DISSERTAO

MAPEAMENTO GENTICO E DETECO DE QTLs EM UM CRUZAMENTO DE LIMO CRAVO E CITRUMELO SWINGLELAURA MACHADO DE FARIA

Campinas, SP 2007

INSTITUTO AGRONMICO CURSO DE PS-GRADUAO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL

MAPEAMENTO GENTICO E DETECO DE QTLs EM UM CRUZAMENTO DE LIMO CRAVO E CITRUMELO SWINGLE LAURA MACHADO DE FARIA

Orientador: Dr. Marcos Antnio Machado Co-orientadora: Dra. Maringela Cristofani-Yaly

Dissertao submetida como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical rea de Concentrao em Melhoramento Gentico Vegetal

Campinas, SP Abril 2007

Ficha elaborada pela bibliotecria do Ncleo de Informao e documentao do Instituto Agronmico F224m Faria, Laura Machado de Mapeamento gentico e deteco e QTLs em um cruzamento de limo Cravo e citrumelo Swingle / Laura Machado de Faria. Campinas, 2007 93 fls Orientador: Dr. Marcos Antnio Machado Co-orientadora: Dra. Maringela Cristofani-Yaly Dissertao - Mestrado em Agricultura Tropical e Subtropical Instituto Agronmico 1. Limo cravo - vrus da tristeza 2. Citros - padro foliar 3. TRAP I. Machado, Marcos Antnio II. Cristofani-Yaly, Maringela III. Campinas. Instituto Agronmico IV. Ttulo CDD. 634.33

minha me Maria, por me possibilitar, com apoio e amor... concluir este trabalho, DEDICO

Aos alunos; jovens pesquisadores que creditam na pesquisa um amanh melhor, OFEREO iii

AGRADECIMENTOS

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Ao pesquisador e orientador Dr. Marcos Antnio Machado pela oportunidade de orientao e crescimento adquiridos com seu nvel de exigncia e estmulo frente aos desafios surgidos;

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pesquisadora e co-orientadora Dra. Maringela Cristofani-Yali pelo seu apoio e ensinamentos que foram constantes e igualmente importantes para este trabalho;

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pesquisadora Dra. Marins Bastianel por sua importante contribuio nas anlises estatsticas;

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Aos pesquisadores Drs. Luis Eduardo Aranha Camargo e Maria Imaculada Zucchi pelas observaes enriquecedoras dissertao como membros examinadores;

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Ao meu av pelas canes inspiradas que tocamos e cantamos juntos, s minhas vozinhas pela amizade e histrias que impulsionaram meus sonhos e minhas esperanas;

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Lu Faldoni pela divertida companhia e auxlio pontual no desenvolvimento das etapas finais experimentais deste trabalho;

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Aos colegas de laboratrio Carol, Fernanda, Flavia, Francineide, Juliana, Keli, Mariana, Marcelo, Paulo, Rafael, Raquel, Thiago e Vandeclei pelos momentos de conhecimentos compartilhados e pela amizade;

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s colegas Dras. Andra e Andria e ao Dr. Berghem, pelas discusses cientficas e prazerosa convivncia, principalmente na etapa de finalizao do mestrado;

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toda a equipe de pesquisadores, aos funcionrios da administrao e colegas do Centro APTA Citros Sylvio Moreira e aos colegas da PG-IAC pelas preciosas colaboraes e amizade no decorrer do curso;

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Ao IAC e ao Centro APTA Citros Sylvio Moreira pela oportunidade oferecida de grande aprendizado;

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Ao CNPq pela bolsa de fomento pesquisa concedida. iv

SUMRIO

NDICE DE TABELAS........................................................................................... vi NDICE DE FIGURAS............................................................................................ vii LISTA DE ANEXOS............................................................................................... viii RESUMO................................................................................................................. ix ABSTRACT............................................................................................................. x 1 INTRODUO.................................................................................................... 01 2 REVISO DE LITERATURA............................................................................. 06 2.1 Citricultura no Brasil.......................................................................................... 06 2.2 Gentica e Melhoramento de Citros................................................................... 08 2.3 Mapas Genticos................................................................................................ 14 2.4 Mapeamento Gentico de Citros........................................................................ 21 2.5 Mapeamento de QTLs........................................................................................ 24 2.6 Padro Foliar, Enraizamento e CTV.................................................................. 26 3 MATERIAL E MTODOS.................................................................................. 29 3.1 Material Gentico............................................................................................... 29 3.2 Extrao do DNA Total..................................................................................... 29 3.3 Marcadores RAPD............................................................................................. 30 3.4 Marcadores Microssatlites................................................................................ 31 3.5 Marcadores TRAPs (Target Region Amplification Polymorphism).. 32 3.6 Avaliao de Caractersticas Morfolgicas........................................................ 34 3.6.1 Morfologia foliar............................................................................................. 34 3.6.2 Capacidade de enraizamento de estacas.......................................................... 34 3.7 Avaliao de Resistncia ao CTV...................................................................... 34 3.8 Anlise Estatstica dos Dados Morfolgicos..................................................... 36 3.9 Construo dos Mapas de Ligao..................................................................... 37 3.10 Identificao de QTLs...................................................................................... 37 4 RESULTADOS E DISCUSSO.......................................................................... 38 4.1 Caracterizao Morfolgica dos Hbridos......................................................... 42 4.1.1 Padro foliar.................................................................................................... 42 4.1.2 Enraizamento de estacas................................................................................. 44 4.2 Avaliao de Resistncia ao CTV...................................................................... 45 4.3 Mapas de Ligao.............................................................................................. 48 4.3.1 Marcadores moleculares................................................................................. 49 4.3.2 Anlise de ligao........................................................................................... 54 4.4 Mapeamento de QTLs........................................................................................ 62 5 CONCLUSES.................................................................................................... 67 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................. 68 7 ANEXOS.............................................................................................................. 87

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NDICE DE TABELAS

Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 -

Cdigos utilizados para os tipos de segregao para uma populao CP (Cross Pollinators)*............................................ Seqncias dos primers fixos e arbitrrios utilizados para os marcadores TRAPs.................................................................... Resultados mdios obtidos da mensurao das variveis CTV, Enraizamento (E), ndice de morfologia foliar (IF) e tipo de folha em trs plantas de 94 hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle e genitores................................................ Estimativa de parmetros genticos obtidos para as caractersticas nmero mdio de estacas enraizadas, absorbncia (CTV) e ndice de morfologia foliar em uma prognie de 94 indivduos do cruzamento entre limo Cravo vs citrumelo Swingle.............................................................. Nmero, tipo de marcadores e a distncia em centiMorgans (cM) de cada grupo de ligao do mapa de citrumelo Swingle................................................................................... Nmero, tipo de marcadores e a distncia em centiMorgans (cM) de cada grupo de ligao do mapa de limo Cravo....... Detalhes dos QTLs detectados nos grupos de ligao de citrumelo Swingle, pelo mtodo Multiple QTL Maping (MQM) associados s caractersticas estudadas........................

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Tabela 4 -

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Tabela 5 -

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Tabela 6 Tabela 7 -

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NDICE DE FIGURAS

Figura 1 -

Ilustrao de como os hbridos de limo Cravo com citrumelo Swingle e os genitores foram inoculados com material de laranja Pra infectada com CTV estirpe Baro B............................................................................................... Padro de fololos e folhas em hbridos de limo Cravo com citrumelo Swingle. (G= limo Cravo, H= hbridos, I= citrumelo Swingle)................................................................... Padro de enraizamento de estacas de limo Cravo (A), citrumelo Swingle (C) e hbrido (B).............................................................................................. Teste de primers RAPD (I07 e I10) para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8)........................................................................... Teste de primers TRAPs para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7)................................................................................................. Teste de primers SSR (CCSME9) para avaliao da segregao utilizando os genitores (LC e CS) e hbridos (1, 2, 3, 4, 5 e 6)................................................................................... Mapa de ligao de citrumelo Swingle com 77 marcadores (36 RAPD, 25 SSR e 16 TRAP) em 8 grupos de ligao........... Mapa de ligao de limo Cravo com 33 marcadores (22 RAPD, 10 SSR e 1 TRAP) em 7 grupos de ligao................... Grupos de ligao de citrumelo Swingle (A) e limo Cravo (B) mostrando marcadores SSR em comum.............................. Marcador SSR (CCSM19) segregando na proporo 1:2:1. LC = limo Cravo, CS = citrumelo Swingle, 1 a 18 hbridos e M = Marcador de peso molecular Ladder 1 Kb Plus............................................................................................. QTLs associados morfologia foliar (A), resistncia a CTV (B) e enraizamento de estacas (C e D) em mapas de ligao de citrumelo Swingle. * Porcentagem de variao fenotpica que cada QTL pode explicar.......................................................

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Figura 2 -

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Figura 3 -

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Figura 4 -

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Figura 5 -

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Figura 6 -

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Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 -

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Figura 11 -

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LISTA DE ANEXOS

Anexo I -

Distribuio de mdias para as variveis: nmero de estacas enraizadas, absorbncia em ELISA (CTV) e ndice de morfologia foliar mensuradas em 94 hbridos........................... Anlise de varincia para CTV, enraizamento e morfologia foliar, referentes avaliao de uma populao de hbridos de limo Cravo e citrumelo Swingle em experimento completamente casualizado em casa de vegetao (Aplicativo: SASM-Agri, Cantieri et al. 2001)......................... Marcadores RAPD e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana................................................................................ Marcadores Microssatlites obtidos a partir de bibliotecas genmicas (CCSM) e bibliotecas de ESTs (CCSME), tipo de repetio, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana...................... Marcadores TRAPs, seqncia dos primers, tipo de segregao e teste de homogeneidade para segregao Mendeliana................................................................................

