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Mapeamento genético em procariotos
Prof. Dra. Adriana DantasProf. Dra. Adriana Dantas
Engenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaEngenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
UERGS – Bento GonçalvesUERGS – Bento Gonçalves
Definições
Mapa genético: define a distância entre mutações em termos de freqüência de recombinação
Mapa por restrição: Digestão do DNA com enzimas de restrição e medição da distância entre os sítios de quebra
Mapa definitivo: conseguido através do seqüenciamento do DNA
Introdução
No mapeamento genético, utilizamos conhecimentos de diversas áreas da genética,
além de procedimentos estatísticos adequados.
Assim, o mapeamento genético envolve a genética mendeliana, a citogenética, a
genética molecular, a genética quantitativa (para mapeamento de QTL’s) e a genética de
populações.
Polimorfismo
Fenotípico: função do gene é afetada
Fragmento de restrição: sítio alvo de enzima é afetado
Seqüência: análise direta do DNA
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): diferença no mapa de restrição entre dois (ou mais) indivíduos
Variação genôomica
Marcadores moleculares podem ser usados para mapeamento
Marcadores são úteis para a construção de mapas de ligação e testes de paternidade.
Mapeamento genético: marcadores: RFLPs, SSR, AFLPs, RAPDs,
enzimas, proteínas, aminoácidos, etc. genótipo e/ou fenótipo de interesse
freqüência de recombinação
Teoria Cromossômica da Herança
De acordo com a teoria cromossômica...
Se os genes R e G estão em cromossomos diferentes:
observe os núcleos das células híbridas F1: RrGg
Considerações
Um indivíduo possui duas cópias de cada partícula de herança (gene).
Essas duas cópias são separadas durante a formação dos gametas e juntam-se novamente quando os dois gametas de encontram para formar um zigoto.
Um locus (plural=loci) é um local em um cromossomo onde ficam os genes.
Os traços são distribuídos independentemente quando os loci dos gene R e G estão em diferentes cromossomos.
Genes no mesmo cromossomo
Se os genes estiverem no mesmo cromossomo, quando
observamos o produto de diferentes meioses, temos os
seguintes gametas: RG 50% : rg 50% ; Rg 0% : rG 0b
De acordo com Mendel, os traços devem estar distribuídos
de maneira independente: RG 25% : rg 25% ; Rg 25% : rG
25%
De acordo com a teoria cromossômica, os traços devem
estar distribuídos com os cromossomos : RG 50% ; rg 50%
Então, qual é o modo de herança real?
Na verdade, pode haver um terceiro resultado quando os dois genes estão
no mesmo cromossomo.
Observa-se também a progênie resultante dos gametas RG e rg em uma
maior freqüência do que a progênie dos gametas Rg e rG.
RG, rg são gametas do tipo parental (o cromossomo no gameta é o mesmo
dos pais) = Rg e rG são gametas não parentais.
Como isso acontece?
Os gametas não-parentais Rg e rG são formados por meio de um processo
chamado de recombinação.
Crossing Over e Recombinação
Permuta simples
Permutas duplas envolvendo 2 cromátides
Permutas duplas envolvendo 3 cromátides
Permutas duplas envolvendo 4 cromátides
Ligação gênica
É um dos fenômenos genéticos mais amplamente conhecidos e estudados.
Logo após a redescoberta dos trabalhos de Mendel, surgiram relatos de genes que não seguiam a lei de segregação independente.
Batenson e Punnett foram os primeiros a relatar o fenômeno em 1905.
No entanto, o trabalho mais célebre sobre ligação gênica deve-se a Morgan e seu discípulo Stutervant, em 1911.
Estes autores relacionaram os desvios da segregação independente à presença dos genes no mesmo cromossomo e propuseram a utilização da freqüência de recombinação para a realização de mapeamento genético.
Proporções na progênie
proporção na progênie: 944 : 965 : 206 : 185
Números 944 e 965 são do tipo parental.
Números 206 e 185 não são do tipo parental (recombinantes).
Se os genes b e vg estiverem em cromossomos diferentes, a
proporção 1 : 1 : 1 : 1 poderia ser esperada para os genótipos
Se os genes b e vg estiverem nos mesmos cromossomos, a
proporção 1 : 1 : 0 : 0 poderia ser esperada para os genótipos
Recombinaçao na meiose
A recombinação ocorre durante a metáfase da meiose I, (células são 4n, cada
cromossomo é duplicado e os cromossomos homólogos são alinhados).
