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Centro de Investigación Científica de Educación Superior de Ensenada, Baja California
Maestría en Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en Microbiología
Dinámica de la flipasa de fosfolípidos DNF-2 y su papel en el crecimiento polarizado en Neurospora crassa
Tesis para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
Maestro en Ciencias
Presenta:
Ivan Murillo Corona
Ensenada, Baja California, México 2017
Tesis defendida por
Ivan Murillo Corona
y aprobada por el siguiente Comité
Ivan Murillo Corona © 2017
Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso formal y explícito del autor y director de la tesis.
Dra. Rosa R. Mouriño Pérez Directora de tesis
Dra. Meritxell Riquelme Pérez
Dr. Josué Álvarez Borrego
Dra. Clara Elizabeth Galindo Coordinadora del Posgrado en Ciencias de la
Vida
Dra. Rufina Hernández Martínez Directora de Estudios de Posgrado
ii
Resumen de la tesis que presenta Ivan Murillo Corona como requisito parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Ciencias de la Vida con orientación en Microbiología.
Dinámica de la flipasa de fosfolípidos DNF-2 y su papel en el crecimiento polarizado en Neurospora crassa
Resumen aprobado por:
__________________________ Dra. Rosa R. Mouriño Pérez
Directora de tesis La asimetría de fosfolípidos de las membranas es una topología importante para la formación de vesículas en el tráfico vesicular. La producción de curvatura en la membrana parece ser una fuerza impulsora para la formación de vesículas. Las proteínas involucradas en la translocación de fosfolípidos a través de la membrana para producir la asimetría son miembros de la familia de las flipasas. Estas son proteínas ATPasas tipo P4 que producen un cambio en la carga y composición de la cara interior de la membrana. En este trabajo, se estudió DNF-2, que es una flipasa de aminofosfolípidos, presuntamente responsable del mantenimiento de la asimetría de la membrana, en Neurospora crassa. Se obtuvo una mutante por deleción del gen dnf-2 (NCU00352) y una cepa que expresaba la proteína quimérica DNF-2-GFP para evaluar su dinámica y localización en células de N. crassa. DNF-2-GFP se localizó en el núcleo del Spitzenkörper, similar a la localización de las quitina sintasas, pero estaba ausente en los septos. Mutantes Δdnf-2 presentaban una reducción del crecimiento de 42.4% en comparación con la cepa silvestre (WT). En la cepa mutante la conidiación fue afectada. Esta cepa producía solo un 50.1% de los conidios producidos por la cepa WT. Además las células de la mutante Δdnf-2 presentaron un crecimiento hifal caracterizado por periodos de polarización, intercalados con periodos de crecimiento isotrópico. Se observó que el Spitzenkörper era inestable y se dividía. La división del Spitzenkörper producía ramificaciones apicales. Estos resultados sugieren que DNF-2, no es esencial pero está involucrada en la estabilidad del Spitzenkörper y en el crecimiento celular. Palabras clave: Flipasas, Neurospora crassa, membrana, secreción.
iii
Abstract of the thesis presented by Ivan Murillo Corona as a partial requirement to obtain the Master of Science degree in Life Sciences with orientation in Microbiology Dynamics of the flippase of phospholipids DNF-2 and its role in polarized growth in Neurospora crassa.
Abstract approved by:
__________________________________ Dr. Rosa R. Mouriño Pérez
Thesis Director Phospholipid membrane asymmetry is an important topography feature for vesicle formation in vesicle traffic. The production of a curvature in the membrane seems to be a driving force for vesicle formation. Flippases are involved in these phospholipids translocation to the cytosolic leaflet of the membrane. These proteins are P-Type 4 ATPases that produce a shift in the charge and composition of the inner leaflet of the membrane. In this work DNF-2, a putative aminophospholipid flippase responsible for the maintenance of the asymmetry of the membrane, was studied in Neurospora crassa. A dnf-2 (NCU00352) gene deletion mutant and a strain expressing the chimeric protein DNF-2-GFP to assess its dynamic and organization in living cells of N. crassa. DNF-2-GFP was localized in the core of the Spitzenkörper, similar to the localization of chitin synthases, but it is completely absent in septa. The Δdnf-2 mutant had a growth rate reduction of 42.34% in comparison with the wild type (WT) strain. Conidiation was affected, producing only 50.1% of the total conidia produced by WT. Cells of the Δdnf-2 mutant showed a distorted hyphal morphology with growth intercalating periods of polarized growth and periods of isotropic growth. The Spitzenkörper was unstable and divided frequently giving rise to apical branches. These results suggest that DNF-2 is not essential, but is involved in Spitzenkörper stability and cell growth. Keywords: Flippases, Neurospora crassa, membrane, secretion.
iv
Dedicatoria
Dedico este trabajo a mis abuelos
María y Francisco
v
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por brindarme la beca y el apoyo económico
necesario para realizar este proyecto. Al CICESE por aceptarme en uno de sus posgrados.
A la Doctora Rosa R. Mouriño Pérez por aceptarme como su estudiante de maestría, ser la directora de mi
proyecto de tesis y darme confianza cuando más lo necesitaba.
A mis sinodales, Dra. Meritxell Riquelme Pérez y Dr. Josué Álvarez Borrego por sus observaciones para
mejorar mi trabajo.
Al Dr. Salomón Bartnicki-García por interesarse en mi trabajo.
A mis compañeros del Laboratorio Mouriño: la Doctora Olga Alicia Callejas, Ariane Ramírez, Fausto
Villavicencio, a Marisela Garduño, al Doctor Fernando Lara Rojas y al Doctor “Candido” Fernando que me
enseñaron todo lo que necesité saber y me guiaron durante mis experimentos sin importar qué tan
obstinado fuí.
A mis compañeros de posgrado del Departamento de Microbiología: a Anayatzin Aguilar, Adriana Rico,
Leonora Martínez, Pamela Ocampo, Tetoy Blancket, Rocío del Carmen Navarro, Leobardo Pérez por ser
una segunda familia y hacer los días agradables.
Al Dr. Bryan Shaw del Departamento de Plant Pathology en Texas A&M y su laboratorio, Brigitte Bomer,
Blake Commer, Zach Schultzhaus, a su esposa Janna Schultzhaus y a Eli James Borrego por recibirme en su
equipo de trabajo durante mi estancia en College Station y dejarme ser parte de sus vidas.
A mis compañeros de generación en la Maestría en Ciencias de la Vida, especialmente a Briseida
Covarrubias, Dulce Alarcón y Lupita Ruíz por ser mis compañeros durante mi estancia en CICESE.
A la Dra. Graciela Guerra Rivas y la Dra. Claudia Mariana Gómez Gutiérrez de la UABC por la formación
académica y la ayuda que me brindaron para seguir con mis estudios después de la carrera.
vi
Al personal del Departamento de Microbiología: Melisa Corral, Guillermo Gonzáles y la Señora Patricia por
brindarnos su apoyo en las diversas tareas del departamento y del posgrado.
A mi mamá, mi papá y mi hermana quienes estuvieron y han estado conmigo, y que hemos pasado por
muchas cosas durante este último par de años.
Y finalmente a mis abuelos, María Sahara Ortiz y Francisco Corona que en paz descansen. Quienes dieron
la confianza para comenzar esta maestría y a quienes dedico este trabajo.
vii
Tabla de contenido
Resumen en español ...................................................................................................................................... ii Resumen en inglés ........................................................................................................................................ iii Dedicatoria .................................................................................................................................................... iv Agradecimientos ............................................................................................................................................ v Lista de figuras .............................................................................................................................................. ix Lista de tablas ................................................................................................................................................. x
Capítulo 1. Introducción ...................................................................................................................... 1
Capítulo 2. Antecedentes .................................................................................................................... 3 2.1 Hongos filamentosos ........................................................................................................................... 3 2.2 Crecimiento polarizado y el Spitzenkörper ......................................................................................... 4 2.3 Proceso de secreción y membrana plasmática. .................................................................................. 5
2.3.1 Proceso de secreción .................................................................................................................. 5 2.3.2 Topología de membrana ............................................................................................................. 5
2.5 Flipasas ................................................................................................................................................ 7 2.5.1 Flipasas en hongos ...................................................................................................................... 9
Capítulo 3. Justificación .................................................................................................................... 10
Capítulo 4. Hipótesis ......................................................................................................................... 11
Capítulo 5. Objetivos ........................................................................................................................ 12 5.1 Objetivo general ................................................................................................................................12 5.2 Objetivos específicos .........................................................................................................................12
Capítulo 6. Metodología ................................................................................................................... 13 6.1 Cepas y plásmidos utilizados .............................................................................................................13 6.2 Medios de cultivo ..............................................................................................................................15 6.3 Cuantificación de la tasa de elongación ............................................................................................16 6.4 Morfología de colonia y borde de la colonia.....................................................................................16 6.5 Cuantificación de producción de conidios ........................................................................................17 6.6 Cuantificación de frecuencia de ramificación ...................................................................................17 6.7 Cuantificación de producción de biomasa ........................................................................................18 6.8 Cruzas ................................................................................................................................................18 6.9 Etiquetamiento de DNF-2 con GFP ...................................................................................................19 6.10 Medición de producción de hifas aéreas ........................................................................................19 6.11 Microscopía confocal de escaneo láser ..........................................................................................20
Capítulo 7. Resultados ...................................................................................................................... 21 7.1 Análisis bioinformático de DNF-1 y DNF-2 ........................................................................................21 7.2 Localización de DNF-2-GFP ................................................................................................................25
