MAKALAH BIOLOGI MOLEKULER I

ASAM NUKLEAT

Kelompok HG 02

Aditya Kristianto 1206249681 Alan Try Putra Samad 1206254403Alif Nuzulul Hidayat 1206249832Devi 1206243601Hendrik 1206261264Nurcahyo Adyota 1206261200

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS INDONESIA

FEBRUARI, 2014

DAFTAR ISI

1 | P a g e

DAFTAR ISI ....................................................................................................................... i

BAB I PENDAHULUAN......................................................................................................1

BAB II STRUKTUR ASAM NUKLEAT ................................................................................2

II.1 Struktur DNA................................................................................................................4

II.2 Struktur RNA................................................................................................................6

BAB III SINTESIS ASAM NUKLEAT...................................................................................8

III.1 Replikasi DNA.............................................................................................................8

III.2 Transkripsi RNA..........................................................................................................10

BAB IV FUNGSI ASAM NUKLEAT DALAM SEL................................................................13

IV.1 Fungsi DNA.................................................................................................................13

IV.2 Fungsi RNA.................................................................................................................16

BAB V ANALISIS DAN DETEKSI ASAM NUKLEAT...........................................................17

V.1.1 Staining.....................................................................................................................17

V.1.2 Elektroforesis Gel......................................................................................................18

V.1.3 Metode Hibridisasi.....................................................................................................19

V.1.4 Metode Blotting/Gel-transfer Hybridization................................................................20

V.1.5 DNA Sequencing.......................................................................................................21

V.2.1 Spektrofotometri UV-Vis............................................................................................24

V.2.2 Metode RT-PCR........................................................................................................25

BAB VI APLIKASI ASAM NUKLEAT...................................................................................26

VI.1 Aplikasi DNA...............................................................................................................26

VI.2 Aplikasi RNA...............................................................................................................33

BAB VII PENUTUP.............................................................................................................35

DAFTAR PUSTAKA............................................................................................................36

2 | P a g e

BAB I

PENDAHULUAN

Sebagai salah satu makromolekul penyusun tubuh manusia, asam nukleatmerupakan komponen penting yang berpartisipasi dalam pewarisan sifat atau okum g maupun pembentukan koenzim.Tidak hanya itu, asam nukleat juga menjadi dasar yangdigunakan dalam menjawab misteri berbagai penyakit. Lebih lanjut, asam nukleat yangterdiri atas deoxyribonucleic acid (DNA) dan ribonucleic acid (RNA) dengan keunggulannyadikembangkan menjadi teknologi di berbagai bidang, dari bidang farmasi, kedokteran,pertanian dan peternakan, kimia sampai dengan bidang okum dan pengadilan. Di bidangfarmasi dan kedokteran dikembangkan teknologi reproduksi aseksual yang menyertakancampur tangan manusia, terapi gen, analisis dan pemetaan penyakit serta analisis STRyang dilakukan setelah transplantasi dengan memanfaatkan teknik PCR.Di bidang pertaniandan peternakan teknologi, okum juga dilakukan untuk mendapatkan individu yangunggul.Di bidang kimia, asam nukleat dapat dimanfaatkan, salah satunya sebagai katalisdan di bidang okum digunakan untuk menyatakan identitas manusia, hewan bahkantumbuhan.

Melihat luasnya aplikasi dari asam nukleat sebagai suatu senyawa kimia yangterdapat dalam tubuh manusia, tentunya mahasiswa teknik kimia yang berhubungan eratdengan sintesis senyawa kimia harus dapat memahami konsep-konsep asam nukleat mulaidari struktur asam nukleat, bagaimana asam nukleat disintesis di dalam tubuh, fungsi danperanan asam nukleat di dalam sel, cara mendeteksi ada atau tidaknya asam nukleat padasuatu sampel, hingga teknik pengaplikasian dari sifat-sifat asam nukleat dalam membantukehidupan manusia sehari-hari.

3 | P a g e

BAB II

STRUKTUR ASAM NUKLEAT

(oleh Alan Try Putra Samad, 1206254403 dan Hendrik, 1206261264)

StrukturAsam nukleat

Secara umum asam nukleat merupakan biopolimer yang tersusun atas monomer-monomernukleotida. Nukleotida adalah monomer penyusun RNA, DNA, dan beberapa kofaktor,seperti CoA, FAD, FMN, NAD, dan NADP. Dalam sel, kofaktor ini memainkan peran pentingdalam fiksasi energi (misalnya fotosintesis), metabolisme, dan transduksi sinyal selular.Nukleotida terdiri dari tiga komponen, yaitu basa nitrogen, gula pentosa, dan sebuah gugusfosfat.

A. Gugus Fosfat

Gugus fosfat pada nukleotida merupakan gugus yang terikat pada atom C nomor 5 melaluiikatan fosfoester. Pada pembentukan polimer nukleotida atau Asam Nukleat, terjadi ikatanfosfodiester. Ikatan fosfodiester ikatan gugus fosfat dengan gugus gula pentosa dari satunukleotida dengan nukleotida lain yaitu pada atom karbon nomor 5 dan 3. Gugus fosfat jugamerupakan penyebab sifat keasaman asam nukleat.

B. Gula pentosa

Gula pentosa pada nukleotida terikat bersama fosfatdan basa nitrogen. Jenis gula pada nukleotida memilikistruktur aldopentosa hemiasetal siklik atau cincinfuranosa serta posisi OH yang menghadap keatas.Gula yang penyusun DNA merupakan deoksiribosasedangkan gula yang menyusun RNA merupakanribosa.

4 | P a g e

Gambar . Struktur Nukleotida

Gambar . Deoksiribosa dan Ribosa

C. Basa Nitrogen

Basa nitrogen pada nukleotida terbagi atas dua jenis yaitu purin dan pirimidin. Basa purinmerupakan senyawa heterosiklik yang disusun oleh dua buah cincin (bisiklik) sedangkanbasa pirimidin merupakan senyawa siklik yang tersusun atas sebuah cincin tunggal(monosiklik).

Basa purin memiliki dua buah derivat yaitu Adenin dan Guanin. Adenin dan Guanin memilikiperbedaan struktur sehingga akan mempengaruhi jumlah ikatan hidrogen bila berpasangandengan basa pirimidinnya.

Basa pirimidin juga mempunyai dua buah derivat namun berbeda untuk DNA dan RNA.Derivat basa pirimidin pada DNA adalah Sitosin dan Timin, sedangkan pada RNA adalahSitosin dan Urasil.

Basa nitrogen memiliki sifat-sifat tertentu diantaranya :

1. Stabilitas

Ikatan hidrogen diantara pasangan basa sama kuat dengan ikatan hidrogen antara basadan molekul air. Olehkarena itu, permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkanmolekul-molekul air dikeluarkan dari pasangan-pasangan basa sehingga ikatan basamenjadi lebih kuat.

2. Pengaruh asam dan alkali

Asam nukleat akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi komponen-komponennya jikaberada dalam asam pekat dan suhu tinggi. Contoh HclO4 suhu 100C.

5 | P a g e

gambar

Gambar 3 Struktur PurinGambar 5. Struktur GuaninGambar 4 Struktur Adenin

Gambar 8. Struktur UrasilGambar 7. Struktur Timin

Gambar 6. Struktur

Gambar 9. Struktur Sitosin

Peningkatan pH menyebabkan perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi enolatkarena molekul tersebut kehilangan sebuah proton yang menyebabkan terputusnyasejumlah ikatan hidrogen dan akhirnya rantai ganda DNA terdenaturasi.

3. Denaturasi Kimia

Beberapa bahan kimia dapat mendenaturasi asam nukleat pada pH netral. Contoh : ureadan formamid.Konsentrasi tinggi dapat merusak ikatan hidrogen yang akhirnya stabilitas struktur sekunderasam nukleat berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi.

4. Viskositas

DNA merupakan molekul yang relatif kaku sehingga larutan DNA mempunyai viskositastinggi. DNA juga merupakan molekul yang sangat rentan terhadap fragmentasi fisik yangmerupakan masalah tersendiri jika ingin mengisolasi DNA.

II.1 StrukturDNA

DNA (Deoxyribonucleic Acid) tersusun oleh dua buah rantai polinukleotida panjangyang saling berpilin membentuk double helix. Setiap polinukleotida tersusun atasdeoksiribosa yang terikat bersama dengan gugus fosfat. Karbon 3 dari molekul gulaterikat dengan karbon 5 dari gugus fosfat yang berada di depan molekul gula. Ikatanyang terjadi antara gugus fosfat dan gula disebut ikatan fosfodiester. Satu putarankomplementer DNA terdiri dari 10 pasang basa dan berotasi sebesar 30 derajat.Jarak antara dua rantai adalah 1,1 nm yang diisi oleh basa nitrogen yang jaraknyaadalah 3,4 A. Setiap putaran dalam helix mempunyai jarak 34 A. Kedua rantaipolinukleotida tersebut anti paralel dalam artian mempunyai arah yang berlawanandengan rantai pasangannya

Rantai polinukleotida yang terdiri dari ikatan gula dan gugus fosfat menyusunkerangka bagian luar DNA sedangkan bagian dalamnya merupakan basa purin yangterikat oleh ikatan hidrogen dengan basa pirimidin.

Antara basa guanin dan sitosin terdapat tiga buah ikatan hidrogen sedangkan antarabasa adenin dan timin hanya terdapat dua buah ikatan hidrogen. Jumlah ikatan yangterbentuk dipengaruhi oleh struktur masing-masing basa. Oleh karena jumlah ikatanhidrogen antara guanin dan sitosin lebih banyak, maka ikatan guanin-sitosin lebihkuat dari ikatan ikatan adenin-timin.

6 | P a g e

Gambar 10. Struktur DNA

Gambar 11. Ikatan Hidrogen Pada Masing-masing Basa Nitrogen

Hukum ekivalen Chargaff menyatakan bahwa proporsi basa A dan T serta C dan Gselalu sama sehingga komposisi DNA dapat dinyatakan hanya dengan dengankandungan C dan G. Dikarenakan ikatan yang kuat antara Guanin dan Sitosin,semakin besarnya nilai C+G akan membuat untaian DNA semakin sulit dipisahkan

Berdasarkan struktur fisik, terdapat tiga tipe DNA yaitu DNA-A, DNA-B, dan DNA-Z.Tabel berikut merupakan tabel karateristik masing-masing tipe DNA.