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Anexo II -

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Anexo III Anexo IV -

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Anexo V -

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FARIA, Laura Machado de. Mapeamento gentico e deteco de QTLs em um cruzamento de limo Cravo e citrumelo Swingle. 2007. 93f. Dissertao (Mestrado em Agricultura Tropical e Sub-Tropical) Ps-Graduao IAC. RESUMO A presena de inmeros fitopatgenos, entre outros desafios presentes, de natureza gentica e botnica, limitam o melhoramento gentico dos citros por mtodos convencionais. A poliembrionia, incompatibilidade sexual e longa juvenilidade dificultam grande parte das estratgias empregadas, principalmente aquelas como a hibridao sexual. O objetivo principal desse trabalho foi o desenvolvimento de mapas de ligao de limo Cravo (C. limonia) e citrumelo Swingle (C. paradisi x P. trifoliata), com vistas ao estudo da herana do vrus da tristeza dos citros (CTV). Ao mapa foram includas ainda caractersticas contrastantes como padro foliar e capacidade de enraizamento de estacas. A estratgia pseudo-testcross foi utilizada para a construo de mapas genticos de ligao, utilizando marcadores moleculares RAPD, SSR e TRAP. Foram genotipados 94 hbridos para constituir a populao de mapeamento. Para tanto, os marcadores foram integrados aos mapas de ligao utilizando o programa JoinMap v 3.0, enquanto que para a deteco e mapeamento de QTLs foram realizadas anlises por meio do programa MapQTL v. 4.0. O nmero mdio de marcadores obtidos por par de primers TRAPs (7,75) foi quase quatro vezes maior que o nmero de marcadores por primer RAPD (2,14). Foi observada a possibilidade de que dois genes complementares e dominantes possam estar envolvidos na caracterstica folha trilobada, sendo cada espcie heterozigtica para um deles. Porcentagens de enraizamento de 70% foram encontradas para citrumelo Swingle, 60% para limo Cravo e de 0 a 90% para os hbridos. Em CTV foi encontrado um controle gentico monognico, com proporo 1:1. As anlises pelo mtodo de Multiple QTL Mapping (MQM) detectaram a presena de um QTL para resistncia a CTV no grupo de ligao 6 (GL 6 - explicando 95,1% da variao fenotpica), um para morfologia foliar (GL 4 - 76,1%) e dois QTLs para a caracterstica enraizamento de estacas (GL 3 e 6 - 50,8% e 37,8%, respectivamente). Embora os genitores possuam gentipos bastante diferentes, a sintenia entre eles foi observada em alguns grupos de ligao. Palavras-chave: vrus da tristeza dos citros, padro foliar, TRAP

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FARIA, Laura Machado de. "Genetic mapping and detection of the QTLs in the crossing of Rangpur lime and Swingle citrumelo". 2007. 93f. Dissertao (Mestrado em Agricultura Tropical e Sub-Tropical) - Ps-Graduao - IAC. ABSTRACT Countless and different phytopathogens among other challenges of genetic and botanical nature, limit conventional approaches for citrus breeding. Poliembryony, sexual incompatibility and long juvenility hinder in a considerable amount of the adopted strategies, mainly the approaches based on sexual hybridization. The main objective of this was to development linkage maps of Rangpur lime (C .limonia) and the Swingle citrumelo (C .paradisi x P. trifoliata), aiming to evaluate the inheritance to citrus tristeza virus (CTV). Contrastive characteristics were included on the map, like the foliar pattern and the rooting capacity of cuttings. The pseudo-testcross strategy was used to build the genetic linkage maps, with RAPD, SSR and TRAP markers. 94 hybrids were genotyped in the map population. In order to achieve that, the markers were integrated to the linkage maps using the software JoinMap v3.0, whereas the software MapQTL v4.0 was used for the detection and mapping of the QTLs. The mean number of markers obtained by pair of primers TRAPs (7.75) was almost four times greater than the number of markers per primer RAPD (2.14). Two complementary and dominant genes seem to be involved in the trifoliate leave characteristic, considering that each species is heterozygote for one of them. Rooting capacities of 70% were obtained for the Swingle citrumelo, 60% for Rangpur lime and from 0 to 90% for hybrids. In CVT, a monogenic genetic control was found, in a 1:1 ratio. The analysis by the Multiple QTL Mapping (MQM) method detected the presence of a QTL for CTV resistance on linkage group 6 (GL 6 - explaining 95,1%of the phenotypic variation),

one for foliar morphology on linkage group 4 (GL 4 -

76,1%) and two QTLs for rooting of cuttings on the linkage groups 3 and 6 (GL 3 and 6 50,8% e 37,8%, respectively). Although the parents are quite different genotype, sinteny between them was also observed in some linkage groups. Key words: citrus tristeza virus - foliar pattern TRAP

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1 INTRODUO

A indstria citrcola uma das principais atividades do agronegcio brasileiro, sendo o suco concentrado congelado sua principal commodity para exportao. O Brasil lidera as exportaes mundiais de suco concentrado de laranja e de sua produo, com participao acima de 70% e de 29% do mercado internacional, respectivamente. Internamente valores expressivos tambm so alcanados, visto que a laranja representa 49% de toda a produo de frutas do pas (NEVES & LOPES, 2005). Com uma rea cultivada em torno de 600 mil hectares e produo de 352 milhes de caixas de 40,8 kg/planta/ano, o setor citrcola conta com uma cadeia altamente organizada desde viveiros at a indstria exportadora e mantm-se h anos na liderana mundial (IEA, 2007). A exportao de suco de laranja concentrado e sub-produtos (pectina, pellet para rao, leos, etc.) movimentam algo prximo de 1,5 bilhes de dlares anuais (OLIVEIRA et al., 2005). importante destacar que o aumento da produo nos ltimos anos explica-se, essencialmente, por um acrscimo de reas de plantio. As condies edafoclimticas tm favorecido a cultura dos citros em vrias regies do Brasil, entretanto, a produtividade mdia ainda muito baixa, quando comparada com outras importantes regies produtoras, como a Flrida, que alcana uma mdia de 6,0 caixas/planta/ano com intensivo uso de irrigao, diferentemente da produo mdia brasileira de 2,0 caixas/planta/ano. Nestes moldes, pode-se afirmar que a baixa produtividade brasileira, associada ausncia de irrigao, deve-se em grande parte a fatores de ordem fitossanitria e s estratgias de manejo do pomar e ps-colheita dos frutos (MACHADO et al., 2005). No entanto, doenas e pragas so os principais fatores limitantes da agroindstria citrcola brasileira, representando mais de 60% do custo de produo. A conseqente vulnerabilidade dos citros a pragas e doenas decorre de uma estreita base gentica ocasionada pela adoo de um sistema de produo considerado monocultural, em que um nmero reduzido de variedades cultivado em grandes extenses. importante salientar que, apesar de o gnero Citrus apresentar uma grande diversidade de espcies, apenas um pequeno nmero

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utilizado comercialmente. Como exemplos dos diferentes fitopatgenos de citros que trouxeram graves problemas ao Brasil no sculo XX, podem ser citados o vrus da tristeza dos citros (CTV) e a leprose nos anos 40, o cancro ctrico nos anos 50, o declnio nos anos 70, a clorose variegada dos citros e a pinta preta nos anos 90 (ROSSETTI et al., 1990) e, mais recentemente, a morte sbita dos citros (MSC) e o huanglongbing (HLB) (ex-greening) (GIMENES-FERNANDES & BASSANEZI, 2001; MLLER et al., 2001; COLETTA-Filho et al., 2004). Uma alternativa racional frente ao usual controle qumico dessas doenas ou de seus vetores a obteno de gentipos com maior resistncia a esses principais patgenos (CRISTOFANI et al., 1999). Sendo assim, os programas de melhoramento gentico e seleo dos citros focam a obteno de novos portaenxertos e variedades copa que sejam resistentes s doenas e pragas, e mais adaptados a condies abiticas adversas. Frente a este cenrio, o melhoramento de citros tem se destacado nas ltimas dcadas, principalmente devido possibilidade de utilizao e incorporao de ferramentas de biotecnologia aos programas tradicionais de melhoramento. Nesse aspecto, a utilizao de marcadores moleculares para a seleo precoce de plantas de origem sexual, oriundas de cruzamentos dirigidos, possibilitou a seleo de um nmero elevado de novas combinaes e, consequentemente, o estabelecimento de um maior nmero de populaes hbridas em condies de campo para seleo de novas variedades e caractersticas agronmicas desejveis. Entretanto, segundo NOVELLI et al. (2006), ROOSE (2003) e CRISTOFANI et al. (2000) algumas limitaes fazem das espcies do gnero Citrus, um desafio para os estudos genticos, especialmente, sua alta heterozigosidade gentica, longo tempo de gerao necessrio para a seleo, recombinao e poliembrionia nucelar adventcia. Podem aparecer, em citros, cerca de trs a doze embries apomticos formados a partir de clulas da nucela. O grau da embrionia nucelar varia entre os porta-enxertos de 100 para menos de 50%. Entretanto, alguns tipos de citros so monoembrinicos, produzindo somente plntulas zigticas (QUEIROZ-VOLTAN & BLUMER, 2005). Embora os desafios na obteno de prognies no cruzamento dentro do gnero Citrus e entre gneros prximos sejam considerveis, existem vrias fontes de resistncia a fatores biticos e abiticos que podem ser potencializadas na 2

obteno de indivduos com caractersticas agronmicas desejveis (MESTRE et al., 1997a). Essa abordagem particularmente importante quando a ela se agregam ferramentas, auxiliando na seleo de indivduos zigticos, na obteno de marcadores, no mapeamento gentico, culminando com a seleo assistida por marcadores, uma etapa ainda em processo de incorporao aos programas de melhoramento de citros. Em se tratando de uma abordagem metodolgica, uma das formas mais eficientes de associar caractersticas fenotpicas com caractersticas genticas por meio de mapas genticos de ligao, no qual essas caractersticas so ordenadas sequencialmente correspondendo de modo aproximado posio dos genes nos cromossomos (ROOSE, 2003). Mapas de ligao tm contribudo de maneira significativa para programas de melhoramento e pesquisa gentica, sendo uma das mais eficientes estratgias para conduo de estudos genticos avanados facilitando a seleo de plantas, o entendimento da herana, estrutura e organizao do genoma. Os citros possuem caractersticas favorveis que auxiliam a construo de mapas genticos. Eles so espcies predominantemente diplides (2n = 18), possuem um genoma pequeno, bom nvel de polimorfismo entre espcies e vrias espcies produzem hbridos frteis (OLIVEIRA et al., 2005). Diferentes marcadores tm sido usados no desenvolvimento de mapas de ligao em vrias populaes de citros. Marcadores dominantes como RAPD random amplified polymorphic DNA (WILLIAMS et al.,1990) e AFLP amplified fragment lenght polymorphism (VOS et al.,1995) so os mais usados, embora apresentem especificidade de populao e sejam mais difceis de serem aplicados em outras populaes por serem biallicos. Marcadores AFLP so capazes de acessar vrios pontos de polimorfismo, com 10 a 20 bandas polimrficas em um nico gel (ROOSE, 2003). Os TRAPs - target region amplification polymorphism (HU & VICK, 2003) so outra classe de marcadores que utilizam primers mais longos que RAPD, melhorando significativamente a reprodutibilidade. Tais marcadores facilitam o desenvolvimento de mapas densos que so efetivos para localizao de caractersticas quantitativas (QTL,quantitative trait loci). A estratgia de mapeamento prioriza o desenvolvimento de um mapa detalhado usando marcadores dominantes de alta resoluo, mas suplementado com marcadores co-dominantes que podem ser mapeados em muitas populaes. Marcadores co-dominantes como SSR - simple 3