Partes de cada cromossomo homólogo realizam o crossing over, trocando, de
forma eficaz, o material genético
Recombinação (evento de crossing over) ocorre com uma certa freqüência .
Os tipos não parentais (recombinantes) são produzidos durante a recombinação.
- As células em meiose foram estudadas e observou-se os cromossomos se
tocando para formar o quiasma (crossing-over).
Seria essa uma evidência de que a recombinação ocorreu?
Para provar que houve recombinação, é necessário observar o número de recombinações produzidas.
A freqüência da recombinação (FR) é uma medida da probabilidade de troca genética
Se os dois genes estão próximos, a freqüência de recombinação é baixa 0%
Se dois genes estão distantes, a freqüência de recombinação é alta ~50%
Diz-se que os genes estão ligados em um mesmo cromossomo se FR for menor do que 50%
Diz-se que os genes não estão ligados se FR for ~ 50%.
Eles podem estar bem distantes em um cromossomo ou podem estar em cromossomos diferentes.
Frequência de recombinação (FR) calculado
Mapas Genéticos
Um Mapa de Ligação Genética mostra a ordem dos genes em um cromossomo. A ordem está baseada nos dados de freqüência de recombinação entre os genes Alfred Sturtevant, um aluno no laboratório de T. H. Morgan, usou os dados de freqüência
de recombinação para construir mapas de ligação genética. Troca da material genético resultam em gametas “b+” e “vg+” Ele usou valores de FR para atribuir distâncias entre os genes em unidades do mapa
(m.u) Exemplo: os genes b e vg em um cromossomo mostram uma freqüência de
recombinação de 17% Portanto, o valor FR informa que os genes b e vg estão separados por 17 unidades de
mapa no mesmo cromossomo
Sturtevant sabia que a RF entre o gene vg e um outro gene chamado cinnabar (cn) era de 8%
Sturtevant descobriu que se os cromossomos fossem entidades lineares, então haveria duas possibilidades:
Descobriu que a freqüência de recombinação entre ao genes b e cn era de 9%, assumindo então que o mapa #2 estava correto.
Sturtevant compilou todos os dados de ligação e desenvolveu um mapa genético bem mais extenso.
Ele inferiu que os genes residiam em cromossomos e conseguiu mapear os genes nos cromossomos observando os dados de FR entre os genes.
Recombinação entre dois genes
1) Para a recombinação ocorrer entre dois genes ligados deve ocorrer “crossing over“entre eles.
2) A probabilidade do “crossing” ocorrer entre dois genes ligados é diretamente proporcional à distância entre eles.
3) Então, a freqüência de recombinação pode ser usada como um indicador da distância entre dois genes.
Analise de recombinação
A análise de recombinação é a técnica usada para determinar quão freqüentemente um “crossing” pode ocorrer entre dois genes durante a meiose e portanto quão distantes esses genes estão um do outro.
Para fazer análises de recombinação :Para fazer análises de recombinação :
1) Um heterozigota para dois genes conhecidos no mesmo cromossomo.
2) Um homozigota recessivo para fazer o cruzamento teste (assim cada genótipo terá um fenótipo único).
3) Suficiente descendência para cálculos acurados da progenie proveniente ou não de “crossing over”.
Mapeamento do cromossomo de Mapeamento do cromossomo de E. coliE. coli
Recombinação entre genes marcadores após transferência
A transferência entre um cruzamento é deduzida da existência de recombinantes produzidos pelo cruzamento
Antes de ser produzido um gene estável, os genes transferidos devem ser integrados ou incorporados ao genoma receptor por um mecanismo de troca.
Troca genética em procariotos
Em procariotos não ocorre entre dois genomas inteiros (como ocorre em eucariotos)
Ocorre entre genoma completo, derivados de F-, chamados endogenoto, e um incompleto, derivado do doador, chamado exogenoto.
A genetica por recombinaçao em bacterias é a genetica de merozigotos.
