotoxicidade das Substâncias __ 34
3.3. Obtenção da DNA Polimerase de Células Vero _________ 35
3.4. Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de Células Vero __ 35
3.5. Vírus ____________________________________________ 36
3.6. Ensaio de Redução da Placas Virais ___________________ 36
3.7. Ensaio de Inibição do Efeito Citopático _________________ 37
3.8. Ensaio de Inibição da Produção de Partículas Virais _______ 37
3.9. Efeito do Tratamento na Síntese Protéica
de Células Infectadas ___________________________________ 38
3.10. Obtenção da DNA Polimerase de HSV-1 _______________ 38
3.11. Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de HSV-1 ________ 39
3.12. Estudo da Toxicidade in vivo ________________________ 39
4. RESULTADOS _________________________________________ 41
4.1. Avaliação da Citotoxicidade __________________________ 41
4.2. Ensaio de inibição da Atividade da DNA Polimerase
de Células Vero ______________________________________ 42
x
4.3. Avaliação da Atividade Antiviral _______________________ 43
4.4. Determinação do EC50 e do S.I. do Derivado 109 _________ 45
4.5. Ensaio de Inibição da Atividade da DNA Polimerase Viral ___ 46
4.6. Efeito do Derivado 109 na Síntese Protéica
de Células Infectadas ___________________________________ 47
4.7. Avaliação da Toxicidade in vivo do Composto 109 _________ 48
5. DISCUSSÃO ___________________________________________ 50
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _________________________ 58
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
3-OS HS
Heparan Sulfato 3-O Sulfatada
µg/mL
Micrograma por Mililitro
Ci/mL
MicroCurie por Mililitro
µM
Micromolar
-TIF
Fator Indutor de Transcrição de Proteínas de Fase .
ACV
Aciclovir
AIDS
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ANP
Aciclonucleosídeo Fosfonatado
CC50
Citotoxicidade em 50%
CO2
Dióxido de Carbono
dATP
Deoxiadenosina Trifosfatada
dCTP
Deoxicitosina Trifosfatada
dGTP
Deoxiguanosina Trifosfatada
DMEM
Dubelcco´s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimetilsulfóxido
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
dNTP
Deoxinucleotídeos Trifosfatados
dTTP
Deoxitimidina Trifosfatada
DTT
Dithiothreitol
EBV
Vírus Epstein-Barr
xii
EC50
Concentração da Droga Capaz de Inibir em 50% a Replicação
Viral
EDTA
Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
g
Força da Gravidade
gB
Glicoproteína Viral B
gC
Glicoproteína Viral C
gD
Glicoproteína Viral D
gH
Glicoproteína Viral H
gL
Glicoproteína Viral L
GAG
Glicosaminoglicana
GTP
Guanosina Trifosfatada
HCF
Proteína Estabilizadora de Fator de Transcrição
HCl
Ácido Clorídrico
HCMV
Citomegalovírus Humano
HCV
Vírus da Hepatite C
HHV
Herpesvírus Humano
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
HPMPC
Cidofovir
HVEM
Mediador da Entrada de Herpesvírus
HSV
Vírus Herpes Simples
ICP
Proteína de Célula Infectada
IMPDH
Desidrogenase de Inosina Monofosfatada
LAT
Transcritos Associados com a Latência
M
Molar
xiii
MgCl2
Cloreto de Magnésio
MHC
Complexo de Histocompatibilidade Principal
mM
Milimolar
MOI
Multiplicidade de Infecção
MTT
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbrometo
N
Normal
nm
Nanômetro
NNRTI
Inibidores Não Nucleosídicos da Transcriptase Reversa de HIV-1
h. p. i.
Horas Pós-Infecção
OCTs
Proteínas Reguladoras de Transcrição
PBS
Salina Tamponada com Fosfato
PFU
Unidades Formadoras de Placas virais
PMSF
Fenilmetilsulfonil Fluoreto
RDP
Ribavirina Difosfatada
RMP
Ribavirina Monofosfatada
RNA
Ácido Ribonucléico
RNAm
Ácido Ribonucléico Mensageiro
RPM
Rotações por Minuto
RTP
Ribavirina Trifosfatada
SDS
Dodecilsulfato de Sódio
SFB
Soro Fetal Bovino
SI
Índice de Seletividade
SSB
Proteína Ligadora de DNA Fita Simples
TAP
Transportador Associado com o Processamento do Antígeno
xiv
TCA
Ácido Tricloroacético
TGP
Transaminase Glutâmico-Pirúvica
TNF
Fator de Necrose Tumoral
TK
Timidina Cinase
UL
Segmento único longo do DNA do HSV
US
Segmento único curto do DNA do HSV
VP
Viral Protein
Vero
Células de Rim de Macaco Verde Africano
VHS
Virus Host Shut-off
VZV
Vírus da Varicela Zoster
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Infecção labial por HSV-1 ____________________________ 1
Figura 2
Eczema herpético (HSV-1) ___________________________ 1
Figura 3
Infecção de córnea por HSV __________________________ 2
Figura 4
Encefalite herpética _________________________________ 2
Figura 5
Eletromicrografia do HSV-1 ___________________________ 6
Figura 6
Diagrama representativo da estrutura do genoma
do HSV-1 _________________________________________ 7
Figura 7
Esquema representativo da entrada do HSV-1
na célula hospedeira ________________________________ 9
Figura 8
Formação do complexo de pré-iniciação _________________ 12
Figura 9
Modelo da replicação do DNA do HSV-1 _________________ 13
Figura 10
Esquema representativo da montagem do
nucleocapsídeo viral _________________________________ 16
Figura 11
Esquema representativo da liberação das partículas
virais de HSV-1 da célula hospedeira ___________________ 16
Figura 12
Latência e reativação do HSV-1 _______________________ 18
Figura 13
Fórmula estrutural do aciclovir e da guanosina ___________ 19
Figura 14
Mecanismo da ação antiviral do aciclovir ________________ 20
Figura 15
Fórmula estrutural do valaciclovir ______________________ 21
Figura 16
Fórmula estrutural do penciclovir ______________________ 22
Figura 17
Fórmula estrutural do fanciclovir _______________________ 22
Figura 18
Fórmula estrutural do foscarnet ________________________ 23
xvi
Figura 19
Fórmula estrutural do cidofovir ________________________ 24
Figura 20
Mecanismo da ação antiviral do cidofovir ________________ 25
Figura 21
Estrutura da ribavirina e de moléculas semelhantes ________ 28
Figura 22
Metabolismo das purinas em células humanas ____________ 28
Figura 23
Capacidade de pareamento promíscuo de bases
da ribavirina _______________________________________ 29
Figura 24
Derivados Aminoálcoois _____________________________ 29
Figura 25
Fórmula estrutural dos derivados
4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-carbonitrilas __________ 31
Figura 26
Efeito dos derivados aminoálcoois na atividade da
enzima DNA polimerase de células Vero ______________ 43
Figura 27
Inibição da produção de partículas virais
pelo composto 109 _________________________________ 45
Figura 28
Efeito dos derivados aminoálcoois (50 M) na atividade
da enzima DNA polimerase viral _______________________ 46
Figura 29
Efeito do composto 109 (100 pM) na atividade
da enzima DNA polimerase viral _______________________ 47
Figura 30
Efeito do composto 109 na síntese protéica
de células infectadas ________________________________ 48
Figura 31
Avaliação da toxicidade in vivo do composto 109 __________ 49
xvii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
CC50 dos derivados Aminoálcoois ______________________ 42
Tabela 2
CC50 dos derivados do sistema Tienopiridina _____________ 42
Tabela 3
Inibição do efeito citopático causada
pelos derivados Aminoálcoois _________________________ 44
Tabela 4
Inibição do efeito citopático causada
pelos derivados do sistema Tienopiridina ________________ 45
xviii
RESUMO
A infecção pelo vírus herpes simples tipo-1 (HSV-1) pode causar várias
doenças, como infecções cutâneas, genitais e encefalites. O aciclovir é o
composto mais utilizado no tratamento destas infecções. Neste trabalho,
avaliamos o mecanismo de ação dos derivados aminoálcoois e dos derivados
Tienopiridina na replicação in vitro do vírus HSV-1 em células Vero. Os derivados
aminoálcoois com radical halogenado foram menos citotóxicos, porém inibiram
menos o efeito citopático do HSV-1. Nenhum deles inibiu a atividade da DNA
polimerase
de células Vero e nem da viral. Os derivados Tienopiridina
apresentaram valores de CC50 semelhantes entre si, mas a inibição do efeito
citopático viral variou de acordo com o radical e com sua posição. O mais
promissor foi o composto 109, que apresentou um EC50 de 100 pM, e, nesta
concentração, inibiu em torno de 50% a atividade da DNA polimerase do HSV-1.
Palavras-chave: HSV-1, agentes antivirais, Aminoálcoois e Tienopiridina.
xix
ABSTRACT
Virus infections by herpesvirus simplex type-1 may cause many diseases, as
cutaneous, genital infections and encephalitis. Acyclovir is the reference compound
used to treat these threats. In this work, we evaluated the mechanism of action of
aminoalcohols derivatives and thienopyridine derivatives in the HSV-1 in vitro
replication in Vero Cells. Aminoalcohols derivatives with halogenated radicals were
less cytotoxic, but they showed less inhibition of the cytopatic effect. In addition,
they didn t inhibit the activity of
cellular DNA polymerases and viral DNA
polymerases. The thienopyridine derivatives showed similar CC50 values, but the
inhibition of the cytopatic effect varied in agreement with the radical and with its
position. The best compound was the 109, that showed a value of EC50 of 100 pM,
and, in this concentration, it inhibited about 50% of the HSV-1 DNA polymerases
activities.
Key-words: HSV-1, antiviral agents, Aminoalcohols and Thienopyridine.