sequence repeats (LITT & LUTTY, 1989), so polimrficos e transferveis entre espcies/variedades e, portanto, mais apropriados para o uso como ncoras para interligar mapas desenvolvidos em diferentes populaes. Neste contexto, marcadores moleculares, especialmente marcadores baseados em PCR, como TRAP (HU & VICK, 2003), AFLP (VOS et al., 1995) e SSR (LITT & LUTTY, 1989), abrem a possibilidade de construo de mapas genticos de modo mais rpido. O desenvolvimento de mapas de ligao de alta resoluo um pr-requisito para se isolar genes usando estratgias de clonagem baseada em mapas (SCHWARZ, et al., 2000). O uso de marcadores ancorados em seqncias repetidas, os denominados microssatlites (SSR), permite a integrao e seleo assistida por marcadores em um amplo espectro de populaes. Um mapa de referncia com marcadores multiallicos co-dominantes fornece a possibilidade de ligar os mapas dos dois genitores envolvidos e permite mapeamento comparativo (BARKLEY, et al., 2006; ROOSE, 2003; CRISTOFANI, et al., 2000). Nos ltimos 12 anos cerca de 20 mapas genticos foram desenvolvidos para citros. Como exemplos; C. grandis (LURO et al., 1996), C. aurantium, C. latipies (SIMONE et al., 1998), C. volkameriana, C. sunki e Poncirus trifoliata (CRISTOFANI et al., 1999; GARCIA et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2004b). Todavia, apesar de diferentes grupos de pesquisa no mundo estarem engajados neste processo, tem sido bastante difcil correlacionar e integrar os grupos de ligao identificados nesses mapas devido ao pequeno nmero de marcadores em comum (RUIZ & ASNS, 2003). Em outros casos, um mapa consenso foi obtido para os dois genitores sem levar em considerao a possvel reorganizao cromossmica que deve ter acontecido durante a evoluo da famlia Aurantioideae. Esses mapas possibilitaram o mapeamento do gene de resistncia tristeza e caractersticas como nanismo, acidez do fruto, resistncia a Tylenchulus semipenetrans Cobb, nmero de sementes, apomixia, resistncia a salinidade, macho esterilidade e resistncia gomose causada por Phytophythora (CAI et al., 1994; CHENG & ROOSE, 1995; GMITTER Jr. et al., 1996; DENG et al., 1997; MESTRE et al., 1997a,b,c; FANG et al., 1998; CRISTOFANI et al., 1999; GARCIA et al., 1999; TOZLU et al., 1999ab; LING et al., 2000; GARCIA et al., 2000; SIVIERO et al., 2001; SIVIERO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2005). Caractersticas estas que sero teis em estratgias de seleo assistida por 4

marcadores na conduo de estudos avanos em melhoramento de citros; ainda em fase de implementao. A maior parte dos mapas reportados relaciona-se com estudos de herana da resistncia a doenas, muitas delas com herana simples (genes de resistncia ou R), outras polignicas (quantitative resistance locus ou QRL). A estratgia de BSA (Bulked Segregant Analysis) descrita por MICHELMORE et al. (1991) foi utilizada em alguns desses mapas. Recentemente, com o aparecimento da morte sbita dos citros (MSC) (GIMENES-FERNANDES & BASSANEZI, 2001; MLLER et a1., 2001), detectou-se a necessidade de obteno de novas combinaes de porta-enxerto que pudessem ser utilizados como uma alternativa ao limo Cravo e que possibilitassem estudos sobre a herana a essa anomalia. Considerando que a morte sbita dos citros uma doena de combinao entre copa e porta-enxerto (limo Cravo e limo Volkameriano), ela altamente preocupante uma vez que o limo Cravo responde por mais 85% dos porta-enxertos no Estado de So Paulo. Portanto, existe grande interesse no desenvolvimento de novos porta-enxertos. Nesse sentido, importante o desenvolvimento de novos hbridos com caractersticas favorveis presentes em genitores contrastantes. Seguindo este raciocnio, seria de grande interesse um porta-enxerto hbrido, com grande nmero de sementes poliembrinicas por fruto, rstico, de induo de produo precoce, com boa tolerncia ao estresse hdrico, que confira boa qualidade aos frutos e produo copa. Todas essas caractersticas esto presentes no limo Cravo e, algumas delas, no citrumelo Swingle (MULLER et al., 2001). Com o surgimento e expanso da MSC, um dos principais objetivos da pesquisa com porta-enxertos passou a ser o desenvolvimento de porta-enxertos que possam substituir o limo Cravo, porm sem perder significativas qualidades dessa espcie, principalmente a tolerncia seca. A hiptese principal desse trabalho que existe suficiente variabilidade gentica dentro dos gentipos dos genitores que permita mapeamento e produo de novos hbridos com tolerncia morte sbita. Uma vez que a avaliao de morte sbita exige experimentao de campo acima de cinco anos, foi feita a avaliao preliminar da tolerncia ao vrus da tristeza, com um dos candidatos associados ao desenvolvimento da doena. Como o patgeno da MSC possui etiologia incerta, trabalha-se com a possibilidade de uma associao do patgeno da MSC com o de CTV. Alm do fato de ambas as doenas serem de combinao copa e porta5

enxerto. Esse projeto faz parte do Programa de Melhoramento de Porta-Enxertos do Centro APTA Citros Sylvio Moreira do IAC. Portanto, o objetivo principal desse trabalho foi o desenvolvimento de mapas genticos de ligao de limo Cravo e citrumelo Swingle, com vistas ao estudo da herana da resistncia ao vrus da tristeza dos citros e de caractersticas contrastantes como padro foliar e capacidade de enraizamento de estacas. Para tanto, foi utilizada uma populao de mapeamento de hbridos, utilizando-se a estratgia de pseudo-testcross com locos marcadores RAPD, SSR e TRAP. 2 REVISO DE LITERATURA

2.1 Citricultura no Brasil A citricultura brasileira apresenta nmeros expressivos que traduzem a grande importncia econmica e social que a atividade gera para a economia do pas. Segundo AZEVEDO (2003), a rea plantada prxima a 600 mil hectares, enquanto que no ano de 2006, somente o Estado de So Paulo produziu cerca de 352 milhes de caixas de 40,8 kg, superando 14 milhes de toneladas anuais (IEA, 2007). O parque citrcola no Brasil se iniciou no sculo XX, com citricultores iniciando o plantio de citros em larga escala, quando estimulados pela crise do caf no final da dcada de 1920. Desde o incio da sua fase comercial, a citricultura concentrada, at ento, em So Paulo e Rio de Janeiro, j era planejada para atender ao mercado externo. Estatisticamente, em 1920, o Brasil j era considerado o quinto maior produtor mundial de citros (BOTEON & NEVES, 2005). Mas, somente a partir dos anos 30 do sculo passado, segundo AZEVEDO (2003), a citricultura comeou a ser implantada comercialmente nos Estados de So Paulo, Rio de Janeiro e Bahia. Entre 1940 e 1960, aps uma sucesso de fatos, como a decadncia do caf nos anos 20, a Segunda Guerra Mundial em 1939, disseminao de doenas, como a tristeza na dcada de 40, cancro ctrico em meados dos anos cinqenta, e conseqente baixo incentivo aos produtores, houve um declnio da citricultura no pas, como apontam BOTEON & NEVES (2005). Em meados da dcada de 1960, o parque citrcola retoma o crescimento. Os primeiros investimentos visando industrializao da laranja no Brasil foram 6

incentivados pela queda da produo norte-americana, devido geada que, em dezembro de 1962, destruiu cerca de 16 milhes de laranjeiras na Flrida (AMARO et al., 2005). Impulsionado por uma srie de outros fatos como incentivos fiscais, condies naturais do Brasil, o parque citrcola mudou seu foco comercial de fruta fresca para indstria processadora. Em desenvolvimento, a partir da dcada de 1980, o Brasil se consolida como o maior produtor mundial de suco de laranja. Desde o processo de industrializao at o momento, o foco principal da citricultura paulista tem sido a produo de suco destinado ao mercado externo (ABECITRUS, 2001; BOTEON & NEVES, 2005). Atualmente, um custo de produo competitivo aliado a um parque industrial atuante em escala global so pontos fortes da citricultura brasileira. Por outro lado, o ponto fraco encontra-se no aparecimento de severas doenas nos pomares, tanto para variedades copa como porta-enxerto. Nas ltimas dcadas, o aparecimento de doenas como a tristeza dos citros (CTV) na dcada de 40 (MOREIRA & MOREIRA, 1991) e a clorose variegada dos citros (CVC) na dcada de 90 (ROSSETI et al., 1990), comprometeu o custo e a oferta futura. Entretanto, o aparecimento das novas doenas neste incio de milnio, como morte sbita dos citros (MSC), (GIMENES & BASSANEZI, 2001; MULLER et al., 2001) e huanglongbing (ex-greening) (COLETTA-Filho et al., 2004), um risco econmico muito presente no setor e pode comprometer a produtividade brasileira no futuro. Enquanto isso, segundo AMARO et al. (2005) e BOTEON & NEVES (2005), o aumento do consumo, a reduo das barreiras tarifrias e fitossanitrias, investimentos em qualidade da fruta fresca, modernizao da sua estrutura de beneficiamento e comercializao, produo a custos competitivos, investimentos em diversidades de sucos de laranja e slida retaguarda de pesquisa, so estratgias a se considerar mantenedoras da estrutura citrcola nacional rentvel. No ano de 2004, o seqenciamento gentico, funcional e comparativo dos citros foi concludo e assim foi possvel saber quais so e onde esto localizados os genes responsveis pela resistncia s principais doenas da laranja, assim como quais so os genes existentes nos vrus, virides, bactrias e fungos que provocam as doenas (CARLOS et al., 2007). Com isso se torna possvel disponibilizar no mercado variedades de laranjas resistentes a um ou dois patgenos, gerando economia cadeia citrcola, principalmente levando-se em conta que as doenas 7

o principal fator limitante da citricultura brasileira, representando mais de 60% do custo de produo, segundo MACHADO et al. (2005). A citricultura brasileira detm o maior banco de informaes sobre citros no mundo, com cerca de 300 mil seqncias de genes como discorre AMARAL et al. (2007). Colocando o Brasil tambm na liderana mundial nas pesquisas cientficas do setor, como exemplos o seqenciamento e mapeamento gentico j realizados de Poncirus trifoliata e de pelo menos seis espcies do gnero Citrus (AMARAL et al., 2007). Avaliando o agronegcio citrcola brasileiro, por trs de todo o caminho que percorre a produo da fruta at chegar s mos dos consumidores, h uma cadeia que gera empregos, pesquisa, movimenta economias locais e gera conhecimento global (BOTEON & NEVES, 2005). 2.2 Gentica e Melhoramento de Citros Estima-se que Citrus e gneros correlatos se originaram entre 20 a 30 milhes de anos atrs, nas regies tropical e subtropical da sia e do arquiplago Malaio, de onde se dispersaram para outras regies do mundo. Em se tratando dos sistemas de classificao existentes, o mais utilizado foi o proposto por SWINGLE (1943), que reconheceu 16 espcies verdadeiras de citros e as classificou entre os seis gneros que compunham o grupo subtribal denominado "rvores de citros verdadeiros" (true citrus fruit trees), subtribo Citrinae, tribo Citreae, subfamlia Aurantioideae da famlia Rutaceae (SWINGLE & REECE, 1967). O nmero de cromossomos dos representantes desse gnero foi corretamente estabelecido pela primeira vez por FROST (1925) como n = 9. Assim, segundo GUERRA et al. (2000), a subfamlia Aurantioideae pode ser caracterizada pela dominncia de diplides, sendo que de suas 60 espcies estudadas at ento, a grande maioria 2n = 2x = 18 e, ocasionalmente, ocorrem autopoliplides intra-especficos (3x e 4x). Poliplides comprovadamente estabilizados so raramente encontrados. A estabilidade do caritipo em Aurantioidea est aparentemente ligada alta capacidade de hibridao interespecfica (GUERRA et al., 1997, 2000). Em relao ao sistema de classificao sistemtica, esse grupo de plantas apresenta grande complexidade. A taxonomia da subfamlia Aurantioideae foi marcada pela proposio de novos gneros, segregados de Citrus, como Poncirus, 8