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-
inviável
viável
a+
a-
a+
a-
a+a+
a-a-a-
inviável
viável
(a)
(b)
(a)Um único crossing leva a cromossomo linear parcialmente diplóide
(b) Um numero par de crossing leva a um anel mais um fragmento linear
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
a+
a-
exogenoto
endogenoto
merozigotomerozigoto
a+
a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-a- a+ a-
inviável
a+
a-
a+
a-
inviável
viável
a+
a-
a+
a-
a+a+
a-a-a-
inviável
viável
(a)
(b)
(a)Um único crossing leva a cromossomo linear parcialmente diplóide
(b) Um numero par de crossing leva a um anel mais um fragmento linear
Possibilidades de crossing
Um único crossing não é muito útil para gerar recombinantes viáveis, pois o anel é quebrado para produzir um cromossomo estranho, linear, parcialmente diplóide.
Para haver o anel intacto, deve haver um numero par de crossing.
O fragmento produzido é apenas um genoma parcial, o qual é perdido durante crescimento celular.
Gradiente de Transferência
Em geral apenas um fragmento do cromossomo doador aparece no receptor
Ocorre a quebra espontânea dos pares conjugantes, de modo que o cromossomo inteiro é raramente transferido
Isso cria um gradiente de transferência natural, o qual torna menos provável que uma célula receptora receba marcadores genéticos mais finais (marcadores mais longe da origem).
Cruzamentos de marcadores doados por Hfr na ordem met, arg, leu
•Ocorre muitos fragmento contendo met do que o locus arg, e o locus leu esta presente apenas num fragmento.
•Desta forma, quanto mais próximo o marcador esta de origem, maior a chance de que ele seja transferido durante a conjugação.
met + arg + met +
met + arg + met +
met + arg + met +
met + arg + met +
met + arg + met +
met + arg + met +
met + arg + met +met + arg + met +
met + arg + met +met + arg + met +
met + arg + met +met + arg + met +
met + arg + met +met + arg + met +
met + arg + met +met + arg + met +
met + arg + met +met + arg + met +
Mapeamento por FR em cruzamentos de Mapeamento por FR em cruzamentos de bactériasbactérias
Para obtermos uma resolução alta entre o loci marcador que estão próximos ao gene
Usamos a FR para medir essa ligação.
Para medir a ligação e obter a distancia de mapa calculada, é necessário que o marcador tenha chance igual de ser transferido junto ao gene.
Três marcadores: met, arg, leu
•A ordem é met, arg, leu
•met é transferido primeiro e leu por ultimo
•Porque o ultimo é o leu?
•Porque se selecionamos o ultimo, então saberemos que todas as células que receberam o fragmento contendo esse ultimo marcador também receberá os outros, met e arg.
Fragmento transferido de cromossomo HfrFragmento transferido de cromossomo Hfr
Leu- arg - met -
Cromossomo F -
Leu- arg - met -Leu- arg - met -
Cromossomo F -
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
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met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
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met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
met+ arg+ met+met+ arg+ met+
Cálculo da distancia do mapa
Unidade do mapa é (u.m) é igual a 1 por cento de crossing no respectivo intervalo.
Na pratica isso é calculado, entre o total de recombinantes recuperados, a porcentagem de recombinantes produzidos por crossings entre dois marcadores.
Por definição, uma unidade de mapa genético (cM) corresponde a 1% de recombinação.
Entretanto, não existe uma relação direta entre cM e número de pares de bases (pb) pois a freqüência de recombinação é influenciada por muitos fatores.
Mapeamento cromossômico
Mapas em bactérias combina as técnicas de mapeamento de conjugação interrompida, mapeamento de recombinação, transformaçao e transdução.
Mapas atuais são utilizados linhagens de Hfr que transferem a partir de pontos diferentes do cromossomo.
Em 1963, o mapa de E. coli já detalhava 100 genes, em 1990 mais de 1.400 genes
Mapa genetico de 1963 de E. coli
Fatores de recombinação
Dentre os fatores ambientais, os que mais alteram as taxas de permuta genética são: ‘status’ iônico celular, nutrição, idade e temperatura
Em estudos de mapeamento, no entanto, deve-se manter o ambiente o mais homogêneo possível para assegurar a confiabilidade dos dados obtidos.
A freqüência de recombinação varia significativamente ao longo dos cromossomos, ocorrendo muito mais recombinação nas regiões medianas dos cromossomos que em regiões estruturais como centrômeros e telômeros.
A escolha dos cruzamentos utilizados para mapeamento genético deve ser criteriosa, pois a freqüência de recombinação é extremamente dependente dos genótipos parentais.