LP BTH Generala 2014-2015

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

1/31

Lucrarea practica nr. 1

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR UTILIZATE N PROCESELEBIOTEHNOLOGICE

Mediul de cultur reprezint un complex de substane organice i anorganice ce constituiesuportul nutritiv sterilizat necesar cultivrii microorganismelor n afara niei lor ecologice naturale.

Un mediu de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:- s fie nutritiv, s conin toate substanele necesare ntreinerii, dezvoltrii i multiplicri

microorganismelor- s fie steril- s aib p-ul optim microorganismului pe care dorim s-l cultivm- s satisfac aerofilia microorganismului cultivat

Mediile de cultur prezint o mare importan n procesele biote!nologice, ele influen"nd direcreproductibilitatea i eficiena te!nologiei aplicate.

#le permit studierea la nivel de laborator a particularitilor morfologice, fiziologice, genetice de biosintez a microorganismelor de cultivate.

Mediile de cultur utilizate n biote!nologie sunt diferite, av"nd n compoziie elemente specificefiecarui tip de microorganism.

1. Clasificarea e!iil"r !e c#l$#r%

Mediile de cultur pot fi clasificate n funcie de mai multe criterii.a$ %up natura substanelor nutritive care intr n compoziia lor:

- naturale- sintetice

b$ %up spectrul lor de activitate:- uzuale, pentru izolare i ntreinerea microorganismelor- selective, pentru selecia microorganismelor

c$ %up consisten:- lic!ide, pentru mbogirea culturilor microbiene, pentru studiul proprietilor bioc!imice

modificrilor asupra substratul lic!id- solide, pentru izolarea microorganismelor i pentru studiul caracterelor coloniilor- semisolide, favorizeaz migrarea microorganismelor n mediu pentru diferenierea ntr

speciid$ %up tipul respirator al microorganismelor cultivate:

- pentru microorganisme aerobe- pentru microorganisme anaerobe

e$ %up scopul i frecvena ntrebuinrii:- curente- de mbogire- de conservare- de identificare

- de bioprocessf$ %up de numrul ingredientelor pe care le conin i n funcie de scop:

- minimale- complexe

g$ &n funcie de scara la care sunt folosite:- de laborator, sunt medii complete, relativ simple care permit obinerea unei biomase

microbiene corespunztoare

- ' -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

2/31

- industriale, sunt medii ieftine, ce asigur necesitile nutriionale ale microorganismelocultivate i producerea compuilor dorii( utilizarea lor permite obinerea de produse finale la un prede cost convenabil

&. C"'"(i)ia e!iil"r !e c#l$#r%

Mediile de cultur utilizate n biote!nologie conin n principal:- surs de carbon i energie- surs de azot- oligoelemente- microelemente- factori de cretere )!ormoni, steroizi$

Surse de carbon

&n ma*oritatea proceselor biote!nologice, principala surs de carbon o constituie glucidele. &nmediile de cultur naturale, sursele de carbon sunt reprezentate de monoglucide )glucoz, fructoz$ saudiglucide )maltoz, za!aroz, lactoz$, fie sub form de substane pure, fie furnizate de produseagroalimentare ca melasa, siropul de glucoz, fina de porumb, zerul de lapte, deeuri celulozice.

+entru obinerea unui mediu de cultur, sursa de carbon se prepar sub forma unei soluii deconcentraie cunoscut, astfel nc"t dup reunire cu celelalte componente ale mediului de culturconcentraia sursei de carbon n mediu s corespund valorii indicate n te!nologie.

Surse de azot

ursa de azot necesar preparrii unui mediu de cultur este reprezentat fie de substaneorganice sau anorganice simple ca amoniacul, ureea, sulfatul de amoniu, fosfatul de amoniu, fie deproduse naturale, ce conin aminoacizi sau proteine cum sunt fina de soia, peptona, extractul de carneextractul de porumb, extractul de dro*die.

ubstana reprezent"nd sursa de azot se c"ntrete la balana te!nic, se dizolv n cantitateminim n ap, se sterilizeaz, iar dup rcire se amestec cu celelalte componente ale mediului decultur.