1
1) INTRODUÇÃO
Infecções causadas pelo vírus herpes simples (HSV) são comuns e podem
ser responsáveis por sérias complicações em pacientes imunodeprimidos (Morfin
& Thouvenot, 2003). Estas infecções podem variar em severidade desde infecções
subclínicas até aquelas que causam lesões permanentes podendo levar à morte
do indivíduo (Jones & Isaacs, 2004). O espectro das infecções por HSV em
humanos é vasto e inclui doença orofaríngea, infecções cutâneas, infecções
genitais, doença ocular e encefalites (Kimberlin, 2003) (Figuras 1, 2, 3 e 4).
Figura 1: Infecção labial por HSV-1
(http://www.ordinace.cz/clanek/opar-8211-herpes/).
Figura 2: Eczema herpético (HSV-1)
(http://www.contemporarypediatrics.com/contpeds/data/articlestandard/contpeds/312004/108010/k2
a041f4.jpg)
2
Figura 3: Infecção de córnea por HSV
(http://news.softpedia.com/news/Herpes-039-Secret-Way-of-Attacking-Cornea-Identified-
36682.shtml)
Figura 4: Encefalite herpética. Com contraste. Observa-se destruição praticamente total e seletiva
dos lobos temporais, deixando lacunas de aspecto acentuadamente hipodenso nas fossas médias,
preenchidas por líquor. Lesões com este aspecto e localização são altamente sugestivas de
seqüela de encefalite herpética por HSV-1. A meningoencefalite por HSV-2 é habitualmente mais
difusa (http://anatpat.unicamp.br/radherpes5.html).
3
1.1) Histórico
O vírus Herpes Simples tipo 1 (HSV-1), também conhecido como Herpesvírus
Humano tipo 1 (HHV-1), foi documentado pela primeira vez pelo médico grego
Hipócrates (460/377 a.C.), que o batizou de herpes (do latim herpin = rastejar,
reptil) devido ao aspecto das lesões causadas pelo vírus, como vesículas no trato
bucal, febre e ulcerações nos lábios. Todas estas manifestações caracterizavam a
doença Herpes febrilis, que foi descrita mais tarde por Heródoto (484/425 a.C.).
No entanto, somente no século XX, entre 1920 a 1960, foi demonstrado que os
isolados virais infectavam uma imensa gama de hospedeiros, como ratos,
camundongos, coelhos, cobaias e macacos. Além disso, também foi demonstrado
que este vírus poderia se multiplicar rapidamente em cultura de células
fibroblásticas, epiteliais, nervosas e ovos embrionados, levando à lise celular. Em
1968, os pesquisadores Nahmias e Dowdle classificaram o vírus herpes no gênero
Simplex e, com base em diferenças imunológicas, epidemiológicas e clínicas,
separaram este vírus em duas espécies diferentes, classificando-os em HSV-1 e
HSV-2 (Miranda et al., 2002). Contudo, desde a última reunião do International
Comitee for Viruses taxonomy (ICVT) o vírus herpes simples tipo 1 foi classificado
como pertencente à família Herpesviridae e à subfamília -herpesvirinae, devido
as suas características genômicas, sorológicas, do ciclo replicativo e da latência
(Miranda et al., 2002).
4
1.2) Família Herpesviridae
A família Herpesviridae compreende os vírus envelopados, que possuem
DNA dupla fita linear (Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002). Nesta família
encontram-se uma grande quantidade de vírus (havendo mais de 100 conhecidos)
capazes de infectar virtualmente todos os vertebrados, incluindo o homem
(Boehmer & Lehman, 1997). Os 8 herpesvírus humanos (HHV) são divididos em
três subfamílias: (1) a -herpesvirinae, onde encontramos o vírus herpes simples
tipo 1 (HSV-1), o vírus herpes simples tipo 2 (HSV-2) e o vírus da varicela zoster
(VZV); (2) a -herpesvirinae, onde encontramos o citomegalovírus humano
(HCMV), herpesvírus humano tipo 6 (HHV-6) e o herpesvírus humano tipo 7 (HHV-
7); e a -herpesvirinae, onde encontramos o vírus Epstein-Barr (EBV) e o
herpesvírus humano tipo 8 ( HHV-8) (Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002).
Apesar do HSV-1 ser classicamente conhecido como causador do herpes
labial e o HSV-2 como causador do herpes genital, podemos encontrar infecções
por HSV-2 no sítio labial e por HSV-1 no trato genital (Bhattarakosol et al., 2005).
O VZV é o causador da catapora em crianças e herpes zoster na reativação da
latência, e o EBV é associado com a mononucleose infecciosa e com o linfoma de
Burkitt. Além do mais, todas as infecções por herpesvírus humanos, até mesmo
aquelas que produzem preferivelmente infecções benignas em indivíduos normais,
podem causar doença grave em pacientes imunodeprimidos. Por exemplo,
pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) podem
apresentar lesões cutâneas herpéticas crônicas e/ou disseminadas, e podem ter
5
recorrências freqüentes de herpes zoster disseminada. A infecção por HCMV pode
causar retinite, sendo a causa mais comum de cegueira em pacientes aidéticos,
além de ser associado com morbidade e mortalidade significantes em transplantes
de órgãos sólidos ou em receptores de transplantes de medula óssea. E o HHV-8
pode causar o sarcoma de Karposi em pacientes aidéticos, sendo esta uma
efermidade classicamente associada com a AIDS (Boehmer & Lehman, 1997;
Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002).
1.3) HSV-1
Como todos os herpesvírus, o HSV-1 é um vírus envelopado, que possui
genoma de DNA dupla fita linear dentro de um capsídeo icosaédrico que consiste
de 162 capsômeros (Kimberlin, 2003, p. 83). O nucleocapsídeo é circundado por
um tegumento protéico, que é composto majoritariamente pela proteína ICP5, e
também pelas proteínas VHS e -TIF, e por um envelope, onde estão inseridas
glicoporteínas codificadas pelo próprio vírus (Metttenleiter, 2004). O capsídeo
mede cerca de 100nm e a partícula viral completa do HSV-1 mede cerca de
150nm (Flakow, 1996) (Figura 5).
6
Figura 5: Eletromicrografia do HSV-1
(http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv2f.html).
O genoma consiste de dois segmentos de DNA covalentemente ligados,
designados de L (longo) e S (curto). Cada segmento consiste de uma seqüência
única flanqueada por repetições invertidas. Adicionalmente, os componentes
únicos L e S (UL e US, respectivamente) podem inverter um em relação ao outro,
criando quatro tipos diferentes de moléculas de DNA que diferem somente na
orientação das suas seqüências de DNA. Cada um dos quatro isômeros é
igualmente virulento na célula hospedeira (Kimberlim, 2003; Whitley & Roizman,
2001) (Figura 6). Após a infecção, o genoma viral linear circulariza-se e a
replicação do DNA é iniciada em um sítio denominado origem de replicação. A
eliminação da necessidade de um mecanismo especializado para replicar a
extremidade cromossômica é uma clara vantagem desta circularização (Boehmer
& Lehman, 1997).
7
Figura 6: Diagrama representativo da estrutura do genoma do HSV-1. As posições das repetições
a, b e c nas repetições terminais (TRL e TRS) e nas repetições internas (IRL e IRS), e as posições
das origens de replicação do DNA (oriL e oriS) estão sendo indicadas. A posição e a direção da
transcrição dos sete genes essenciais são indicados pelas setas. A área aumentada mostra a
composição da seqüência a, consistindo de repetições diretas (DR) 1, 2 e 3, e dos domínios únicos
(U) b e c. Abreviações: U, único; t, terminal; n, número variável de cópias; , orientação invertida; L,
longo; S, curto Sem escala (Boehmer & Lehman, 1997, p. 349).
1.4) Ciclo de Multiplicação do HSV-1
1.4.1) Adsorção, penetração e transporte intracelular
As etapas iniciais do ciclo de multiplicação do HSV-1 compreendem a
adsorção e a fusão. As cadeias de glicosaminoglicanas (GAGs) na superfície
celular, dentre as quais podemos ressaltar as heparan sulfato, fornecem sítios de
adsorção, uma vez que podem interagir com as glicoproteínas B e C do envelope
do HSV-1 (Scanlan et al., 2005) (Figura 7a). De acordo com o modelo atual para a
entrada do HSV-1, as heparans sulfato possuem um papel importante na
aderência das glicoproteínas virais C (gC) e B (gB) na superfície da célula alvo
(Tiwari et al., 2005, p. 930). Após isso, ocorre a ligação da glicoproteína viral D
8
(gD) com um de seus receptores da superfície celular (Figura 7b), que em
associação com outras 3 glicoproteínas: gB e o complexo gH/gL, leva a fusão do
envelope viral com a membrana plasmática da célula alvo (Figura 7c). Vários
receptores celulares para a gD do HSV-1 são conhecidos. Estes incluem o
herpesvirus entry mediator (HVEM), que é um membro da família do receptor do
fator de necrose tumoral (TNF), 2 membros da família de receptores da nectina, e
uma isoforma modificada da heparan sulfato: a heparan sulfato 3-O sulfatada (3-
OS HS). As modificações enzimáticas nas heparans sulfato para gerar as 3-OS
HS são catalisadas pela enzima sulfotransferase 3-O. O 3-OS HS é um receptor
de gD diferente das outras duas proteínas receptoras, porque ele é um
polissacarídeo que contém resíduos sulfatados específicos e atua como um
receptor para a adsorção assim como para a fusão, durante a entrada do HSV-1
(Tiwari et al., 2005; Scanlan et al., 2005). Estes receptores são expressos em
diferentes células e tecidos, determinando um importante papel na definição da
preferência viral para invadir células e tecidos específicos (Tiwari et al., 2005). Por
exemplo, o HVEM é expresso em muitos tecidos humanos fetais e adultos,
incluindo pulmão, fígado, rim, e tecidos linfóides (Tiwari et al., 2005) Por outro
lado, o receptor da nectina-1 é extensivamente expresso em células humanas de
origem epitelial e neuronal, assim como na córnea humana, enquanto o receptor
da nectina-2 é amplamente expresso em muitos tecidos humanos, mas com
somente uma expressão limitada em células neuronais e em queratinócitos. Já o
receptor não protéico 3-OS HS é expresso em muitas linhagens de células
humanas, como células neuronais e endoteliais (Tiwari et al., 2005).