7.2.1 Localización de DNF-2-GFP en hifas maduras ...........................................................................25 7.2.2 Localización de DNF-2-GFP y CHS-1-mChFP ..............................................................................27
7.3 Fenotipo de las mutantes por deleción de los genes dnf-1 y dnf-2. .................................................29 7.3.1 Corroboración de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 ......................................................................29
viii
7.3.1 Morfología de las colonias y las hifas de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2...................................30 7.3.2 Tasa de elongación y crecimiento de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 en N. crassa. ..................32 7.3.3 Formación de ramificaciones en las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 de N. crassa. ..........................33 7.3.4 Cuantificación de producción de conidios ................................................................................35 7.3.5 Dinámica del Spitzenkörper en hifas maduras de la cepa Δdnf-2 ............................................36 7.3.6 Comportamiento del citoesqueleto de actina en la mutante Δdnf-2 .......................................39
Capítulo 8. Discusión ........................................................................................................................ 41
Capítulo 9. Conclusiones ................................................................................................................... 44
Literatura citada ............................................................................................................................... 45
ix
Lista de figuras
Figura Página
1 Diagrama del sistema de asimetría de membrana…………………………………………………… 7 2 Diagrama de la estructura de la flipasa Dnf1 de S. cerevisiae………………………………….. 8 3 Diagrama de los oligonucleótidos utilizados en este estudio para amplificar los
genes dnf-1 y dnf-2…………………………………………………………………………………………………. 15 4 Esquema de los dominios de la DNF-1 y DNF-2 de Neurospora crassa…………………….. 23 5 Predicción bioinformática de la estructura tridimensional de (A) DNF-1 y (C) DNF-2,
y localización hipotética de los dominios transmembranales (B) de DNF-1 y (D) de DNF-2…………………………………………………….……………………………………………………………….. 24
6 Alineamiento de la secuencia proteica de DNF-1 y DNF-2 alineadas a la secuencia de su respectiva proteína homologa en S. cerevisiae. …………………………………………….. 24
7 Localización de DNF-2-GFP en hifas maduras. DNF-2-GFP (verde) se localiza como un punto en el centro del Spitzenkörper teñido con FM4-64 (rojo). ………………………. 26
8 Serie de tiempo de DNF-2-GFP: La cabeza de flecha denota una partícula fluorescente que se acerca al Spitzenkörper ….………………………………………………………. 27
9 Localización de DNF-2-GFP y CHS-1-mChFP en hifas maduras de N. crassa…………….. 28 10 Corroboración del genotipo de las mutantes por deleción. …………………………………… 29 11 Morfología de la colonia de las cepas Δdnf-1 y Δdnf-2 después de 12h de
crecimiento. …………………………………………………….…………………………………………………….. 30 12 Imagen del borde de la colonia de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y cepa WT…………… 31 13 Morfología de las hifas de las cepas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y la cepa WT………….. 32 14 Análisis de elongación y biomasa de las cepas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y la cepa
WT……………………………………………………….…………………………………………………………………. 33 15 Producción de hifas aéreas en mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y la cepa WT……………… 34 16 Frecuencia de ramas producidas de las mutantes Δdnf-2 y Δdnf-
1………………………….. 35 17 Producción de conidios de las cepas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2. ……………………………. 36 18 Serie de tiempo del comportamiento del Spitzenkörper teñido con FM4-64 en las
hifas de la mutante Δdnf-2. …………………………………………………….……………………………… 38 19 Trayectoria del Spitzenkörper en la cepa Δdnf-2 y WT, panel derecho corresponde
a la gráfica comparativa de la posición del Spitzenkörper de una serie de tiempo….. 39 20 Serie de tiempo de una hifa de la cepa Δdnf-2 expresando Lifeact etiquetada con
GFP teñida con FM464. …………………………………………………….……………………………………. 40
x
Lista de tablas
Tabla Página
1 Cepas utilizadas. …………………………………………………….……………………………………………….. 13
2 Plásmidos utilizados. …………………………………………………….…………………………………………. 14
3 Oligonucleótidos utilizados. …………………………………………………….………………………………. 14
4 Porcentaje de identidad entre las flipasas de N. crassa y S. cerevisiae.…………………….. 22
5 Porcentaje de identidad entre las flipasas de N. crassa y A. nidulans……………………….. 22g
6 Porcentaje de identidad entre las flipasas de S. cerevisiae y A. nidulans…………………… 22
1
Capítulo 1. Introducción
La unidad básica de los hongos filamentosos es una célula de forma tubular conocida como hifa. Al
conjunto de hifas que forman una colonia se le denomina micelio. Para que las hifas tengan forma tubular,
los hongos presentan dos estrategias de crecimiento: el crecimiento intercalar donde el material nuevo es
agregado en las laterales de la hifa a cierta distancia de la punta, este tipo de crecimiento se observa en
basidiomicetos y en el género Epichloë de ascomicetos (Jersild et al., 1967; Voisey, 2010); y el crecimiento
polarizado, que ocurre exclusivamente en el ápice y es el crecimiento que predomina en la mayoría de los
hongos filamentosos. Para que el crecimiento polarizado sea posible, es necesario un centro suministrador
de vesículas situado en el ápice de cada hifa (Bartnicki-García et al., 1989, 1995). Este centro corresponde
a un cúmulo de vesículas de diferentes tamaños y composiciones que se ha denominado Spitzenkörper
(Girbardt, 1957; Howard, 1981). Se cree que éste tiene un papel fundamental en la dirección del
crecimiento y en la morfología de las hifas (Bartnicki-García et al., 1995; Riquelme et al., 1998, 2011). Las
vesículas dentro del Spitzenkörper están divididas en dos poblaciones: una en el núcleo que corresponde
a las microvesículas que acarrean diferentes clases de quitina sintasas, mientras que en la capa que rodea
este núcleo, se localizan las macrovesículas encargadas del transporte de glucano sintasas principalmente
(Riquelme et al., 2007; Riquelme y Sánchez-León, 2014; Sánchez-León et al., 2011; Verdín et al., 2009). El
crecimiento polarizado depende de una secreción dirigida y constante de las vesículas para la extensión
de los límites de la hifa, es decir, de la membrana plasmática y la pared celular.
La ruta de secreción así como la maquinaria molecular involucrada en el crecimiento, está conservada en
hongos y animales (Ellgaard, 1999; Lord et al., 2011; Seaman, 2008). En levaduras, el material es
transportado desde el retículo endoplasmático (RE), a través de vesículas compuestas de membrana del
organelo donador donde el material transportado o cargo, puede estar embebido en la membrana o ser
acarreado en el lumen. Las vesículas se forman a partir de curvaturas de la membrana donadora, para ser
escindidas y moverse a través del citoplasma, hasta llegar a la membrana receptora del aparato de Golgi
y anclarse. El contenido de la vesícula progresa a través de las cisternas de Golgi, hasta llegar a las cisternas
trans-Golgi, donde se forman vesículas a asistidas por una cubierta de clatrina para ser transportada a su
destino final, que puede ser la membrana plasmática o la vacuola (Bonifacino y Glick, 2004; Lord et al.,
2011; Pelham y Rothman, 2000).
2
Según el modelo del mosaico fluido, la membrana celular es una bicapa de fosfolípidos dispuestos de
manera opuesta con proteínas embebidas. Este arreglo, puede desplazarse libremente de manera lateral,
sin embargo, para que los fosfolípidos o proteínas puedan atravesar la membrana, se requiere una
inversión de energía, lo cual resulta en un proceso energéticamente desfavorable poco frecuente. La
conformación de la membrana (curvatura y composición química), son factores importantes en la
biogénesis de las vesículas de transporte anterógrado y retrógrado. Las balsas lipídicas (esfingolípidos,
fosfoinosítidos y aminofosfolípidos) son regiones con una composición distinta al resto de la membrana
enriquecidas con moléculas que se aglutinan de manera autónoma y son insolubles en detergentes
(Simons y Ikonen, 1997). Se ha observado que son importantes en el tráfico vesicular y clasificación de
proteínas para su transporte. Existe evidencia que otro grupo de fosfolípidos conocidos como
aminofosfolípidos, sirven como punto de referencia para inducir la asociación de proteínas involucradas
en distintos procesos celulares; por ejemplo, la fosfatidilserina que propicia la asociación de efectores
potenciales como Rab-GTPasas o Arf-GAP (Das et al., 2012; Xu et al., 2013). En las células los
aminofosfolípidos se encuentran en concentraciones distintas en ambos lados de la membrana, generando
una asimetría, debido a la acción de proteínas translocadoras llamadas flipasas, las cuales pertenecen a la
superfamilia de ATPasas Tipo-P IV.
Se han identificado las flipasas de la levadura Saccharomyces cerevisiae y se ha descrito su localización, así
como los fenotipos de las mutantes por deleción o condicionales de cada una de estas flipasas (Alder-
Baerens et al., 2006; Catty et al., 1997; Gall et al., 2002; Hanamatsu et al., 2014; Liu et al., 2006). En hongos
filamentosos se identificaron los homólogos de las flipasas de S. cerevisiae, DnfA, DnfB, DnfC y DnfD y se
describió la localización y dinámica de DnfA y DnfB (Schultzhaus et al., 2015).
Sin embargo, no existen estudios sobre las flipasas en Neurospora crassa. En el presente trabajo se
etiquetó a la flipasa homóloga a Drs2 de S. cerevisiae utilizando la proteína fluorescente GFP. Se estudió
su localización y dinámica con la ayuda de microscopía confocal de escaneo láser, y se observó el efecto
que tiene la mutación por deleción del gen de esta flipasa (Δdnf-2) en N. crassa. Este organismo, es un
hongo filamentoso que ha sido utilizado como modelo para el crecimiento polarizado, gracias a que su
manipulación genética es relativamente sencilla, crece rápidamente y su tamaño es útil para la
microscopía, entre otras características.
3
Capítulo 2. Antecedentes
2.1 Hongos filamentosos
Los hongos son un grupo de organismos eucariotas saprófitos o descomponedores de materia muerta.
Este grupo incluye especies importantes de patógenos de plantas y animales (Sexton y Howlett, 2006;
Sharon y Shlezinger, 2013). Los hongos también son utilizados en la industria textil, alimenticia y
farmacéutica (Kashyap et al., 2001; Schmidt, 2011). Son organismos que poseen diversas morfologías y
estrategias tróficas y reproductivas. Algunos hongos tienen una morfología celular denominada hifa
(Deacon, 2005), la cual es similar a la de los pelos radiculares o los tubos de polen de las plantas, siendo
esta una de las principales características de los hongos filamentosos.
Las hifas son estructuras celulares alargadas de forma tubular que se extienden polarizadamente desde la
punta, ramificando de manera lateral ocasionalmente (Reinhardt, 1892; Riquelme, 2013). Pueden estar
segmentadas por barreras celulares transversales llamadas septos, que varían en distribución y morfología
según el phylum. Como en el caso de los hongos ascomicetos A. nidulans y N. crassa, donde los septos se
distribuyen en intervalos regulares a lo largo de la hifa (Clutterbuck, 1970; Shatkin y Tatum, 1959). Por
otro lado, existen hongos filamentosos, como los anteriormente clasificados como Zygomycota, que
tienen un micelio cenocítico (carecen de septos).
El extremo anterior de los hongos filamentosos conocido como ápice, es una terminal semielipsoidal
donde se observa una gran actividad biológica. En el organismo Mucor rouxii, demostraron con
experimentos autoradiográficos (Bartnicki-García y Lippman, 1969), que la síntesis de pared nueva en
hongos filamentosos se concentra en el ápice en un gradiente hacia las zonas más antiguas de la hifa
(Peberdy et al., 2001; Wösten et al., 1991). También se ha observado que la maquinaria asociada a la
endocitosis, se localiza en una zona llamada collar endocítico en la región subapical muy cercana al ápice
(Araujo-Bazán et al., 2008; Berepiki et al., 2010; Echauri-Espinosa et al., 2012; Peñalva, 2010).