Tabel . Perbandingan tipe DNA

Ciri-ciri DNA-A DNA-B DNA-ZTipe helix Berpilin ke

kananBerpilin ke

kananBerpilin ke kiri

Diameter (nm) 2.55 2.37 1.84Jarak antara dua pasang basa

(nm)0.29 0.34 0.37

Jarak antara dua pasang basadalam satu pilinan (nm)

3.2 3.4 4.5

Jumlah pasangan basa dalamsatu pilinan

11 10 12

Topologi lekukan mayor Sempit,dalam

Lebar,dalam

Rata

Topologi lekukan minor Dangkal,lebar

Sempit,tidak

dalam

Sempit, dalam

7 | P a g e

Gambar 12. Bentuk DNA A, B, dan Z

Struktur yang terbentuk pada DNA cenderung dipengaruhi oleh ikatan hidrogen yangterjadi antara masing-masing pasangan basa nitrogen yang ada. Jumlah pasanganbasa pada masing-masing tipe DNA menentukan bentuk yang akan dihasilkan akibatinteraksi antara basa nitrogen tersebut

II. 2 StrukturRNA

RNA (Ribonucleic Acid) terbentuk dari polimer nukleotida rantai tunggal yangberpilin. Pada setiap gula ribosa, terikat satu dari 4 basa diantaranya adenin (A),urasil (U), sitosin (C), atau guanin (G). Meskipun hanya merupakan rantai tunggal,basa nitrogen pada RNA tetap dapat memiliki ikatan hidrogen,yaitu dengan basa dari rantainya sendiri. Tipe RNA yangberbeda yang terdapat pada sel yaitu messenger RNA(mRNA), ribosomal RNA (rRNA), dan transfer RNA (tRNA).Sejumlah RNA seringkali ditemukan berpartisipasi dalampembentukan ekspresi gen.

RNA messenger atau mRNA tersusun atas empat daerahutama. Daerah yang pertama adalah ujung 5 yang merupakan basa guaninmodifikasi dan dapat diidentifikasi oleh ribosom. Daerah kedua merupakan daerahkoding dimana proses transkripsi terjadi. Daerah koding merupakan daerahterpanjang karena terdiri dari kodon-kodon yang terbentuk akibat proses transkripsidengan DNA. Daerah ini biasa diawali oleh kodon AUG (kodon start) dan diakhirioleh kodon UAG, UGA, atau UAA (kodon stop). Daerah ketiga adalah daerahtak-tertranslasi yang terdapat pada kedua ujung RNA. Daerah ini sangat pentinguntuk efisiensi translasi dari transkrip serta untuk mengendalikan laju translasi.Daerah terakhir adalah daerah ujung 3 yang merupakan basa adenin.

Gambar 14. Struktur mRNA

RNA ribosomal atau rRNA merupakan jenis RNA yang mendominasi dalam tubuhmakhluk hidup. Sekitar 75% dari total RNA yang ada adalah rRNA. RNA Ribosomalterbagi menjadi dua sub-unit yaitu Large Subunit (LSU) dan Small Subunit (SSU)rRNA LSU dan SSU terletak berhimpitan dan mengapit mRNA. Terdapat tiga bindingsites pada Ribosom yaitu A (Aminoacyl-tRNA bindind site), P (Peptidyl-tRNA bindingsite) dan E (Exit site)

8 | P a g e

Gambar 13. Struktur RNA

RNA transfer atau tRNA memiliki panjang sekitar 73-94 buah nukleotida. StrukturRNA transfer membentuk loop yang masing-masing dinamakan loop D, loop TvC,dan loop antikodon,. Loop D mengandungdihydrouridine dan terdapat pada lenganD yang memiliki 4 pasang basa nitrogen. Loop TvC mengandung pseudouridine danterdapat pada lengan TvC yang memiliki 5 pasang basa nitrogen. Loop antikodonsendiri mengandung antikodon dan terdapat pada lengan antikodon yang memilii 5pasang basa nitrogen. Bagian lain dari RNA transfer adalah lengan asam aminoyang akan berikatan dengan asam asimo.

Struktur RNA Tersier dipengaruhi oleh interaksi basa padadaerah yang berbeda. Interaksi ini melibatkan pasanganbasa nitrogen yang tidak umum atau adanya interaksi tigaatau lebih basa nitrogen. Adenosin yang tidakberpasangan mempengaruhi interaksi sehingga terbentukstruktur RNA tersier yang stabil. RNA transfer memilikistruktur tersier yang menyerupai huruf L.

9 | P a g e

Gambar 15. Struktur rRNA

Gambar 16. Struktur tRNA

Gambar 17. tRNA tersier

BAB III

SINTESIS ASAM NUKLEAT

(oleh Alan Nurcahyo Adyota, 1206261200)

III.1 Replikasi DNA

Pada tahun 1953, Watson dan Crick mengemukakan struktur DNA berbentuk double helixdan menyatakan bahwa jika untaian ganda tersebut dipisahkan, setiap untai pada molekuldapat bertindak sebagai template di mana sebuah untai baru komplementer dapatterbentuk, sehingga dapat membuat dua molekul DNA yang identik.

DNA tidak dapat disintesis.Namun, DNA dapat direplikasi. Proses replikasi DNA berlangsungsecara semikonservatif. Pada proses konservatif, DNA yang dihasilkan masing-masingterdiri dari dua untaian ganda sejenis, yaitu dua untai induk bersatu pada satu hasil replikasi,sedangkan dua untai anak bersatu pada hasil replikasi lainnya. Sementara itu, prosesreplikasi dispersif akan menghasilkan DNA dengan material campuran dari induk dan anakpada masing-masing untaian. Gabungan dari kedua proses itu disebut sebagai prosessemikonservatif. Pada proses semikonservatif, satu untai induk dan satu untai anak munculpada produk akhir. DNA baru dibuat dengan menggunakan DNA asli sebagaitemplate.Untaian berpisah pada daerah tertentu.

Berikut ini merupakan ilustrasi dari ketiga proses replikasi DNA:

10 | P a g e

Gambar 18. Replikasi Semikonservatif, Konservatif, dan Dispersif

Replikasi DNA baru akan tercapai jika terdapat beberapa enzim sebagai berikut:

a. Topoisomerasi: Enzim ini menginisiasi pembukaan double helix denganmemotong salah satu untaian

b. Helikase: Enzim ini membantu pembukaan untaian. Agar pemisahan untaiandapat terjadi, perlu dilakukan pemisahan ikatan hydrogen dari pasangan basa.

c. SSB (Single-Strand Binding-Protein): Menstabilkan untaian terpisah danmencegah mereka bersatu kembali sehingga bahan kimia untuk polimerisaasidapat berfungsi pada untaian tunggal.

d. DNA Polimerase: Enzim ini berfungsi untuk menyatukan kembali nukleotidatrifosfat seiring zat tersebut berikatan hydrogen dengan basa komplementer.Enzim ini juga berfungsi untuk memindai kesalahan dan membuat perbaikan.

e. Ligase: Segmen DNA kecil pada untaian yang belum tersambung disatukan olehenzim ini.

Polimerisasi nukeotida digambarkan oleh persamaan reaksi berikut:

Mekanisme dari polimerisasi dijabarkan sebagai berikut.Polimerisasi selalu memanjangkansegmen DNA yang berkembang menuju ujung 3.Karena kebutuhan polimerisasi, salah satuuntaian DNA direplikasi terus-menerus, sementara untaian lainnya hanya dapat direplikasidalam potongan-potongan pendek.

Pemisahan sebagian double helix berlansung di situs yang disebut sebagai garpu replikasi(replication fork).Seiring replikasi dari untaian yang terpisah berlangsung, garpu replikasibergerak, melepas untaian DNA lainnya.Ketika garpu bergerak menuju ke ujung 5 padasatu untaian, replikasi untaian ini berlangsung secara kontinu dan membentuk untaian baruyang disebut sebagai leading strand.Sementara itu, garpu bergerak menuju ujung 3 padauntaian lainnya, sehingga mencegah polimerisasi terus-menerus pada untaiankomplementer baru.Segmen-segmen pendek dari DNA komplementer, disebut sebagaifragmen Okazaki, diproduksi dan disatukan kembali oleh enzim ligase.Untaian DNA ini yangdisebut sebagai lagging strand.

III.1.1Reparasi DNA

Reparasi DNA penting sebagai pengoreksi kesalahan dan perbaikan kerusakan.DNA adalahsatu-satunya makromolekul yang diperbaiki ketika rusak. Salah satu kegunaan dari strukturDNA yang beruntai ganda adalah ia dapat memperbaiki kerusakannya sendiri. Beberapaperubahan kimiawi yang dapat merusak DNA, antara lain:

a. Hidrolisis spontan dari nukleosida menghilangkan komponen basa.b. Hidrolisis spontan dari sitosin mengubahnya menjadi urasil.

11 | P a g e

Gambar 19, Polimerasi Nukleotida

c. Metabolit beracun dapat mengoksidasi atau memetilasi komponen basa.d. Sinar UV dapat mendimerisasi sitosin atau timin.

Perubahan-perubahan ini menganggu pemasangan basa dan membuat deformasistruktural pada double helix.Enzim inspeksi dan perbaikan mendeteksi deformasitersebut dan menggunakan nukleotida yang masih baik untuk mengganti unit yangrusak.