Oligoelemente i microelemente

osforul, potasiul, sodiul, sulful i magneziul sunt elemente de baz pentru microorganisme, frde care nu pot exista. #le sunt furnizate din srurile minerale care se introduc n mediul de cultur.

Microelemente ca fier, cupru, cobalt, mangan, zinc i molibden sunt de asemenea eseniale, fiindde regul prezente n mediu sub form de impuriti existente n alte ingrediente ale mediului.

rurile minerale componente ale mediului de cultur se c"ntresc i se dizolv separat n apapoi se reunesc i se sterilizeaz conform protocolului indicat n reeta de lucru.

*. Re+#li +e,erale !e 're'arare a e!iil"r !e c#l$#r%

&n general, exist dou variante de preparare a mediilor de cultur:a$ c"ntrirea i dizolvarea pe r"nd a substanelor indicate n reet, ntr-o cantitate minim de ap

completarea cu ap p"n la volumul dorit i apoi sterilizarea mediului de culturb$ c"ntrirea, dizolvarea i sterilizarea separat a ingredientelor indicate n reeta de lucru, urmat

de reunirea lor n condiii asepticeea de-a doua variant prezint avanta*ul c elimin eventuale interaciuni ce pot s apar ntre

diferite componente din mediu n timpul operaiei de sterilizare termic. %e exemplu, n timpusterilizrii prin autoclavare a sursei de carbon, reprezentat de glucide i a sursei de azot, reprezentat deaminoacizi, au loc reacii Maillard, cu formarea unor produi denumii /melanoide0 care au efecin!ibitor asupra microorganismelor.

+entru prepararea mediilor de cultur utilizate n biote!nologie, se parcurg urmtoarele operaii:- pregtirea i c"ntrirea ingredientelor

- 1 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

3/31

- dizolvarea substanelor, de obicei la rece, ntr-o cantitate de ap distilat mai mic dec"volumul total de mediu preparat

- verificarea i a*ustarea p-ului cu a*utorul unor soluii alcaline de 2a3 sau 24, sau soluiacide de l sau acid lactic, dup caz. Msurarea p-ului se efectueaz cu a*utorul !"rtiilorindicatoare p sau cu p-metru

- filtrarea, pe !"rtie de filtru )daca este cazul$- completarea cu ap distilat la volumul final- topirea agarului, pentru mediile solide, prin fiebere 45 min sau autoclavare )5,6 atm$- repartizarea mediilor lic!ide, n recipiente de diverse capaciti, n funcie de necesit

)eprubete, flacoane #rlenme7er, sticle$- sterilizarea mediilor, de regul '6-15 min, la '1'5 pentru mediile care nu conin glucide, ia

cele cu glucide '6-15 min, la ''65, pentru a evita caramelizarea lor- controlul sterilitii mediilor, prin incubare timp de 18 ore, la temperatura la care urmez s

se incubeze mediul de cultur- adugarea eventualelor substanelor termosensibile sterilizate separat prin alte metode- stocarea mediilor, la 8-95, nu mai mult de 8 sptm"ni

Exemple de medii de cultur

ulion nutritiv- #xtract de carne

- +epton- lorur de sodiu- ;p distilatp, sterilizare '155, 15 min

5,4?

5,6?5,6?

'555 ml

@eloz nutritiv- ulion nutritiv- ;gar

p, sterilizare '155, 15 min

'555 ml',6-1,5?

Mediu A+@ - solid- @lucoza 1?- +eptona 1?- #xtract de dro*dii '?- ;gar 1? (- p < >

- 4 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

4/31


-ERMENTAIA LACTIC

+rin fermentaie lactic se nelege procesul biologic prin care n urma degradrii unui mediu decultur rezult ca produs principal acidul lactic.

ermentaia lactic are numeroase aplicaii practice n domenii diferite cum sunt:- industria alimentar, la conservarea crnii, petelui, legumelor, la prepararea erbetului

dulceurilor, ca acidifiant pentru sucuri i siropuri, la prepararea laptelui acru, a iaurtului i a altorproduse lactate, la obinerea unor buturi din cereale i a unor specii de bere