9
Figura 7: Esquema representativo da entrada do HSV-1 na célula hospedeira
(http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv4f.html).
Em seguida, o nucleocapsídeo nú (desenvelopado) é transportado para o
núcleo da célula, sendo que proteínas do tegumento parecem ainda estarem
associadas com o capsídeo. Depois que o nucleocapsídeo alcança os poros do
núcleo, o DNA viral é translocado no nucleoplasma (Garner, 2003). A proteína do
tegumento denominada VHS (virus host shutoff), produto do gene UL41,
permanece no citoplasma e interage com uma proteína celular para degradar
(a)
(b)
(c)
(d)
10
RNAm do hospedeiro logo após a infecção. A -TIF (VP16), outra proteína do
tegumento, é liberada no núcleo juntamente com o DNA viral e regula a expressão
de genes (como será visto mais adiante) (Whitley & Roizman, 2001) (Figura 7d).
1.4.2) Etapa de Replicação
O ciclo lítico do HSV-1 envolve a expressão de três conjuntos de genes
virais: Imediatamente iniciais ou de fase , iniciais ou de fase
e tardios ou de
fase
(Hancock, Corcoran & Smiley, 2006). Na fase
são produzidas
principalmente proteínas que regulam a replicação viral, na fase
são produzidas
proteínas que sintetizam e empacotam o DNA viral, e na fase
são produzidas
proteínas que, em sua maioria, constituem o vírion (Whitley & Roizman, 2001). A
fase
tem início quando a proteína do tegumento viral, -TIF, se liga aos fatores
celulares HCF e OCT-1, e o complexo resultante (denominado complexo de pré-
iniciação) associa-se a seqüências alvo específicas nos promotores dos genes de
fase , situados no genoma viral (Hancock, Corcoran & Smiley, 2006) (Figura 8).
Então, inicia-se a produção de proteínas de fase . O HSV-1 codifica 5 genes de
fase : as proteínas de célula infectada 0, 4, 22, 27 e 47 (ICP0, ICP4, ICP22,
ICP27 e ICP47, respectivamente) (Quinn; Dalziel & Nash, 2000) A ICP0, atua
como um transativador promíscuo de genes, estimulando a expressão de genes
do HSV pertencentes a todas as três classes temporais (fases ,
e ) durante a
infecção lítica (Hancock, Corcoran & Smiley, 2006). A ICP4 é uma proteína
ligadora de DNA que interage com fatores de transcrição para ativar a transcrição
11
da maioria dos genes de fase
e , e reprimir a transcrição de certos genes de
fase
(Olesky, 2005). Mesmo não sendo essencial para a replicação do HSV-1
em cultura, a ICP22 é necessária para uma expressão eficiente de genes de fase
, assim como um subconjunto de genes de fase
(O Toole et al., 2003). A ICP27
reprime a expressão de certas proteínas de fase
e , e induz a expressão de
proteínas de fase
(Olesky, 2005). A ICP27 também contribui para a diminuição
na expressão de genes celulares pela inibição do processamento do pré-RNAm
(Lindberg & Kreivi, 2002). A ICP47 se liga às proteínas transportadoras TAP1 ou
TAP2 e as impede de transportar peptídeos para o retículo endoplasmático, para o
acoplamento ao MHC de classe I (Whitley & Roizman, 2001). As proteínas de fase
incluem as enzimas que são necessárias para a replicação do genoma viral:
DNA polimerase (complexo UL30/UL42); timidina cinase (TK); proteína ligadora de
DNA fita simples (SSB), também conhecidas como ICP8; DNA helicase-primase;
proteína ligadora de origem (proteína UL9); e aquelas envolvidas no metabolismo
de nucleotídeos (Figura 9). Homólogos destas enzimas são encontrados
virtualmente em todos os herpesvírus. O programa temporal de expressão dos
genes termina com o aparecimento das proteínas de fase , que constituem as
proteínas estruturais da partícula viral (Boehmer e Lehman, 1997).
12
Figura 8: Formação do complexo de pré-iniciação (Wysocka & Herr, 2003, p. 295).
13
14
Figura 9: Modelo da replicação do DNA do HSV-1. 1-3: Sucessiva ligação, giro e distorção de oriS
pela proteína UL9. I, II e A+T representam os sítios de reconhecimento da proteína UL9 (os Boxes
I e II, e a região A+T, respectivamente). As setas convergentes indicam a orientação relativa dos
Boxes I e II. As setas divergentes indicam a transcrição dos promotores de ICP4 e de ICP22/47. 4:
Ligação de ICP8 com a proteína UL9 e o DNA distorcido. 5: Desenrolamento do DNA, dependente
de ATP, que gera fitas de DNA cobertas por ICP8. 6A: Recrutamento da DNA helicase-primase
15
(UL8-5/52) pela proteína UL9, seguida pela síntese do primer (linha curvada) e dissociação da
proteína UL9. 6B: Recrutamento da DNA polimerase -primase (Pol -Primase) pela proteína UL9,
seguida pela síntese do primer (linha curvada) e pelo alongamento, e a dissociação da proteína
UL9 e da DNA polimerase -primase. 7: Desenrolamento da bolha de replicação e inserção do
primer na fita atrasada pela DNA helicase-primase. Síntese de DNA na fita de leitura e na fita
atrasada promovida pela DNA polimerase do HSV-1 (Pol/UL42). As setas indicam a direção da
translocação das proteínas envolvidas no processo (Bohemer & Lehman, 1997, p. 360-361).
Após a montagem das partículas virais no núcleo da célula hospedeira
(Figura 10), o nucleocapsídeo viral é envelopado, através da fusão com a
membrana nuclear interna, havendo o aumento de vírus envelopados no espaço
perinuclear. Para que as partículas virais possam ser liberadas do núcleo da célula
hospedeira ocorre a fusão do envelope viral com a membrana nuclear externa,
havendo uma acumulação de capsídeos sem envelope no citoplasma. Os
capsídeos são então re-envelopados por vesículas derivadas do complexo de
Golgi. Esta última etapa pode estar sendo mediada por interações entre proteínas
do tegumento viral e porções citoplasmáticas de glicoproteínas virais, que já
estariam inseridas nas vesículas derivadas do Golgi (Melancon et al., 2004)
(Figura 11).
16
Figura 10: Esquema representativo da montagem do nucleocapsídeo viral
(http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv4f.html).
Figura 11: Esquema representativo da liberação das partículas virais de HSV-1 da célula
hospedeira (http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv4f.html).
17
1.4.3) Latência
Após a infecção e replicação local nas mucosas, o HSV-1 pode alcançar o
terminal nervoso. O vírus é conduzido por transporte axonal retrógrado para os
corpos das células nervosas, resultando muito freqüentemente em uma infecção
latente destes neurônios. O padrão temporal de expressão genética não é
observada em células infectadas latentemente, onde a expressão genética viral
restringe-se aos transcritos associados com a latência (LATs) (Quinn; Dalziel &
Nash, 2000). Os principais sítios de latência no homem são os gânglios trigêmios
e dorsais, e uma variedade de estímulos (tais como estresse físico ou emocional,
febre, luz ultravioleta, e lesão tecidual) pode resultar na reativação de vírus
latentes. Estes vírus, então, retornam pelos axônios, produzindo um novo ciclo de
infecção produtiva no sítio da infecção inicial ou próximo deste sítio, podendo
resultar no reaparecimento da doença (Quinn; Dalziel & Nash, 2000; Kimberlin,
2003; Kimberlin & Whitley, 2005) (Figura 12).
18
Figura 12: Latência e reativação do HSV-1. a) Translocação do DNA viral para o núcleo da célula
epitelial; b) Transporte axonal retrógrado; c) Transporte axonal anterógrado
(http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/03006987h.htm).
Durante o período de latência o HSV-1 associa-se a histonas, formando um
DNA epissomal. Além disso, a latência ocorre principalmente no sistema nervoso
onde há uma maior expressão do fator nuclear OCT-2 em relação a isoforma
OCT-1, que é expressa principalmente em outros tecidos. Na maioria dos tecidos
a proteína do tegumento viral -TIF interage preferencialmente com a proteína
OCT-1. Esta ligação é estabilizada pelo fator HCF proporcionando a formação do
complexo de pré-iniciação junto ao TATA Box do genoma do HSV-1, iniciando a
transcrição de genes de fase alfa e conseqüente infecção produtiva (Preston,
2000).
19
1.5) Algumas das Principais Drogas Utilizadas no Tratamento de Infecções
por HSV-1
1.5.1) Aciclovir e Valaciclovir
O aciclovir (ACV) (Figura 13) é um análogo da deoxiguanosina que atinge
especificamente células infectadas pelo vírus herpes. Isto ocorre porque a primeira
fosforilação que ele sofre é catalisada pela timidina cinase viral. Depois, as
cinases celulares executam as fosforilações subseqüentes, produzindo o aciclovir
trifosfatado, que é a forma biologicamente ativa, atuando como um inibidor
competitivo da DNA polimerase viral (Bredy & Bernstein, 2004; Morfin &
Thouvenot, 2003; Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002; De Clercq, 2004). Após
a incorporação do aciclovir trifosfatado na cadeia de DNA, ele atua como um
terminador de cadeia pela ausência do grupo 3 -hidroxil que permitiria o
alongamento da cadeia de DNA (Gilbert, Bestman-Smith & Boivin, 2002) (Figura
14).
Figura 13: Fórmula estrutural do aciclovir e da guanosina
(http://www.geocities.com/gdh5n1/h5n1_9.html).