III.1.2 Perbedaan Replikasi DNA pada Sel Prokarotik dan EukaryotikReplikasi DNA pada prokariotik berbentuk sirkular, sehingga dikenal sebagai replikasi karena bentuknya.Sementara itu, replikasi DNA apada sel eukariotik dimulai daritempat-tempat spesifik yang menyebabkan untaian DNA berpisah dan membentukgelembung replikasi.Salah satu perbedaan utama dari replikasi DNA pada sel prokariotik dengan seleukariotik adalah protein atau enzim yang terlibat. Berikut merupakan tabelperbandingan enzim pada kedua sel:

Tabel . Enzim Yang Terlibat Pada Replikasi DNA

Protein Prokariotik/Eukariotik Aktivitas/PeranDNA Polimerase I Prokariotik Polimerase 5 ke 3 dan Eksonuklease

5 ke 3 dan 3 ke 5DNA Polimerasi III Prokariotik Polimerase 5 ke 3 dan Eksonuklease

3 ke 5DNA Polimerase Eukariotik Polimerase 5 ke 3, bergabung denga

primase dan memulai sintesis DNA dariRNA primer

DNA Polimerase Eukariotik Polimerase 5 ke 3 dan Eksonuklease5 ke 3 dan 3 ke 5

DNA Polimerase Eukariotik Polimerase 5 ke 3DNA Polimerase Eukariotik Polimerase DNA 5 ke 3 mitokondrialPrimase Keduanya Polimerase RNADNA Helikase Keduanya Membuka untaian DNASSB Keduanya Mencegah penggabungan kembaliTopoisomerase I danII

Keduanya Menginisiasi pembukaan untaian DNA

DNA Girase Prokariotik Topoisomerase IIDNA Ligase Keduanya Menyatukan untaian DNAProtein Inisiator Keduanya Mengikat pada permulaan replikasiTelomerase Eukariotik Membalikkan aktivitas transkriptase

Perbedaan lainnya adalah pada sel prokariotik, replikasi DNA berlangsung melaluipembelahan biner.Sementara pada sel eukariotik, replikasi DNA berlangsung pada fase Spada siklus pembentukan sel.

III.2 Transkripsi RNA

Transkripsi RNA adalah proses di mana DNA secara enzimatis di-copy oleh RNA Polimeraseuntuk memproduksi RNA komplementer. Dalam kata lain, transkripsi merupakan transferinformasi genetic dari DNA ke RNA. Seperti replikasi DNA, proses transkripsi terjadi dariarah 5 ke 3.Transkripsi sendiri terbagi atas 3 tahap, yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi.

12 | P a g e

Transkripsi RNA berlangsung mirip dengan replikasi DNA. Permulaan transkripsi ditandaidengan rangkaian nukleotida karakteristik pada suatu gen dalam untaian DNA, dan daerahini terikat ke sebuah protein promotor, RNA polymerase, yang menginisiasi sintesis RNA.Struktur untaian ganda DNA terbuka pada daerah promotor dan salah satu untaian bertindaksebagai template untuk pembentukan RNA.Molekul RNA kemudian terbentuk dalam untaiantunggal dan bertindak sebagai pembawa informasi dari DNA ke organel tempat sintesisprotein, yaitu ribosom.RNA ini kemudian disebut sebagai messenger RNA (mRNA).

Salah satu untaian DNA pada double helix memiliki informasi genetic yang digunakan untuksintesis protein.Untaian ini disebut sebagai sense.Untaian yang terikat ke sense disebutsebagai antisense, yang bertindak sebagai template untuk mendapatkan molekul mRNAyang menyampaikan salinan informasi sense ke ribosom.

Protein promotor terikat ke rangkaian nukleotida spesifik yang mengidentifikasikansense.Sintesis RNA kemudian terinisasi menuju ke arah 3, seiring nukleotida trifosfat terikatke basa komplementer pada untaian template.Rangkaian nukleotida stop sequencekarakterisitik menterminasi sintesis RNA.Molekul mRNA kemudian dilepaskan ke sitoplasmauntuk mencari ribosom, dan DNA kembali ke struktur double helix. Berikut ilustrasitranskripsi RNA:

III.2.1 Perbedaan Transkripsi RNA pada Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik

Pada bakteri, semua transkripsi dilakukan oleh satu jenis RNA polymerase.Polimerase inimengandung empat subunit katalis dan sebuah subunit regulator yang diketahui sebagaisigma. Beberapa jenis faktor sigma telah diidentifikasi dan setiap sigma tersebutmengendalikan transkripsi dari gen dengan rangkaian unik. Faktor sigma kemudianmengikat rangkaian promotor yang spesifik.

Operon adalah gen struktural dan situs pengendali yang mengatur laju transkripsi gen-gentersebut. Kebanyakan operon pada bakteri terdisi dari banyak gen struktural dan situspengendali. Pada bakteria, banyak operon yang mengandung lebih dari satu struktural gen,atau sistron.Operon-operon polisistronik tersebut ditranskripsikan menjadi mRNA

13 | P a g e

Gambar 20. Transkripsi RNA

tunggal.Sementara itu, operon pada sel eukariotik biasanya bersifat monosistronik, yaitumasing-masing mengandung satu gen.

Pada sel eukariotik, transkripsi terjadi secara lebih kompleks daripada bakteri.Pada seleukariotik, terdapat tiga jenis RNA polymerase, yaitu tipe I, II, dan III.Polimerase ini berbedadalam jumlah dan tipe subunit yang mereka miliki, dan juga kelas RNA yang merekatranskripsi, di mana RNAP I mentranskripsi RNA ribosomal (rRNA), RNAP II mentranskripsimRNA, dan RNAP III mentranskripsi transfer RNA (tRNA).

Pada sel eukariotik, molekul yang ditranskripsi sebagai mRNA biasanya dimodifikasi dandiperpendek oleh proses editing yang menghilangkan material yang tidak relevan. DNAorganisme eukariotik biasanya ribuan kali lebih besar dan lebih kompleks daripada selbacterial prokariotik.Perbedaan ini dikarenakan, antara lain, karena rangkaian nukleotidayang berulang. Selain itu, lebih dari 95% DNA manusia ditemukan di rangkaian yangmengintervensi gen dang bagian dari gen. Segmen DNA yang mengandung informasi yangmembangun gen disebut sebagai exons, sementara segmen yang tidak mengandung kodedisebut sebagai introns. Sebelum molekul mRNA meninggalkan nukleus, basa yang tidakdiperluka yang membangun intronakan dipotong, dan exon yang mengandung informasiberguna akan disambung dalam tahapan yang disebut sebagai RNA splicing. Dalam hal ini,molekul mRNA yang lebih pendek yang mengandung cetak biru untuk protein spesifik dikirimmenuju ribosom.

14 | P a g e

Gambar 21. Proses Splicing

BAB IV

FUNGSI ASAM NUKLEAT DALAM SEL

(oleh Aditya Kristianto, 1206249681)

Asam nukleat terbagi menjadi dua, yaitu DNA dan RNA, masing-masing tersusun atasnukleotida. Struktur dari semua protein, biomolekul dan komponen sel, adalah produk dariinformasi yang diprogram kedalam nukleotida dari sel asam nukleat. Kemampuan untukmenyimpan dan mentransfer informasi genetik dari generasi ke generasi adalah kondisidasar untuk kehidupan.

IV.1 FungsiDNA

Terdapat lima fungsi dalam DNA, yaitu :

- Membawa materi genetikFungsi ini merupakan fungsi utama dari DNA. Melalui percobaan yang

dilakukan oleh Oswald T. Avery dan koleganya pada tahun 1940an, DNA diekstrakdari sel penyakit bakteri streptococcus pneumoniae dan diinjeksikan kedalam selnormal bakteri tersebut, kemudian bakteri normal tersebut menjadi mengandung selpenyakit (Nelson, 2008 : 278). Pada tahun 1952, Alfred D. Hershey dan MarthaChase melakukan studi infeksi sel bakteri oleh virus (bakteriofage) dengan DNA atauprotein yang berlabel (diusut) radioaktif. Dari percobaan dan studi tersebut, dapatdisimpulkan bahwa DNA membawa informasi genetik

- Mengontrol aktivitas selProtein yang berinteraksi dengan DNA mengubah gen prokariotik menjadi

aktif atau tidak aktif dalam menghadapi perubahan lingkungan sel. Gen menentukanurutan nukleotida dari molekul mRNA spesifik, lalu mRNA menentukan urutan dariasam amino dalam molekul protein (DNA RNA protein). Jadi, gen yang aktifsedang ditulis kedalam RNA, dan informasinya ditranslasikan kedalam molekulprotein spesifik. Proses keseluruhan dimana informasi genetik mengalir dari genmenuju protein, disebut ekspresi gen (heterokatalis) (Campbell, 2012 : 210). Kontrol

15 | P a g e

dari ekspresi gen memungkinkan sel untuk memproduksi protein jenis tertentu kapandan dimana protein tersebut dibutuhkan.

Gambar 22. Bakteri Eschericia coli (E. coli)

Bakteri Escherichia coli, atau biasa disebut E. coli , dapat dipakai sebagaicontoh. Bakteri ini mempunyai kemampuan untuk mengubah aktivitas metabolik seldalam merespons perubahan lingkungan. Contohnya, E. coli memproduksi enzimyang diperlukan untuk memetabolisme gizi spesifik hanya pada saat gizi tersebuttersedia.

- Sintesis proteinDNA berperan sebagai instruksi manual pada fungsi ini. DNA memprogram

RNA untuk melakukan sintesis protein, dengan dua tahap utama yaitu transkripsi(sintesis RNA) dan translasi (sintesis protein) (Campbell, 2012 : 190)

- Autokatalis (replikasi)Ketika DNA bereplikasi, masing-masing dari molekul anak akan memiliki satu

untai lama, yang merupakan bagian dari induk, dan satu untai baru. Model replikasiini dikenal sebagai model semikonservatif (Campbell, 2012 : 188)

Gambar 23. Model replikasi DNA

Replikasi molekul DNA dimulai pada tempat khusus yang dinamakan originsof replication, dimana bentangan pendek (short stretches) dari DNA memiliki urutannukleotida spesifik dimana protein melekat pada DNA dan memisahkan rantai.Seperti ditunjukkan pada gambar 3, replikasi berlangsung di dua sisi, menciptakangelembung. Rantai induk (biru) terbuka sebagai tempat rantai anak (abu-abu)memanjangkan diri di kedua sisi gelembung. Alhasil, seluruh gelembung menyatu,menghasilkan dua molekul DNA anak.

16 | P a g e

Gambar 24. Gelembung dalam proses replikasi DNANukleotida bebas (free nucleotide) disebut juga DNA polimerase. Penyatuan

gelembung dilakukan dengan bantuan enzim DNA ligase.

- RenaturasiRenaturasi adalah proses pembentukan kembali struktur untai-ganda DNA

dari keadaan terdenaturasi. Renaturasi merupakan suatu proses yang dapat terjadisecara in vivo (dalam makhluk hidup) maupun in vitro (dalam lingkungan terkontrol).Renaturasi in vitro dapat digunakan untuk mengetahui kesamaan atau kedekatangenetis antara suatu organisme dengan organisme lain, untuk mendeteksi macamRNA tertentu, untuk mengetahui apakah suatu urutan nukleotida tertentu ada lebihdari satu pada suatu jasad, serta untuk mengetahui lokasi spesifik suatu urutannukleotida pada genom.