- zoote!nie, la conservarea i nsilozarea nutreurilor- medicin, ca antiseptic- industria c!imic, ca mordant la colorarea i imprimarea textilelor- n industria pielriei

@lucoza ructoza-difosfat

;lde!ida 4-fosfoglicerica)1 molecule$

;cid 4-fosfogliceric )1 molecule$

+iruvat Bactat

1 ;C+ 1 ;%+

2;%D2;%11 ;%+

1 ;C+

Calea e$a/"lic% !e f"rare a aci!#l#i lac$ic 0+lic"li(a

Principiul metodeiMateriile prime de natur amidonoas sau za!aroas din fermentatoare sunt nsm"nate cu

culturi selecionate de Lactobacillus delbrueckii, pentru amidon, glucoz, melase, Lactobacillusbulgaricus, pentru zer sauLactobacillus plantarum, pentru leii bisulfitice. %up 9-'5 zile de incubare l86-655, E5-E9? din materia prim este transformat n acid lactic. +e msur ce se formeaz, acidu

lactic este neutralizat cu a)3$1

astfel nc"t, produsul final obinut este lactatul de calciu. ;cidul lacticeste separat din lactatul de calciu prin tratare cu 138form"ndu-se astfel a38 care precipit i poatfi separat prin filtrare. oluia de acid lactic se concentreaz prin evaporare n vid p"n la 65-95? dinvolumul iniial, dup care se purific.

='13= 1 4F 3 F 33 glucoz acid lactic )-!idroxipropionic$

1 4F 3 F 33 D a34 )4F 3 F 33$1a D 31D 13acid lactic lactat de calciu

)4F 3 F 33$1a D 138 1 4F 3 F 33 D a38G lactat de calciu acid lactic

Pre'ararea i,"c#l#l#iacteriile folosite pentru fermentaia lactic difer n funcie de materia prim utilizat i de

temperatura de incubare. Bactobacili folosii sunt rezisteni la aciditate i foarte activi n producereaacidului lactic:

- Lactobacillus bulgaricus

- Lactobacillus casei

- 8 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

5/31

- Lactobacillus delbrueckii

- Lactobacillus leichamanni

- Streptococcus lactis

ateriale necesare!

- tulpini de bacterii lactice- ans, eprubete sterile, pipete sterile- ap distilat sau ser fiziologic sterile- bec de gaz

od de lucru!e introduc 6 ml de ap distilat sau ser fiziologic peste o cultur vegetativ de bacterii lactice

se omogenizeaz bine. uspensia obinut va fi folosit ca inocul pentru nsm"narea baloanelor cumediu de fermentaie

&nainte de nsm"nare se verific microscopic puritatea inoculului.

-ere,$a)ia la flac"a,e+rocesul de fermentaie decurge cu rezultate bune ntr-un mediu cu materii amidonoase

za!arificate i cu aciditate mic )p < 6,6$.

aterii prime i materiale!

- glucoz, )28$1+38, pepton, a34- flacoane #rlenme7er de '55 ml-

pa!are erzelius de 655 ml- pipete sterile- cilindru gradat- !"rtie de p- termostat

od de lucru!e prepar '55 ml mediul de cultur cu urmtoarea compoziie:

- glucoz '5?

- )28$1+38 5,'?-

pepton 5,6?- a34 '?

p < 6,6%up c"ntrire i dizolvare mediul se repartizez n flacoane #rlenma7er de '55 ml, c"te 65

mlHflacon i se sterilizeaz la ''55, 15 minute. %up rcire, n fiecare flacon se adaug steril c"te 1 minocul de bacterii lactice pregtite anterior. lacoanele se incubeaz >1 de ore la 815.

1. 2aria)ia 'arae$ril"r /i"c3iici 'e 'arc#rs#l fere,$a)iei lac$ice

1.1. Determinarea consumului de glucoz pe parcursul fermentaiei lactice

%ezvoltarea microorganismelor este influenat de variaiile concentraiei de substrat. %in acesmotiv, n mediile de biosintez se determin i se urmrete pe tot parcursul bioprocesului, concentraiasursei de carbon.