Fortunella e Microcitrus. No entanto, no h fortes evidncias morfolgicas para a manuteno desses gneros, uma vez que caracteres diagnsticos de um deles podem ser encontrados em outros representantes do referido grupo. Seus representantes apresentam grande compatibilidade sexual, o que possibilitou a origem natural de hbridos intergenricos e interespecficos ao longo do processo de evoluo do grupo (ARAJO & ROQUE, 2005). As espcies do gnero Citrus reproduzem-se sexuadamente por autopolinizao e polinizao cruzada, assexuadamente por apomixia nucelar adventcia e agronomicamente por propagao vegetativa. Suas sementes possuem tanto embries zigticos, como apomticos, apresentando, em geral, apomixia facultativa, com nmero varivel de embries entre um a doze. Algumas espcies so monoembrinicas e no aproveitadas como porta-enxertos em funo da alta variabilidade na prognie, conduzindo o plantio com baixa uniformidade. Os mtodos de seleo de embries zigticos e nucelares podem se basear em caractersticas morfolgicas (TEICH & SPIEGEL-ROY, 1972), qumicas e bioqumicas (FURR & REECE, 1946; PIERINGER & EDWARDS, 1967; TATUM et al., 1974; TORRES et al., 1978; ANDERSON et al., 1991) ou moleculares (BASTIANEL et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2002, 2003). Espcies do gnero Citrus e outras de gneros correlacionados como Poncirus e Fortunella apresentam compatibilidade gentica, produzindo hbridos frteis de interesse para o melhoramento. Exemplos tpicos dessa compatibilidade sexual so os hbridos do gnero Citrus com P. trifoliata. Aps as devastadoras geadas ocorridas na Flrida em 1894-1895, pesquisadores do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos iniciaram, em 1897, um programa de produo de cultivares copas resistentes ao frio mediante a hibridao de trifoliata com cultivares de citros. Desse trabalho, surgiram dezenas de hbridos citranges, citrumelos, citrandarinas, citradias, citremons e citrumquats alguns dos quais vieram a se tornar porta-enxertos comerciais em diversos pases, inclusive no Brasil (BOTEON et al., 2005). Aps hibridao com Poncirus, os descendentes denominados citranges, citrandarins, citrumelos, entre outros, apresentam folhas trifoliadas, que uma caracterstica morfolgica governada por um gene dominante, que determina essa caracterstica quando em homozigose e heterozigose. Contudo, vale ressaltar, que o uso de Poncirus como um dos genitores em programas vai muito alm de sua 9

marcante morfologia de folha trilobada, haja visto que esse gnero apresenta inmeras caractersticas agronmicas importantes, como resistncia a doenas e melhor qualidade de fruta na variedade copa enxertada sobre ele. O citrumelo Swingle originado do cruzamento entre o pomelo (C. paradisi Macf.) Duncan e P.trifoliata, sendo utilizado como porta-enxerto devido a muitas caractersticas como tolerncia tristeza, exocorte, xiloporose (GRANT et al., 1961; HUTCHISON, 1974) e ao declnio (BERETTA et al., 1994). Tambm resistente gomose de Phytophthora, ao nematide dos citros (O'BANNON & FORD, 1978) e morte sbita dos citros (GIMENES & BASSANEZI, 2001). Plantas enxertadas em citrumelo Swingle produzem bem em solos arenosos ou argilosos, porm no tm bom comportamento em solos com pH elevado e nos solos mal drenados (WUTSCHER, 1979). moderadamente resistente seca e a geadas. Entretanto, suas plntulas so suscetveis mancha bacteriana dos citros, causada por Xanthomonas axonopodis pv. citri, que causou a queima de milhes de mudas na Flrida nos anos oitenta. As laranjeiras e outras espcies enxertadas no trifoliata (P.trifoliata) ou em seus hbridos apresentam maior dimetro do tronco do porta-enxerto que o da copa, o que no impede que as plantas sejam produtivas e longevas. Poucas cultivares apresentam combinaes denominadas de incompatveis. Como exemplo, a laranja Pra e o tangor Murcott so incompatveis com os trifoliatas e diversos de seus hbridos, entre eles os citranges e os citrumelos (POMPEU, 2005). Em So Paulo, laranjeiras Valncia enxertadas em citrumelo Swingle produziram menos que as enxertadas em limo Cravo (POMPEU Jr. & BLUMER, 2002), porm com frutos de qualidade superior queles obtidos sobre os limes Cravo e Volkameriano. Ele esteve entre os porta-enxertos que induziram maior produo lima cida Tahiti em Bebedouro e Agua (FIGUEIREDO et al., 2001). No Rio de Janeiro, laranjeiras Natal em citrumelo Swingle foram mais produtivas que as enxertadas em limo Cravo, limo Volkameriano, tangerina Clepatra e outros porta-enxertos (GRAA et al., 2001). De acordo com SWINGLE (1967), o limo Cravo um lemandarin, isto , um hbrido natural de limo (C. limon L.) e uma tangerina (C. reticulata Blanco), originado na regio de Canton, no Sul da China, onde conhecido como limo Canton. Na classificao de TANAKA (1954), o limo Cravo considerado uma espcie (C. limonia) nativa da ndia, onde conhecido pelo nome de Jamir. Supe10

se que ele tenha sido levado do sudeste da sia para a Europa e da para as Amricas, tendo sido introduzido no Brasil pelos colonizadores (POMPEU, 2005). A primeira referncia ao seu uso como porta-enxerto no Brasil foi feita por ROLFS & ROLFS (1931), que encontraram em Minas Gerais laranjeiras enxertadas nesse porta-enxerto, plantadas na dcada de 1900. Esses autores ficaram entusiastas com o uso do limo Cravo, considerando-o excelente porta-enxerto. Em So Paulo, vem sendo comercialmente empregado desde a dcada de 1920, porm seu uso foi ampliado a partir dos anos cinqenta, quando veio a substituir a laranja Azeda pela suscetibilidade desta ao vrus da tristeza dos citros. H muitas razes para seu uso por viveiristas e citricultores: tolerncia tristeza, resistncia seca, facilidade na obteno das sementes, grande vigor no viveiro antes e depois da enxertia, bom pegamento das mudas por ocasio do plantio no pomar, rpido crescimento das plantas, produo precoce, altas produes de frutos de regular qualidade, compatibilidade com todas as cultivares copa, mdia resistncia ao frio e bom comportamento nos solos arenosos (POMPEU, 2005). De modo geral, o limo Cravo apresenta mdia resistncia gomose de P. parastica e P. citrophthora, embora existam variaes entre as selees. Segundo MUNTANER et al. (1976), as selees Santa Brbara e EEL so as mais resistentes, e o limo Cravo Periforme e lima Borneo red, as mais suscetveis. Sendo considerado suscetvel aos nematides Tylenchulus semipenetrans e Pratylenchus jaehni (CAMPOS, 2002), no tendo sido encontradas referncias sobre o comportamento das suas diversas selees a esses nematides. tolerante ao vrus da tristeza dos citros (COSTA et al., 1954; GRANT et al., 1961), mas mostra caneluras quando infectado por raas severas do vrus, como a variante Capo Bonito (MLLER et al., 1968). Recentemente, com o aparecimento da morte sbita dos citros (MSC) (GIMENES & BASSANEZI, 2001; MLLER et al. 2001), detectou-se a necessidade de obteno de novas combinaes de porta-enxerto que pudessem ser utilizados como uma alternativa ao limo Cravo e que possibilitassem estudos sobre a herana da resistncia a MSC. O interesse no desenvolvimento desses hbridos evidente, uma vez que se pretende associar as caractersticas favorveis que esto presentes nos dois genitores. Segundo CRISTOFANI et al. (2000) e NOVELLI et al. (2005), os citros possuem muitas caractersticas agronmicas que so difceis de selecionar por 11

tcnicas convencionais de melhoramento, devido maioria delas possurem herana aparentemente quantitativa, com exceo de algumas, como resistncia CTV, leprose e morfologia foliar, que so aparentemente governadas por um ou dois genes. No melhoramento gentico de citros, o estudo do modo de herana de resistncia a doenas e de outras caractersticas importantes, apresenta um determinado grau de complexidade especialmente devido a fatores de ordem gentica, botnica e agronmica. Tais como a heterogeneidade gentica do gnero, poliembrionia natural, recombinao, longo perodo pr-reprodutivo, incompatibilidade, alta heterozigosidade, complexidade dos mecanismos genticos, depresso por autogamia e as longas geraes necessrias para se realizar selees (CRISTOFANI, 1999). O uso de um nmero reduzido de variedades com base gentica estreita e o sistema de produo de citros como monocultura fez com que a indstria citrcola se tornasse vulnervel a pestes e doenas. Como aconteceu com o vrus da tristeza dos citros (CTV) na dcada de 1940, cancro ctrico na dcada de 50, clorose variegada de citros nos anos 90 e mais recentemente morte sbita de citros (MSC) e huanglongbing (greening). Os programas de melhoramento gentico de Citrus focam, principalmente, a obteno de novos porta-enxertos e variedades copa resistentes s doenas, pragas e mais adaptados a condies abiticas adversas. Vale destacar que como os programas de melhoramento de espcies anuais, o melhoramento de plantas perenes lenhosas tambm deve basear-se no conhecimento do controle gentico da herana de caractersticas importantes e no uso e manuteno dos recursos genticos disponveis (POMPEU, 2005). Neste contexto, uma das formas mais eficientes de associar as caractersticas fenotpicas da cultura com as caractersticas genticas por meio de mapas de ligao, no qual essas caractersticas so ordenadas seqencialmente, correspondendo de modo aproximado posio dos genes nos cromossomos (MACHADO et al., 2005). Em se tratando do mtodo mais eficiente de se obter hbridos , sem dvida, mediante hibridao artificial com polinizao controlada. Alm de permitir o controle da identidade de ambos os genitores, reduz significativamente os riscos de cruzamentos indesejveis e de auto-fecundao, o que ocasiona a perda de identidade do genitor masculino (MACHADO et al., 2005). Entretanto, a maioria das pesquisas de melhoramento de Citrus tem pretendido selecionar variedades que so resistentes a doenas. Sendo que poucos estudos genticos, de fato, usando uma 12