Renaturasi merupakan proses yang terjadi secara lambat dan berlangsungdalam dua tahap. Pertama, untai-tunggal DNA (sense) bertemu dengan untai-tunggalyang lain (antisense) secara acak. Kedua, jika urutan nukleotida kedua untai-tunggaltersebut komplementer, maka akan terjadi ikatan hidrogen dan terbentuk strukturuntai-ganda pada suatu bagian.Pembentukan ikatan hidrogen tersebut kemudianakan dilanjutkan pada bagian yang lain secara cepat sehingga terbentuk strukturuntai-ganda yang lengkap. Tahapan yang menentukan kecepatan renaturasi bukanpada proses pembentukan untai-ganda nya, melainkan proses tumbukan antaramolekul untai-tunggal dengan molekul untai-tunggal yang lain. Dengan kata lain,renaturasi dipengaruhi oleh hambatan friksional. Proses ini berlangsung secara acaksehingga sangat ditentukan oleh konsentrasi molekul DNA.

17 | P a g e

Gambar 25. Proses renaturasi DNA (searah jarum jam)

IV.2 Fungsi RNA

Fungsi utama dari RNA adalah untuk mentransfer kode genetik dari DNA untukmensintesis protein. Perbedaan umum RNA dengan DNA adalah pada rantai-nya, DNAmemiliki dua rantai (doublehelix), sedangkan RNA hanya memiliki satu rantai (single helix).RNA dibagi dua jenis, yaitu genetik dan non-genetik.RNA genetik memiliki fungsi yang samadengan DNA, yaitu sebagai pembawa informasi genetik dan mengontrol aktivitas sel, namunRNA genetik hanya dapat ditemukan pada makhluk hidup tertentu yang tidak memiliki DNA,seperti virus. RNA non-genetik tidak berperan sebagai pembawa informasi genetik, sehinggaRNA non-genetik hanya dimiliki oleh makhluk hidup yang memiliki DNA (bertolak-belakangdengan RNA genetik)

Berdasarkan fungsinya, RNA non-genetik dibagi menjadi tiga, yaitu :

- Messenger RNA (mRNA)mRNA membawa informasi genetik yang telah disalin dari DNA dalam bentuk kodekata (Adenine,Uracil,Guanine,Cytidine) yang masing-masing mewakili asam aminotertentu.

- Transfer RNA (tRNA)tRNA merupakan kunci untuk mengartikan kode-kode dalam mRNA. Setiap tipe dariasam amino mempunyai tipe tRNA masing-masing, yang mengikat danmembawanya ke rantai polipeptida jika kode dalam mRNA sesuai.

18 | P a g e

- Ribosomal RNA (rRNA)rRNA menyatu dengan kumpulan protein untuk menyusun ribosom. Strukturkompleks ini, yang secara fisik bergerak sepanjang molekul mRNA, mengkatalispenyusunan asam amino menjadi rantai protein. rRNA juga mengikat tRNA danmolekul tambahan yang diperlukan untuk sintesis protein. Ribosom tersusun atassub-unit besar dan kecil, yang masing-masing mengandung molekul rRNA sendiriatau molekul lain.

RNA juga memiliki fungsi pertahanan, yaitu dengan RNA interference (RNAi).RNAi adalahproses biologis dimana molekul RNA menghambat ekspresi gen, dengan caramenyebabkan pengrusakan mRNA. .Terdapat dua tipe RNA yang merupakan sentral dariRNAi, yaitu micro RNA (miRNA), dan small interfering RNA (siRNA).

- miRNAmiRNA dapat ditemukan pada hewan, tanaman, maupun virus. miRNa

memiliki fungsi utama di dalam pengaturan gen (regulasi gen) pasca-transkripsi.miRNA melewati pasangan basa dengan urutan komplementer dalam molekulmRNA, menng-non-aktifkan gen melalui penahanan translasional atau degradasitarget.

Fungsi lain dari miRNA adalah sebagai kontrol siklus sel, apoptosis danbeberapa perkembangan dan proses fisiologis termasuk diferensiasi sel punca(stem cell), hematopoiesis (pembentukan sel darah), sekresi insulin, metabolismekolesterol dan lain-lain.

- siRNAsiRNA berfungsi sebagai pencegah mRNA dari produksi protein dengan

mengikat mRNA dan mendegradasinya dalam urutan tertentu. Dalam melakukannya,pencegahan dilakukan berdasarkan korespondensi urutan nukleotida

BAB V

ANALISIS DAN DETEKSI ASAM NUKLEAT

(oleh Alif Nuzulul Hidayat, 1206249832)

V.1 Analisis Kualitatif

19 | P a g e

V.1.1 Staining

Staining adalah metode identifikasi DNA atau RNA dengan cara menysipkan zat yangdapat mengeluarkan warna kepada DNA atau RNA tersebut. Karena DNA atau RNAtidak dapat kita lihat dengan mata telanjang, maka sebenarnya tujuan dari pemberianwarna (staining) tersebut berfungsi untuk mengetahui keberadaan(eksistensi) atau lebihspesifiknya letak DNA atu RNA yang sedang kita uji. Zat-zat yang biasa digunakandalam staining adalah

a) EtBr (Ethidium Bromide) : EtBr berikatan diantara basa hidrofobik padanukleotida DNA dan memendarkan warna kuning atau jingga pada panjanggelombang 290 nm. EtBr merupakan senyawa mutagenik dan sangatberbahaya jika terpapar ke dalam tubuh manusia sehingga penggunaannyaharus sangat hati-hati.

b) Acridine Orange : Zat ini digunakan untuk analisis DNA dan memendarkanwarna hijau (green fluorescence) dengan emisi maksimum pada panjanggelombang 525 nm ketika terikat pada DNA. Selain digunakan untuk DNA,acridine orange juga dapat digunakan untuk identifikasi RNA danmemendarkan warna merah (red fluorescence) pada sekitar panjanggeombang 650 nm.

V.1.2 Elektroforesis Gel

Elektroforesis gel adalah metode untuk memisahkan molekul asam nukleat denganmemanfaatkan sifat DNA yang memiliki muatan negatif (pada gugus fosfat). Akibatadanya muatan negatif tersebut, molekul asam nukleat akan bergerak menuju kutub

20 | P a g e

Gambar 26. Acridine Orange

Gambar 27. Ethidium Bromide

Gambar 28. (a) Proses Elektroforesis gel (b) Contoh Hasil Analisis elektroforesis gel

(a) (b)

positif pada alat yang digunakan pada elektroforesis ini. Hal tersebut dapat dilihat padagambar di bawah ini.

Dari gambar di atas terlihat bahwa sampel DNA (asam nukleat) bergerak ke arahelektroda positif. Pergerakan/migrasi dari molekul-molekul asam nukleat tersebutbergantung pada berat molekul masing-masing molekul asam nukleat. Molekul yangmemiliki berat lebih ringan (lebih panjang rantainya) akan bergerak lebih lambatdaripada molekul yang memiliki berat molekul lebih besar. Dengan begitu, molekulasam nukleat dapat dibedakan atas berat molekulnya dengan cara membandingkannyadengan sampel standar (sudah diketahui berat molekulnya). Berat molekul asamnukleat sebanding dengan panjang rantainya sehingga asam nukleat juga dapatdibedakan berdasarkan banyaknya pasangan nukleotidnya. Semakin banyak pasangannukleotid yang terkandung, maka akan semakin panjang pula rantainya.

RNA atau DNA berukuran kecil atau memiliki nukleotida sebanyak 500 atau kurangumumnya dipisahkan oleh elektrofresis gel poliakrilamid, sedangkan molekul yang lebihbesar biasanya dipisahkan dengan metode elektroforesis gel agarosa, yaitu polisakaridayang diekstraksi dari rumput laut (kemudian dilarutkan dalam cairan buffer panas,dituangkan dalam cetakan, dan menurunkan suhu hingga terbentuk menjadi gel),karena memiliki porositas yang lebih besar. Pemisahan DNA (asam nukleat) yangmemiliki ukuran lebih dari 25 kb (kilo base) biasanya dapat dipenuhi denganmenggunakan teknik yang dinamakan pulsed-field electrophoresis, dimana tekniktersebut menyebabkan molekul DNA mengubah orientasi medannya selama migrasiberlangsung.

Pita DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid tidak terihat, kecuali DNA tersebut diberitanda atau diberi label. Tanda atau label yang dimaksud disini adalah warna. Salah satumetode yang cukup sensitif dalam pewarnaan DNA (DNA staining) adalah dengan

21 | P a g e

merendamnya dalam EtBr(ethidium bromida) yang akan menghasilkan pancaran warnatertentu apabila disinari sinar UV. Deteksi lain yang lebih sensitif adalah denganmemasukkan sebuah radioisotop ke dalam DNA sebelum elektroforesis. Radioisotopyang biasa digunakan adalah 32P yang dapat mengeluarkan partikel berenergi. Haltersebut dapat dideteksi dengan mudah oleh tenik autoradiografi.

Sensitivitas teknik elektroforesis gel sangatlah baik hingga dapat membedakan molekulDNA atau RNA dengan selisih hanya satu nuleotida antara molekul satu dengan yanglainnya sehingga metode ini sangat berharga dalam proses DNA sequencing. Karenalaju migrasi molekul dalam gel juga dapat dipengaruhi oleh bentuk dari molekultersebut, elektroforesis dapat digunakan untuk memisahkan molekul-molekul denganbentuk yang berbeda, misalnya bentuk circular dan linear atau relaxed dan supercoiled.

V.1.3 Metode Hibridisasi

Metode hibridisasi asam nukleat dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNAdari patogen dalam spesi klinis dan untuk mengetahui letak gen spesifik dalam sel.Hibridisasi DNA merupakan metode atau teknik yang memanfaatkan kemampuan asamnukleat untuk membentuk molekul dengan dua rantai yang stabil ketika dua rantaitunggal dengan basa yang komplementer digabungkan dalam kondisi yang sesuai.