20
Figura 14: Mecanismo da ação antiviral do aciclovir (ACV). O ACV atua nas DNA polimerases
virais, tal como a DNA polimerase dos herpesvírus. Antes que ele possa interferir com a síntese de
DNA viral, ele necessita ser fosforilado intracelularmente, em três passos, até a forma trifosfatada.
A primeira fosforilação é executada pela timidina cinase codificada pelo HSV, e, portanto,
ocorrendo em células infectadas (De Clercq, 2004, p. 125).
O valaciclovir (Figura 15) é um éster L-valina do aciclovir que atua como uma
pró-droga oral do mesmo. Desse modo, o valaciclovir é absorvido e convertido a
aciclovir no fígado (Bredy & Bernstein, 2004; De Clercq, 2004).
21
Figura 15: Fórmula estrutural do valaciclovir (De Clercq, 2004, p. 125).
1.5.2) Penciclovir e Fanciclovir
O penciclovir (Figura 16) é um análogo da deoxiguanosina e o seu
mecanismo de ação é similar ao do aciclovir. Embora o penciclovir trifosfatado
seja 100 vezes menos potente na inibição da DNA polimerase viral do que o
aciclovir trifosfatado, alcança altas concentrações intracelulares e tem vida longa
nas células infectadas pelo HSV (Bredy & Bernstein, 2004; Gilbert; Bestman-Smith
& Boivin, 2002).
22
Figura 16: Fórmula estrutural do penciclovir (De Clercq, 2004, p. 126).
O fanciclovir (Figura 17) é um éster diacetil do penciclovir que atua como uma
pró-droga oral do mesmo. É bem absorvido no trato gastrointestinal (70%) e a sua
conversão em penciclovir ocorre através da hidrólise de dois grupos acetil e de
uma oxidação na posição 6 (Bredy & Bernstein, 2004; De Clercq, 2004).
Figura 17: Fórmula estrutural do fanciclovir (De Clercq, 2004, p. 126).
23
1.5.3) Foscarnet
O foscarnet (Figura 18) inibe diretamente a DNA polimerase viral e não
necessita ser fosforilado pela timidina cinase viral (Bredy & Bernstein, 2004). O
foscarnet é um análogo do pirofosfato que interfere com a ligação do pirofosfato
(difosfato) com seu sítio de ligação na DNA polimerase viral, durante o processo
de polimerização do DNA (De Clercq, 2004). A inibição da replicação viral é
conseqüência da prevenção da clivagem do pirofosfato do deoxinucleotídeo
trifosfatado, resultando em uma incapacidade de alongar o DNA (Whitley, 2002). A
significante toxicidade limita seu uso contra o HSV somente no caso de infecções
por cepas resistentes ao aciclovir (Bredy & Bernstein, 2004).
Figura 18: Fórmula estrutural do foscarnet (De Clercq, 2004, p. 128).
1.5.4) Cidofovir
O cidofovir (Figura 19), um análogo da citidina, é um aciclonucleosídeo
fosfonatado (ANP) que deve ser fosforilado para sua forma difosfatada por cinases
da célula hospedeira para exercer sua atividade antiviral. O cidofovir difosfatado
inibe seletivamente a DNA polimerase viral, agindo como um terminador de cadeia
24
(Bredy & Bernstein, 2004; De Clercq, 2004; Gilbert; Bestman-Smith & Boivin,
2002) (Figura 20). O cidofovir apresenta uma substancial nefrotoxicidade quando
admininstrado pela via intravenosa e o seu no tratamento de infecções por HSV é
restrito às infecções por cepas resistentes ao aciclovir e ao foscarnet (Bredy &
Bernstein, 2004).
Figura 19: Fórmula estrutural do cidofovir (De Clercq, 2004, p. 128).
25
Figura 20: Mecanismo da ação antiviral do cidofovir (HPMPC). O HPMPC necessita ser
fosforilado, em dois passos, até a forma difosforiladapara, para que ele possa atuar como um
terminador de cadeia (De Clercq, 2004, p. 129).
1.6) Substâncias Testadas neste Trabalho
1.6.1) Derivados 1,4 aminoálcoois contendo anel 1,2,3 triazólico (ou
Derivados Aminoálcoois)
Os derivados aminoálcoois (Figura 24) foram sintetizados tomando como
base um análogo nucleosídico da purina denominado 1- -D-ribofuranosyl-1,2,4-
triazole-3-carboxamide (ribavirina) (Figura 21). A estrutura da ribavirina não é tão
semelhante aos nucleosídeos naturais. Entretanto, ela é similar a estrutura do
26
AICAR, um precursor biossintético das purinas. O AICAR monofosfatado na
posição 5 é um intermediário na síntese de novo de nucleotídeos purínicos.
Quando o anel triazólico está aderido à ribose, a ribavirina parece um análogo
ribonucleosídico, e não um análogo deoxiribonucleosídico. A estrutura do anel
triazólico da ribavirina é muito similar à nicotinamida, que é um componente das
coenzimas envolvidos com várias desidrogenases, como a nicotinamida adenina
dinucleotídeo (NAD) e a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP). Os
derivados aminoálcoois possuem um anel triazólico em sua estrutura, assim como
a ribavirina. A ribavirina foi primeiramente sintetizada em 1972 (Parker, 2005),
sendo o primeiro nucleosídeo antiviral sintético de amplo espectro (Graci &
Camerom, 2002). Atualmente, a ribavirina tem sido utilizada clinicamente em
combinação com o interferon-
no tratamento de infecções pelo vírus da hepatite
C (HCV) e como monoterapia para o tratamento de infecções pelo vírus da febre
Lassa e pelo vírus sincicial respiratório (Graci & Camerom, 2002). A ribavirina é
admininstrada como um nucleosídeo. Uma vez na célula, é rapidamente
convertida à ribavirina monofosfatada (RMP) pela cinase de adenosina.
Fosforilações seqüenciais levam à formação e acumulação de ribavirina
trifosfatada (RTP) (Graci & Camerom, 2002).
Enquanto.a ribavirina apresenta atividade antiviral em laboratório contra uma
ampla variedade de vírus de DNA e de RNA, o seu mecanismo de ação ainda é
discutido (Graci & Camerom, 2002). A RMP tem se mostrado como um inibidor da
desidrogenase de inosina monofosfatada (IMPDH), uma enzima celular necessária
para a síntese de novo da guanosina trifosfatada (GTP) (Figura 22). Visto que o
27
GTP é necessário para a transcrição, tradução e/ou replicação de todos os vírus,
pequenas reduções no pool de GTP celular poderiam resultar no amplo espectro
da atividade antiviral da ribavirina (Graci & Camerom, 2002). Além do mais, com
alguns vírus, a atividade antiviral da ribavirina é prevenida (pelo menos
parcialmente) pela administração de guanosina. Entretanto, com outros vírus (RSV
e vírus da vaccínia) isto não acontece (Parker, 2005). Então, outros mecanismos
de ação para a ribavirina têm sido propostos. Recentemente, numerosos
pesquisadores têm sugerido que o tratamento com ribavirina induz mutações no
genoma viral de RNA. Estes pesquisadores têm observado que a aumentada
freqüência de mutações resulta na produção de genomas defeituosos. Isto
ocorreria porque a ribavirina poderia parear com a citidina e com a uridina (Parker,
2005) (Figura 23). Contudo, o uso terapêutico da ribavirina é limitado pela sua
toxicidade, que consiste principalmente de anemia, visto que ela pode acumular-
se nas células vermelhas do sangue, causando hemólise, e de teratogenicidade
(Di Stefano et al, 1997; Grancher et al, 2004).
28
Figura 21.: Estrutura da ribavirina e de moléculas semelhantes (Parker, 2005, p. 166).
Figura 22.: Metabolismo das purinas em células humanas. A inibição da IMP desidrogenase
resulta na inibição da produção de GTP e de dGTP. Abreviações: RR, ribonucleotídeo redutase;
APRT, adenina fosforibosiltrasnferase; Ado kinase, quinase de adenosina; HGPRT,
hipoxantina/guanina fosforibosiltrasnferase; PNP, fosforilase de nucleosídeos de purina (Parker,
2005, p. 166).
29
Figura 23.: Capacidade de pareamento promíscuo de bases da ribavirina. Abreviações: R, ribose
(Graci & Camerom, 2002, p. 176).
Os derivados aminoálcoois testados foram: 1) (2S,3S)-6,6-Dimetil-3-(2 -fenil-
2 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil)-biciclo[3.1.1]heptan-2-ol (ADNHR); 2) (2S,3S)-6,6-
Dimetil-3-(1 -fenil-1 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil)-biciclo[3.1.1]heptan-2-ol (ADLEHR); 3)
(2S,3S)-3-[1 -(3 -clorofenil)-1 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil]-6,6-Dimetil- biciclo[3.1.1]
heptan-2-ol (ADClHR); 4) (2S, 3S)-3-[1 -(4 -fluorofenil)-1 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil]-
6,6-Dimetil- biciclo[3.1.1] heptan-2-ol (ADFHR). Estas substâncias foram
sintetizadas no Departamento de Química Orgânica da UFF pelo aluno Ronaldo C.
S. Júnior, orientado pelo professor Sérgio Pinheiro.
OH
N
N
N
NN
N
OH
NN
N
OH Cl
OH
FNN
N
ADClHR
ADFHRADLEHR
ADNHR
Figura 24: Derivados Aminoálcoois.
30
1.6.2) Derivados 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-carbonitrilas (ou
Derivados do Sistema Tienopiridina).
Desde a descoberta dos derivados 4-anilino-1H-pirazolo[3,4-b]piridina como
uma nova classe de inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa do HIV-
1 (NNRTI) (Bernardino et al., 1996), vários estudos têm sido feitos a fim de
investigar o relacionamento da estrutura com a atividade destes moléculas e,
assim, potencializar sua antividade antiviral (Azevedo et al., 2002a; Azevedo et al,
2002b; Bernardino et al., 1996). Então, a síntese das novas 4-
(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas ocorreu pela reação nucleofílica do 5-carboetoxi-4-
clorotieno[2,3-b]piridina com diferentes anilinas. Desse modo, é esperado que as
substâncias obtidas possam reter o potencial antiviral em comparação aos
derivados pirazolo-piridina parentes.