&n cazul n care sursa de carbon a unui mediu de biosintez este constituit din glucideconcentraia acestora se determin prin metoda Schoorl sau prin metoda "ertrand, bazate pe reacie!ling sau prin metoda enzimatic. Menionm c primele dou metode, nu ofer un grad de precizifoarte ridicat, astfel nc"t, atunci c"nd se dorete un control riguros al concentraiei sursei de carbon peparcursul bioprocesului, se aplic alte metode.

- 6 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

6/31

&n probele colectate pe parcursul biosintezei, se determin concentraia glucozei, dup care setraseaz curba de variaie a glucozei pe parcursul fermentaiei, nscriind pe abscis timpul defermentaie, iar pe ordonat concentraia n glucoz.

DETERMINAREA GLUCIDELOR REDUCTOARE PRIN METODA SCHOORL

Principiul metodei

&n mediul alcalin, la cald, glucidele reductoare reduc complexul cuprotartric, format prinamestecarea soluiilor e!ling I i e!ling II, p"n la oxid cupros )u13$, precipitat rou crmiziu@ruparea alde!idic se oxideaz la carboxil.

oluia de sulfat de cupru i sarea eignette, n exces de !idroxid de sodiu, poart numele desolu#ie $ehling. %e obicei, aceasta se prepar n momentul ntrebuinrii prin amestecarea a dou soluide baz, n cantiti egale:

- soluia$ehling %, soluie cupric: u38x 613- soluia$ehling %%, soluie bazic: 2a3 D tartrat dublu de 2a i J )sare eignette$

2a3 .u)3$1 2a1,38

3 . .33J

13.u

.u,38 D D

.u)3$1 D

.332a.3 3 . .332a

.33J.3

D

Cartrat de sodiu si potasiu

),are ,eignette$

.omplex cuprotartric

);lbastru inc!is$

omplexul cuprotartric format oxideaz funciunea alde!idic a glucidului reductor )glucoza$el reduc"ndu-se la oxid cupros. antitatea de oxid cupros este proporional cu cantitatea de glucoz dinmediul de reacie.

K 3 13 u1333J

332a1 uD 1

3

3

D D D1 K 33

3

3

332a

33J1

;ldozaomplex cuprotartric

)albastru inc!is$

are eignette;cid organic

&n metoda c!oorl, restul de u)3$1 care nu a fost redus se aciduleaz cu 138transform"ndu-se din nou n u38i I1care se titreaz cu tiosulfat de sodiu.

.u)3$1 1,38 .u,38 13

JI J1,38 .u1,38 I1

2a1,134 2a1,83=amidon

D D 1

1 D 1 D.u,38 D

I1 1 2aI DD

Ba titrare, se utilizeaz ca indicator o soluie de amidon care formeaz cu iodul un compu

colorat n albastru nc!is. %up titrare, soluia devine alb.&eacti'i necesari!- soluie e!ling I- soluie e!ling II- soluie 138 16?- soluie JI 15?- soluie amidon '?

od de lucru:- = -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

7/31

e preleveaz '5 ml din mediul de fermentaie i se filtreaz pe !"rtie de filtru. %in proba filtratse iau n lucru dup cum urmeaz:

- n primele 89 de ore de fermentaie )glucoza variaz ntre '1-6?$ F 5,6 ml- ntre 89-E= ore de fermentaie )glucoza variaz ntre 6-5?$ F ' ml&ntr-un flacon #rlenme7er de 655 ml, se pipeteaz '5 ml soluie e!ling I i '5 ml soluie

e!ling II, 15 ml ap distilat i 5,6 ml H ' ml prob. e nclzete la flacr potrivit, pe o sit de azbestastfel nc"t soluia s a*ung la fierbere n aproximativ 4 minute, dup care se menine la fierbere 1minute. %easupra flaconului se aeaz o p"lnie se sticl pentru condensarea vaporilor de ap. e rcetecu ap curent, dup care adaug '5 ml soluie 13816? i '5 ml JI 15?.

oluia obinut se titreaz sub agitare cu soluie de tiosulfat de sodiu 5,'2, p"n c"nd soluiadevine glbuie. e adaug c"teva picturi soluie amidon '? i se continu titrarea p"n ce culoareasoluiei devine alb.