4
2.2 Crecimiento polarizado y el Spitzenkörper
El crecimiento polarizado es a la extensión de una zona específica en la célula, al contrario del crecimiento
isotrópico, en el cual la célula se expande en todas direcciones. En la mayoría de los hongos filamentosos,
el crecimiento polarizado confiere la forma tubular a la hifa. Los hongos filamentosos crecen
polarizadamente desde el momento en el que la unidad reproductiva (espora) determina uno o más sitios
para iniciar la extensión de la célula, romper la simetría y continuar el crecimiento durante el desarrollo
vegetativo, para formar lo que se conoce como micelio. El crecimiento polarizado es promovido por un
suministro constante de vesículas, en las que se transporta material que llega al sitio de crecimiento para
formar nueva pared. La evidencia señala, que estas vesículas son transportadas desde la zona posterior
hacia el ápice de las hifas por las proteínas motoras que transitan por el citoesqueleto de microtúbulos
(McDaniel y Roberson, 2000; Mouriño-Pérez et al., 2006; Riquelme, 2013), para después ser acumuladas
en una estructura, muy cercana al ápice denominada Spitzenkörper (del alemán: Spitzen=apical,
körper=cuerpo). El Spitzenkörper, fue descrito y nombrado por primera vez en el basidiomiceto Coprinus
sp. (Brunswick, 1924) y posteriormente observado y descrito en diversas especies de hongos filamentosos
superiores (ascomicetos y basidiomicetos) (Girbardt, 1957; Grove y Bracker, 1970). Esta estructura es un
cúmulo de vesículas localizado en el domo apical. Observaciones por microscopía electrónica de
transmisión demuestran que el Spitzenkörper está integrado por estratos de distinta naturaleza en
contenido; su núcleo o centro es ocupado por un grupo de vesículas denominadas microvesículas,
ribosomas y una red entretejida de filamentos de actina. Este núcleo de microvesículas está rodeado por
una nube difusa de vesículas de mayor diámetro llamadas macrovesículas (Grove y Bracker, 1970; Harris
et al., 2005; Howard, 1981; Verdín et al., 2009). Las quitinas sintasas y glucano sintasas se han localizado
específicamente en las microvesículas y macrovesículas respectivamente (Riquelme et al., 2007; Sánchez-
León et al., 2011; Verdín et al., 2009). Lo que sugiere que el Spitzenkörper juega un papel importante en
la organización y reparto del material formador de pared celular y por tanto, también en el crecimiento
polarizado.
Según el modelo del Vesicle Supply Center (VSC) o centro suministrador de vesículas, el Spitzenkörper
actúa como un nodo central de abasto, donde las vesículas y su contenido son acumulados y redistribuidos
en todas direcciones, mientras éste se desplaza junto con el ápice manteniendo una estrecha relación el
uno con el otro (Bartnicki-García et al., 1989). En los ápices de las hifas maduras y en sus ramificaciones,
el Spitzenkörper rige la dirección y velocidad del crecimiento polarizado (Girbardt, 1957; Reynaga-Peña et
5
al., 1997; Riquelme et al., 1998). Las hifas de cepas con mutaciones o creciendo bajo estrés físico presentan
un Spitzenkörper inestable, lo que se ha relacionado con un crecimiento polarizado deficiente (Girbardt,
1957; Reynaga-Peña et al., 1997). Adicionalmente, por medio del uso de pinzas láser, se ha demostrado
que la posición del Spitzenkörper en el ápice, dicta la dirección del crecimiento polarizado (Bracker y Lopez-
Franco, 1997; Wright et al., 2007). De acuerdo a toda la evidencia, se ha establecido al Spitzenkörper como
uno de los orquestadores centrales de esta forma de crecimiento.
2.3 Proceso de secreción y membrana plasmática.
2.3.1 Proceso de secreción
En la llamada ruta clásica de secreción descrita en S. cerevisiae, las proteínas son sintetizadas y
translocadas al retículo endoplasmático (RE). Algunas quedan en el lumen y otras embebidas en la
membrana plasmática. Desde el RE, ambos grupos de proteínas son transportados hacia las cisternas del
aparato de Golgi, a través de vesículas compuestas de membrana del RE con las proteínas embebidas y su
contenido. Las vesículas se originan de la membrana donadora por la curvatura producida por las proteínas
de cubierta COPII, Sar1+GTP, Sec23+Sec24 y Sec13+Sec31 (Bonifacino y Glick, 2004). Una vez formadas,
las vesículas se separan de la membrana del RE y se mueven a través del citoplasma hasta llegar al aparato
de Golgi. La vesícula es anclada a la membrana del aparato de Golgi, por las proteínas Uso1 y Ypt1 y se
fusiona a través de la SNARE Sec22 (Lord et al., 2011). En el aparato de Golgi, nuevamente se forman
vesículas con la intervención de la cubierta del complejo COPI, para trasladar entre sus cisternas, el
contenido del lumen así como la carga de la membrana (Pelham y Rothman, 2000). Finalmente, las cargas
son transportadas de las cisternas trans-Golgi a su destino final en la membrana plasmática/exterior de la
célula o a la vacuola, a través de vesículas que utilizan una cubierta de clatrina para ser escindidas de
aparato de Golgi.
2.3.2 Topología de membrana
El direccionamiento del tráfico vesicular, así como la clasificación de proteínas transportadas son
importantes en el crecimiento polarizado, ya que este depende de la correcta localización de los materiales
necesarios para la extensión del ápice en hongos filamentosos. Se ha identificado la importancia de la
6
composición de la membrana plasmática en zonas específicas, como la existencia de regiones definidas de
membrana, formadas por una población químicamente distinta al resto, como es el caso de las balsas
lipídicas (Simons y Ikonen, 1997), que son importantes en las funciones de tráfico y clasificación de
proteínas. El fosfatidilinositol 4,5-fosfato, es necesario para la clasificación de tráfico vacuolar en S.
cerevisiae, por medio de la fosfatidilinositol 3-fosfato cinasa, Vps34 (Schu et al., 1993). La SNX1 (sorting
nexin-1) en mamíferos, reconoce los 3-fosfoinosítidos como punto de anclaje, lo que propicia la formación
de vesículas para la endocitosis de receptores de membrana (Carlton et al., 2004).
Recientemente, se ha demostrado que otras poblaciones de fosfolípidos, como los aminofosfolípidos,
pueden también servir como punto de referencia para inducir la asociación de proteínas que
desencadenarán distintos procesos celulares. La presencia de un aminofosfolípido, la fosfatidilserina (PS),
promueve la asociación de la ArfGAP Gcs1 a la membrana, por medio de su dominio APSL+ (Xu et al., 2013).
La fosfatidilserina también induce la asociación de la GTPasa Cdc42 a la membrana, al competir con su
inhibidor de disociación de nucleótido de guanina (Das et al., 2012). Los aminofosfolípidos, son fosfolípidos
formados por ácidos grasos, una molécula de glicerol que conecta el ácido graso a un grupo amino o amida,
y su distribución en la membrana depende de su translocación a través de la misma por medio de proteínas
transmembranales. El movimiento de los fosfolípidos de una cara de la membrana a la otra, es un proceso
energéticamente desfavorable, que implica vencer las fuerzas que mantienen a las moléculas hidrofílicas
separadas de la matriz hidrofóbica, lo cual lo hace un evento poco frecuente; sin embargo, en seres vivos
las membranas presentan una composición desigual entre ambas caras. El índice de translocación de
fosfatidilcolina en vesículas, es de 0.017 µmol/(cm2/s) (Kornberg y McConnell, 1971). Aun así, este
transporte aleatorio es suficiente para equilibrar la composición de ambos lados de la membrana, en
ausencia de la actividad de las proteínas responsables de la asimetría. Las proteínas que realizan este
transporte, pertenecen a distintas familias de proteínas y cada una tiene una función específica: Las
ATPasas de la familia Tipo-P IV transportan fosfolípidos de la cara exterior de la membrana a la cara
citosólica y son conocidas como flipasas (Figura 1). Una familia de transportadores ABC (del inglés ATP
Binding Cassette), las flopasas, produce el transporte contrario, de una subpoblación de aminofosfolípidos,
y por último, las escramblasas que permiten el transporte a favor del gradiente de concentración y no
utilizan energía para su función (Figura 1).
7
Figura 1. Diagrama de las proteínas del sistema de asimetría de membrana.
2.5 Flipasas
Las flipasas son proteínas transmembranales clasificadas en la superfamilia de proteínas ATPasas tipo P,
de la subclase IV (Tang et al., 1996). La mayoría está formada por una subunidad catalítica (α) y una
subunidad no catalítica (β). Su papel como translocadoras selectivas de fosfolípidos, fue descubierta por
primera vez en eritrocitos de humano (Seigneuret y Devaux, 1984) y más tarde fueron propiamente
descritas en S. cerevisiae (Catty et al., 1997; Tang et al., 1996). Las flipasas son transportadas desde el RE
a los organelos de la vía secretora y endocítica y a la membrana plasmática. La subunidad catalítica α de
estas proteínas, está formada por un dominio actuador (A), un dominio de fosforilación (P), y un dominio
de unión a nucleótido (N) (Figura 2). En el dominio A, ocurre el cambio de conformación, mientras que en
el dominio P, es donde se encuentra el motivo de fosforilación DKTGTLT. Finalmente, el dominio N está
formado por 6-11 estructuras α-hélices transmembranales, y es el lugar en donde se posiciona el ATP. Los
segmentos transmembranales 3 y 4 (en algunos casos también los segmentos 5 y 6) forman un canal polar,
por donde se transporta la cabeza polar del fosfolípido; el residuo hidrofóbico se reorienta en la matriz
lipídica de la membrana y nunca se expone al exterior. El sitio que reconoce el sustrato, fosfatidilserina o
8
fosfatidiletanolamina, se conforma por la región citosólica que se encuentra entre los dominios
transmembranales 3 y 4 (Baldridge y Graham, 2012; Bublitz et al., 2011; Palmgren y Nissen, 2011).
Figura 2. Diagrama de la estructura de la flipasa Dnf1 de S. cerevisiae (A: dominio actuador, P: dominio de fosforilación, N: dominio de unión a nucleótido) (Modificado de Baldridge R., 2012).