Além disso, diversas atividades, inclusive atividades biológicas, já foram
descritas para moléculas com o sistema Tienopiridina ou com estruturas
relacionadas. Estas substâncias já foram descritas sendo utilizadas como corantes
(Ho, 2005), atuando na prevenção da arteriosclerose (Suzuki et al., 2001), no
sistema cardiovascular; (McCort, et al., 2001), como anti-inflamatórios (Cardoso et
al., 2002), no tratamento da asma (Cardoso et al., 2002), na prevenção do
reumatismo e da artrite (Beaton et al., 2001), tendo atividade antiprotozoária
(Mello et al., 2004), antitumoral (Hayakawa et al., 2004; Munchhof et al., 2004),
anticonvulsivante (Amano et al., 2004), antibacteriana (Lohray et al., 2004) e
antiviral (Hartline, et al., 2005).
Os derivados do sistema Tienopiridina (Figura 25) (Tabela 1) testados foram:
31
1) 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (101);
2) 4-(2 -metil-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (102)
3) 4-(4 -metil-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (104);
4) 4-(2 -carboxi-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (105);
5) 4-(3 -nitro-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (109);
6) 4-(4 -nitro-fenilamino)tiieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (110);
7) 4-(3 -flúor-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (112);
8) 4-(4 -flúor-fenilamino)tiieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (113);
9) 4-(4 -bromo-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (119).
Estas substâncias também foram sintetizadas no Departamento de Química
Orgânica da UFF pelo aluno Luis Pinheiro, orientado pela professora Alice
Bernardino.
S
NH
CN
S
NH
CN
CH2OH
S
NH
CN
F
S
NH
CN
CH3
S
NH
CN
NO2
S
NH
CN
F
S
NH
CN
CH3
S
NH
CN
O2N
S
NH
CN
Br
102 104101
105 109 110
112 113 119
Figura 25: Fórmula estrutural dos derivados 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-carbonitrilas.
32
2) OBJETIVOS
2.1) Objetivos Gerais
Como as drogas utilizadas no combate a infecção por HSV-1 podem causar
efeitos colaterais e, devido ao surgimento de cepas de HSV-1 resistentes aos
drogas de referência, como o aciclovir, nosso objetivo é encontrar novas
moléculas com atividade anti-HSV-1, baixa citoxicidade e caracterizar o
mecanismo de ação das substâncias mais promissoras.
2.2) Objetivos Específicos
Avaliar a citotoxicidade das substâncias, determinando seu valor de CC50,
através dos ensaios de exclusão do corante vital Azul de Trypan ou de
redução mitocondrial do sal de tetrazolium (MTT). Para algumas substâncias,
também foi avaliado seu efeito na atividade da DNA polimerase
de células
Vero;
Avaliar o potencial antiviral das substâncias através do ensaio de inibição do
efeito citopático viral e do ensaio de inibição da produção de partículas virais;
Determinar o índice de seletividade in vitro da substância mais promissora;
Determinar o possível alvo de ação das substâncias no ciclo replicativo do
HSV-1, avaliando seu efeito na síntese protéica de células infectadas e na
atividade da DNA polimerase viral;
Estudar a citotoxicidade in vivo das substâncias mais promissoras, avaliando
seus efeitos nos níveis de glicose, ácido úrico, uréia e TGP.
33
3) MATERIAL E MÉTODOS
3.1) Células e Drogas
Foram utilizadas células VERO, que são culturas contínuas de fibroblastos de
rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops). Estas células foram
cultivadas em DMEM (Dulbecco's modified Eagle s medium) contendo 5% de soro
fetal bovino (SFB), 100U/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina e
2,5 g/mL de anfotericina B (fungizona). As culturas foram mantidas a 37ºC em
atmosfera com 5% de CO2. Durante a passagem, as células foram tratadas com
PBS-1X/EDTA (Reagen) e tripsina 0,25% (GIBCO).
Neste trabalho foram testadas substâncias de duas classes: Derivados
aminoálcoois e derivados do sistema Tienopiridina. Todas as substâncias foram
sintetizadas no Departamento de Química Orgânica da Universidade Federal
Fluminense, diluídas em Dimetilsulfóxido (DMSO) 100% e estocadas a 4ºC nas
concentrações de 50mM. Durante os testes, as substâncias foram diluídas em
DMEM com soro.
Foram testados neste trabalho 4 derivados aminoálcoois: ADNHR, ADLEHR,
ADClHR e ADFHR, e 9 derivados do sistema Tienopiridina: 101, 102, 104, 105,
109, 110, 112, 113 e 119.
34
3.2) Ensaio para Avaliação da Citotoxicidade das Substâncias
A citotoxicidade foi avaliada por dois métodos:
a) Ensaio de Exclusão do Corante Vital Azul de Trypan
No primeiro método, células Vero foram cultivadas em placas de 24 poços
em uma densidade de 4 x 104 células/poço Em alguns poços, as células foram
mantidas em contato com os derivados testados em diferentes concentrações e
em outros, nenhuma substância foi adicionada (grupo controle), permanecendo
assim por 72h a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2. Após este período, as
células foram tratadas com PBS/EDTA, tripsinizadas e coradas com Azul de
Trypan a 0,04% em PBS. Assim, a viabilidade celular foi calculada e, depois,
comparamos a viabilidade dos poços tratados com a dos poços controle. A
fórmula utilizada para o cálculo da viabilidade celular foi o seguinte:
b) Ensaio de Redução Mitocondrial do Sal de Tetrazolium (MTT)
No segundo método, células Vero foram mantidas em placas de 96 poços em
uma densidade de 1 x 104 células/poço. Em alguns poços, as células foram
mantidas em contato com os derivados em diferentes concentrações e em outros,
nenhum derivado foi adicionado (grupo controle), permanecendo por 72h a 37ºC
em atmosfera com 5% de CO2. Após esse período, foi adicionado MTT a 5mg/mL.
Viabilidade (%) = No
de Células Viáveis x 100
No
de Células Totais
35
Após 4h de incubação a 37ºC foi adicionado 100 L da solução de 10% de SDS,
0,01N de HCl e após 24h os poços foram analisados em leitor de Elisa a 540 e
620nm. Os resultados foram analisados comparando a absorbância dos poços
tratados com os controles (Mosmann, 1983).
3.3) Obtenção da DNA Polimerase de Células Vero
Um extrato não purificado foi obtido a partir de células Vero não infectadas.
Estas células foram lisadas com um tampão específico contendo 0,25 mM fosfato
de potássio (pH 7,2), 10mM de 2-mercaptoetanol, 1mM EDTA, 0,5% Triton-X-100,
20% de glicerol e 0,5 mM de PMSF. Em seguida, as células foram sonicadas 8X
por 15 segundos e o conteúdo foi centrifugado a 12.000 rpm (Sorvall RCS. 5B) por
10 min a 4ºC (Knopf, 1979).
3.4) Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de Células Vero
Com a finalidade de avaliarmos a citotoxicidade das substâncias frente à
enzima DNA polimerase celular , a reação enzimática foi realizada por 30 min a
37ºC em um tampão específico. Este tampão continha, contendo 50 mM Tris-HCl
(pH 8,0), 8 mM de cloreto de magnésio, 0,5 mM DTT, 0,1 mM de dATP, 0,1 mM de
dGTP, 0,1 mM de dCTP, [3H] dTTP (0,5 Ci/nmol), 25 g de DNA ativado (DNA de
esperma de salmão) e a substância testada na concentração de 50 M em um
volume final de 100 L. No final da reação, foi adicionado TCA 10%, e, então, as
36
amostras foram filtradas em filtros de fibra de vidro GF/C (Whatman) previamente
lavados com TCA 10%, e a radioatividade incorporada foi determinada por
cintilação de fase líquida (Knopf, 1979).
3.5) Vírus
As partículas virais (cepa AR-29, resistente ao aciclovir, gentilmente cedida
pela professora Márcia Wigg da Universidade Federal do Rio de Janeiro) foram
diluídas em meio DMEM sem soro e multiplicadas em células Vero, utilizando-se
uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 (Lagrota et al., 1994; Esquenazi et al.,
2002). Após 24h pós-infecção (p.i.), as células foram lisadas por ciclos de
congelamento e descongelamento. O conteúdo foi centrifugado a 400x g por
20min a 4ºC e o título viral foi dosado pelo ensaio de redução de placas virais
(Kuo et al., 2001).
3.6) Ensaio de Redução de Placa Virais
Para determinarmos o título viral, células Vero, mantidas em placas de 6
poços em uma densidade de 3x105 células/poço, foram infectadas com diferentes
diluições de HSV-1 por 1h a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2. Após este
período, o inóculo viral foi retirado e as monocamadas cobertas com DMEM com
5% de soro fetal bovino e 1% de Metilcelulose (Fluka) (meio para ensaio de
redução de placas virais). Após 72h as monocamadas de células foram fixadas
com 10% de formaldeído e coradas com 0,1% de cristal violeta. Em seguida as
37
placas virais foram contadas e o título do vírus foi determinado de acordo com o
número de placas virais (PFU/mL).
3.7) Ensaio de Inibição do Efeito Citopático
A avaliação da inibição do efeito citopático viral pelas substâncias foi
realizada em células Vero, mantidas em placas de 96 poços (1 x 104 células/poço)
e infectadas com diferentes diluições de HSV-1 durante 1h a 37ºC em atmosfera
com 5% de CO2. Após este período, o inóculo viral foi retirado e as células foram
tratadas com as substâncias nas concentrações de 50 M. Após 72h, o título viral
foi determinado na presença e na ausência dos derivados. Ao comparar o título do
grupo controle (células infectadas apenas) com o do grupo tratado (células
infectadas e tratadas), determinamos a porcentagem de inibição do efeito
citopático viral causado pelas substâncias testadas (Reed & Muench, 1938).