&n paralel se realizeaz un martor folosind 15 ml ap distilat, '5 ml soluie e!ling I i '5 msoluie e!ling II. Ba martor nu este necesar fierberea. &n continuare se lucreaz identic ca la prob.

Ta/el#l 4. orespondena ntre concentraia glucidelor reductoare i volumul de tiosulfatutilizat la titrare

l Na&S&O* 561l Na&S&O* Gl#c"(% 7+8 Za3%r i,9er$i$ 7+8 Za3ar"(% 7+8' 5,4' 4,1 4,1 4,'1 5,4' =,4 =,8 =,14 5,41 E,8 E,> E,48 5,41 '1,= '4,5 '1,86 5,41 '6,E '=,8 '6,== 5,41 'E,1 'E,9 '9,9> 5,41 11,8 14,1 11,59 5,41 16,= 1=,6 16,5E 5,48 19,E 1E,E 19,8'5 5,48 41,4 44,8 4',>'' 5,44 46,> 4=,9 46,5'1 5,48 4E,5 85,4 49,6'4 5,48 81,8 84,9 8',='8 5,46 86,9 8>,4 88,E'6 5,46 8E,4 65,9 89,1'= 5,46 61,9 68,4 6',=

'> 5,46 6=,4 69,5 66,''9 5,46 69,E =',9 69,>'E 5,4= =4,4 =6,6 =1,415 5,4= ==,E =E,8 =6,E

(alculul rezultatelor:0N : ,; - < = l Na&S&O*

unde: 2 < volumul de tiosulfat de sodiu 5,'2 folosit pentru titrarea martoruluin < volumul de tiosulfat de sodiu 5,'2 folosit la titrarea probei < factorul soluiei de tiosulfat de sodiu 5,'2 )5.EE55$

#c!ivalena n susbstan reductoare din proba luat n lucru se gsete n tabelul =.

1. C>,! se ia# ?, l#cr# 56@ l

C",ce,$ra)ie ?, +l#c"(% 0 < + +l#c"(% 0$a/el 56&

&. C>,! se ia# ?, l#cr# 1 l 'r"/%

C",ce,$ra)ie ?, +l#c"(% 0 < + +l#c"(% 0$a/el 561

- > -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

8/31

&n cazul n care sursa de carbon din mediu este reprezentat de un diglucid ca za!aroza, pentrudeterminarea coninutului n glucide reductoare se aplic aceeai metod, cu deosebirea c sefectuaez n prealabil o !idroliz a probei de analizat.

+entru !idroliza diglucidelor se preleveaz din proba respectiv 6 ml, se dilueaz cu 15 ml apdistilat, se adaug 6 ml l '5?. ;mestecul se menine n ap fierbinte la =>5, timp de 6 minut iapoi se rcete imediat n *et de ap rece. e aduce amestecul la 65 ml cu ap distilat ntr-un baloncotat. %in aceast soluie se iau c"te 6 ml pentru dozarea glucozei n modul descris mai sus.

- 9 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

9/31

Lucrarea practica nr. )

1.2. Variaia pH-ului pe parcursul biosintezei de acid lactic

+e parcursul procesului de fermentaie p-ul mediului variaz, determinarea lui fc"ndu-se cua*utorul !"rtiei indicatoare de p sau cu p-metrul.

+entru neutralizarea aciditii i pentru meninerea p-ului n intervalul 6-6,6 )optim pentrudezvoltarea bacteriilor lactice$, pe msur ce se formeaz acid lactic, n mediul de fermentaie se adauga34, a)3$1sau 24. a34 se poate aduga n mediu fie la nceputul fermentaiei, fie treptat, pe

parcurs.&n timpul fermentaiei se colecteaz probe la intervale regulate de timp. %ac p-ul scade sub 8)at"t fermentaiile cu bacterii, c"t i cu dro*dii$, se fac corecii cu a34, soluii amoniacale )'1,6?$ saucu soluii de 2a3 85?.