prognie controlada, tm sido realizados para entender a herana com relao resistncia a importantes doenas. Embora os desafios na obteno de prognies F1 no cruzamento dentro do gnero Citrus e entre gneros prximos sejam considerveis (NOVELLI, et al., 2006) a introgresso de genes em Citrus por hibridao sexual freqentemente dificultada pela poliembrionia, incompatibilidade sexual e longa juvenilidade. Essa abordagem particularmente importante quando a ela se agregam ferramentas da biotecnologia, auxiliando na seleo de indivduos zigticos, na obteno de marcadores, no mapeamento gentico, culminando com a seleo assistida por marcadores. No tocante s diferentes estratgias de melhoramento de citros, atualmente, a grande referncia na literatura so as pesquisas envolvendo gentica-genmica. De maneira, que pode-se dizer que estudos de mapeamento genticos completam a genmica funcional que por sua vez completam os de mapeamento. Assim sendo, a gentica-genmica vem surgindo como a nova opo para se observar os fenmenos da herana, determinando o gentipo por anlise direta das seqncias de DNA. Segundo KONING et al. (2005), a genmica funcional tem sido aplicada na dissecao gentica de Citrus em diferentes caminhos; para detectar locos de caractersticas quantitativas (QTLs), no cruzamento experimental entre linhagens que diferem nas caractersticas contrastantes, delineando estas diferenas; mapeamento gentico e fsico; estudos de expresso gnica, na medio dos nveis de expresso ou inferncias de expresso diferencial para milhares de genes usando microarranjos, entre outras inmeras aplicaes. Uma estrutura de mapeamento, chamada mapeamento funcional, tem sido proposta para caracterizar, em um nico passo, os locos de caractersticas quantitativas quantitative trait loci (QTLs) ou mesmo os nucleotdeos de caractersticas quantitativas quantitative trait nucleotide (QTN), segundo WU & LIN (2006). Os QTNs so bastante teis integrando finas estratgias de mapeamento e clonagem posicional de genes localizados. A abordagem fornece uma proveitosa estrutura quantitativa e analisvel para estimar a interao entre aes gnicas e mudanas desenvolvimentais. Outra poderosa abordagem gentica-genmica uma combinao dos mtodos de mapeamento tradicional quantitative trait loci (QTL) com dados de 13

microarray, resultando em uma notvel utilidade em um grande nmero de investigaes recentes biolgicas. Estes estudos de locos associados com variao herdvel na expresso de outros genes no genoma (eQTL) so similares aos estudos tradicionais de QTLs, com um objetivo principal em identificar os locais genmicos aos quais as caractersticas expressas so ligadas (KENDZIORSKI et al., 2006). Neste contexto, a seleo assistida por marcadores, uma etapa ainda em processo de incorporao aos programas de melhoramento de citros (MACHADO et al., 2005), pode combinar todas estas diferentes estratgias. Estas vo desde anlises QTL de fentipos associadas com anlises QTL de nveis de expresso de genes at transformao gentica. KIRST et al. (2004), conduziram um retrocruzamento interespecfico de uma populao de Eucalyptus e observaram que QTLs para crescimento do dimetro estavam co-localizados com eQTLs para genes relacionados com lignina, sugerindo que caractersticas de crescimento e lignina so controladas pelos mesmos locos. Neste sentido, microarrays tm sido usados para determinar nveis de expresso de genes em populaes segregantes e identificar regies genmicas (QTLs de expresso de genes ou eQTLs), explicando variaes do transcrito em genes co-regulados. Portanto, quando os microarrays so correlacionados com dados fenotpicos de uma caracterstica quantitativa, possvel identificar com sucesso genes candidatos posicionais. Desta forma, dados do transcrito, dados fenotpicos e genotpicos podem ser integrados para identificar genes controlando variao no crescimento em diversas espcies. Nos trabalhos de KIRST et al. (2004), as anlises em populaes de Eucalyptus spp revelaram uma reduo coordenada de nveis de transcrito para enzimas codificando genes envolvidos na biossntese de lignina na prognie que mostra um crescimento superior. 2.3 Mapas Genticos Em funo do ciclo de reproduo e da perenidade de muitas espcies lenhosas de polinizao aberta e altamente heterozigticas, o mapeamento gentico, mesmo com marcadores moleculares, ainda no est to avanado quanto o de espcies anuais. A disponibilidade de prognies de cruzamentos entre diferentes espcies e variedades de Citrus, por exemplo, ainda muito rara. Na maioria das vezes, somente prognies do cruzamento entre dois genitores, com 14

certa heterozigosidade, encontram-se disponveis para estruturao de mapas de ligao. Para superar problemas dessa natureza, GRATTAPAGLIA & SEDEROFF (1994) propuseram a utilizao de uma estratgia, por eles denominada de pseudo-testcross", que permite a construo de mapas de ligao com base em prognie F1 de genitores altamente heterozigotos. Nessa abordagem, a configurao do cruzamento no precisa ser planejada a priori, como em um cruzamento teste clssico, mas pode ser inferida a posteriori, aps a anlise de segregao dos marcadores na prognie. O mtodo mais importante e comum de mapeamento utiliza a freqncia de recombinao para determinar a distncia relativa entre duas caractersticas ligadas. STURTEVANT (1913) estabeleceu que a freqncia de quiasmas entre dois genes ligados de certa forma proporcional distncia fsica entre ambos. Esse princpio a base para o mapeamento gentico. Uma unidade de centiMorgan equivale a aproximadamente 1% de recombinao quando os marcadores esto bastante prximos, ou podem diferir da porcentagem de recombinao quando esto mais distantes em vista da ocorrncia de crossing-over duplo, triplo, etc. Diversas funes de mapeamento tm sido utilizadas na correo das distncias calculadas em porcentagem de recombinao para a distncia em centiMorgan (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996). Com base na freqncia de recombinao realizada uma anlise para distribuio independente entre os locos segregantes para identificar pares de caractersticas ligadas. Aps essa etapa, os marcadores ligados so combinados em grupos de ligao. A ordem linear dos marcadores dentro de cada grupo deduzida da distncia gentica relativa a cada um em estimativas dois a dois (RITTER et al., 1990). Outros mtodos utilizando estimativas de mxima verossimilhana da freqncia de recombinao entre os marcadores e algoritmos de ordenao rpida de um grande nmero de marcadores tm sido empregados para a construo de mapas com maior preciso. Existem disponveis diversos programas computacionais com base no mtodo da mxima verossimilhana, tais com Linkage 1 (SUITER et al., 1983), Mapmaker (LANDER et al., 1987), GMendel (LIU & KNAPP, 1992), Joinmap (STAM, 1993), entre outros. O JoinMap baseado em um LOD modificado em funo de um teste de Qui-quadrado independente, permitindo, assim, a integrao de marcadores de diferentes tipos de segregao em mapas genitores e a construo de mapas consensos. 15

Assim como para outras espcies, o mapeamento gentico de plantas perenes requer alguns requisitos, como: i) escolha dos genitores com fentipo contrastante em relao caracterstica de interesse, por exemplo, resposta diferenciada em relao resistncia a alguma doena; ii) polinizao controlada entre os genitores com produo de uma prognie com tamanho mnimo e representativo de eventos meiticos, e iii) obteno de centenas de marcadores com segregao mendeliana clssica. Ao se caracterizar um loco marcador desejvel que os marcadores moleculares sejam polimrficos, que no sofram seleo, sejam co-dominantes para que todos os possveis alelos dos locos marcadores possam ser identificados e contenham maior informatividade que os dominantes. Cada vez mais, mapas genticos de ligao vm sendo utilizados em vrias espcies, principalmente aps o desenvolvimento de diferentes classes de marcadores moleculares, segundo CARNEIRO & VIEIRA (2002). No entanto, os primeiros mapas genticos baseavam-se em marcadores morfolgicos e citolgicos. Estes ltimos eram obtidos a partir de alteraes cromossmicas (aneuploidias, translocaes, delees e inverses), principalmente em culturas de mais fcil observao das alteraes fenotpicas causadas por essas modificaes, como milho, tomate e ervilha. No entanto, esses marcadores so restritos s espcies de amplo conhecimento citolgico. A partir do desenvolvimento de marcadores bioqumicos (isoenzimas) e moleculares (DNA), o mapeamento gentico passou a ser utilizado em vrias espcies, at mesmo naquelas para as quais nem sequer havia ainda estudos de ligao a algum marcador. Portanto, os mapas genticos tm importante papel em muitas reas da gentica: anlise de QTLs, clonagem baseada em posio no mapa, melhoramento por meio da seleo assistida por marcadores (SAM) e, mais recentemente, na genmica comparativa. A seleo indireta, por meio de marcadores genticos, tem sido sugerida para caractersticas de baixa herdabilidade, que requerem grandes populaes para sua mensurao (FERREIRA, 1995). O mapeamento comparativo (comparative mapping ou synteny mapping) constitui outra importante aplicao dos mapas genticos (FEUILLET & KELLER, 2002). A comparao das estruturas genmicas de diferentes espcies, do ponto de vista de homologia de genes e conservao de distncias e da ordem de ligao nos cromossomos, permite melhor compreenso da evoluo dos genomas (CARNEIRO & VIEIRA, 2002). Outra utilizao do mapeamento comparativo 16

como estratgia de obteno de um mapa nico de referncia para a maioria das espcies vegetais cultivadas, pelo menos ao nvel de famlias taxonmicas (CARNEIRO & VIEIRA, 2002). Desse modo, um mapa gentico saturado do genoma passou a ser a base para estudos avanados de gentica, incluindo a identificao e isolamento de genes e estudos da estrutura, expresso e funo desses genes, como enfatizam OLIVEIRA et al. (2005) em seus trabalhos. Altas resolues em regies especficas (isto , prximas a genes de interesse) so fundamentais para a identificao, isolamento e clonagem de genes, que vem se tornando uma realidade em espcies com mapas genticos bem definidos (ROOSE et al., 2000). Nos ltimos poucos anos, mapas integrados de muitas espcies tm sido publicados. Devido ao aumento na densidade dos locos e decrscimo no nmero de gaps, estes mapas consensos tm fornecido uma identificao mais precisa de genes principais e/ou QTLs de importncia agronmica. Adicionalmente eles tm auxiliado a conduzir a seleo assistida por marcadores e estudar a estrutura e organizao do genoma, estudos de evoluo e introgresso de genes. O mapeamento gentico se tornou mais freqente, principalmente aps o advento da tecnologia de seqenciamento de alta produo, que tem gerado informaes abundantes sobre seqncias de DNA para os genomas de muitas espcies de plantas. Isto inclui o seqenciamento de seqncias genmicas completas para o modelo de planta Arabidopsis thaliana em 2000 e para o arroz (Oryza spp.) em 2002. Adicionalmente, as Expressed Sequence Tags (ESTs) de outras importantes espcies cultivadas tm sido geradas, e ferramentas poderosas de bioinformtica tm anotado milhares de seqncias como genes funcionais putativos. Neste contexto, marcadores moleculares representam a tarefa de relacionar estas informaes geradas de seqncias de DNA com fentipos particulares. Conseqentemente, h uma forte demanda em melhorar tcnicas de marcadores para se melhor utilizar a informao de seqncias disponveis. Um mapa saturado a base para estudos avanados de gentica, incluindo a identificao, isolamento e estudos da estrutura, expresso e funo dos genes. A clonagem de genes se tornou uma realidade em espcies com mapas genticos bem definidos. Entretanto, a construo de mapas de alta resoluo, vale ressaltar, isto , que permitam encontrar marcadores bastante prximos ou at mesmo completamente ligados ao gene um pr-requisito para a clonagem de genes 17