Proses pertama yang terdapat dalam proses hibridisasi adalah denaturasi. Prosesdenaturasi dilakukan dengan cara memanaskan larutan yang berisi DNA pada suhu100C atau degan mengubah larutan tersebut dengan pH yang sangat tinggi (pH 13).Apabila hal tersebut dilakukan, maka pasangan basa komplementer terdiri dari duarantai/pita yang secara normal membentuk double helixakan terpisah satu sama lainnyadan struktur double helix tersebut akan terdisosiasi secara cepat membentuk dua rantaitunggal.

Setelah proses denaturasi berlangsung, dua rantai tunggal DNA kemudiandiletakkan/dilekatkan ke sebuah lembaran padatan seperti nitroselulosa atau membrannilon. Untuk mengidentifikasi DNA target, sebuah molekul DNA atau RNA rantai tunggalyang telah diketahui struktur basanya, biasa disebut dengan probe, ditambahkan kemembran dalam larutan buffer. Hal tersebut memungkinkan pembentukan ikatanhidrogen atara basa yang saling komplementer dari DNA target dan probe. Probememiliki ukuran dengan panjang berkisar antara 15 hingga ribuan nukleotid. Probe(dikatakan seperti itu karena digunakan untuk mencari sekuens DNA) diikatkan denganreporter group, yaitu penanda kimia atau radioaktif, untuk memungkinkan terjadinyapendeteksian. Hibridisasi menggunakan DNA probe sangatlah sensitif dan selektifhingga dapat mendeteksi satu DNA sequence komplementer diantara ribuan yanglainnya.

Setelah probe berikatan dengan DNA target, kemudian dilakukanpemisahan/pembuangan probe yang tidak bereaksi dengan DNA target dengan caramencuci atau membilasnya dalam larutan buffer. Setelah pembilasan dilakukan, halyang tersisa di atas nitroselulosa adalah DNA target dan molekul probe yang telahmelekat ke sekuens komplementer di DNA target membentuk hybrid yang stabil.

Hibridisasi dari DNA target dan probe dideteksi oleh pengujian terhadap reporter groupyang menempel pada probe. Jika reporter group terdeteksi, artinya hibridisasi telahterjadi. Jika tidak ada reporter group yang terdeteksi, maka dapat diasumsikan bahwamolekul target tidak memiliki sequences yang komplementer terhadap yang ada padaprobe, dan itu menandakan bahwa gen atau segmen DNA yang dicari tidak ada dalamsampel.

22 | P a g e

Gambar 29. Hibridisasi DNA

V.1.4 Metode Blotting/Gel-transfer Hybridization

Blotting pada dasarnya adalah istilah yang digunakan untuk menyatakan transfer DNAatau RNA target dari gel yang dihasilkan melalui proses elekteroforesis gel ke lembarannitroselulosa sebelum terjadinya proses hibridisasi. Jika dalam proses blotting digunakanRNA, maka hal tersebut dinamakan dengan Northern Blotting. Sebaliknya, jikan yangdigunakan adalah DNA, maka istilah yang digunakan adalah Southern Blotting.

Secara umum, dalam proses blotting dilakukan hal-hal sebagai berikut :

a. DNA atau RNA dipisahkan berdasarkan ukurannya melalui proseselektroforesis gel

b. DNA atau RNA dalam gel (telah dipisahkan berdasarkan ukurannya)kemudian ditransfer (blotting) ke lembaran nitroselulosa atau nilon.

c. Lembaran nitroselulosa atau nilon yang telah berisi DNA atau RNA kemudiandiinkubasikan dalam larutan berisi probe DNA.

d. Terjadi proses hibridisasi antara probe DNA dengan DNA atau RNA target.e. Dilakukan pendeteksian untuk memeriksa apakah sekuens DNA yang kita uji

terdapat dalam DNA atay RNA target.

23 | P a g e

Gambar 30. Metode Blotting/gel-transfer Hybridization

V.1.5 DNA Sequencing

DNA sequencing adalah suatu metode yang digunakan untuk mentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, dan timin pada sepotong DNA. Dalam DNAsequencing terdapat dua metode yangpaling dikenal, yaitu metode Maxam &Gilbert dan metode Sanger. Metode Maxam& Gilbert didasarkan pada pembelahanDNA pada lokasi tertentu denganpenggunaan zat-zat kimia daripada enzim.Namun, metode ini sudah jarangdigunakan. Metode yang lebih seringdigunakan saat ini adalah metode Sanger.

Dalam metode Sanger, sintesis DNAsecara enzimatik terjadi melaluipembentukan secara berurut ikatanfosfodiester antara gugus 5 fosfat yangbebas dari nukleotid yang masuk dan

24 | P a g e

gugus 3 OH dari rantai yang tumbuh. Proses ini berlangsung di sepanjang DNAtersebut. Pada metode ini digunakan dideoxynucleotide triphosphates(ddNTPs) yang memilikisebuah atom H pada karbon-3 dari gula ribosa. Hal tersebut sedikit berbeda dengandeoxynucleotide triphosphates(dNTPs) yang memiliki gugus OH pada karbon-3 darigula ribosa. Adanya atom H pada ddNTPs membuat rantai yang sedang tumbuhtidak dapat melangsungkan lagi pertumbuhannya. Dengan kata lain,dideoxynucleotide triphosphates berperan sebagai penghenti rantai. Dalam reaksisintesis, jika dideoxynucleotide triphosphates ditambahkan, maka proses sintesistersebut akan berhenti karena 3 OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotidaberikutnya tidak ada.

Gambar 32. Struktur Deoxynukleosida dan Dideoxyukleosida

Berikut adalah beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses DNA sequencingdengan metode Sanger :

DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template

DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida

baru ke ujung 3 dari template Sejumlah nukeotida normal Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan

pewarna fluorescent)

25 | P a g e

Gambar 31 Daughter & Template Strand

Gambar di bawah ini menjelaskan mekanisme dalam proses DNA sequencingmenggunakan metode Sanger.

Gambar 33. Mekanisme DNA Sequencing Metode Sanger

26 | P a g e

Mekanisme yang terjadi dalam proses tersebut adalah

A. Seperti yang telah dikatakan sebelumnya, DNA sequencing metodeSanger menggunakan deoxynucleotide triphosphates dandideoxynucleotide triphosphates.

B. DNA yang telah dimurnikan disintesis in vitro dalam sebuah campuranyang mengandung molekul DNA rantai tunggal yang akan diurutkan(sequenced), enzim polimerase DNA, DNA primer pendek yangmemungkinkan polimerase untuk memulai sintesis DNA , dan empatdNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Jika analog dari ddNTP muncul padacampuran nukleotid, maka ddNTP tersebut dapat masuk ke dalam rantaibaru yang sedang tumbuh. Akibatnya, pertumbuhan rantai akan berhenti.Dalam ilustrasi di bawah ini, terlihat bahwa sejumlah kecil ddATP masukke dalam campuran nukleotida. ddATP tersebut bersaing dengan dATPyang jumlahnya berlebih sehingga ddATP sangat jarang munculdibandingkan dATP dalam rantai yang sedang tumbuh tersebut.

C. Untuk menentukan urutan lengkap dari sebuah fragmen DNA, rantaiganda DNA pertama-tama dipisahkan ke dalam bentuk rantai tunggalnyadan satu diantaranya digunakan sebagai template untuk prosessequencing. Empat ddNTP digunakan di empat reaksi sintesis DNA yangberbeda. Reaksi tersebut dilakukan terhadap sejumlah salinan dari DNAawal yang digunakan. Setiap reaksi akan menghasilkan sejumlah salinanDNA yang terhenti pada titik-titik berbeda dalam urutan. Hasil tersebutkemudaian dipisahkan oleh proses elektroforesis dalam empat jalursejajar seperti yang terlihat dalam gambar. Setelah itu, urutan DNA dapatditentukan dengan membaca hasil elektroforesis dari yang terbawah dansecara berturut-turut hingga yang teratas.

V.2 Analisis Kuantitatif

V.2.1 Spektrofotometri UV-Vis

Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis sebenarnya memanfaatkankemampuan DNA murni yang dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaanbasa-basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada 280nm. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNAberkisar antara 1.8-2.0. DNA memiliki nilai tingkat kemurnian yang tinggi jika nilaiabsorbannya antara 1.8 sampai 2.0, jika melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diujimasih mengandung kontaminan dari protein membran atau senyawa lainnyasehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1.8 makanddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit.

Selain menentukan kemurniannya, kita juga dapat menentukan konsentrasi DNAatau RNA dalam suatu sampel. Rumus yang dapat digunakan untuk menghitungkonsentrasi dari DNA atau RNA tersebut adalah sebagai berikut :

[DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran

27 | P a g e

260 = nilai absorbansi pada 260 nm50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 g untai gandaDNA per ml

[RNA] = 260 x 40 x faktor pengenceran

40 = 40 g untai ganda RNA per ml

V.2.2 Metode RT-PCR sebagai pendukung analisis kuantitatif asam nukleat

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction, yaitu reaksi berantaimenggunakan aktivitas enzim Polymerase. PCR merupakan suatu teknik ataumetode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakanorganisme.Teknik ini berguna untuk menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalamwaktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan penerapan PCR banyakdilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanyamemerlukan jumlah sampel yang sangat kecil.

Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksiPCR. Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chainreaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction) adalah suatu teknikpengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligusmenghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. RealTime PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilaiabsolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasiterhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadapsekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.

Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR)atau PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakanuntuk mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuksatu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkandeteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlahsalinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkanatau gen normalisasi tambahan.

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhirreaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarosesetelah dilakukan proses elektroforesi, sedangkan analisa menggunakan Real TimePCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung,keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagaihasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatanhasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gelagarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawakarsinogenik.

Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR, yang utama adalahDNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secarareal time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metodekuantifikasi yang umum digunakan antara lain :

28 | P a g e

a) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNArantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green, dan

b) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yangakan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen,misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiappengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akanmeningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukansejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yangdihasilkan.