&n final, se traseaz curba de p, nscriind pe abscis timpul de fermentaie, iar pe ordonatvaloarea p-ului.

1.3. Determinarea concentraiei totale de acid lactic pe parcursul fermentaiei

+e parcursul fermentaiei lactice exist permanent un amestec de acid lactic liber i lactat decalciu. +entru determinarea concentraiei n acid lactic total existent n mediul de cultur se determin

concentraia acidului lactic liber la care se adaug concentraia n acid lactic existent sub form de lactade calciu.

A. De$eri,area aci!#l#i lac$ic li/er ?, e!i#l !e fere,$a)ie

Principiul metodei;cidul lactic formeaz n urma reaciei cu !idroxidul de sodiu, lactat de sodiu. idroxidul de

sodiu rmas neconsumat se determin titrimetric cu o soluie de acid clor!idric 5,'2, n prezen defenolftalein, ca indicator. antitatea de !idoxid de sodiu consumat n reacie este direct proporionalcu cantitatea de acid lactic din prob.

4F 3 F 33 D 2a3 L 4F 3 F 332a D 13l D 2a3 L 2al D 13

od de lucru!

+roba de mediu se filtreaz pe !"rtie band albastr. &ntr-un flacon #rlenme7er de 655 ml seintroduc 5,6 ml prob, 15 ml ap distilat i 65 ml 2a3 5,'2. e astup flaconul cu dop rodat i se lasn repaus 45 de minute. e titreaz n prezen de fenolftalein cu l 5,'2 p"n la decolorare. &nparalel, se face un martor, n aceleai condiii dar fr prob de acid lactic.

(alculul rezultatelor!

'ml 2a3 5,'2 corespunde la 5,55E559 g acid lactic

unde: m< volumul de l 5,'2 folosit la titrarea martoruluip< volumul de l 5,'2 folosit la titrarea probeig < cantitatea de prob luat n lucruf < facturul soluiei de l 5,'2

B. De$eri,area lac$a$#l#i !e calci# ?, e!i#l !e fere,$a)ie

- E -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

10/31

Principiul metodei

Metoda se bazeaz pe dozarea ionilor de calciu prin complexarea lor cu sarea disodic a aciduluetilendiaminotetraacetic )#%C;-2a1$ sau complexon %%%, n prezen de murexid, ca indicatoromplexul iniial, format ntre ionii de calciu i indicator, este colorat n roz-violet.

D2a-33. .33-2aD

D.1

3 .

3

2

1.

.a1D

.a

1.

.1 2

.1

.1

3

. 3

3.

3

.1

.1

2.1

1.

1.

2

3

.3

.1

.33-2aDD2a-33.

.omplexon 4

omplexonat de calciu

Ionii de calciu rmai n mediul de reacie se titreaz cu soluie #%C;-2a1 form"ndcomplexonatul de calciu. &n momentul apariiei n soluie a unui exces de complexon III, acesta va

reaciona cu complexul iniial, format ntre ionii de calciu i murexid, eliber"nd murexidul carecoloreaz soluia n albastru.

&eacti'i necesari!

- soluie #%C; 5,56M )'5'8212a139 x 113$: '9,='1 g #%C; disodic se dizolv n apdistilat i se completeaz la '555 ml

- soluie tampon amoniacal p < '5: 6,8 g clorur de amoniu se dizolv n 65 ml ap distilat, seadaug 46 ml 2416? i se completeaz cu ap distilat la '55 ml

- soluie sulfat de magneziu 5,56M )Mg38 x >13$: se c"ntresc ',14 g i se dizolv n '55 map distilat

- eriocrom negru C )15'1243>2a$: ' g eriocrom negru C se amestec cu '55 g 2al- proba de mediu: 15 ml lic!id de fermentaie se trateaz un v"rf de spatul de a34i se las

45 de minute n repaus pentru neutralizare, apoi se filtreaz pe !"rtie de filtru

od de lucru!

%in mediul filtrat se msoar un volum de lic!id astfel nc"t cantitatea de lactat de calciu s fie155 mg.