3.8) Ensaio de Inibição da Produção de Partículas Virais
Células Vero, mantidas em placas de 24 poços em uma densidade de 1 x 105
células/poço, foram infectadas com HSV-1 utilizando-se MOI de 1 por 1h a 37ºC
em atmosfera com 5% de CO2. Após esse período as células foram tratadas com
diferentes concentrações dos derivados em DMEM contendo 5% de SFB. As
células foram lisadas por 3 ciclos de congelamento e descongelamento 20h p.i. O
sobrenadante foi titulado pelo ensaio de inibição do efeito citopático.
38
3.9) Efeito do Tratamento na Síntese Protéica de Células Infectadas
Células foram mantidas em garrafas de cultura de 25 cm2 (2 x 106 células) e
infectadas ou não com HSV-1 com MOI de 1 por 1h a 37ºC. Em seguida, o vírus
residual foi lavado e as células foram incubadas na presença ou ausência de do
derivado 109 na concentração de 50 M. Após 4h de infecção foi adicionado [35S]-
Metionina (50 Ci/mL) e mantido por 2h quando as culturas foram lisadas com T
(Tris-HCl (pH 6,8) 1M; azul de bromofenol 0,02%; -mercaptoetanol 5%; SDS
10%; glicerol 10%).
Para que fosse realizada a mensuração da radiação por cintilação de fase
líquida, as amostras foram tratadas com TCA 10% e filtradas em filtros de fibra de
vidro (Whatman) GF/A.
3.10) Obtenção da DNA Polimerase de HSV-1
Células Vero foram infectadas com MOI de 5 por 12h em atmosfera com 5%
de CO2. Após esse período foi adicionado um tampão específico (0,25 mM fosfato
de potássio (pH 7,2), 10mM de 2-mercaptoetanol, 1mM EDTA, 0,5% Triton-X-100,
20% de glicerol e 0,5 mM de PMSF), as células foram sonicadas 8X por 15
segundos e o conteúdo foi centrifugado a 12.000 rpm (Sorvall RCS. 5B) por 10
min a 4ºC (Knopf, 1979).
39
3.11) Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de HSV-1
A reação enzimática foi realizada por 30 min a 37ºC em um volume final de
100 L, contendo 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM DTT, 8 mM MgCl2, 100 mM
sulfato de amônia, 0,1 mM dNTP, sendo [3H]-dTTP (0,5 Ci/nmol) e 25 g de DNA
de esperma de salmão desnaturado. Os derivados aminoálcoois foram testados
na concentração de 50 M e o derivado 109 na concentração de 0,1 nM. Após
esse período a reação foi interrompida pela adição de TCA 10%. As amostras
foram filtradas em filtros de fibra de vidro GF/C (Whatman) previamente lavados
com TCA 10%, e a radioatividade incorporada foi determinada por cintilação de
fase líquida (Knopf, 1979).
3.12) Estudo da Toxicidade in vivo
Foram injetados 250 L do derivado 109 na concentração de 2mg/mL em
cada animal (ficando em uma concentração final em torno de 300 M/g), sendo
que nos controles foram injetados 250 L de DMSO 1%, e avaliada a sua influência
nos níveis sangüíneos de glicose, uréia, ácido úrico e de transaminase glutâmico-
pirúvica (TCP).
Para a dosagem dos níveis destas substâncias, camundongos foram
sangrados pela região retro-orbital anteriormente e após o tratamento, e a amostra
de sangue ficou em repouso por 2h, sendo, posteriormente, centrifugada à 1500
r.p.m. por 10 minutos. No caso específico da avaliação dos níveis de glicose,
40
também foi adicionado o anticoagulante fluoreto de potássio. Todos os
camundongos utilizados eram fêmeas, da linhagem Balb/c, com 20 a 25g de peso
e 2 meses de idade.
A quantificação da glicose, da uréia, do ácido úrico e do TCP foi feita com kits
(Gold Analisa Diagnóstica) específicos para cada um, por método enzimático
colorimétrico. Este experimento foi realizado no Departamento de Imunologia da
UFF pela aluna Valéria Garrido Martins, orientada pelas professoras Izabel
Frugulhetti e Gerlinde Teixeira.
A análise estatística dos dados foi feita utilizando o programa Excel, para
Windows. A significância dos dados foi determinada através do teste t de Student.
Utilizamos um intervalo de confiança de 95%; logo, valores de P < 0,05 foram
considerados significativos.
41
4) RESULTADOS
4.1) Avaliação da Citotoxicidade
A citotoxicidade foi definida por Nardone (1977) como sendo o conjunto de
alterações da homeostase celular que leva a uma série de modificações que
interferem na capacidade adaptativa das células, bem como na sobrevivência,
multiplicação e realização de suas funções metabólicas. A intensidade da lesão
celular depende de vários fatores, tais como a concentração do material testado, o
tempo de exposição, o tipo de célula, a capacidade da substância em penetrar na
célula, entre outras (Hu & Hsiung, 1989).
Para avaliar a citotoxicidade das substâncias testadas, utilizamos os ensaios
de exclusão do corante vital Azul de Trypan ou da redução mitocondrial do sal de
tetrazolium (MTT). Por meio destes métodos, buscamos a concentração das
substâncias necessária para inibir em 50% a viabilidade de células Vero (CC50).
Foi observado que entre os derivados aminoálcoois, as moléculas que
apresentavam radicais halogenados foram as que exibiram menores
citotoxicidades. A molécula que apresentava radical cloro (ADClHR) e a que
apresentava o radical flúor (ADFHR) apresentaram valores de CC50 > 200 M e
>300 M, respectivamente (Tabela 1).
42
Tabela 1: CC50 dos derivados aminoálcoois.
Derivados Aminoálcoois CC50 ( M)
ADNHR >75ADLEHR <200
ADClHR >200
ADFHR >300
Em relação aos derivados do sistema Tienopiridina, foi observado que, em
geral, todos os valores de CC50 destas substâncias foram bastante próximos entre
si. Vale ressaltar que dentre estas moléculas, aquela sem substituição no anel
fenilamino (derivado 101) exibiu a menor citotoxicidade, apresentando um valor de
CC50 >300 M (Tabela 2).
Tabela 2: CC50 dos derivados do sistema Tienopiridina.
Derivados Tieno-Piridina Radical CC50 ( M)
101 R = H >300104 R = p-CH3 <300
109 R = m-NO2 <300
110 R = p-NO2 <300
112 R = m-F <300113 R = p-F <300119 R = p-Br <700
4.2) Ensaio de inibição da Atividade da DNA Polimerase de Células Vero
As DNA polimerases são enzimas fundamentais que participam do processo
de replicação do DNA (Holmberg, Henry & Romesberg, 2005). A inibição da
atividade destas enzimas poderia ser um possível mecanismo de citotoxicidade
43
das substâncias testadas. Sendo assim, avaliamos a influência dos derivados na
atividade da enzima DNA polimerase
celular, isoladas de células Vero. Foi
observado que nenhum dos derivados aminoálcoois inibiu a atividade desta
enzima (Figura 26).
Efeito dos Aminoálcoois na DNA Polimerase Alfa de Células Vero
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
150,0
ADNHR ADLEHR ADClHR ADFHR Controle
C.
P.
M (
% d
o C
on
tro
le)
Figura 26: Efeito dos derivados aminoálcoois na atividade da enzima DNA polimerase
de
células Vero. Os resultados foram expressos em % do controle desvio padrão da média (n = 3).
4.3) Avaliação da Atividade Antiviral
Para avaliar se as substâncias estudadas apresentavam potencial antiviral,
foi utilizado o teste de inibição do efeito citopático viral (Reed & Muench, 1938).
Efeito citopático é o conjunto das modificações provocadas pelas partículas virais
nas células hospedeiras. A maioria dos vírus provoca modificações celulares
específicas e possíveis de se observar ao microscópio. No caso do HSV, o efeito
citopático se expressa pelo aparecimento de células arredondadas, brilhantes,
44
freqüentemente ligadas umas às outras por prolongamentos citoplasmáticos,
formando focos de infecção. Esses focos têm aspecto característico de cachos de
uva, que se estendem pelo tapete celular, desorganizando-o (Girard & Hirth,
1989).
Com relação aos derivados aminoálcoois, os melhores resultados foram
obtidos com as moléculas sem a inserção de radicais halogenados. O ADNHR e o
ADLEHR, que não possuem tais radicais, apresentaram inibições do efeito
citopático maiores que 90%. Por outro lado, a molécula ADClHR, que apresentava
a inserção de um radical cloro, apresentou uma inibição do efeito citopático um
pouco inferior, atingindo cerca de 75% (Tabela 3).
Tabela 3: Inibição do efeito citopático causada pelos derivados aminoálcoois (n = 3).
Derivados Aminoálcoois Inibição (%) Desvio Padrão ( )ADNHR 94 1,7ADLEHR 92 2,6ADClHR 75 6,0
Com relação aos derivados do sistema Tienopiridina, a inibição do efeito
citopático viral variou bastante de acordo com os radicais e sua posição (Tabela
4). Dentre os derivados deste sistema, o derivado 109, com radical nitro na
posição meta, foi o que melhor inibiu o efeito citopático viral, atingindo 99% de
inibição. Além do mais, a posição deste radical foi crítica para este efeito, visto que
o derivado 110, com este mesmo radical, porém na posição para, não apresentou
inibição do efeito citopático viral.
45
Tabela 4: Inibição do efeito citopático causada pelos derivados do sistema Tienopiridina (n = 2-3).
* Aumentou os títulos virais, portanto apresentou inibição de 0%.