En animales se han detectado consistentemente, proteínas pertenecientes a la familia de las flipasas, en
humanos se han identificados 14 flipasas, en ratón 15 y en Caenorhabditis elegans 12. La actividad de las
flipasas, se ha vinculado a distintos procesos celulares, en el nemátodo C. elegans es necesaria la
translocación de fosfatidilserina por su flipasa TAT-1 y su respectiva subunidad CHAT-1, para la formación
de dominios tubulares en los endosomas, para la regulación del tráfico del material entre estos y la
membrana plasmática. Además, el correcto reciclaje de GLUT-4, importador de glucosa, depende de la
formación de estos subdominios tubulares en los endosomas, para ser reciclado a la membrana plasmática
9
correctamente. En mamíferos se ha observado, en eritrocitos, que la perdida de la asimetría de membrana
o bien la acumulación de fosfatidilserina en el exterior de la membrana plasmática, es un señalizador
importante en la formación de coágulos, además de ser una señal de apoptosis y la eliminación de la célula
por macrófagos (Fadeel y Xue, 2009).
2.5.1 Flipasas en hongos
En S. cerevisiae se han identificado 5 flipasas, Dnf1 y Dnf2, con su subunidad no-catalítica Lem3, Drs2 con
su subunidad no-catalítica Cdc50, Dnf3 con su subunidad no-catalítica Crf1, y Neo1 que carece de una
subunidad adicional. Desde que se descubrió su papel como translocadoras de aminofosfolípidos, se han
vinculado con funciones dependientes del tráfico vesicular. Mutantes por deleción de drs2 son deficientes
en la producción de vesículas dirigidas a la membrana (Gall et al., 2002). La asimetría de membrana
producida por Drs2 es necesaria para la entrega correcta del factor alfa a la membrana plasmática (Sartorel
et al., 2015). Esto puede deberse a defectos en la formación de subdominios de la membrana del
endosoma, que propician la clasificación de proteínas de membrana, ya sea en la ruta clásica de Rcy1
dependiente de clatrina o por una ruta alternativa independiente de clatrina (Gall et al., 2002; Hanamatsu
et al., 2014; Hankins et al., 2015).
En el hongo filamentoso A. nidulans, se ha observado que las flipasas DnfA y DnfB se encuentran
localizadas en la región apical del hongo, principalmente en el Spitzenkörper, además de algunos organelos
(Schultzhaus et al., 2015). Las mutantes por deleción de DnfA y DnfB tienen un crecimiento deficiente y
una tasa de conidiación baja. Existe la posibilidad de que los fenotipos deficientes presentes en las
mutantes de las flipasas, sean consecuencia de la pérdida en la asimetría de los fosfolípidos en la
membrana plasmática, así como en la membrana de organelos. Sin embargo, hace falta información sobre
estas proteínas, su localización y sus efectos en el crecimiento de hongos filamentosos, para determinar
su importancia en el crecimiento polarizado.
10
Capítulo 3. Justificación
Las flipasas tienen un papel importante en la creación de asimetría entre las capas de las diferentes
membranas celulares, con el propósito de establecer señales para las diferentes cargas y destinos de las
vesículas que son secretadas o endocitadas en las células. Por ejemplo, en C. elegans se ha identificado
que la asimetría de membrana generada por las flipasas, está involucrada en el reconocimiento de sitos
de endocitosis (Chen et al., 2010). Por otro lado, en S. cerevisiae, hay evidencia de que las flipasas están
implicadas en el crecimiento polarizado durante la formación del shmoo, en la respuesta hormonal de
apareamiento y durante la gemación, así como, en la generación y clasificación de vesículas en el tráfico
vesicular (Hankins et al., 2015; Hua, 2002; Saito et al., 2004; Sartorel et al., 2015;). En el hongo filamentoso
A. nidulans se ha encontrado que cada flipasa pertenece a distintas poblaciones de vesículas, que tienen
una localización diferente en el Spitzenkörper (Schultzhaus et al., 2015). Sin embargo no se ha podido
establecer cuál es el papel que estas proteínas tienen en el tráfico de membranas y su impacto en el
crecimiento polarizado y organización celular de hongos filamentosos.
11
Capítulo 4. Hipótesis
• La flipasa DNF-2 se transporta hacia la membrana plasmática, a través de vesículas secretoras para
localizarse en la región apical y subapical.
• La deleción de dnf-2 tendrá repercusiones sobre el crecimiento polarizado de N. crassa.
12
Capítulo 5. Objetivos
5.1 Objetivo general
Evaluar la dinámica de la flipasa de fosfolípidos DNF-2 y su papel en el crecimiento polarizado de
Neurospora crassa.
5.2 Objetivos específicos
Determinar la localización y dinámica de la flipasa de fosfolípidos DNF-2.
Determinar el efecto que tienen las mutaciones por deleción de los genes dnf-2 y dnf-1 sobre el
crecimiento polarizado.
13
Capítulo 6. Metodología
6.1 Cepas y plásmidos utilizados
Se utilizaron las cepas descritas en la siguiente tabla:
Tabla 1. Cepas uti lizadas
Escherichia coli
DH5αTM™ M F- Ф80ΔlacZΔM15 Δ(lacZYA–argF) U169recA1 endA1 hsdR17 -+ (r, m) PhoA supE44 λ-thi-1 Kk gyrA96 relA1
Invitrogen™
Neurospora crassa
WT mat a, tipo WT FGSC #4200
9717 mat A, Δmus-51::bar+; his-3- FGSC #9717
Δdnf-2 mat a, Δdnf-2 FGSC #16377
Δdnf-1* mat a Δdnf-1, Δmus-51 FGSC #11620
Δdnf-1 mat a Δdnf-1, Δmus-51 Este estudio
Δdnf-2, his-3 mat a, Δdnf-2, his-3 Este estudio
Δdnf-2, L. Act::sGFP* mat a, Δdnf-2, Lifeact::sgfp Este estudio
TJV12-1a mat A; chs-1::mchfp+::hph+ (Verdín et al., 2009)
dnf-2::sgfp* mat A, dnf-2::sgfp Este estudio *Cepa en estado heterocarión.
Se obtuvieron conidios de la cepa WT y de las cepas mutantes Δdnf-2 y Δdnf-1. Se prepararon soluciones
de conidios con una concentración de 2.59 x 106 conidios/ ml para cada cepa, las cuales fueron utilizadas
para experimentos posteriores.
Se utilizaron los plásmidos descritos en la siguiente tabla:
14
Tabla 2. Plásmidos utilizados
Plasmido Genotipo Fuente
pMF272 Pccg-1::sgfp+ Freitag, M., et al 2004
pGEM®-T Easy Vector Vector de clonación Promega Corporation
pGEM®-T Easy Vector + dnf-2 pGEM(dnf-2) Este estudio
pRM49 Pccg-1::Lifeact::sgfp+ Delgado-Álvarez et al., 2010
pRM84 Pccg-1::dnf-2::sgfp+ Este estudio Todos los plásmidos fueron almacenados en buffer EB del kit de Extracción de Gel (Qiagen N.V.)
Los oligonucleótidos fueron diseñados a partir de las secuencias de interés de los genes encontrados en la
base de datos de fungiDB (Gottlieb et al., 2016) y analizados en OligoAnalizer 3.1 (Integrated DNA
Technologies®) para predecir y evitar estructuras secundarias, heterómeros y otras estructuras no
deseadas. Posteriormente, los oligonucleótidos fueron sintetizados por IDT (Integrated DNA
Technologies®) y el liofilizado recibido fue disuelto Buffer EB de Qiagen N.V. a una concentración de 200
mM (20X) (Figura 3).
Los oligonucleótidos utilizados se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados
Oligonucleotido Secuencia Características
dnf-1 ORF3’ For TCCTCATGGGTGTCTT GGATC
Oligonucleótido que hibrida a aproximadamente 1100 bases del codón de paro del gen con anotación NCU07443.
dnf-1 (PacI) Rev CCTTAATTAATTGTTGA CTATCCCGCCTTTCGTC
Oligonucleótido que hibrida justo antes del codón de paro del gen con anotación NCU07443, además agrega un sitio de restricción PacI.
dnf-2 ORF3’ For CCATATTGGTGTCGGT ATCAGC
Oligonucleótido que hibrida a aproximadamente 1100 bases del codón de paro del gen con anotación NCU00352.
(SpeI) dnf-2 For GGACTAGTATGGCGGC TGGCCGCC
Oligonucleótido que hibrida en el inicio del gen con anotación NCU00352 además de agregar un sitio de restricción SpeI.
dnf-2 (PacI) Rev CCTTAATTAATTGATTCG GTCTTGAACTGGCCATC
Oligonucleótido que hibrida justo antes del codón de paro del gen con anotación NCU00, además agrega un sitio de restricción PacI.
15
Figura 3. Diagrama de los oligonucleótidos utilizados en este estudio para amplificar los genes dnf-1 y dnf-2.
6.2 Medios de cultivo
Para crecer N. crassa, se utilizó el Medio Mínimo de Vogel (MMV) preparado a partir de una solución 50X
de sales de Vogel que contienen 250 g/L de fosfato de potasio monobásico monohidratado (KH2PO4·H2O),
125 g/L de citrato de sodio dihidratado (Na3C6H5O7·2H2O), 100 g/L de nitrato de amonio (NH4NO3), 5 g/L
de sulfato de magnesio anhidro (MgSO4), 3.8 g/L cloruro de calcio (CaCl2), 5 mL de solución de elementos
traza, 0.25 g/L de Biotina y 15 g/L de sacarosa como fuente de carbono (Vogel, 1956). Para solidificar el
medio se agregó 15 g/L de agar a la solución de MMV antes de esterilizar. Los medios para cultivos con
requerimiento de histidina, fueron preparados agregando 2 ml de una solución de almacenamiento,
esterilizada previamente por filtración con un filtro de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0.2
µm, a una concentración de 25 mg/ml en 50 ml de MMV agar o líquido ya estéril, dependiendo de lo
requerido. Los medios de selección de resistencia a Higromicina B fueron preparados de una manera
similar agregando 150 µL de una solución de almacenamiento a una concentración de 50 mg/ml en 50 ml
de medio MMV ya estéril.
Para inducir la fase sexual y realizar las cruzas de cepas con distintos tipos de apareamiento se utilizó el
Medio Sintético de Cruzas (MSC), utilizando sales sintéticas de cruza 2X (SSC) las cuales contienen 0.1% de
16
KH2PO4, 0.2% de nitrato de potasio (KNO3), 0.14% de fosfato de potasio dibásico (K2H2PO4), 0.2% de sulfato
de magnesio heptahidratado (MgSO4·7H2O), 0.02% de cloruro de sodio (NaCl) y 0.02% de cloruro de calcio
(CaCl), 0.5% de sacarosa como fuente de carbono y 2% de agar (Westergaard y Mitchell, 1947). Para hacer
la selección de conidios transformados de N. crassa, se utilizó el medio de FGS, preparado con agar al 1.5%,
sales de Vogel y como fuente de carbono una mezcla de carbohidratos preparados en un stock 10X: 20 g
de sorbosa, 0.5 g de glucosa y 5 g de fructosa en 200 ml de agua destilada, la cual es posteriormente
esterilizada por filtración y agregada al medio con agar justo antes de utilizarse.