+e parcursul fermentaiei, numrul de ml prob luai n lucru variaz astfel:- 18 ore n < 4 ml- >1 ore n < 1 ml- >1-E= ore n < ' ml

&ntr-un flacon #rlenme7er de 655 ml )'$ se introduc: n ml prob, 6 ml soluie tampon amoniacali '55 ml ap distilat.

&ntr-un alt flacon #rlenme7er de 655 ml )1$ se introduc: ' ml sulfat de magneziu 5,56M, un v"rde spatul de eriocrom negru C. e titreaz cu #%C;-2a15,56M p"n la coloraie albastr.

oluia obinut )denumit edetat de 2a i Mg$ din flaconul )1$ se adaug n flaconul )'$ ceconine proba de titrat pentru observarea corect a vira*ului culorii )magneziul adugat intensificculoarea fr s modifice rezultatul deoarece este titrat$.

oluia reunit se titreaz cu #%C;-2a15,56M p"n la coloraia albastr, not"ndu-se volumutotal folosit.

- '5 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

11/31


oncentraia n lactat de calciu din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:unde: ; < volumul de #%C; cu care s-a

titratf < factorul soluiei de #%C; 5,56Mn < numrul de ml prob luai n lucru

antitatea de acid lactic existent n mediul de cultur sub form de lactat de calciu se calculeazconform urmtorului raionament:

1'9 g lactat de calciu NNNNNNN 1 x E5 g acid lactic b g lactat de calciu obinut NNNN A g acid lactic

A g acid lactic < 1 x E5 x b H 1'9

oncentraia de acid lactic sub form de lactat calculat pentru ' ml prob luat n lucru secalculeaz astfel:

acid lactic sub form de lactat)?$ < A x '55

- '' -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

12/31

Lucrarea practica nr. *

PRELUCRAREA MEDIULUI DE -ERMENTAIE LACTICA

Ba sf"ritul procesului de fermentaie mediul se trateaz cu !idroxid de calciu, astfel nc"tprodusul final s se gseasc n ntregime sub form de lactat de calciu. uspensia obinut se filtreaziar lic!idul se trateaz cu acid sulfuric p"n la reacie acid pentru descompunerea lactatului de calciu nacid lactic i precipitat de sulfat de calciu. %up filtrarea sulfatului de calciu, soluia diluat de acidlactic se concentreaz.

oncentrarea se face prin evaporare n vid, la presiune sczut, p"n la 'H6 din volumul iniialc"nd concentraia de acid lactic este 65-95?. +rodusul obinut, acidul lactic brut, denumit i /acid lacticuz te!nic0, poate fi folosit fie ca atare n industrie, fie purificat.

+entru purificarea acidului lactic se folosesc mai multe metode:- recristalizarea lactatului de calciu i tratarea ulterioar a acestuia cu acid sulfuric pentru

obinerea acidului lactic liber(- transformarea lactatului de calciu n lactat de On care cristalizeaz mai uor dec"t celelate

sruri ale acidului lactic. Bactatul de zinc se purific prin cristalizri repetate, apoi se trateaz cu!idrogen sulfurat pentru precipitarea sulfurii de zinc. oluia de acidul lactic se decoloreaz cucrbune activ, se filtreaz i se concentreaz n vid(

-esterificarea acidului lactic cu alcool metilic. Mediul se trateaz cu acid sulfuric i se menine

8-6 ore la cald. +recipitatul se ndeprteaz prin filtrare, iar excesul de alcool metilic prin distilare(- oxidarea acidului lactic cu diferii ageni oxidani )!ipoclorit de sodiu, !ipoclorit de calciu

permanganat de potasiu, acid azotic, ap oxigenat, clor, ozon$(- extragerea cu solveni )eter izopropilic$(- trecerea unui curent de vapori de alcool metilic prin soluiile apoase de acid lactic( lactatul de

metil d natere prin !idroliz i distilare la acid lactic pur.

od de lucru!

Mediul de fermentaie obinut n laborator )'55 ml$, se trateaz cu 6 ml 138 concentrat, se lastimp de 45 minute pentru descompunere, dup care se filtreaz pe !"rtie band albastr pentrundeprtarea sulfatul de calciu. Bic!idul perfect limpede, conin"nd aproximativ '5? acid lactic, seconcentreaz sub vid p"n la 'H6 din volumul iniial. &n final, se determin concentraia acidului lacticobinut.