BAB VI

APLIKASI ASAM NUKLEAT

(oleh Devi, 1206243601)

VI.1 AplikasiDeoxyribonucleic Acid (DNA)

a KloningKloning merupakan salah satu cara yang digunakan untuk membentuk

turunan baru yang memiliki materi genetik yang sifatnya sama baik dari segihereditas mapun penampakannya dari sel somatik satu atau lebih induk.Dengan demikian, teknik ini digolongkan sebagai reproduksi aseksual.Secara umum, proses ini terdiri atas lima langkah, antara lain :1 Pemotongan DNA pada lokasi tertentu. Urutan yang spesifik pada

endonuklease mendukung tahap pemotongan ini.2 Pemilihan sebuah molekul DNA yang mampu mereplikasi dirinya sendiri.

DNA tersebut dikenal sebagai vektor/agen kloning.3 Penggabungan dua fragmen DNA secara kovalen dengan menggunakan

enzim ligase. Molekul-molekul DNA yang digabung dari dua atau lebihsumber disebut DNA rekombinan.

4 Pemindahan DNA rekombinan dari tabung reaksi ke sel inang yangmenyediakan enzim untuk replikasi DNA.

5 Pemilihan atau identifikasi sel inang yang mengandung DNA rekombinan.

Organisme pertama yang digunakan sebagai inang DNA rekombinanadalah bakteri Escherichia coli. Proses kloning pada bakteri ini dilakukansebagai berikut :

29 | P a g e

Gambar 34. Kloning DNA Pada Escherichia coli

Namun, seiring dengan perkembangan zaman, proses rekayasa genetikaini mulai dapat dilakukan pada hewan maupun tumbuhan, bahkan padamanusia. Kloning pada hewan yang pertama kali dinyatakan sukses karenahewan tersebut mampu bertahan hidup cukup lama, yaitu sekitar enam tahunadalah domba Dolly yang lahir pada tahun 1996. Proses kloning yangdilakukan untuk mendapatkan embrio domba ini adalah sebagai berikut :

Gambar 35. Kloning Domba Dolly

Sedangkan, kloning tumbuhan disebut juga sebagai kultur jaringan.Sedikit agak berbeda dengan kloning hewan yang membutuhkan inang untukmenumbuhkan DNA rekombinan yang terbentuk, kloning tumbuhan tidak

30 | P a g e

membutuhkan kehadiran inang.Kultur jaringan memanfaatkan nutrisi yangmengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik untukmengisolasi sel, protoplasma, jaringan, atau organ sehingga bagian-bagiantersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanamansempurna.

Gambar 36. Ilustrasi Proses Kultur Jaringan

Di balik perkembangan dan keberhasilan teknik ini, sebagian masyarakatdunia mengecamnya.Namun, tidak sedikit juga masyrakat yang mendukungdilanjutkannya teknik ini dengan berbagai alasan. Beberapa kelebihan teknikini, antara lain :1 Kerusakan gen dapat dikurangi.2 Mempercepat proses penyembuahan dari suatu kecelakaan.3 Kemandulan dapat dikurangi.4 Menghasilkan obat-obatan atau jenis zat tertentu yang berguna dalam

bidang kedokteran.5 Menjaga keanekaragaman hayati.6 Sebagai bahan percobaan dalam meneliti penyakit manusia dan

pengobatannya.7 Mengembangkan karakter yang baik dari jenis tertentu sehingga dapat

meningkatkan nilai tumbuhan/hewan tertentu.

Sedangkan, kekurangan teknologi kloning ini adalah :1 Menyebabkan penuaan dan kematian dini.2 Menurunnya nilai keindividuan dan nilai kehidupan manusia.3 Menurunkan iman dan kepercayaan kepada Tuhan yang Maha Esa.

b Terapi GenTerapi gen adalah teknik untuk mengoreksi gen-gen yang cacat, yang

bertanggung jawab terhadap suatu penyakit. Terapi ini telah mulai dilakukansejak tahun 1970.Teknologi ini masih terus dikembangkan hingga sekarang,karena masih penuh dengan resiko. Biasanya terapi gen dapat dijadikanalternatif pengobatan penyakit yang disebabkan oleh cacat gen tunggalseperti hemofilia, anemia sel bulan sabit, cystic fibrocis, muscular dystrophy,

31 | P a g e

kanker dan infeksi virus. Tujuanutama terapi gen adalah mengganti genmutasi yang menyebabkan penyakit dengan gen yang normal.

Selama ini terdapat beberapa pendekatan terapi gen yang berkembang,yaitu :1 Menambahkan gen-gen normal ke dalam sel yang mengalami

ketidaknormalan.2 Melenyapkan gen abnormal dengan gen normal dengan melakukan

rekombinasi homolog.3 Mereparasi gen abnormal dengan cara mutasi balik selektif, sedemikian

rupa sehingga akan mengembalikan fungsi normal gen tersebut.4 Mengendalikan regulasi ekspresi gen abnormal.5 Mencegah diekspresikannya gen-gen yang jelek atau abnormal (gene

silencing).

Terdapat dua jenis terapi gen berdasarkan sel yang disisipkan dengan gennormal, antara lain :1 Terapi gen garis germinal. Pada terapi ini, sel haploid (sperma atau sel

telur) dimodifikasi dengan menyisipkan gen-gen fungsional ke dalamnya. 2 Terapi gen somatik. Pada terapi ini, gen normal ditambahkan ke dalam

gen somatik yang terinfeksi penyakit, rusak atau tidak berfungsi lagi.Sedangkan, berdasarkan tempat berlangsungnya proses terapi, terpi genjuga dapat dibedakan menjadi dua, yaitu :1 Terapi gen in vivo. Terapi ini dilakukan langsung pada sel atau jaringan

tubuh yang terkena penyakit.2 Terapi gen ex vivo. Teknik ini dilakukan dengan memindahkan jaringan

yang terinfeksi keluar dari tubuh untuk diterapi. Selanjutnya, setelah salahsatu dari pendekatan di atas dilakukan, jaringan atau sel tubuhdikembalikan ke tubuh pasien.

Gambar 37. Perbedaan in vivo dan ex vivo Terapi Gen

Dalam teknik ini dibutuhkan molekul yang berfungsi sebagai carrier(pembawa) gen untuk mencapai sel taget. Molekul ini dinamakan vektor.Yangdigunakan sebagai vektor biasanya adalah virus (retrovirus atau adenovirus),

32 | P a g e

yang telah dimodifikasi sehingga tidak menyebabkan penyakit ataumikropartikel biologi berupa liposom. Retrovirus mampu mengintegrasi materigenetik yang terdapat dalam gen normal kedalam kromosom di sel tubuhmanusia. Sedangkan adenovirus mampu menghasilkan DNA ke dalamnukleus, tetapi DNA tidak terintegrasi ke dalam kromosom.Vektor ini dapatdiinjeksikan atau dimasukkan kedalam tubuh manusia melalui pembuluhdarah. Vektor ini akan terarah menuju jaringan spesifik di dalam tubuh,khususnya sel tunggal yang terinfeksi penyakit.

Secara umum, gen normal yang akan disisipkan ke dalam gen mutasidimodifikasi dalam virus atau dibungkus dengan liposom. Selanjutnya, gennormal ini akan dimasukkan ke lokasi spesifik dalam genom untukmenggantikan gen yang cacat. Selanjutnya gen akan diproses berdasarkanpendekatan tertentu seperti yang disebutkan di atas, sehingga dihasilkan genyang normal.

c Vaksin DNAVaksin telah mulai dikenal sejak lama, yaitu pada tahun 1796 ketika

Edward Jenner menemukan vaksin cacar.Sejak saat itu vaksin, yangmerupakan substansi yang digunakan untuk memperoleh respon imunterhadap mikroorganisme patogen, terus dikembangkan.Generasi pertamavaksin adalah vaksin yang mengandung mikroorganisme hidup yang telahdilemahkan dan generasi kedua adalah vaksin yang mengandungmikroorganisme yang dimatikan, serta generasi ketiga (vaksin sub unit)adalah vaksin rekombinan yang mengandung fragmen antigenik dari suatumikroorganisme yang dapat merangsang respon imun.Vaksin generasipertama sering bermutasi kembali, sedangkan vaksin kedua berbahaya bagitubuh karena mengandung formalin atau fenol dan sering mengalamikegagalan.Untuk mengatasinya, dikembangkan vaksin generasi ketiga,namun ternyata vaksin generasi ini hanya dapat menimbulkan respon imunhumoral, dan tidak dapat menimbulkan respon imun seluler.

Vaksin generasi keempat, vaksin DNA, dapat menghasilkan protein asingatau antigen yang dapat menstimulasi respon imun, sehingga dapatmencegah berbagai penyakit infeksi pada manusia, seperti HumanImmunodeficiency Virus (HIV), malaria, virus dengue, cytomegalovirus, virusEbola, virus influenza, avian influenza viruses, West Nile virus (WMV), SARScoronavirus, dan virus hepatitis B.

Struktur dan elemen genetik dari suatu vaksin DNA terdiri dari dua unitutama yaitu unit propagasi plasmid yang berfungsi sebagai pengendalireplikasi dan perbanyakan plasmid DNA secara in vitro dalam sel bakteri(biasanya Eschericia coli), sesuai dengan jumlah dan volume yang diinginkansaat produksi. Sedangkan, unit yang kedua terdiri dari fragmen DNA yangmengandung gen vaksin yang telah dikloning ke dalam plasmid DNA, dimanagen vaksin ini diharapkan mengekspresi protein asing di dalam sel hospes(tubuh manusia).

Plasmid vaksin DNA terdiri dari fragmen DNA untuk replikasi dan markaseleksi.Plasmid DNA ditransformasi ke dalam sel bakteri, kemudian diseleksisel transforman yang mengandung plasmid DNA.Klon bakteri yang membawaplasmid DNA ini kemudian dibiakkan dalam media yang sesuai dalam skalaindustri, kemudian plasmid DNA diisolasi, dimurnikan dan diformulasi menjadivaksin DNA.Untuk meningkatkan potensi vaksin DNA, biasanya dalamplasmid DNA ditambahkan ISS, yaitu nukleotida heksamer yang dapat

33 | P a g e

berinteraksi dengan reseptor dan meningkatkan sifat imonogenisitas darivaksin DNA.

Vaksin DNA, di dalam tubuh manusia berkerja dengan mekanismesebagai berikut :

1 Disuntikkan ke dalam jaringan hospes.2 Plasmid DNA bereplikasi secara otonom dan memproduksi protein

asing atau antigen yang dikode oleh gen vaksin.3 Antigen menstimulasi sel B yang kemudian dapat memproduksi

antibodi terhadap antigen atau protein asing yang dikode olehplasmid DNA.