baseada em mapeamento. Marcadores moleculares, segundo CHEN et al. (2006a) e HU & VICK (2003), realizam um importante papel na genmica estrutural e funcional de animais, plantas e espcies microbianas. A deteco de Quantitative Loci Traits (QTLs) principais em mapas de ligao genticos baseada em marcadores moleculares oferece uma refinada viso da arquitetura gentica de caracteres quantitativos e uma ferramenta potencial para melhoramento efetivo por meio de seleo assistida por marcadores (YOSHIMARU et al., 1998; LING et al., 2000). Os estudos de WILLIAMS et al. (1990) demonstraram que primers curtos com seqncias de nucleotdeos arbitrrias podem ser usados para reproduzir segmentos amplificados de DNA genmico de uma extensa variedade de espcies. Estes marcadores foram denominados de random amplified polymorphic dna (RAPD). Entre os mtodos baseados em DNA, a anlise com RAPD uma das mais utilizadas em programas de melhoramento (BASTIANEL et al., 1998). Estes marcadores utilizam um conjunto de primers universais que podem ser usados para anlise genmica em uma ampla variedade de espcies e so dominantes, visto que segmentos de DNA de mesmo tamanho so amplificados de um indivduo, mas no do outro. Desta forma, no possvel distinguir se um segmento de DNA amplificado de um loco que heterozigoto (1 cpia) ou homozigoto (2 cpias). Outra eficiente tcnica com marcadores inclui os chamados AFLP (amplified fragment length polymorphism), que geram locos dominantes. Eles tm sido utilizados para determinar a localizao cromossomal de fentipos mutantes, por meio de uma estratgia de mapeamento de todo o genoma (PETERS et al., 2004). Recentemente, LI & QUIROS (2001) publicaram uma nova tcnica de marcador molecular denominada sequence related amplification polymorphism (SRAP), em que pares de primers com ncleos ricos em AT ou GC so usados para amplificar fragmentos intragnicos por deteco de polimorfismo. O aspecto comum de SRAP, RAPD e AFLP que fragmentos mltiplos podem ser gerados em uma nica reao de amplificao. Entretanto, estas tcnicas no usam, a priori, informao da seqncia, e os marcadores gerados so distribudos aleatoriamente no genoma. HU & VICK (2003) desenvolveram uma tcnica rpida e eficiente baseada em PCR, que utiliza ferramentas de bioinformtica e dados de EST para gerar 18

marcadores polimrficos ao redor de genes alvo candidatos. Este polimorfismo de amplificao de regies alvo (TRAP) utiliza dois primers de aproximadamente 18 nucleotdeos para gerar marcadores. Um dos primers, o fixo, desenhado a partir de uma seqncia alvo do banco de dados EST, amplificando seqncias parciais do gene candidato. O segundo primer, o arbitrrio, uma seqncia arbitrria, com 3 a 4 nucleotdeos rica em AT e/ou GC (embora deva existir de 40 a 60% de contedo rico em GC para manter a estabilidade adequada do primer), em seu ncleo, para anelar com introns e exons., amplificando as demais regies provveis do gene candidato. Alm desta regio, o primer arbitrrio possui 3 a 4 nucleotdeos seletivos em sua extremidade 3 e seqncias de preenchimento na extremidade 5. Uma reao de amplificao ento realizada e os fragmentos de 50-900 pb so separados em um gel de seqenciamento ou de poliacrilamida. A tcnica tem sido utilizada tendo como alvo genes que governam caractersticas agronmicas de interesse para o melhoramento. Diferenas morfolgicas entre 16 espcies de Helianthus spp obtidas pelo sistema taxonmico de classificao para estas espcies foram confirmadas e bem retratadas quando confrontadas com dados obtidos por marcadores TRAP, em estudos feitos por Hu et al. (2003). Estes autores construram uma rvore filogentica com os dados de um sistema multiplex -, utilizando 6 primers (2 primers fixos, com alvo em seqncias gnicas de genes de resistncia a doena com regies repetidas ricas em leucina ou stios de ligao a nucleotdeos e 4 primers arbitrrios), resultando em mais de 100 fragmentos polimrficos entre estas espcies. Outra classe de marcadores, os microssatlites ou simple sequence repeats (SSR) so de marcadores marcadores codominantes, microssatlites multiallicos, tm permitido altamente aumentar informativos, e de ampla utilizao na maior parte das culturas. A identificao e desenvolvimento significativamente a densidade dos mapas de ligao obtidos com outros marcadores. Em girassol, por exemplo, tm sido utilizados na integrao de diferentes mapas genticos previamente obtidos com marcadores restriction fragment length polymorphism (RFLP) (YU et al., 2003). A utilizao de microssatlites na construo e/ou integrao de mapas genticos em citros tem sido limitada devido falta de um nmero suficiente de marcadores polimrficos disponveis para esta finalidade. Embora tenham ajudado a aumentar a densidade 19

em alguns dos mapas genticos j obtidos (JARREL et al., 1992; GARCIA et al., 1999), eles ainda no tm permitido obter nveis de saturao apropriados (KIJAS et al., 1997; ROOSE et al., 2000; RUIZ & ASNS, 2003, CRISTOFANI et al., 2000). Especialmente em se tratando de microssatlites, segundo LI et al. (2002), estes esto distribudos tanto em regies codificantes como no-codificantes do genoma; sua distribuio no genoma possui significncia evolutiva e dinmica; possuindo funes e efeitos na expresso gnica e desordem gentica, organizao da cromatina, ciclo celular, processos do metabolismo do DNA e contribuio relativa de replicao e mecanismos de reparo associado ao DNA. A distribuio genmica no-aleatria dos microssatlites (SSRs) nos organismos enfatizada nos trabalhos de LI et al. (2004), em que discorrem que numerosas linhas de evidncia tem demonstrado este fato, o que bastante interessante em trabalhos de mapeamento (FALCO et al., 2004). Estes autores enfatizam que a vantagem adicional do desenvolvimento de microssatlites a partir de ESTs o fato de que, ao mapear estes microssatlites, automaticamente so mapeados genes no mapa gentico. Sendo que alguns destes genes mapeados podem constituir potenciais candidatos para funes importantes devido sua co-localizao com QTLs para caractersticas fenotpicas de importncia econmica. Isto, presumivelmente devido aos seus efeitos na organizao da cromatina, regulao da atividade gnica, recombinao, replicao do DNA, ciclo celular, metabolismo de plantas e na evoluo do gene. FALCO et al. (2004) mapearam 1000 microssatlites a partir de ESTs de diferentes espcies e tecidos de Eucalyptus, esperando com isso a cobertura de todo o genoma com uma densidade de marcadores suficiente pra poder fazer mapeamento de QTLs com preciso, bem como a ancoragem com o mapa fsico. Por outro lado, a utilizao de marcadores co-dominantes na construo e saturao de mapas de ligao de fundamental importncia, pois esses tambm permitem resolver as ambigidades existentes na correlao entre as evidncias citogenticas e as caractersticas dos diferentes grupos de ligao (distribuio dos marcadores dentro do grupo). Estes marcadores podem ser usados como ncoras para combinar mapas de ligao obtidos em diferentes laboratrios ou com diferentes populaes, gerando assim um mapa gentico que melhor represente a estrutura e organizao dos diferentes grupos de ligao (KIJAS et al., 1997; 20

SANKAR & MOORE, 2001). ROSTOKS et al. (2003), baseando-se em anlises de seqncias genmicas e mapeamento gentico, encontraram quatro diferentes genes de reao-induzidahipersensitivos (HIR), relacionados com a hipersensibilidade putativa em cevada, uma das mais eficientes formas de defesa de plantas contra patgenos biotrpicos. Neste trabalho de mapeamento, estes autores retratam uma importante contribuio na caracterizao de mecanismos moleculares de resposta hipersensitiva em plantas. O primeiro mapa gentico para seringueira (Hevea spp.) foi feito por LESPINASSE et al. (1999) utilizando a estratgia pseudo-testcross para saturao com marcadores RFLP, AFLP, SSR e isoenzimas. Mapeamento molecular do gene da macho-esterilidade nuclear em girassol (Helianthus annuus L.) usando marcadores TRAP e SSR foi realizado por CHEN et al. (2006B). Sendo que os marcadores que foram ligados mais firmemente com o gene ms9, que controla a macho-esterilidade, sero teis na seleo assistida por marcadores de plantas macho-estreis entre populaes segregantes, o que facilitaria o isolamento deste gene pelo uso da abordagem de clonagem baseada em mapa. 2.4 Mapeamento gentico de Citros At o ano de 2003, 14 mapas genticos de Citrus foram publicados (RUIZ & ASINS, 2003). Neste mesmo ano, estes mesmos autores inovaram e publicaram o primeiro mapa de ligao gentico comparando grupos de ligao de espcies intergenricas de Poncirus e Citrus. Contudo, mapas genticos em especial dolimo Cravo, ainda no foram relatados na literatura. Os primeiros mapas de ligao de citros foram desenvolvidos com locos isoenzimticos e RFLP utilizando famlias de retrocruzamento intergenrico de Citrus e P. trifoliata, de tangerina com pomelo e uma famlia F2 intergenrica de Citrus e Poncirus. Vrios mapas de citros j foram publicados, embora nenhum ainda seja consensual, isto , represente efetivamente todo o gnero (LIOU, 1990; DURHAM et al., 1992; JARREL et al., 1992; RUIZ & ASINS, 2003). A saturao com mais marcadores em alguns desses mapas possibilitou o mapeamento do gene de resistncia tristeza e caractersticas como nanismo, acidez do fruto, resistncia a T. semipenetrans Cobb, nmero de sementes, apomixia, resistncia salinidade, macho-esterilidade e resistncia gomose de Phytophthora (CAI et al., 1994; 21

CHENG & ROOSE, 1995; GMITTER Jr. et al., 1996; DENG et al., 1997; MESTRE et al., 1997a,b,c; FANG et al., 1998; CRISTOFANI et al., 1999; GARCIA et al., 1999; TOZLU et al., 1999ab; LING et al., 2000; GARCIA et al., 2000; SIVIERO et al., 2001, 2006). A maior parte dos mapas relaciona-se com estudos de herana da resistncia a patgenos, algumas delas monognica, outras polignicas (quantitative resistance loci ou QRL). GUERRA (1984) ressalta que o gnero Citrus e correlatos tm caractersticas vantajosas que facilitam a construo de mapas genticos, visto que so diplides (n = 9, 2n = 18), altamente heterozigticos, permitindo, a produo de hbridos inter-especficos e inter-genricos. Muitos projetos de mapeamento gentico de muitas espcies de Citrus tm sido conduzidos com o propsito de identificar genes e/ou locos de caractersticas quantitativas (QTL) para resistncia/tolerncia para sal e frio (MOORE et al., 2000), vrus da tristeza dos citros (CRISTOFANI et al., 1999), dormncia, juvenilidade e vigor (ROOSE et al., 1992), peso da planta e acidez do fruto (GMITTER et al., 1996). Em 2004, por exemplo, OLIVEIRA et al. (2004a, b) elaboraram mapas de ligao de laranja Pra e tangerina Cravo utilizando marcadores RAPD e a estratgia pseudo-testcross, sendo, este trabalho, de importante relevncia para estudos posteriores da herana ao CVC, cancro ctrico e leprose. Estudos de mapeamento gentico de locos de resistncia oligognica relacionados resistncia ao Citrus tristeza vrus (CTV) so predominantes (GMITTER Junior et al., 1996; DENG et al., 1997; MESTRE et al., 1997a,b,c; CRISTOFANI et al., 1999). Trabalhos de mapeamento para resistncia tristeza, conduzidos no Centro APTA Citros Sylvio Moreira (CRISTOFANI et al., 1999), determinaram o loco de resistncia a esse vrus no grupo de ligao I do mapa de P. trifoliata. Por sua vez, dois trabalhos de mapeamento de resistncia quantitativa de citros a patgenos foram reportados (LING et al. 2000; SIVIERO, 2001, 2006). O primeiro deles determinou a localizao de QRLs de citros para o T. semipenetrans (LING et al., 2000), herdada do genitor P. trifoliata como nico loco gnico dominante, responsvel por 53,6% da variao fenotpica do carter. CRISTOFANI et al. (1999) relatam o uso de RAPD e BSA (MICHELMORE et al., 1991) para construir mapa de ligao gentico e mapear a resistncia gentica ao vrus da tristeza dos citros (CTV) presente em P. trifoliata usando estratgia pseudo-testcross. Em seus trabalhos OLIVEIRA et al. (2005) 22