Escherichia coli fue cultivada en medio LB: triptona (BactoTM tryptone) 1%, extracto de levadura (BactoTM
yeast extract) 0.5%, y cloruro de sodio (NaCl) 1% agregando agar al 2% para los medios sólidos. Para las
selecciones de transformantes se agregó ampicilina a una concentración de 100 µg/ml.
6.3 Cuantificación de la tasa de elongación
Se midió por triplicado la tasa de elongación de las cepas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y la cepa WT. Para esto
se prepararon cajas de Petri de 160 mm con 50 mL de MMV-solidificado con agar al 1.5%. Después se
inocularon con una suspensión de conidios de 15 μL a una concentración de 2.59x106 conidios/mL (38,850
conidios) en la periferia de la caja. Posteriormente se marcó la circunferencia de la colonia cada 3 h durante
42 h. El primer registro se realizó a las 18 h después de la inoculación. Cuando el micelio de la cepa WT
llegó al borde de la caja, estas fueron fotografiadas con una cámara D3100 de Nikon, con un lente DX SWM
VR asférica ∞ - 028m/0.92ftØ52 montada en un tripie. La distancia de crecimiento de cada marca fue
cuantificada en el software Piximètre 5.9 R1520, calibrado con una regla graduada en milímetros.
6.4 Morfología de colonia y borde de la colonia
Para observar las características de las colonias, se inocularon 5 µL de la solución de conidios en el centro
de una caja Petri de 100 mm de diámetro con MMV y se incubó durante 12 h a 30°C. Una vez concluido el
periodo de incubación, las cajas fueron fotografiadas. El borde de la colonia se observó después de 18 h
de incubación a 30°C, utilizando un estereoscopio SZX12 (Olympus®) con una cámara DP70 (Olympus®) en
el software DPManager v1.1.1.71 OLUMPUS OPTYCAL CO, calibrado con una regla graduada en milímetros.
Las observaciones fueron realizadas en el borde de la colonia durante no más de 20 min por colonia para
17
minimizar los efectos del cambio de temperatura y la exposición a la luz. Las fotografías de la colonia
fueron tomadas con una cámara D3100 de Nikon, con un lente DX SWM VR asférica ∞ - 028m/0.92ftØ52
montada en un tripie. La distancia de crecimiento de cada marca fue cuantificada en el software Piximètre
5.9 R1520, calibrado con una regla graduada en milímetros.
6.5 Cuantificación de producción de conidios
Para obtener una comparación de la producción de conidios entre la cepa WT y las cepas Δdnf-2 y Δdnf-
1, se sembraron 15 μL de solución conidios [2.59 x 106 conidios/mL] en matraces de 250 mL con 50 mL
de MMV-Agar 1.5%, lo más cercano posible a la parte media del agar. Se incubaron en obscuridad a 30°C
durante 24 h y posteriormente a 25°C en luz blanca durante 72 h. Los conidios fueron recuperados
utilizando embudos con filtros de tela (Corporación Magitel, C.A.), primero lavando el micelio del cultivo
con 50 mL de sorbitol estéril al 1 M agitando vigorosamente y posteriormente, pasando la solución por
el filtro y centrifugando a 5,000 rpm por 5 min. El sobrenadante fue cuidadosamente retirado por pipeteo
y el precipitado fue enjuagado con 30 mL de agua destilada estéril, para después ser nuevamente
centrifugado a 5,000 rpm por 5 min para retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla de conidios en
2 mL de sorbitol estéril al 1 M. Por último, se tomaron 10 µL de cada muestra para ser diluidas 1:10 y
contadas en cámara de Neubauer, cada repetición por duplicado.
6.6 Cuantificación de frecuencia de ramificación
Para el conteo de ramificaciones, se inocularon 15 µL de solución de conidios a una concentración de 2.59
x 106 conidios/ml en un extremo de la caja y se incubaron durante 18 h a 30°C. Después los bordes fueron
observados al estereoscopio a una amplificación de 90X y se obtuvieron imágenes para análisis
posteriores. Como en los ensayos de observación de morfología del borde de colonia, las muestras eran
observadas durante no más de 20 min para minimizar el efecto de la exposición a condiciones ambientales.
La tasa de ramificación se obtuvo, realizando conteos de las hifas de las cepas WT (n=69), Δdnf-2 (n=88) y
Δdnf-1 (n=96), contando las ramas de cada hifa en los primeros 500 µm desde el ápice hacía la región
posterior de la hifa. Los 500 µm fueron determinados utilizando el programa Piximètre 5.9 R1520 calibrado
con la escala proporcionada por el software del estereoscopio SZX12 (Olympus®).
18
6.7 Cuantificación de producción de biomasa
Para la medición de biomasa se agregaron 45 µL de solución de conidios [2.59 x 106 conidios/ml] de la cepa
WT como control y las cepas mutantes Δdnf-2 y Δdnf-1 en 100 ml de MMV líquido, por triplicado y se
incubaron a 30°C por 48 h en oscuridad. Posteriormente, fueron filtrados por vacío en filtros (Whatman®)
#1 de 90 mm de diámetro (previamente pesados) en un embudo Büchner acoplado a un matraz Kitasato
y una bomba de vacío y secados posteriormente. Las muestras fueron secadas a 60°C durante 2 h y fueron
pesadas inmediatamente (al peso obtenido se sustrajo de la masa del filtro previamente obtenida).
6.8 Cruzas
Para obtener la mutante homocarión de la cepa Δdnf-1 y la mutante auxotrófica de histidina de Δdnf-2, se
procedió a realizar cruzas inoculando uno de los pares de cepas en una caja de Petri de 60 mm con MSC y
posteriormente se incubó a 30°C durante 2 días (d). Después se agregaron gotas de una suspensión
concentrada de los conidios del tipo de apareamiento complementario y se incubó a 25°C en oscuridad;
una vez transcurridas 3 semanas se recuperaron las ascosporas adheridas a la tapa de la caja de Petri con
agua destilada estéril. Las alícuotas con las ascosporas en agua estéril, fueron dejadas a temperatura
ambiente durante 5 d. Transcurrido este periodo, las alícuotas se extendieron en una placa de MMV
selectivo (conteniendo higromicina) y fueron activadas por calor a 60°C durante 1 h y después incubadas
a 30°C durante 5h. La placa fue observada cada hora al estereoscopio en busca de ascosporas germinadas.
Las colonias fueron cortadas y transferidas a tubos con medio selectivo. Para identificar las cepas his-3-
(auxótrofas de histidina), se inoculó un fragmento de micelio de las colonias resultantes de una sola
ascospora, en placas con MMV+histidina y placas con MMV. Se observó el crecimiento de cada colonia y
se clasificaron las colonias carentes de crecimiento en placas con MMV como cepas his-3-. La
corroboración del genotipo fue realizada mediante la extracción de DNA genómico y amplificando por PCR
con los oligonucleótidos dnf-1 ORF’3 For, dnf-1(PacI) Rev para la cepa Δdnf-1 y dnf-2 ORF’3 For, dnf-2(PacI)
para la cepa Δdnf-2.
19
6.9 Etiquetamiento de DNF-2 con GFP
El marcaje de DNF-2 con GFP, se realizó amplificando el marco abierto de lectura del DNA genómico de la
cepa WT, utilizando los oligonucleótidos (SpeI) dnf-2 For y dnf-2 (PacI) Rev, que añaden los sitios de
restricción SpeI y PacI al inicio y final del amplicón respectivamente, y se utilizó el plásmido pMF272
(Freitag et al. 2004). El plásmido y el inserto fueron digeridos con las enzimas de restricción SpeI y PacI
(New England Biolabs ® Inc.) durante 12 h en una doble digestión para después ser ligados con la DNA
Ligasa T4 (New England Biolabs ® Inc.) durante 18 h a una temperatura de 16°C, en una reacción con una
relación 1:3 (vector:inserto). Tras la reacción de ligación, se transformaron células químicamente
competentes de E. coli DH5αTM™ (InvitrogenTM) por el método de shock térmico; se mezclaron 10 µL de la
reacción de ligación con 50 µL de células frescas y se incubaron en hielo durante 1 h, después de la
incubación las células se pusieron a 42°C por un minuto e inmediatamente se pusieron en hielo.
Posteriormente, fueron incubadas durante 1 h en medio LB líquido a 37°C y se sembraron en placas de
agar con medio selectivo LB con ampicilina y se incubaron durante 14 h a 37°C. Las colonias resultantes
fueron transferidas a medio LB con ampicilina y de los cultivos resultantes se extrajo el plásmido según el
protocolo de lisis alcalina del Molecular Cloning A Laboratory Manual (Sambrook y Russell, 2006). Los
plásmidos fueron corroborados, utilizando las enzimas de restricción correspondientes a los sitios
agregados por los oligonucleótidos, incubando una alícuota durante 12 h a 37°C. Una vez obtenida la
corroboración del plásmido deseado, se transformó la cepa de N. crassa FGSC#9717 agregando 20 µL de
solución del plásmido a una concentración de 500 ng/µL y 90 µL de una solución de conidios frescos
(sorbitol 1 M). La mezcla fue incubada en hielo durante 30 min y posteriormente sometida a un shock
eléctrico para inducir transformación por electroporación bajo las condiciones: Voltaje 1500 V,
Capacitancia: 25 µF, Resistencia 600 ohm en el electroporador Gene Pulser XcellTM (Bio-Rad Laboratories,
Inc.) en una cubeta de electroporación con pozo de 2 mm de ancho. Tras la electroporación,
inmediatamente se agregó 1 mL de Sorbitol 1M estéril, se extendieron los conidios en placas de medio
FGS y se incubaron a 30°C durante 4 d. Las colonias resultantes fueron aisladas en tubos de cultivo con
MMV y se cribaron en el microscopio confocal de escaneo láser en busca de patrones de fluorescencia.
6.10 Medición de producción de hifas aéreas
La producción de hifas aéreas se comparó por duplicado preparando tubos de cultivo de 10 mm de
diámetro x 75 mm de alto (VWR®) con 1.5 mL de MMV, agregando 5 µL de solución de conidios en el
20
centro del agar e incubando durante 48 h a 30°C. Pasado el periodo de incubación, los cultivos fueron
fotografiados y las imágenes obtenidas fueron procesadas para alinearlas en el software Adobe®
Photoshop ® CS6 (Versión 13.0). Finalmente las fotografías fueron analizadas en el programa Piximètre 5.9
R1520 calibrado con una regla graduada en milímetros.