4 Sel yang mampu memproduksi antibodi (antigen presenting cells)selanjutnya melalui jalur major histocompatibility complex (MHC) Ipada sel CD8+T atau MHC II pada sel CD4+T, sehingga mengalamiproses yang berbeda dalam merangsang sistem imunitas tubuh.

5 Protein asing juga dapat langsung masuk ke dalam suatu sel penyajilainnya, misalnya sel dendritik, dapat merangsang sistem imunhumoral dan imun seluler.

d Analisis IdentitasUji identitas dalam bidang forensik biasanya diawali dengan tes darah

menggunkan sistem penggolongan ABO.Selanjutnya, penanda baru untukidentitas dan kekeluargaan didasarkan pada variasi protein serum dan enzimsel darah merah. Namun, sejak ditemukannya metode identifikasi yangberbasis DNA 20 tahun yang lalu oleh Sir Alec Jeffreys dari University ofLeicester di United Kingdom, metode konvensional di atas mulai ditinggalkan.Beliau tertarik untuk mempelajari variasi gen antar individu dan melakukanbeberapa percobaan untuk mendeteksi perbedaan gen pada manusia. Beliaukemudian menyadari bahwa terdapat bagian gen yang berupa rangkaianberulang yang variatif dan merupakan gen informatif (pembeda). Bersamadengan koleganya, selanjutnya beliau mengembangkan penelitian radioaktif,yang dibuat dari rangkaian pendek gen, yang dapat membatasi rangkaianberulang tersebut sehingga terbentuk pola yang unik untuk setiap individu.Halini dinamakan sidik jari DNA.

Langkah-langkah yang dilakukan dalam analisis ini antara lain melakukanekstraksi DNA dari sampel berupa darah, cairan semen, kulit, atau rambut.Setelah diekstraksi, dilakukan penambahan enzim restriksi, yang berfungsisebagai pemotong DNA sehingga dihasilkan DNA dengan segmen-segmenkecil yang berbeda antar individu.Segmen-segmen ini kemudian disortirdengan elektroforesis sel agarosa dan diwarnai dengan etidiumbromida.Selanjutnya dilakukan metode Southern bolt untuk mentransfer DNAke dalam membran.Penelitian radioaktif diaplikasikan ke dalam membran danpola DNA dideteksi dengan mengekspos membran ke film sinar x. Hasilnyaberupa pola DNA yang terlihat seperti barcode.

Selain metode di atas, dapat pula digunakan metode isolasi.Sampelberupa cairan seperti darah dapat diisolasi dengan menggunakan bahankimia phenolchloroform, sedangkan sampel padat diisolasi dengan chilex.Apabila metode isolasi yang digunakan, selanjutnya dilakukan prosespemurnian dengan menggunakan teknik sentrifugasi dan filtrasi vakum ataumemanfaatkan produk-produk pemurnian seperti butir magnet yangmemanfaatkan silica coated paramagnetic resin. Kemudian, sampel DNAdimasukkan ke dalam mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai

34 | P a g e

tahapan amplifikasi.Hasil akhir dari tahap amplifikasi adalah berupa kopiurutan DNA lengkap dari DNA sampel.Selanjutnya kopi ini dikarakterisasidengan elektroforesis untuk melihat pola pitanya.

Pola yang dihasilkan dari analisis ini berbeda untuk setiap individu.Polaini kemudian dianalisis pola Short Tandem Repeats (STR)-nya. Selanjutnya,dilakukan tahapan typing. Proses ini dimaksudkan untuk memperoleh tipeDNA. Mesin PCR akan membaca data-data DNA dan menampilkannya dalambentuk angka-angka dan gambar-gambar identifikasi DNA, yang selanjutnyadigunakan untuk mencocokkan tipe-tipe DNA.

Selain itu, Profesor Jeffreys juga mengamati DNA dari suatu keluarga.Terlihat bahwa ayah dan ibu memiliki pola DNA-nya sendiri dananak-anaknya memiliki pola gabungan dari ayah dan ibunya.Hasil penelitianini kemudian dimanfaatkan untuk mengidentifikasi kasus-kasus dimanaindentitas seorang anak diragukan, identifikasi korban kecelakaan yang tidakdikenali lagi, kasus pembunuhan dan sebagainya.

e Sertifikasi Makanan

Sifat unik DNA yang dapat diidentifikasi salah satunya dengan metodePolymere Chain Reaction (PCR) dapat dimanfaatkan untuk menganalisiskandungan dalam makanan. Dengan langkah-langkah yang sama denganyang dilakukan untuk analisis identitas, teknik ini dapat menguji suatu sampelmakanan. Pola DNA yang dihasilkan dari metode ini menunjukkan kandunganyang terdapat di dalam makanan yang diuji.Dengan melakukan pencocokandengan informasi database yang dimiliki, kandungan dalam makanan dapatdiidentifikasi.

Penemuan terbaru oleh para ilmuwan Johannes Gutenberg UniversityMainz (JGU) di Jerman adalah sebuah metode untuk menentukan kandunganmakanan dengan lebih akurat yang dinamakan All-Food-Seq.Metode yangdigunakan adalah sebuah metode digital sederhana yang dapat menghitungpotongan-potongan DNA.Metode ini dinyatakan dapat mendeteksi kandungandaging kuda sebesar 1% pada makanan tertentu.Metode ini juga dapatmengidentifikasi bumbu-bumbu yang digunakan sehingga dapat membantumencegah terjadinya alergi terhadap makanan pada konsumen.

f Deteksi dan Pemetaan Penyakit

Bab baru dalam diagnosa penyakit infeksi telah dibuka dengandiembangkannya teknologi DNA, khususnya dalam pemanfaatan PCR danprobe asam nukleat berlabel untuk menelusuri patogen-patogen tertentu.Misalnya, karena urutan DNA HIV diketahui, PCR dapat digunakan untukmengamplifikasi dan kemudian mendeteksi DNA HIV dalam sampel darahatau jaringan. Hal ini sering merupakan cara terbaik untuk mendeteksi suatuinfeksi tidak tampak. Saat ini ratusan kelainan genetik manusia dapatdiidentifikasi dengan teknologi ini, bahkan sebelum muncul gejala ataubahkan sebelum lahir.Adapula kemungkinan mengidentifikasi pembawa alelresesif yang secara potensial berbahaya, namun tanpa gejala.

Analisis hibridisasi memungkinkan untuk mendeteksi bentuk alelabnormal dari gen yang ada di dalam sampel DNA. Bahkan, dalam kasus genbelum diklon sekalipun, keberadaan alel abnormal dapat didiagnosis dengan

35 | P a g e

akurasi yang masuk akal jika penanda RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism) yang berhubungan dekat telah ditemukan. Alel untukpenyakit Huntington dan sejumlah penyakit lain sebelumnya telah berhasildideteksi. Begitu gen dipetakan dengan lebih tepat, gen itu dapat diklon untukpengkajian dan digunakan sebagai probe untuk menemukan DNA yangidentik atau mirip seperti yang sekarang dilakukan untuk penyakit Huntington,fibrosis sistik, dan banyak penyakit lainnya.

Gambar 38. Penanda RFPL yang Dekat dengan Suatu Gen

g Analisis STR dalam Transplantasi

Transplantasi pada manusia berarti pemindahan jaringan tuuh dari suatutempat ke tempat lain. Transplantasi sendiri dapat dibedakan menjadi duajenis, yaitu : autologus dan alogenik. Transplantasi autologus merupakantransplantasi yang sumber jaringan atau organnya adalah bagian tubuhpasien itu sendiri, sedangkan transplantasi alogenik mendapatkan donor dariorang lain. Salah satu contoh transplantasi alogenik adalah transplantasisum-sum tulang.Setelah melakukan Bone Marrow Transplant (BMT),dilakukan Bone Marrow Engraftment Analysis. Terdapat beberapakemungkinan yang terjadi, antara lain :

1 Complete engraftment2 Penolakan3 Di antara keduanya

Metode yang digunakan untuk mengetahui kemungkinan di atas adalahmetode PCR.Pertama-tama, DNA donor dan resipien diamplifikasi denganSTR pada lokus 12, pada lokus 4 dan 8 secara bersamaan.Lokus-lokus STRadalah Powerplex (CSF1PO, TPOX, TH01, vWA, D16S539, D7S820,D13S317, D5S818) and FFFL (FESFPS, F13B, F13A01, LPL).Selanjutnyaproduk PCR dipisahkan dengan elektroforesis kapiler. Alel donor danpenerima dibandingkan untuk mengidentifikasi paling sedikit 1 lokus dimanapenerima mempunyai nomor lain pengulangan dibandingkan denganpendonor. Lokus ini kemudian akan digunakan untuk evaluasipost-transplantasi tentang chimerism. DNA dari sampel post-transplantasidiproses dengan amplifikasi PCR dengan quadriplex STR set yangmengandung lokus informatif dan setelah elektroforesisi kapiler, puncakdaerah alel digunakan untuk menentukan persentase kesamaan DNApendonor dan penerima transplantasi.

36 | P a g e

VI.2 AplikasiRibonucleic Acid (RNA)

a Terapi Gen

Seperti yang telah diuraikan di atas, diketahui bahwa terdapat limapendekatan dalam melakukan terapi gen. Namun, pada saat ini pendekatanyang paling berkembang adalah melakukan pencegahan terhadapdiekspresikannya gen-gen yang jelek atau abnormal, yang dikenal sebagaigene silencing. Untuk tujuan ini, penggunaan RNA lebih dimungkinkandibandingkan dengan DNA.Gagasan yang diusulkan adalah denganmereparasi mRNA sehingga yang digunakan adalah regulasi sel itusendiri.Dengan demikian, efek samping yang merugikan dapat ditekan(Penman, 2002). Penghambatan proses ekspresi gen dapat dilakukan padabeberapa tahap, diantaranya adalah tahap translasi, yaitu denganmengganggu proses translasi tersebut pada molekul mRNA. Molekul RNAyang akan ditranslasi mempunyai sekuense di bagian hulu sebagai tempatpengenalan bagi ribosom dalam proses sintesis protein. Ribosom, sebagaimesin pensintesis polipeptida yang kemudian dimodifikasi lebih lanjut menjadiprotein, memerlukan situs pengenalan yang terdapat dalam mRNA untukdapat melaksanakan tugasnya. Potongan pendek dari duplex RNA atau DNAuntai ganda dilaporkan mengakibatkan degradasi RNA lain yang memilikisekuens berkesuaian. Perkembangan terkini adalah ditemukannya microRNA (miRNA) yang berperan membungkam ekspresi gen (Johnston, 2004;Pfeffer, et al, 2002).