Derivados Tienopiridina Radical Inibição (%) Desvio Padrão ( )101 R = H 79 6,2
102 R = o-CH3 66 7,0
104 R = p-CH3 9 5,7
105 R = o-H3CO 71 4,4
109 R = m-NO2 99 0,7
110 R = p-NO2 0 *112 R = m-F 35 7,1113 R = p-F 82 4,4119 R = p-Br 78 3,6
4.4) Determinação do EC50 e do S.I. do Derivado 109
Através da triagem feita inicialmente, o derivado 109 mostrou-se o mais
promissor, e, por isso, continuamos o estudo desta substância. Para determinar,
então, a concentração efetiva desta molécula capaz de inibir 50% da produção de
partículas virais (EC50), foi realizada regressão não-linear a partir de uma curva
com várias concentrações do derivado 109. Foi observada uma inibição da
replicação do HSV-1 de maneira dose-dependente, atingindo valor de EC50 em
torno de 100pM (Figura 27).
y = 5,6011Ln(x) + 97,593
0
25
50
75
100
0,001 0,01 0,1 1
Concentração do Composto 109 (uM)
Inib
ição
da
Pro
du
ção
de
Par
tícu
las
Vir
ais
(%)
Figura 27: Inibição da produção de partículas virais pelo derivado 109 (n = 2).
46
Com base nos valores de CC50 e EC50, foi calculado o valor do índice de
seletividade (S.I.), que representa o grau de segurança para a utilização de uma
substância in vitro . Este parâmetro farmacológico foi calculado através da razão
entre o CC50 e o EC50 da substância. O derivado 109 apresentou seu S.I. em torno
de 3 x 106, enquanto que o do aciclovir é da ordem de 103.
4.5) Ensaio de Inibição da Atividade da DNA Polimerase Viral
Para isto, utilizamos a DNA polimerase do HSV-1 obtida a partir do extrato de
células Vero infectadas. Para evitar a ocorrência de atividades inespecíficas
derivadas de possíveis DNA polimerases celulares contaminantes, foi adicionado
ao meio de reação 100mM de sulfato de amônio.
Os resultados apresentados na figura 28 mostraram que não houve inibição
da atividade enzimática por nenhum dos derivados aminoálcoois na concentração
de droga testada (50 M).
Efeito dos Aminoálcoois na DNA Polimerase de HSV-1
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
150,0
ADNHR ADLEHR ADClHR ADFHR Controle
C.
P.
M (
% d
o C
on
tro
le)
Figura 28: Efeito dos derivados aminoálcoois (50 M) na atividade da enzima DNA polimerase
viral. Os resultados foram expressos em % do controle desvio padrão da média (n = 3).
47
Dentre os derivados do sistema Tienopiridina, testamos a substância mais
promissora, o derivado 109, na concentração do seu EC50 (100 pM). Podemos
destacar que houve uma inibição da atividade enzimática em torno de 50%,
indicando que este deve ser o principal alvo da ação do derivado 109 (figura 29).
Efeito do Composto 109 na DNA Polimerase de HSV-1
0
25
50
75
100
125
150
Composto 109 Controle
C.
P.
M.
(% d
o C
on
tro
le)
Figura 29: Efeito do derivado 109 (100 pM) na atividade da enzima DNA polimerase viral. Os
resultados foram expressos em % do controle
desvio padrão da média (n = 2).
4.6) Efeito do Derivado 109 na Síntese Protéica de Células Infectadas
Estudos realizados primeiramente na década de 70 mostraram que o vírus
Herpes é capaz de provocar uma inibição da síntese de macromoléculas da célula
hospedeira (Fenwick & Walker, 1978). Então, neste experimento avaliamos se o
derivado mais promissor, o 109, seria capaz de reverter a inibição da síntese de
proteínas de células Vero causada pelo vírus através de pulso de [35S]-Metionina.
As células Vero foram divididas em quatro grupos: controle (Figura 30 - C),
infectado (Figura 30 - I), controle tratado (Figura 30 - CT) e infectadas e tratadas
48
(Figura 30 - IT). Como era esperado, houve uma inibição da síntese protéica de
células infectadas com HSV-1 (Figura 30 - I). Apesar da inibição da síntese
protéica celular induzida pelo derivado 109 (Figura 30 - C e CT), o tratamento das
células infectadas com este derivado na concentração de 50 M aumentou em
torno de quatro vezes (Figura 30 - IT) a síntese protéica total em comparação ao
infectado não tratado (Figura 30 - I).
Incorporação com Metionina
0
50
100
C CT I ITCP
M (
% d
o C
on
tro
le)
Figura 30: Efeito do derivado 109 na síntese protéica de células infectadas. Os resultados foram
expressos em % do controle desvio padrão da média (n = 3).
4.7) Avaliação da Toxicidade in vivo do Derivado 109
A toxicidade in vivo do derivado 109 foi avaliada em relação aos seguintes
parâmetros bioquímicos: níveis de glicose, ácido úrico, uréia e transaminase
glutâmico-pirúvica (TGP) no sangue de camundongos, uma vez que a dosagem
destas substâncias pode dar informações importantes sobre possíveis alterações
metabólicas que possam estar sendo induzidas pela administração das
substâncias testadas.
49
Glicose
0
30
60
90
120
150
180
0 1 2 3 4 5 6 7 8Animais
Co
nce
ntr
ação
(m
g/d
L)
Antes
Depois
Ácido Úrico
012345678
0 1 2 3 4 5 6 7 8Animais
Co
nce
ntr
ação
(m
g/d
L)
Antes
Depois
Uréia
0
20
40
60
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Animais
Con
cent
raçã
o (m
g/dL
)
Antes
DepoisTGP
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8Animais
Co
nce
ntr
ação
(U/L
)
AntesDepois
Figura 31: Avaliação da toxicidade in vivo do derivado 109 (300 M/g). Foram dosados no sangue
de camundongos antes e depois do tratamento os (a) níveis de glicose, (b) níveis de acido úrico,
(c) níveis de uréia e os (d) níveis de TGP. Os pontos azuis representam a dosagem antes do
tratamento e os pontos rosa a dosagem após o tratamento. Nos animais 7 e 8 foi administrado
apenas DMSO.
Observamos que, na concentração testada (em torno de 300 M/g), o
derivado 109 levou a aumentos significativos dos níveis de glicose, TGP e de
uréia, em relação aos animais não tratados. O único parâmetro que não se
comportou deste modo foram os níveis de ácido úrico (Figura 31). Entretanto, esta
dose utilizada foi bem maior que o valor de seu EC50 e, mesmo assim, não foi letal
para os camundongos, visto que nenhum dos animais morreu como resultado do
tratamento.
(a) (b)
(c) (d)
50
5) Discussão
A grande incidência de doenças causadas por vírus acomete uma parcela
significativa da população humana mundial. Sendo assim, estudos que visam o
controle de propagação e manifestação de tais doenças, além da inativação
destes patógenos, seriam de grande interesse, incluindo os estudos relacionados
com o desenvolvimento de novos fármacos com este tipo de atividade. Contudo,
em contraste com a enorme quantidade de fármacos antibacterianos e
antifúngicos, o atual arsenal terapêutico antiviral compreende em torno de 40
fármacos, sendo a maioria destes utilizados no tratamento de infecções pelo HIV
(De Clercq, 2004). Uma das principais razões para a falta de sucesso no
desenvolvimento de fármacos antivirais é a natureza dos vírus, os quais possuem
uma estrutura extremamente simples e um sistema enzimático bastante restrito,
sendo totalmente dependentes dos processos metabólicos celulares para sua
multiplicação. Assim, agentes que inibem a replicação viral, em geral, também
exibem certo grau de toxicidade às células hospedeiras (White & Fenner, 1994).
O bioisosterismo consiste em uma maneira racional de se obter novas
moléculas que possam apresentar atividade biológica, utilizando como modelo
uma substância com estrutura e atividade biológica conhecida, e, a partir daí,
sintetizar e avaliar novos análogos estruturais da droga conhecida.
Desse modo, os derivados aminoálcoois foram sintetizados tomando como
base a ribavirina, que é um nucleosídeo antiviral sintético de amplo espectro. Os
derivados aminoálcoois possuem um anel triazólico, que também está presente na
51
ribavirina. A ribavirina inibe a replicação de vários vírus de DNA e de RNA,
incluindo ortomixo-, paramixo-, arena-, bunia-, herpes-, adeno-, pox, e retrovírus
(Gilbert & Knight, 1986; Huggins, 1989). A ribavirina possui um anel triazólico
ligado a uma ribose, mimetizando um ribonucleosídeo. Então, numerosos
pesquisadores têm encontrado recentemente que o tratamento com a ribavirina
induz mutações em genomas de vírus de RNA, visto que é capaz de parear tanto
com a citidina, quanto com a uridina (Parker, 2005; Graci & Cameron, 2002).
Entretanto, a atividade antiviral da ribavirina não é observada somente em vírus
com genoma de RNA. Desse modo, já é bem documentado que o tratamento de
células com ribavirina resulta na inibição da Desidrogenase de Inosina
Monofosfatada (IMPDH), visto que a RMP compete com o IMP (o substrato natural
da IMPDH), diminuindo os níveis intracelulares de GTP. A diminuição da
quantidade destes nucleotídeos certamente interferiria com a replicação viral, visto
que os vírus, assim como as células hospedeiras, são dependentes do GTP e do
dGTP para a replicação do material genético. Então, é provável que a inibição da
IMP desidrogenase seja responsável pela toxicidade da ribavirina em células
humanas e, também, por sua atividade antiviral de amplo espectro. Este
desequilíbrio no pool de nucleotídeos poderia fazer com que a polimerase viral
substituísse o GTP por nucleotídeos alternativos (ATP, UTP ou CTP), mas para
que a inibição da IMPDH seja um alvo antiviral efetivo, a replicação viral teria que
ser mais sensível ao declínio dos níveis intracelulares de GTP do que as células
hospedeiras (Parker, 2005).
Os derivados do sistema Tienopiridina também foram sintetizados explorando
52
este conceito de bioisosterismo para o planejamento de moléculas bioativas.