6.11 Microscopía confocal de escaneo láser
Toda la microscopía confocal se realizó utilizando el microscopio confocal Olympus FluoVieWTM FV1000
(Olympus, Japan). Se usó un objetivo UPlanFLN de una amplificación de 60X N.A. 1.42 de inmersión de
aceite. Como fuente de luz se utilizó un láser de Argón, para las muestras etiquetadas con la proteína
fluorescente GFP y un láser de Helio-Neón para las muestras teñidas con FM4-64 (FM® Lipophilic Styryl
Dyes) o etiquetadas con mCherry. Las cepas fueron inoculadas en medio MMV 1.5% y puestas a crecer
durante 12 h para la WT, 20 h para la cepa mutante Δdnf-2, y 40 h para la cepa Δdnf-1. Posteriormente,
las muestras se prepararon siguiendo el método del bloque de agar invertido (Hickey et al., 2004): 1)
cortando un rectángulo cerca del borde de la colonia de aproximadamente 1cm x 4cm, 2) colocando el
agar con micelio boca abajo y dejándolo caer suavemente sobre un cubreobjetos VWR® Micro Cover
Glasses, Rectangular No. 1 ½, 3) permitiendo un tiempo de recuperación mínimo de 30 min. Para las
observaciones con el marcador lipofílico N-(3-triethilamoniompropil)-4-(6-[4-dietilaminofenil] hexatrienil)
dibromuro de piridinio (FM4-64) se colocaron 10 µL del fluoróforo a una concentración de 5 µM en el
cubreobjetos previo a la colocación del bloque de agar.
21
Capítulo 7. Resultados
7.1 Análisis bioinformático de DNF-1 y DNF-2
Para estudiar los translocadores de fosfolípidos en N. crassa, hizo una búsqueda bioinformática de las
secuencias codificantes de las proteínas de interés en el organismo de estudio. Se realizó un Blast a nivel
de secuencia de aminoácidos de las proteínas correspondientes a los genes dnfA y dnfB de A. nidulans y
de dnf1 y drs2 de S. cerevisiae, y se identificaron sus homólogos correspondientes en N. crassa. Para
dnfA/dnf1 se identificó el gen NCU07443, cuya secuencia proteica tiene un porcentaje de identidad de
43%, comparada con Dnf1 de S. cerevisiae y de 52% comparada con DnfA de A. nidulans. Para dnfB/drs2,
se identificó el gen NCU00352, cuya secuencia proteica tiene un porcentaje de identidad de 50%
comparada con Drs2 de S. cerevisiae y 69% comparada con A. nidulans.(Tabla 4, 5 y 6). De acuerdo a la
nomenclatura para N. crassa, los genes fueron nombrados dnf-1 y dnf-2 respectivamente. En las tablas 4,
5 y 6, se muestra además, la comparación de las proteínas correspondientes a dnf2, dnf3 y neo1 de S.
cerevisiae, de dnfC y dnfD de A. nidulans y la comparación entre los genes que codifican para las flipasas
en S. cerevisiae y A. nidulans, con la finalidad de mostrar el panorama completo de las flipasas en N. crasa,
aunque para este estudio solo se tomaron en cuanta dnf-1 y dnf-2.
Tabla 4 Porcentaje de identidad entre las fl ipasas de N. crassa y S. cerevisiae
Neurospora crassa
Sacc
ha
rom
yces
cer
evis
iae
Dnf-1 NCU07443
Dnf-2 NCU00352
Dnf-3 NCU03592
Dnf-4 NCU03818
Dnf1 YER166W
42.976% 26.418% 23.714% 20.035%
Dnf2 YDR093W
42.46% 26.937% 23.532% 18.75%
Dnf3 YMR162C
22.347% 22.161% 30.534% 18.681%
Drs2 YAL026C
25.919% 49.895% 23.549% 21.287%
Neo1 YIL048W
19.219% 24.275% 18.521% 46.086%
22
Tabla 5 Porcentaje de identidad entre las fl ipasas de N. crassa y A. nidulans.
Neurospora crassa A
sper
gill
us
nid
ula
ns
Dnf-1 NCU07443
Dnf-2 NCU00352
Dnf-3 NCU03592
Dnf-4 NCU03818
DnfA AN8672
52.665% 25.09% 22.65% 19.365%
DnfB AN6112
25.512% 68.736% 23.98% 23.572%
DnfC AN2011
21.157% 24.887% 40.603% 18.385%
DnfD AN6614
18.366% 22.724% 17.448% 59.21%
Tabla 6 Porcentaje de identidad entre las fl ipasas de S. cerevisiae y A. nidulans.
Aspergillus nidulans
S. c
erev
isia
e
DnfA AN8672
DnfB AN6112
DnfC AN2011
DnfD AN6614
Dnf1 YER166W
44.7% 27.9% 22.7% 19.1%
Dnf2 YDR093W
43.7% 27.4% 22.7% 19.4%
Dnf3 YMR162C
23.0% 23.0% 36.7% 18.7%
Drs2 YAL026C
27.2% 52.3% 25.4% 21.6%
Neo1 YIL048W
20.266% 24.466% 18.928% 46.172%
Una vez identificados los genes, se modeló la estructura a nivel de proteína. En primer lugar se buscó la
predicción de dominios, encontrando que DNF-1 tiene 1,562 aminoácidos, con un dominio de hidrolasa,
nueve dominios transmembranales y siete motivos de unión a sitios de endocitosis NPFxD (Figura 4). Por
otra parte, DNF-2 tiene 1,360 aminoácidos, presentando el mismo dominio de hidrolasa, siete dominios
transmembranales, 11 motivos de unión a sitios de endocitosis NPFxD y adicionalmente, tres dominios
SH3 de interacción proteína-proteína (Figura 4).
23
Figura 4. Esquema de los dominios de la DNF-1 y DNF-2 de Neurospora crassa. Los dominios naranjas corresponden a la hidrolasa, los verdes a dominios transmembranales, los azules son motivos de unión a sitios de endocitosis y los rojos corresponden a dominios SH3 de interacción proteína-proteína.
Además se realizó la modelación tridimensional de las proteínas con el software POV-Ray 3.7 para
Windows. En la Figura 5, se observan ambas estructuras y la localización de los dominios
transmembranales.
24
Figura 5. Predicción bioinformática de la estructura tridimensional de (A) DNF-1 y (C) DNF-2, y localización hipotética de los dominios transmembranales (B) de DNF-1 y (D) de DNF-2. Modelos elaborados con POV-Ray 3.7 para Windows.
Para corroborar la especificidad en el sustrato (tipo de fosfolípidos) para cada una de las flipasas DNF-1 y
DNF-2, se compararon sus secuencias proteicas con sus homólogos en S. cerevisiae, Dnf1 y Drs2 (Figura
6). Las secuencias de los sitios responsables de la especificidad de la flipasa descritos por Baldridge y
Graham (2012) fueron alineadas utilizando la herramienta de alineamiento de UniProt (EMBL-EBI, PIR, y
SIB, 2016).
Figura 6. Alineamiento de la secuencia proteica de DNF-1 y DNF-2 alineadas a la secuencia de su respectiva proteína homologa en S. cerevisiae.: Los recuadros rojos señala los aminoácidos involucrados en la especificidad del fosfolípido translocado por la flipasa.
25
El porcentaje de identidad entre DNF-1 y Dnf1 en las regiones correspondientes a la especificidad de
sustrato (TM3-LL3-4-TM4) fue de 40%, el aminoácido triptófano en la posición W618 está sustituido en
DNF-1 por tirosina. DNF-2 y Drs2 mostraron un porcentaje de identidad de 61.1% en las regiones
involucradas en su especificad, una fenilalanina en la posición 574 es la que le confiere el reconocimiento
de un fosfolípido específico.
7.2 Localización de DNF-2-GFP
7.2.1 Localización de DNF-2-GFP en hifas maduras
Para conocer la distribución y dinámica de la proteína DNF-2 en hifas maduras de N. crassa, se observó en
el microscopio confocal láser una cepa que expresaba la proteína etiquetada con GFP. La DNF-2-GFP se
observó como un punto fluorescente en la región central del Spitzenkörper (Figura 7). En la figura 7 se
muestra como DNF-2-GFP ocupa la región del núcleo del Spitzenkörper teñido con FM4-64.
Adicionalmente, se observaron algunos puntos difusos en el citoplasma que no colocalizan con el FM4-64.
Estos puntos fluorescentes de DNF-2-GFP se mueven hacia la zona apical y se fusionan con la acumulación
en el ápice (Figura 7-8; cabeza de flecha).
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Figura 7. Localización de DNF-2-GFP en hifas maduras. DNF-2-GFP (verde) se localiza como un punto en el centro del Spitzenkörper teñido con FM4-64 (rojo). Ocasionalmente se observan puntos de fluorescencia (cabezas de flecha) en el subápice que no colocalizan con el FM4-64. Barra de escala: 10µm.
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Figura 8. Serie de tiempo de DNF-2-GFP: La cabeza de flecha denota una partícula fluorescente que se acerca al Spitzenkörper.(m:s) Barra de escala 10µm
7.2.2 Localización de DNF-2-GFP y CHS-1-mChFP
Con el antecedente de A. nidulans, donde encontraron que DnfB se observa en la región del Spitzenkörper
donde se acumulan las microvesículas, se llevó a cabo un experimento de coexpresión de DNF-2-GFP y la
proteína quitina sintasa-1, CHS-1 etiquetada con mChFP. Se observó que tanto la DNF-2-GFP como la CHS-
1-mChFP colocalizan en el ápice de la hifa (Figura 9). Sin embargo, no en todas las vesículas que viajan
hacia el Spitzenkörper se ve la señal fluorescente de ambas proteínas. La CHS-1-mChFP se observa en los
septos, pero la DNF-2-GFP no se localiza ahí.
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Figura 9. Localización de DNF-2-GFP y CHS-1-mChFP en hifas maduras de N. crassa. (A)DNF-2-GFP, CHS-1-mCHFP y el traslape de ambas. (B) Gráfica de la intensidad de fluorescencia de la región marcada con puntos discontinuos, que muestra que ambas señales se encuentran colocalizando, el panel inferior, muestra un acercamiento de la región subapical que hace evidente la colocalización en el ápice de las hifas maduras. Barra de escala: 10µm.
29
7.3 Fenotipo de las mutantes por deleción de los genes dnf-1 y dnf-2.
Para determinar el efecto de la deleción de los genes dnf-1 y dnf-2 en la morfología y crecimiento de N.
crassa, se observaron las colonias de las mutantes y se evaluó la morfología colonial e hifal, así como la
tasa de elongación vegetativa, la producción de biomasa, la formación de ramificaciones y producción de
conidios.