Gambar 39. Mekanisme Kerja Antisense RNA dalam Menghalangi Ekspresi Gen

Mekanisme kerja antisense RNA adalah sebagai berikut (Dale, 1994;Glick & Pasternak, 1994).Untai DNA yang ditranslasi disebut untai sense,sedangkan yang mempunya sekuens basa nukleotida komplemen denganuntai sense disebut untai antisense. Jika untai sense berikatan dengan untaiantisense membentuk dupleks, maka terjadi pemblokiran proses translasiyang mengakibatkan terjadinya penghambatan ekspresi gen (Penman, 2002).Sedangkan, terapi yang memanfaatkan siRNA melalui mekanisme yangditunjukkan oleh ilustrasi di bawah ini untuk menghambat ekspresi genabnormal.

37 | P a g e

Gambar 40. Mekanisme Kerja siRNA dalam Menghalangi Ekspresi Gen

b Sebagai Katalis

Salah satu peranan RNA yang cukup unik adalah sebagai katalis untukbeberapa reaksi.Karena kemampuan ini.beberapa RNA disebut sebagairibonucleic acid enzyme atau ribozyme. RNA dapat mengkatalisis reaksikimia karena kemampuannya untuk menggulung sehingga membentukstruktur tiga dimensi kompleks serta mengikat molekul kecil dan ion logamdivalen.Kemampuan ini dipengaruhi oleh gugus 2-hidroksil ribosa danmenjadi pembeda RNA dari DNA. RNA tidak hanya mampu mengkatalisisreaksi transfer fosfat ester di dalam RNA, tetapi juga mampu menunjukkanaktivitas amino-acyl esterase serta mampu mempromosikan formasi ikatanpeptida. Dalam peranannya sebagai katalis, RNA membantu mempercepatreaksi dengan menurunkan energi aktivasi.Setelah reaksi selesai berjalan,katalis lepas sebagai suatu senyawa tunggal kembali. Mekanisme kerjaribozyme secara lengkap masih dalam proses penelitian.

38 | P a g e

BAB VII

PENUTUP

Asam nukleat merupakan polimer nukleotida yang tersusun atas basa nitrogen, gulapentosa, dan gugus fosfat.Asam nukleat yang berperan sebagai pembawa materi genetikadalah DNA dan RNA. DNA (Deoxyribonucleic Acid) tersusun oleh dua buah rantaipolinukleotida panjang yang saling berpilin membentuk double helixsedangkanRNA(Ribonucleic Acid) terbentuk dari polimer nukleotida rantai tunggal yang berpilin. Adabeberapa tipe RNA yang ditemukan pada sel, diantaranya adalah messenger RNA (mRNA),ribosomal RNA (rRNA), dantransfer RNA (tRNA).Fungsi utama dari DNA adalah membawamateri genetik, dan fungsi lainnya adalah mengontrol aktivitas sel, sintesis protein denganbantuan RNA, replikasi dan renaturasi. Fungsi utama dari RNA adalah mentransfer kodegenetik dari DNA untuk mensintesis protein. RNA dibagi menjadi dua jenis, yaitu RNAgenetik ,seperti virus, dan RNA non-genetik untuk sintesis protein. Dalam mensintesisprotein, RNA non-genetik dibagi menjadi tiga jenis, yaitu mRNA, tRNA, dan rRNA,masing-masing mempunyai fungsi spesifik. RNA juga berperan dalam sistem pertahanandari gen asing, dengan RNAi. Sifat-sifat asam nukleat tersebut dapat diterapkan padaberbagai macam bidang seperti kedokteran, pertanian, bahkan pengadilan.

39 | P a g e

DAFTAR PUSTAKA

Albert, Johnson. 2006. Molecular Biology of the Cell 5th Edition: Garland Science.

American Journal Clinic Pathology, 2007. miRNA : The New Gene Silencer. [online] Tersediadi : http://www.medscape.com/viewarticle/567900_3 [Diakses 18 Februari 2014]

Anne Traftron, MIT News Office, 2009. Explained : RNA interference. [online] Tersedia di : http://web.mit.edu/newsoffice/2009/explained-rna.html [Diakses 18 Februari 2014]

Arumingtyas, E., Fatchiyah, dan Rahayu, S. (2011) Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta : Penerbit Erlangga.

Baggott, J. 1995. Nucleic Acids.[Online]. Available: http://library.med.utah.edu/NetBiochem/nucacids.htm. [15 Januari 2014, 22.45 WIB]

BBC. (2011) Cloning , [Online], Available : http://www.bbc.co.uk/schools/gcsebitesize/science/add_gateway_pre_2011/living/cloningrev4.shtml[17 Feb 2014].

Clancy S. 2008. RNA Transcription by RNA Polymerase: Prokaryotes vs Eukaryotes. [Online]. Available: http://www.nature.com/scitable/topicpage/rna-transcription-by-rna-polymerase-prokaryotes-vs-961. [18 Januari 2014, 21.30 WIB]

Cox, M. dan Nelson, D. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th edition, New York : W.H. Freeman and Company.

Departemen Farmasi FMIPA-UI. (2009) Vaksin DNA : Vaksin DNA Generasi Keempat, Majalah Ilmu Kefarmasian [Electronic] , vol.VI, no.1, pp.28-37, Available : http://journal.ui.ac.id/index.php/mik/article/download/1211/1116, [22 Feb 2014].

Department of Biology.Chapter 4, University of Texas Arlington: Author. Available: http://www.uta.edu/biology/robinson/classnotes/3315/chapter4.htm. [17 Januari 2014, 20.25 WIB]

Deparment of Bioscience.PHAR 2911 Dales Lecture 5, University of Sydney: Author. Available: http://sydney.edu.au/science/molecular_bioscience/PHAR2811/PHARlectures/PHARlecture5/PHARlecture5notes.pdf. [17 Januari 2014, 20.35]

Exiqon, 1996. What are microRNAs ?. [online] Tersedia di : http://www.exiqon.com/what-are-microRNAs [Diakses 18 Februari 2014]

Geoffrey, Cooper. 2000. The Cell - A Molecular Approach 2nd Edition: Boston University

40 | P a g e

http://www.medscape.com/viewarticle/567900_3http://www.exiqon.com/what-are-microRNAshttp://sydney.edu.au/science/molecular_bioscience/PHAR2811/PHARlectures/PHARlecture5/PHARlecture5notes.pdfhttp://sydney.edu.au/science/molecular_bioscience/PHAR2811/PHARlectures/PHARlecture5/PHARlecture5notes.pdfhttp://www.uta.edu/biology/robinson/classnotes/3315/chapter4.htmhttp://journal.ui.ac.id/index.php/mik/article/download/1211/1116http://www.nature.com/scitable/topicpage/rna-transcription-by-rna-polymerase-prokaryotes-vs-961http://www.nature.com/scitable/topicpage/rna-transcription-by-rna-polymerase-prokaryotes-vs-961http://www.bbc.co.uk/schools/gcsebitesize/science/add_gateway_pre_2011/living/cloningrev4.shtmlhttp://www.bbc.co.uk/schools/gcsebitesize/science/add_gateway_pre_2011/living/cloningrev4.shtmlhttp://library.med.utah.edu/NetBiochem/nucacids.htmhttp://web.mit.edu/newsoffice/2009/explained-rna.html

James Baggott, 1995. Nucleic Acids. [online] Tersedia di : http://library.med.utah.edu/NetBiochem/nucacids.htm [Diakses 17 Februari 2014].

Malik, A. (2005) RNA Therapeutic, Pendekatan Baru dalam Terapi Gen, Majalah Ilmu Kefarmasian [Electronic] , vol.II, no.2, pp.51-61, Available : http://staff.ui.ac.id/system/files/users/amarila.malik/material/amarila0202.pdf , [18 Feb 2014].

Misra, S. (2013) Human Gene Therapy : A Brief Overview of the Genetic Revolution, Japi [Electronic] , vol.61, no.6, pp.127-133, Available : http://www.japi.org/february_2013/06_ra_human_gene_therapy_a.pdf, [18 Feb 2014].

National Center for Biotechnology Information, 2010. The Three Roles of RNA in Protein Synthesis. [online] Tersedia di : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/ [Diakses 17 Februari 2014]

Pecorino, L. (2000) Animal Cloning, [Online], Available :http://www.actionbioscience.org/biotechnology/pecorino.html [17 Feb 2014].

Primrose, S. B., R. M., Twyman, R. W. Old, 2001, Principle of Gene Manipulation, 6th, Blackwell Science, Ltd., UK

Reece, Jane B., et al, 2012. Campbell Biology : Concepts and Connections 7th edition. San Francisco : Pearson Education, Inc

Reginald, Garrett; Grisham M., Charles.2005. Biochemistry 3rd Edition: Cengage Learning.

Reusch, W. 2013.Nucleic Acids.[Online]. Available: https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/nucacids.htm. [16 Januari 2014, 14.20 WIB]

Rice, G. 2012. Replication: DNA Copied into DNA; Transcription: DNA Copied into RNA. [Online]. Available: http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/transcrip.html. [18 Januari 2014, 20.40 WIB]

Wolf YI, Aravind L, Grishin NV, Koonin EV. 1999. Evolution of aminoacyl-tRNA synthetases--analysis of unique domain architectures and phylogenetic trees reveals a complex history of horizontal gene transfer events. Genome Res. 9 (8): 689710.

Yuwono, Triwibowo, 2010. Biologi Molekular. Jakarta : Penerbit Erlangga

41 | P a g e

http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/transcrip.htmlhttps://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/nucacids.htmhttp://www.actionbioscience.org/biotechnology/pecorino.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/http://www.japi.org/february_2013/06_ra_human_gene_therapy_a.pdfhttp://staff.ui.ac.id/system/files/users/amarila.malik/material/amarila0202.pdfhttp://library.med.utah.edu/NetBiochem/nucacids.htm