Foram observadas características estruturais de dois derivados do sistema
Pirazolopiridina que apresentaram atividade antiviral (Bernardino et al., 1996),
onde um deles apresentou atividade antiviral frente à enzima Transcriptase
Reversa do HIV-1 e o outro frente ao vírus Vaccínia (Azevedo et al. 2002). O
grupo fenilamino presente nessas moléculas na posição C-4 foi mantido, e por
bioisosterismo de anel entre os anéis pirazol e tiofeno foi proposta a síntese de
alguns derivados do sistema Tienopiridina: os 4-(Fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-
carbonitrilas, que incluem todos o derivados do sistema Tienopiridina presentes
neste trabalho. O sistema Tienopiridina está presente em substâncias que
apresentam atividade antiviral, já tendo sido descritas moléculas que inibem o
vírus HSV-1 (Hartline et al., 2005; Pinheiro et al., 2004) e que apresentam
atividade frente ao HIV-1 (Bellarosa et al.,1996).
Isto faz com que tanto os derivados aminoálcoois aqui testados, quanto os
derivados do sistema Tienopiridina presentes neste trabalho sejam substâncias
promissoras, que necessitam de uma avaliação biológica para verificar a
existência de um possível potencial antiviral. Os requisitos essenciais para um
fármaco antiviral são sua eficácia e o mínimo de toxicidade às células hospedeiras
(Vanden-Berghe, Vlietinck & Van-Hoof, 1986). Assim, a relação entre os efeitos
farmacológicos e tóxicos de uma substância é um requisito importante quando se
está verificando sua aplicabilidade como agente terapêutico (Melo, 2000).
Nossos resultados demonstraram que em relação aos derivados
aminoálcoois, as moléculas halogenadas se mostraram menos citotóxicas em
53
relação àquelas não halogenadas (Tabela 2). Porém, as moléculas halogenadas
apresentaram valores menores de inibição do efeito citopático do HSV-1, sendo
menos efetivas contra este vírus (Tabela 4). Já os derivados do sistema
Tienopiridina apresentaram, em geral, valores de citotoxicidade bem semelhantes,
sendo que o derivado sem substituinte no anel fenilamino (derivado 101) foi o que
apresentou o valor de CC50 mais promissor (Tabela 3). Contudo, a atividade
antiviral não teve relação direta com os diferentes radicais presentes, variando
bastante de acordo com o radical inserido, assim como com a sua posição na
molécula (Tabela 5). Por exemplo, comparando a atividade antiviral do derivado
110, que possui o radical nitro na posição para, com o derivado 109, que possui o
radical nitro na posição meta, podemos observar uma variação de zero até
aproximadamente 100% de inibição do efeito citopático, respectivamente. Mas
quando comparamos os derivados 112 e 113, radical flúor nas posições meta e
para, respectivamente, é observado o inverso. O derivado com radical flúor na
posição meta não apresentou uma atividade antiviral significativa, enquanto o que
apresenta o radical na posição para exibe uma melhor atividade. Isto demonstra
que a atividade não tem correlação com a posição do radical.
Como as células eucarióticas possuem um repertório de DNA polimerases,
onde há pelo menos três DNA polimerases envolvidas com a replicação ( ,
e ),
uma DNA polimerase mitocondrial ( ), e pelo menos doze tipos de DNA
polimerases com função de reparo ( , , , , , , , , , ,
e REV1) (Kuriyama
et al., 2005) e sabendo que a DNA polimerase
é uma enzima essencial para a
replicação do DNA e, subseqüentemente, para a divisão celular (Kamisuki et al.,
54
2004), foi avaliado o efeito dos derivados aminoálcoois na atividade da DNA
polimerase
de células Vero. Observamos que nenhuma destas moléculas inibiu
a atividade desta enzima, não sendo esta uma forma de citotoxicidade destas
substâncias (Figura 26).
Devido ao fato do derivado 109 ter se mostrado bastante promissor durante a
triagem inicial das substâncias, foi dada continuidade ao estudo deste derivado,
visando a elucidação do seu mecanismo de ação. Esta molécula apresentou um
valor de CC50 menor do que 300 M, enquanto que o do aciclovir, que é uma das
drogas mais utilizadas no combate à infecção pelo HSV, é quase três vezes maior
(860 M). Contudo, o EC50 do aciclovir em M.O.I. de 1 é 1,2 M, enquanto que o
do derivado 109 é em torno de 100 pM (Figura 27). Desse modo, o derivado 109
apresenta um S.I. em M.O.I. de 1 em torno de 3 x 106, enquanto que o do aciclovir
é da ordem de 103, ou seja, em torno de 3 logs menor do que o do derivado 109,
mostrando o potencial antiviral desta substância, frente a replicação do HSV-1.
Como o HSV-1 codifica grande parte das proteínas necessárias para a sua
replicação lítica, incluindo sua DNA polimerase (complexo UL30/UL42) (Lin &
Ricciard, 2000) e também pelo fato de esta enzima desempenhar um papel vital
na replicação do HSV-1, sendo alvo de mais de 90% das drogas em uso clínico
(Naesens and De Clercq, 2001), avaliamos o efeito dos derivados na atividade da
DNA polimerase do HSV-1. Nenhum dos derivados Aminoálcoois, testados na
concentração de 50 M, foi capaz de inibir a atividade desta enzima de forma
significativa (Figura 28), enquanto que o derivado do sistema Tienopiridina mais
promissor, o derivado 109, inibiu cerca de 50%, quando testado na concentração
55
de 100 pM, ou seja, a concentração igual ao valor de seu EC50 (Figura 29).
Então, nenhum dos derivados aminoálcoois testados teve efeito na atividade
da DNA polimerase
de células Vero, assim como na atividade da DNA
polimerase de HSV-1. Isto sugere que a atividade antiviral destes derivados não é
resultante de uma ação sobre a atividade de DNA polimerases e que estas
substâncias não apresentam citotoxicidade pela inibição da atividade da DNA
polimerase
celular. Porém, percebemos que o derivado 109, assim como seu
precursor, apresentam a capacidade de inibir a atividade de polimerases do tipo B,
sabendo que seu precursor é um inibidor não nucleosídico da atividade da enzima
transcriptase reversa do HIV-1 (NNRTI). Além disso, percebe-se uma correlação
de praticamente 100% entre o EC50 e a inibição da atividade enzimática, pois foi
visto que, na concentração de 100 pM, o derivado inibe 50% da produção de
partículas virais (EC50) e que, nesta mesma concentração, o derivado inibe
também em 50% a atividade da DNA polimerase de HSV-1, demonstrando que
esta enzima é o alvo da ação desta molécula.
Sabendo que o HSV é capaz de provocar uma diminuição da síntese de
macromoléculas da célula hospedeira (Fenwick & Walker, 1978), também foi
estudado o efeito do derivado 109 (50 M) na síntese de proteínas de células
controle e infectadas. Observou-se que o tratamento foi capaz de aumentar a
síntese protéica das células infectadas em torno de quatro vezes, quando
comparado com a síntese protéica das células infectadas não tratadas. Também
foi observado que, nesta concentração, o tratamento causou uma redução da
síntese protéica celular (Figura 30). É importante ressaltar que a concentração
56
utilizada neste experimento foi maior do que a concentração mais efetiva desta
substância, ou seja, seu EC50.
Finalmente, analisamos os efeitos do derivado 109 in vivo sobre os níveis de
TGP, glicose, ácido úrico e uréia. A TGP é uma enzima encontrada
predominantemente no fígado, em concentração moderada nos rins e em menor
quantidade no coração e nos músculos esqueléticos. Na célula hepática, o TGP
localiza-se no citoplasma (90%) e na mitocôndria (10%). A glicose é a principal
fonte de carboidrato do organismo e sua concentração sérica está intimamente
ligada à ação da insulina. O ácido úrico é um metabólito do catabolismo de
purinas, ácidos nucléicos e nucleoproteínas. Já a uréia é produzida a partir da
deaminação de aminoácidos. Em três parâmetros analisados (níveis de glicose,
TGP e uréia) houve alterações em seus respectivos níveis no soro de
camundongos tratados, sendo observada uma tendência a elevação dos níveis
destas substâncias. Somente os níveis do ácido úrico não se alteraram de forma
significativa (Figura 31). Porém, a dose utilizada, que foi bem maior que o seu
valor de EC50, não foi letal para os camundongos, não havendo morte de nenhum
dos animais. É importante ressaltar que a quantidade de animais testados ainda é
baixa e que a quantidade de droga necessária in vitro para levar a uma reposta é
muito baixa, sendo necessário determinar a quantidade terapêutica da substância
necessária in vivo e observar se, nesta concentração, o mesmo padrão
permanece.
Nossos resultados mostraram que o derivado 109 estaria atuando inibindo a
atividade da DNA polimerase do HSV-1, que é uma proteína de fase , essencial
57
para replicação do DNA viral. Conseqüentemente haveria um número menor de
genomas virais sintetizados, resultando em uma inibição da fase gama, da
automontagem viral e do seu brotamento, visto que as etapas da replicação do
HSV-1 ocorrem em cascata. Conseqüentemente, haveria uma redução dos títulos
virais e da dispersão viral para outras células. Um outro aspecto importante destes
dados é que tanto o aciclovir quanto o derivado 109 têm o mesmo alvo, a DNA
polimerase do HSV-1. Considerando o fato do aciclovir ser um análogo
nucleosídico, ao contrário do derivado 109, surge a possibilidade de que eles
estejam inibindo a mesma enzima, porém, atuando em pontos distintos. Desse
modo, poderíamos cogitar a possibilidade de uso conjunto destas substâncias,
visando um efeito terapêutico aditivo ou sinergístico.
Então, devido ao constante surgimento de cepas resistentes às drogas em
uso clínico, e ao fato de muitas destas drogas apresentarem efeitos colaterais, é
de extrema importância esta busca por novos fármacos com boa atividade antiviral
e com baixa citotoxicidade.
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