construram um mapa gentico integrado entre C. sinensis (L.) Osbeck cv. Pra e C. reticulata Blanco cv. Cravo usando dois tipos diferentes de segregao de marcadores. A saturao dos mapas com a incluso de novos marcadores aumenta o nmero de grupos de ligao com marcadores de ambos os genitores, fazendo com que o nmero destes grupos seja o mesmo do nmero haplide cromossmico da espcie. Ademais, vale mencionar que segundo OLIVEIRA et al. (2005) pequeno o conhecimento sobre a herana gentica das principais caractersticas agronmicas de Citrus. A identificao de QRLs para Phytophthora parasitica Dastur, fungo responsvel pela gomose de citros (SIVIERO, 2001, 2006), tambm conduzido no Centro APTA Citros Sylvio Moreira, constitui o primeiro trabalho de mapeamento gentico de citros de resistncia a esse patgeno e no qual se identificou, inequivocamente, herana quantitativa. SIVIERO et al. (2001, 2006) identificaram QTLs associados resistncia gomose de P. parasitica em citros a partir de um cruzamento entre C .sunki e P. trifoliata. Foram detectados 3 QTLs ligados resistncia gomose em P.trifoliata cv. Rubidoux e 1 QTL em C. sunki. Os QTLs detectados e denominados Ppr-Pt1, Ppr-Pt2 e Ppr-Pt3 (resistncia a P.parasitica em P.trifoliata) so responsveis por 26, 27 e 38% da variao fenotpica para resistncia gomose em P.trifoliata cv. Rubidoux respectivamente. O QTL PprCs (resistncia a P. parasitica em C. sunki) responsvel por 14% da variao fenotpica total para a resistncia gomose. A deteco de vrios locos controladores associados resistncia gomose em P. trifoliata cv. Rubidoux e a reao dos indivduos da prognie em relao resistncia a P. parasitica indicam que esse carter de natureza quantitativa, concordando com as hipteses defendidas por FURR & CARPENTER (1961) e HUTCHISON (1985). LING et al. (2000) verificaram que um marcador molecular ligado ao gene de resistncia ao CTV, descrito por DENG et al. (1997), encontra-se mapeado a 10,8 cM do gene de resistncia ao T. semipenetrans, podendo tratar-se de uma regio com diferentes genes de resistncia no genoma de P. trifoliata (HAMMOND-KOSAK & JONES, 1997; LING et al., 2000). Evidncias experimentais suportam a hiptese de que o grupo de ligao I de P. trifoliata do mapa descrito por CRISTOFANI et al. (1999) possa tambm apresentar uma regio rica de genes de resistncia, em face da associao estatstica de determinados marcadores desse grupo ligados ao gene de resistncia ao CTV a eventos de 23

resistncia de citros gomose (SIVIERO, 2001, 2006). A estratgia de clonagem baseada em mapa j vem sendo utilizada para genes de resistncia de citros. O primeiro patossistema de citros a ser contemplado com esse tipo de abordagem fina de mapeamento foi o gene Ctv (resistncia tristeza) a partir de P. trifoliata, tendo sido construdos mapas de alta resoluo para o loco Ctv (DENG et al., 2001; YANG et al., 2003). BASTIANEL et al. (2005), estudaram a herana de resistncia do citros leprose e localizao de QTLs no mapa de ligao usando marcadores AFLP e RAPD desenvolvidos de 143 hbridos obtidos do cruzamento entre o genitor resistente, tangor Murcott com um genitor suscetvel laranja doce Pra, sendo que estas plantas foram estabelecidas em campo, infectadas com o vrus e a incidncia e severidade da leprose avaliada por trs anos consecutivos. Segundo SIVIERO et al. (2006), mapas de ligao gentico de P. trifoliata cv. Rubidoux e C. sunki foram construdos previamente usando marcadores moleculares RAPD (CRISTOFANI et al., 1999), explorando a estratgia de mapeamento pseudo-testcross. Dois conjuntos de dados separados foram gerados, uma para cada genitor. Uma anlise de ligao preliminar foi realizada com um modelo de retrocruzamento de fase desconhecida em LOD > 4.0 e mximo

= 0,30. Setenta e oito primers mostraram combinao pseudo-testcross, ondeo marcador estava presente em um dos genitores, ausente em outro e segregando na prognie. Anlises de ligao revelaram que 125 desses locos RAPD se ligaram em 18 grupos de ligao (10 grupos com 63 marcadores RAPD para P. trifoliata. O comprimento total desses mapas foi 732,32 cM para C.sunki e 866.88 cM para P. trifoliata, com a distncia entre marcadores variando de 0 a 43,8 cM. 2.5 Mapeamento de QTLs Pouco se sabe sobre a base gentica envolvendo o controle de caractersticas fenotpicas de citros, tais como, morfologia foliar e capacidade de enraizamento de estacas, ou mesmo a tolerncia a patgenos, como o vrus da tristeza dos citros. Provavelmente isso deve ao fato dos estudos quase sempre se direcionarem para o estudo da resistncia de gentipos especficos. A maior parte das caractersticas agronmicas de citros deve ser controlada por locos quantitativos, com exceo de poucas como; CTV, leprose e,

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aparentemente, morfologia foliar. O estudo desses locos dever permitir a identificao, mapeamento e quantificao de seus efeitos. Porm, a deteco eficiente de QTLs depende do seu nmero, magnitude de seus efeitos, caractersticas de herdabilidade, interaes entre genes, freqncia de recombinao entre os QTLs e os tipos de marcadores e grau de saturao do mapa (TANKSLEY, 1993; YOUNG, 1996; LIU, 1998). A maioria dos mtodos comumente usados para se detectar a associao entre marcadores QTL e traos fenotpicos, envolve anlises de marcadores individuais, utilizando-se teste t simples, regresso linear, anlise da varincia, razo de verossimilhana e estimao da mxima verossimilhana; mapeamento por intervalo usando novamente a abordagem de verossimilhana, regresso e uma combinao das abordagens verossimilhana e regresso (LIU, 1998). Finalmente, o mapeamento por intervalo-composto; uma combinao de mapeamento de intervalo simples e regresso linear mltipla (ZENG, 1993, 1994). QTLs podem ser detectados considerando-se ambientes separadamente ou em grupos, por meio de uma anlise integrada dos dados em diferentes ambientes. SIVIERO et al. (2003) detectaram QTLs associados a marcadores moleculares para a capacidade de enraizamento de estacas em prognies hbridas do cruzamento entre C. sunki e P. trifoliata Rubidoux. Os autores relataram o primeiro estudo de mapeamento de QTL para enraizamento em Citrus e gneros relacionados e concluram que a presena de marcadores moleculares e QTLs associados a enraizamento de estacas de citros distribudas em grupos de ligao de P. trifoliata Rubidoux indicam que estas regies so de interesse para seleo de gentipos que enrazam facilmente. Deve ser destacado que a capacidade de enraizamento uma importante caracterstica para a multiplicao clonal de indivduos que sero avaliados como porta-enxertos. De outra forma seria necessrio aguardar por vrios anos para que esses indivduos floresam e frutifiquem para ento serem avaliados como porta-enxerto. O baixo conhecimento de como marcadores so associados com QTLs economicamente importantes, gera inmeros fatores limitantes na pesquisa de melhoramento gentico, como QURESHI et al. (2004) exemplificaram no caso das pesquisas com algodo (Gossypium spp). Segundo CRISTOFANI et al. (2000), um mapa de referncia com marcadores multi-allicos co-dominantes identificam locos e funciona como ponte entre os mapas dos genitores, fazendo com que um 25

determinado nmero de locos ncoras se tornem disponveis para uma mapeamento refinado de locos de caractersticas quantitativas (QTL), permitindo, o que se pode denominar de mapeamento comparativo. 2.6 Padro Foliar, Enraizamento e CTV Em se tratando de hbridos de citros com P. trifoliata, embora exista alta variao morfolgica, so poucas as informaes relativas ao estudo da herana dessas caractersticas, como, por exemplo, morfologia foliar e enraizamento. O carter folha trilobada conhecido como mostrando dominncia em cruzamentos sendo que alguns hbridos mostram uma mistura de folhas bifoliadas e monofoliadas. Em um cruzamento entre C. sunki e Poncirus trifoliata, 100% dos hbridos obtidos apresentavam folha trilobada indicando a dominncia e provvel homozigose do gene ou genes que controlam o carter em P. trifoliata (CRISTOFANI, 1997). Em plntulas de tangor Temple e tangerina Clementina polinizadas com citrange Troyer, um retrocruzamento para folha tipo monofoliada, cerca de 20 a 30 % das plntulas eram monofoliadas (CAMERON E FROST, 1968). Segundo os autores, estes dados indicam que o carter folha trilobada condicionado por dois genes dominantes. TOXOPEUS (1962) relatou que entre 50 plntulas do cruzamento entre C. grandis (L.) Osbeck x C. hystrix (ambos monofoliados) cerca de 1/3 eram trifoliata. Ele sugeriu que dois genes complementares e dominantes podem estar envolvidos, sendo cada espcie heterozigtica para um deles. Segundo SIVIERO et al. (2003) a propagao de plantas por meio de enxertia e enraizamento de estacas pode favorecer a reduo de juvenilidade. Embora sejam tradicionalmente propagadas por enxertia, a estaquia pode ser um mtodo alternativo e eficiente na propagao de algumas espcies como lima Tahiti (C. latifolia) (PRATI et al., 1999). Os estudos de enraizamento de estacas de Citrus e gneros correlatos procedem geralmente a estudos do potencial genotpico, porcentagem de estacas enraizadas e as diferenas de hbridos diferentes em enraizar, especialmente com a induo por reguladores de crescimento. Contudo, pouco conhecido sobre a base gentica envolvendo o controle dessas caractersticas. O enraizamento de estacas depende de fatores tais como idade, vigor da planta, lenhosidade, reguladores de crescimento, meio ambiente, localizao da 26