7.3.1 Corroboración de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2
Se obtuvieron mutantes heterocariones de los genes dnf-1 y dnf-2 del Fungal Genetics Stock Center. Se
hicieron cruzas con una cepa WT mat A y la mutante Δdnf-1 mat a (het) y las cepas FGSC #9717 y Δdnf-2.
Se obtuvieron 5 ascosporas viables de la cruza WTxΔdnf-1, de las cuales solo una creció en el tubo de
cultivo. De la cruza FGSC #9717xΔdnf-2 se obtuvieron 9 ascosporas viables, de las cuales solo una fue
auxótrofa de histidina. Las cepas obtenidas se sometieron a corroboración por PCR. Se obtuvo el DNA de
las cepas WT, WTxΔdnf-1 y FGSC #9717xΔdnf-2. Se llevó a cabo una PCR con oligonucleótidos específicos
para amplificar el fragmento de los últimos 1100~pares de base del marco abierto de lectura de los genes
dnf-1 y dnf-2. Se confirmó la ausencia de amplicones de dnf-1 y dnf-2 en las mutantes respectivas, solo en
el control positivo se observó la banda correspondiente a los genes (Figura 10). Para corroborar la calidad
del DNA de las cepas mutantes, se amplificó como control el marco abierto de lectura del gen tea-2.
Figura 10. Corroboración del genotipo de las mutantes por deleción
30
7.3.1 Morfología de las colonias y las hifas de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2
La morfología de la colonia, se estableció mediante la observación del micelio después de 12 a 24 h de
incubación. En la cepa mutante de Δdnf-1, se observaron colonias planas y de menor densidad a diferencia
de las de la cepa WT (Figura 11). Las colonias de Δdnf-2 fueron más elevadas y con una mayor densidad de
hifas a diferencias de cepa WT y de la cepa mutante Δdnf-1 (Figura 11 y 12).
Figura 11. Morfología de la colonia de las cepas Δdnf-1 y Δdnf-2 después de 12h de crecimiento.
31
Figura 12. Imagen del borde de la colonia de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y cepa WT. Barra de escala = 100 µm
La morfología de las hifas maduras de las colonias mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 también se comparó con la
cepa WT. Las hifas de la mutante Δdnf-1 tuvieron un menor diámetro (7.4±0.7 µm) que la cepa silvestre
(10.6±0.4 µm), y presentaron un perfil crenulado, producido por la dificultad que tiene esta mutante para
mantener la dirección de crecimiento (Figura 13). La mutante Δdnf-2 presentó hifas con un diámetro
similar al de la cepa WT (11.39±0.38 µm), sin embargo, al igual que la mutante Δdnf-1, mostró problemas
para mantener la dirección de crecimiento, por lo que se produjeron hifas con abultamientos (Figura 13).
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Figura 13. Morfología de las hifas de las cepas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y la cepa WT. A diferencias de las hifas de la cepa WT y de la mutante Δdnf-2, las hifas de la cepa mutante Δdnf-1 tienen un menor diámetro y un con dificultad para mantener la dirección de crecimiento, mientras que las de la cepa mutante Δdnf-2 tenían un diámetro parecido al de cepa WT y presentaban periodos de crecimiento isotrópico y polarizado, con eventos de perdida de la dirección. (m:s) Barra de escala: 10 µm.
7.3.2 Tasa de elongación y crecimiento de las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 en N. crassa.
El crecimiento de Δdnf-1 y Δdnf-2 de N. crassa estuvo disminuido. La tasa de elongación vegetativa de las
hifas de ambas cepas, Δdnf-1 y Δdnf-2, fue significativamente menor que la de la cepa WT. La mutante
Δdnf-1 presentó un crecimiento del 30.6% (1.2 mm/h) con respecto a la cepa WT (Figura 14A y 14B),
mientras que en la mutante Δdnf-2, la tasa de elongación fue el 57.7% (2.3 mm/h) con respecto a la cepa
WT (Figura 14A y 14B). En la producción de biomasa, hubo una reducción más drástica en la mutante Δdnf-
1, que solo presentó el 11.2% de crecimiento con respecto a la cepa WT (Figura 14C), sin embargo, la
mutante Δdnf-2 no estuvo significativamente afectada (94.1%) (Figura 14C).
33
Figura 14. Análisis de elongación y biomasa de las cepas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y la cepa WT. (A) Grafica de la tasa de elongación durante 42h de crecimiento. (B) Índice de elongación de las cepas mutantes y la cepa WT. En ambos casos, las cepas mutantes crecen menos que la cepa WT.(N=3) (C) Biomasa producida después de 24 h de crecimiento. Se observa que la cepa mutante Δdnf-1 produce menos biomasa que la cepa WT. Por el contrario, en la cepa mutante Δdnf-2 no se observó una diferencia significativa en la producción de biomasa con respecto a la cepa WT (N=5). Barras de error muestran el error estándar.
7.3.3 Formación de ramificaciones en las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 de N. crassa.
Debido a que el micelio de ambas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 tenía un relieve y densidad diferente, se
evaluó cuantitativamente la producción de hifas aéreas y de formación de ramificaciones. Ambas
mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 produjeron hifas aéreas de tamaño significativamente menor comparado con la
cepa WT, 62.0% y 74.2%, respectivamente. Comparando ambas mutantes, se observó que entre ellas
también hubo una diferencia significativa, siendo la mutante Δdnf-1 la que presentó menor producción de
hifas aéreas (Figura 15).
34
Figura 15. Producción de hifas aéreas en mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2 y la cepa WT. Barra de error representan el error estándar. En ambos casos, la producción de hifas aéreas fue menor comparado con las de la cepa WT. Las barras de error representan el intervalo de confianza al 95%.(N=3)
Por otro lado, se cuantificó la producción de ramificaciones, en la cepa mutante Δdnf-1, las ramificaciones
fueron principalmente laterales. Mientras que en la mutante Δdnf-2, las ramificaciones se formaban en el
ápice con una frecuencia de cuatro ramas en 500 µm, lo que representa el doble de ramificaciones de las
que produjeron la cepa WT y la mutante Δdnf-1 (Figura 16).
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Figura 16. Frecuencia de ramas producidas de las mutantes Δdnf-2 y Δdnf-1. (A) Frecuencia absoluta de hifas principales con un número determinado de ramificaciones. (B) Promedio de ramificaciones. Barras de error = Intervalo de confianza al 95%.
7.3.4 Cuantificación de producción de conidios
Para conocer si la eliminación de los genes Δdnf-1 y Δdnf-2 causaba defectos en la reproducción asexual,
se evaluó la producción de conidios. Se encontró que las cepas con la mutación Δdnf-1 producían
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únicamente 3.9% conidios con respecto a la WT, mientras que la cepa mutante Δdnf-2 producía el 49.8%
(Figura 17).
Figura 17. Producción de conidios de las cepas mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2. Las barras de error representan el intervalo de confianza al 95%.
7.3.5 Dinámica del Spitzenkörper en hifas maduras de la cepa Δdnf-2
Para conocer con mayor detalle el efecto de la eliminación del gen dnf-2 en el crecimiento polarizado, se
evaluó el comportamiento del Spitzenkörper teñido con el fluoróforo FM4-64. Se observó que el
Spitzenkörper no seguía una trayectoria constante, continuamente se movía hacia un lado o hacia el otro
en el domo apical, incluyendo en el eje z (Figura 18). También se observó que el Spitzenkörper se
37
desensamblaba, y se recuperaba en dos o más sitios de donde continuaba creciendo la hifa,
posteriormente las fracciones del Spitzenkörper se volvían a concentrar en un solo punto y se recuperaba
el crecimiento apical, estos eventos ocurrían intermitentemente, por lo que se producían hifas con
protuberancias anormales (Figura 18). En los casos en los que no se volvían a unir las fracciones del
Spitzenkörper, se generaron ramificaciones apicales (Figura 18). En la figura 19 se muestra un traslape
cuadro por cuadro de la posición del Spitzenkörper en la mutante Δdnf-2 y la cepa silvestre, donde se hace
evidente como se divide y se vuelve a unir produciendo cambios de crecimiento isotrópico y crecimiento
polarizado intercalados.
Figura 18. Serie de tiempo del comportamiento del Spitzenkörper teñido con FM4-64 en las hifas de la mutante Δdnf-2. El movimiento del Spitzenkörper es irregular (flechas) moviéndose de manera lateral. En algunas ocasiones se observa que se forma más de un Spitzenkörper a partir de uno inicial (B y C), los cuales se fusionan (D) y se vuelven a separar (E) para finalmente formar hifas individuales a partir de cada uno (F). (m:s) Barra de escala: 10 µm.
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Figura 19. Trayectoria del Spitzenkörper en la cepa Δdnf-2 y WT. El panel izquierdo corresponde a un traslape de cuadro por cuadro de una serie de tiempo en color falso de hifas teñidas con FM464, Barra de escala = 10 µm. El panel derecho corresponde a la gráfica comparativa de la trayectoria del Spitzenkörper de una serie de tiempo. Cuadrante = 2µm.
39
7.3.6 Comportamiento del citoesqueleto de actina en la mutante Δdnf-2
Al observar la inestabilidad del Spitzenkörper teñido con FM4-64, se realizó un experimento para observar
la organización y dinámica del citoesqueleto de actina en la mutante Δdnf-2. Para esto se produjo una cepa
con la deleción del gen dnf-2 que expresara la proteína quimérica Lifeact-GFP, que es un marcador general
de la F-actina. En la figura 20 se muestra una serie de tiempo donde se observa como la F-actina se
encuentra en el Spitzenkörper en la región central pero más escasa que en la WT (ver Delgado-Álvarez et
al., 2010). Esta acumulación varía a través del tiempo, se ve que va disminuyendo la señal fluorescente, lo
que puede significar que el citoesqueleto de actina en esta zona se está desensamblando para
posteriormente volverse a ensamblar. Adicionalmente, se observó la actina forma el collar endocítico a
una distancia constante del domo apical pero que abarca hasta la región basal de la hifa (Figura 20).
40
Figura 20. Serie de tiempo de una hifa de la cepa Δdnf-2 expresando Lifeact etiquetada con GFP teñida con FM464. Barra de escala = 10 µm.
41
Capítulo 8. Discusión
En hongos filamentosos hay información amplia aunque no suficiente, sobre la maquinaria de secreción y
el sistema de tráfico vesicular, así como de la maquinaria de polaridad. Sin embargo, se conoce poco sobre
el mecanismo de organización vesicular en el Spitzenkörper. Además no existen estudios que expliquen
un mecanismo por el cual se establece la estratificación en las poblaciones de vesículas del Spitzenkörper
(Riquelme, 2013; Verdín et al., 2009), una probable explicación es la posibilidad de que las poblaciones de
vesículas están identificadas por la composición y topología de la membrana que las forma. Las flipasas
son proteínas candidatas para efectuar este tipo de “etiquetamiento”, ya que teóricamente una flipasa
puede modificar cualitativa y cuantitativamente la distribución de aminofosfolípidos de la superficie de
una vesícula.
Saccharomyces cerevisiae cuenta con cinco flipasas y tres subunidades regulatorias; los ortólogos Dnf1 y
Dnf2 con la subunidad Lem3, Dnf3 con la subunidad Crf1, Drs2 con la subunidad Cdc50 y Neo1 (Catty et
al., 1997; Hua, 2002). Drs2 es una flipasa translocadora de fosfatidilserina y a menor grado
fosfatidiletanolamina, requiere de la subunidad no catalítica Cdc50 para su actividad y salida del retículo
endoplásmico, se localiza en los endosomas y en la red trans-Golgi circulando entre estos organelos y la
membrana plasmática (Graham, 2004; Natarajan et al., 2004; Saito et al., 2004; Sartorel et al., 2015). Su
actividad como translocador de fosfatidilserina se ha relacionado con el tráfico y la organización de
proteínas a través de la red trans-Golgi y los endosomas. El hongo filamentoso N. crassa tiene cuatro
flipasas de fosfolípidos; NCU07443 que corresponde al homólogo de Dnf1 y Dnf2, NCU00352 homólogo
de Drs2, NCU03593 homólogo de Dnf3, y NCU03818 homologo a Neo1. En este estudio se examinaron las
mutantes por deleción de genes correspondientes de las flipasas NCU07443 y NCU00352, denominadas
como DNF-1 y DNF-2 respectivamente, para determinar su papel en el crecimiento polarizado, además de
utilizar etiquetado por proteínas fluorescentes para conocer la localización y su dinámica de la proteína
DNF-2.
El índice de identidad demostrado y la similitud en el sitio de especificidad (Baldridge y Graham, 2012)
sugieren que tanto DNF-1 como DNF-2 tienen los mismos sustratos que sus homólogos en S. cerevisiae,
fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina para DNF-1, y fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina para DNF-2.
42
La tirosina en la posición 620 de Dnf1 es reemplazada por un triptófano en el amino ácido en la posición
620 de DNF-1, ambos aminoácidos cuentan con un residuo hidrofóbico de gran tamaño que de igual
manera sugiere una similitud en la especificidad de sustrato entre los homólogos de la flipasa, sin embargo,
la tirosina presenta un grupo hidroxilo, que propiciaría la interacción con grupos anicónicos como el de la
fosfatidilserina.
Un aspecto interesante de este grupo de proteínas es la presencia del motivo NPFxD de endocitosis, que
fue encontrado por primera vez en levaduras, como parte de proteínas residentes del Golgi, que
aparentemente son endocitadas mediante este motivo (Tan, Howard, y Payne, 1996). NPFxD está presente
tanto en DNF-1 como DNF-2 al igual que en Dnf1 y Drs2 de S. cereivisiae (Liu et al., 2006) y en DnfA y DnfB
de A. nidulans (Schultzhaus et al., 2015). En organismos como Penicillium spp está ausente. Aunque P4-
ATPasas están relativamente conservadas en eucariotas, solo uno de todos los motivos está presente en
hongos. Por ejemplo, aunque dos secuencia NPFxD están presentes en Drs2 en levaduras, su deleción no
resulta en un cambio observable en su localización (Liu et al., 2006). En este estudio, no se evaluó el efecto
de la ausencia del motivo NPFxD en las mutaciones en DNF-1 y DNF-2 en la endocitosis directamente, sin
embargo, la internalización del colorante FM4-64, es prueba de que la endocitosis se está llevando a cabo
en estas mutantes, por lo que este aspecto tendrá que seguir estudiándose.
La deleción de DNF-1 tuvo un efecto severo en las hifas, tanto en el crecimiento como en la formación de
conidios, esto podría ser explicado por el papel que tiene esta proteína en la secreción. El decremento en
la tasa de crecimiento puede deberse a que hay una alteración en el tráfico vesicular, debido a que por la
distribución alterada de aminofosfolípidos, las vesículas no llegan a su destino para ser exocitadas y liberar
su contenido. Asimismo, la reducción dramática de la producción de conidios puede ser el resultado de un
proceso similar, en el que la falta de secreción impida su formación (Alder-Baerens et al., 2006; Balhadère
y Talbot, 2001). En Magnaporthe oryzae, el homólogo de DNF-1 es esencial para la patogenicidad
(Balhadère y Talbot, 2001; Gilbert et al., 2006). Estas mutantes son deficientes en la formación del
apresorio y la penetración del hospedero (Balhadère y Talbot, 2001) muy probablemente por los
problemas en la secreción de vesículas.
En la mutante de DNF-2 de N. crassa se observó un patrón errático en la dirección del Spitzenkörper, por
lo que se decidió observar el efecto de la mutación de esta proteína en el citoesqueleto de actina que es
el soporte principal de esta estructura. Al observar la actina con el reportero general Lifeact-GFP, se
43
observó que hay una desorganización intermitente de este citoesqueleto en el núcleo del Spitzenkörper
pero no una desaparición completa de la nube de vesículas, esto sugiere que la ausencia de los filamentos
de actina afecta fundamentalmente la organización de las microvesículas, y que de alguna manera, la falta
de asimetría de membrana genera inestabilidad del citoesqueleto de actina. En S. cerevisiae, Arf-GAP Gcs1,
involucrada en la formación de vesículas, presenta un motivo el cual se asocia a la fosfatidilserina, la
mutante por deleción del gen correspondiente a Gcs1 presenta un fenotipo similar a la mutante de dnf-2
en cuanto a la organización de la actina (Blader et al., 1999; Xu et al., 2013).
El Spitzenkörper es una estructura dinámica compuesta de muchas vesículas que han sido agrupadas en
al menos dos clases, un grupo de pequeñas vesículas o microvesículas que se encuentra en el centro del
Spitzenkörper, y otro de vesículas de mayor tamaño que rodean a las primeras formando la capa externa
de esta estructura (Grove y Bracker, 1970; Howard, 1981; Lopez-Franco y Bracker, 1996; Verdín et al.,
2009). En A. nidulans, DnfA ha sido localizada en la capa más externa del Spitzenkörper. En N. crassa, DNF-
2 se localizó al igual que DnfB de A. nidulans en la región central del Spitzenkörper. Aunque las levaduras
de gemación no tienen esta estructura, hay cierta analogía en que hay dos rutas secretoras reguladas por
dos flipasas distintas y que transportan cargos a diferentes destinos (Harsay y Bretscher, 1995). Estas
flipasas son la Drs2p y Dnf3p (Alder-Baerens et al., 2006; Gall et al., 2002). En N. crassa se demostró que
las microvesículas que contienen la flipasa DNF-2, colocalizan con las microvesículas que contienen la
quitina sintasa CHS-1. Y aunque en este organismo no se ha podido observar, en A. nidulans, DnfA está
asociada en las macrovesículas que colocalizan con Gs-1 que es un componente de la 1,3 β-glucano sintasa.
Esta separación espacial y funcional sugiere que la colección de vesículas en el Spitzenkörper no es un
evento al azar, sino un proceso altamente regulado de secreción y crecimiento. Considerando los hallazgos
en A. nidulans de DnfA y DnfB (Schultzhaus et al., 2015) y los de DNF-2 en este trabajo, se puede decir que
tienen un papel complementario en el soporte del crecimiento polarizado a través de diferentes tipos de
vesículas.
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Capítulo 9. Conclusiones
La similitud en el sitio de especificidad sugieren que el sustrato de DNF-1 es fosfatidilcolina y
fosfatidiletanolamina y para DNF-2 fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina.
La tirosina en la posición 620 de Dnf1 es reemplazada por un triptófano en el amino ácido en la
posición 620 de DNF-1.
El motivo NPFxD de endocitosis está presente tanto en DNF-1 como DNF-2.
DNF-2 se localiza exclusivamente en el núcleo del Spitzenkörper en las membranas de las
microvesículas.
DNF-2 se transporta de manera anterógrada desde regiones anteriores al subápice.
DNF-2 colocaliza con vesículas que acarrean la quitina sintasa 1 CHS-1
DNF-2 participa en la estratificación del Spitzenkörper modificando la composición fosfolipídica de la
superficie de las vesículas.
La mutación dnf-1 y dnf-2 tiene un severo efecto en el crecimiento vegetativo y producción de hifas
aéreas.
La mutación dnf-1 y dnf-2 afecta la reproducción sexual.
La endocitosis no se ve notoriamente afectada en las mutantes Δdnf-1 y Δdnf-2
La ausencia de DNF-2 desestabiliza el Spitzenkörper afectando el crecimiento polarizado y su dirección.
DNF-2 está involucrada en la estabilidad del citoesqueleto de actina en el Spitzenkörper, en ausencia
de esta el citoesqueleto de actina presenta eventos de inestabilidad.
45
Literatura citada
Alder-Baerens, N., Lisman, Q., Luong, L., Pomorski, T., y Holthuis, J. C. M. (2006). Loss of P4 ATPases Drs2p and Dnf3p disrupts aminophospholipid transport and asymmetry in yeast post-Golgi secretory vesicles. Molecular Biology of the Cell, 17(4), 1632–42. https://doi.org/10.1091/mbc.E05-10-0912
Araujo-Bazán, L., Peñalva, M. A., y Espeso, E. A. (2008). Preferential localization of the endocytic internalization machinery to hyphal tips underlies polarization of the actin cytoskeleton in Aspergillus nidulans. Molecular Microbiology, 67(4), 891–905. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.06102.x
Baldridge, R. D., y Graham, T. R. (2012). Identification of residues defining phospholipid flippase substrate specificity of type IV P-type ATPases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(6), E290–E298. https://doi.org/10.1073/pnas.1115725109
Balhadère, P. V, y Talbot, N. J. (2001). PDE1 encodes a P-type ATPase involved in appressorium-mediated plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe grisea. The Plant Cell, 13(9), 1987–2004. https://doi.org/10.1105/TPC.010056
Bartnicki-García, S., Bartnicki, D. D., y Gierz, G. (1995). Determinants of fungal cell wall morphology: the vesicle supply center. Canadian Journal of Botany, 73(S1), 372–378. https://doi.org/10.1139/b95-271
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