estaca, nutrio e fatores genticos relacionados ao gnero ou espcies de interesse. (FERGUSON et al., 1986; ABOU-RAMASH et al., 1998). Segundo PIO et al. (2005), a umidade um dos fatores externos que mais contribuem para que ocorra enraizamento das estacas. Outros estudos demonstram que os fatores que afetam a iniciao e o desenvolvimento de razes so relacionados prpria planta (estado hdrico, condies fitossanitrias, balano hormonal e nutricional) e/ou relacionados com condies ambientais (temperatura, luminosidade e umidade relativa) (MAUAD et al., 2004; NORBERTO et al., 2001; PASQUAL et al., 2001). Em se tratando do efeito de reguladores de crescimento no enraizamento de estacas, segundo ROCHA et al. (2004), a induo de enraizamento para muitas espcies dependente da aplicao de reguladores vegetais de natureza auxnica, principalmente cido indolbutrico (IBA), com ao na atividade das clulas de cmbio e na formao de razes adventcias. Este pr-tratamento com auxinas tem proporcionado em algumas espcies, rapidez e uniformidade de enraizamento, alm de aumento do nmero de razes adventcias. Alm da necessidade da adio de auxinas existem outros fatores que influenciam no enraizamento como o potencial do gentipo da cultivar, as condies ambientais, a posio da origem das estacas, assim como, a participao de substncias como auxinas. SHAZLY et al. (1994) estudaram o efeito de trs destes reguladores em diferentes concentraes para enraizamento de estacas de lima e lima cida. Concluram que IBA promoveu a melhor porcentagem de enraizamento, maior nmero e maiores razes para ambos os gentipos. Segundo PRATI et al. (1999) o efeito benfico dos reguladores de crescimento (IBA e NAA) foi observado no enraizamento de lima cida Tahiti e laranja doce. Enquanto que RAKESHKUMAR et al. (1995) relatam que estacas de limo verdadeiro (C. limon) tratadas, antes de serem plantadas, com cido indol-3-butrico associado com cido phidrobenzico mostraram um melhor enraizamento nas concentraes de 2g/L IBA e 2 g/L de pHBA. Ao lado de caractersticas morfolgicas ou fisiolgicas, caractersticas associadas tolerncia a determinados patgenos so to importantes quanto o estudo da resistncia. Sabe-se que o gnero Citrus tolerante ao Citrus tristeza vrus (CTV), enquanto alguns gneros afins, como P. trifoliata, podem apresentar resistncia ou imunidade, representada pela incapacidade do vrus de se replicar em seus tecidos. Hbridos entre Citrus e Poncirus apresentam segregao mendeliana 27

para a resistncia, que deve ser governada por um gene ou por um gene de efeito principal (MESTRE et al., 1997b; BORDIGNON et al., 2003). Devido alta eficincia do T. citricidus como um vetor, praticamente impossvel eliminar o vrus dos pomares. Estratgias vm sendo conduzidas para introduzir resistncia, seja com abordagens tradicionais (hibridao, mapeamento, etc.) ou com transformao gentica. Entretanto, vale a pena ressaltar que estratgias de melhoramento gentico, com uma abordagem moderna para resistncia tristeza, geralmente, envolvem o uso de P. trifoliata (HEARN et al., 1993), inclusive com mapeamento desta caracterstica. Segundo BORDIGNON et al. (2003), uma das maneiras de se controlar a tristeza usar variedades de copas e de porta-enxertos que interajam conforme a capacidade de multiplicar as partculas virais em suas clulas e de tolerar sua presena nos tecidos do floema. Portanto, a tolerncia de citros ao CTV parece estar associada a uma menor ou maior capacidade de multiplicao dos vrus em seus tecidos. Embora no exista nenhuma relao entre ttulo do vrus e sua severidade, tem sido observado que em variedades mais sensveis, como laranja Pra e limo Galego, o vrus apresenta-se em alta titulao (MACHADO et al., 1997). Os mtodos de deteco e caracterizao do vrus baseiam-se em sintomas em variedades indicadoras (ensaios biolgicos), mtodos sorolgicos associados ou no a microscopia eletrnica (determinao de partculas virais) e mtodos moleculares (determinao de genoma viral). Diferente do mtodo biolgico de deteco, vrios outros testes comearam a ser usados a partir de 1978 para a deteco do vrus, medida que anticorpos mono e policlonais produzidos contra a protena do capsdeo do CTV tornaram-se disponveis. BAPTISTA et al. (1996) purificaram partculas do CTV de lima cida Galego que foram utilizadas como antgeno para produo de anticorpos policlonais. Estes apresentaram ttulo e especificidade elevados, e no ocorreu reao cruzada com protenas da planta hospedeira em ELISA, dot immunoprint assay (DIBA), Western blot e tissue immunoprint. A protena do capsdeo do CTV expressa em Escherichia coli T. Escherich tambm foi utilizada como antgeno para a produo de anticorpos mono e policlonais (TARGON, 1997; TARGON et al., 1997. STACH-MACHADO et al. 2002). Esses anticorpos tambm vm sendo adotados rotineiramente, para deteco do CTV por intermdio das tcnicas citadas. 28

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 Material Gentico Os genitores limo Cravo [Citrus limonia Osbeck], resistente seca, suscetvel morte sbita dos citros e s estirpes mais severas do vrus da tristeza do citros e citrumelo Swingle [Citrus paradisi Macf. cv. Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.], suscetvel seca, resistente morte sbita dos citros e ao vrus da tristeza dos citros, pertencentes ao banco de plantas matrizes do Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC, Cordeirpolis/SP, foram utilizados em hibridao controlada como genitores feminino e masculino, respectivamente. Foram genotipados 94 hbridos zigticos para constituir a populao de mapeamento. As plantas de origem zigticas j haviam sido previamente selecionadas daquelas nucelares por meio de marcadores moleculares RAPD e seleo visual, nas quais os hbridos com morfologia foliar idntica ao genitor feminino foram descartados para as anlises. 3.2 Extrao do DNA Total O DNA total foi extrado de folhas frescas de acordo com a metodologia descrita por MURRAY & THOMPSON (1980), com adaptaes introduzidas por MACHADO et al., (1996). Cerca de 200mg de folhas frescas foram lavadas e trituradas em almofariz com nitrognio lquido at a obteno de um p fino. Aps transferncia do macerado para tubos de polipropileno de 1,5 mL, foram adicionados 750 L de tampo de extrao (1% CTAB; 100 mM Tris-HCI pH 7,5; 10 mM EDTA; 0,7M NaCl; 2% sarcosil; 2% mercaptoetanol) 60C. Os tubos foram mantidos por 40 min sob agitao peridica para completa homogeneizao. Aps o resfriamento, foi adicionado ao extrato o mesmo volume de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1), e feita uma incubao por 5 min a 60 C e, em seguida, uma centrifugao por 8 min a 2.449 xg. O sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo e homogeneizado com o mesmo volume de CTAB 10% (10% CTAB; 0,7M NaCl), aps o que, igual volume de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1) foi novamente adicionado e centrifugado por 8 min a 2.449 xg. O sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo e ele, adicionado igual volume de tampo de precipitao (1% CTAB; 50 mM Tris-HCI pH 7,5; 10mM 29

EDTA)

misturado

gentilmente,

permanecendo

40

min

em

repouso

e,

posteriormente, centrifugado por 6 min 12.096 xg. Aps a centrifugao, o sobrenadante foi descartado e o sedimentado ("pellet") formado, dissolvido em 400 L de TE, com alta concentrao de NaCI (10 mM Tris-HCI pH 7,5; 1 mM EDTA; 1M NaCl) 65C, at completa dissoluo. Posteriormente, aps resfriamento, o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol 100% e centrifugado por 6 min 12.096 xg e em seguida precipitado novamente com 1,8 volumes com etanol 70%. O DNA obtido foi dissolvido em 60 L de H2O milliQ contendo 10 g/L de RNAse para a eliminao completa de contaminao por RNA. O rendimento foi de 60ng de DNA/L. 3.3 Marcadores RAPD Os primers (80) avaliados nas reaes de amplificao de fragmentos de DNA foram de seqncias arbitrrias de 10 nucleotdeos dos kits da Operon Technologies Inc. As reaes de amplificao foram preparadas em um volume total de 13 L e constitudas de: H2O milliQ (4,4 L), Tampo 10X (Invitrogen) (1,3 L), dNTPs - 0,2 mM de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP - Pharmacia (1L), 0,2 mM de primer de 10 nucleotdeos (15 ng) - Operon (3 L), Taq DNA polimerase (1,5 unidades), (Invitrogen) (0,3 L) e de uma soluo de 3L de DNA (5ng/L). A amplificao foi conduzida em termocicladores MJ Research Thermocycler programados para 36 ciclos de 1 min a 92 C, 1 min a 36 C e 2 min a 72 C. Ao final do ltimo ciclo, foi feita uma extenso final de 10 min a 72 C. Os produtos da reao foram visualizados em gel de agarose (1,6%) preparado em tampo TAE (0,04 M Tris-acetato, 1 mM EDTA) e corados com brometo de etdio (0,5 g/mL). A corrida eletrofortica foi feita em tampo TAE 1X a 80 V, por aproximadamente 3h e os gis fotografados no sistema Eagle Eye (Stratagene), sobre luz ultravioleta. Para a seleo de primers foram inicialmente preparadas reaes para seis indivduos da prognie, escolhidos ao acaso e ambos os genitores. Primers que geraram polimorfismo entre os genitores e segregao dos marcadores em pelo menos um indivduo da prognie foram ento genotipados em todos os indivduos da populao mapa. O polimorfismo entre os gentipos foi estimado por meio da presena ou ausncia de bandas amplificadas por PCR. O tamanho dos fragmentos RAPD foi 30o o o o

estimado por comparao com o marcador 1Kb Plus DNA Ladder (Gibco). Os marcadores RAPD de boa intensidade e reprodutibilidade foram analisados quanto segregao mendeliana esperada (1:1 ou 3:1) nos 94 indivduos da prognie. Marcadores RAPD foram analisados de forma que os marcadores com presena de bandas no genitor limo Cravo (ou citrumelo Swingle) tiveram os gentipos na populao de mapeamento codificados para lm, quando presente, ou ll, quando ausente. Para os marcadores provenientes de citrumelo Swingle (ou limo Cravo), os gentipos foram codificados como np, quando a banda estivesse presente, e nn quando ausente. 3.4 Marcadores Microssatlites Marcadores microssatlites ou SSR (Simple Sequence Repeats) foram amplificados a partir de seqncias de microssatlites obtidas tanto do banco de dados do genoma citros (CitEST) (57) como de DNA genmico (171), previamente obtidas no laboratrio. As reaes de amplificao foram preparadas em um volume total de 25 L e constitudas de: H2O milliQ (13,95L), Tampo 10X (Invitrogen) (2,5 L), MgCl2 1,5 mM (1,25), dNTPs - 0,2 mM de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP Pharmacia (1L), 0,1 M de cada primer (2 L), Taq DNA polimerase (1,5 unidades), (Invitrogen) (0,3 L) e de uma soluo de 2,0 L de DNA (50ng/L). A amplificao foi conduzida em termocicladores MJ Research programado para 30 ciclos de 94C por 30s, 65-56C por 30s e 72C por 5s. A temperatura de anelamento se inicia a 65C, decrescendo at 0,3C a cada ciclo seguido por 3 ciclos de anelamento a 56C. Os produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose 4% com brometo de etidio (0,5 ng/mL) e fotografados sobre luz ultravioleta. Os marcadores encontrados apresentaram todos os tipos de segregao para uma populao CP (Cross Pollinators). Os cdigos utilizados para a construo do arquivo mapa esto apresentados na tabela 1.

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Tabela 1. Cdigos utilizados para os tipos de segregao para uma populao CP (Cross Pollinators) *.Cdigo Descrio loco heterozigoto em ambos os genitores, quatro alelos loco heterozigoto em