CALCULUL RANDAMENTULUI DE OBINERE A ACIDULUI LACTIC

aracterizarea bioprocesului de obinere a acidului lactic prin fermentaie se realizeaz princalcularea mai multor randamente.

+entru evidenierea gradului de utilizare a glucozei la sf"ritul fermentaiei, at"t pentrudezvoltarea microorganismelor c"t i pentru biosintez, se calculeaz randamentul de consum aglucozeii randamentul de trans+ormare a glucozei ,n acid lactic.

+entru evaluarea bioprocesului la sf"ritul biosintezei se calculeaz randamentul de ob#inere aacidului lactic.

a$ Kandamentul de consum al glucozei

+rin calculul acestui randament se obin informaii referitoare la proporia total n care a fosconsumat substratul pentru dezvoltarea microorganismelor i pentru producerea de acid lactic. ;cesta nofer ns informaii referitoare la gradul de transformare a glucozei n acid lactic.

cantitatea de glucoz consumatP < x '55

- '1 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

13/31

cantitatea de glucoz iniial

b$ Kandamentul de transformare a glucozei n acid lactic

;cest calcul ofer informaii cu privire la specificitatea microorganismului productor capacitatea acestuia de a produce acid lactic i nu ali produi.

cantitatea de glucoz transformat n acid lacticP < x '55

cantitatea de glucoz consumat

c$ Kandamentul de obinere a acidului lactic

;cesta intereseaz din punct de vedere te!nologic, ntruc"t ofer informaii globale referitoare ladesfurarea bioprocesului.

cantitatea de acid lactic obinut practicP < x '55

cantitatea de acid lactic teoretic

antitatea de acid lactic obinut practic, se calculeaz n funcie de volumul final al mediului defermentaie.

antitatea teoretic de acid lactic se deduce din stoec!iometria reaciei c!imice de transformare aglucozei, in"nd cont de cantitatea introdus la nceputul procesului de fermentaie.

+entru o mai bun nelegere a randamentelor prezentate mai sus, se consider urmtoruexemplu:

Exemplue consider urmtoarele concentraii i volume iniiale i finale:

- volum iniial de fermentaie < E6 ml- volum final de fermentaie < 95 ml- concentraie iniial de glucoz < E,5? )gHv$

- concentraie de acid lactic < 4,6? )gHv$- concentraie de lactat de calciu < 8? )gHv$- concentraie final de glucoz < 5,4? )gHv$

se calculeze randamentele de consum al glucozei, de transformare a glucozei n acid lactic cel de obinere a acidului lactic.

a- &andamentul de consum al glucozei

antitatea de glucoz iniial introdus n mediul de fermentaie se calculeaz astfel:E x E6 H '55 < 9,66 g glucoz iniial

cantitatea de glucoz consumat < cantitatea iniial de glucoz F cantitatea final de glucoz

antitatea de glucoz rmas n mediu la sf"ritul fermentaie se calculeaz astfel:5,4 x 95 H '55 < 5,18 g glucoz final

antitatea de glucoz consumat < 9,66 F 5,18 < 9,4' g glucoz comsumat

c< 6*1 6@@ 155 < F

b- &andamentul de trans+ormare a glucozei ,n acid lactic

- '4 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

14/31

antitatea de glucoz transformat n acid lactic se obine din calculul stoec!iometric al reacieglobale:

='13= L 1 4F 3 F 33glucoz acid lactic '95 E5

cantitatea total deacid lactic

? )gHv$- volum iniial mediu de fermentaie < 655 ml- concentraie final de alcool etilic < 6,1? )vHv$- volum final mediu de fermentaie < 8E6 ml

antitatea iniial de glucoz:

E,> x 655 H '55 < 89,6 g glucoz iniial

antitatea de alcool etilic teoretic se calculeaz din ecuaia )'$ astfel:'95 g glucoz NNNNNNN. E1 g alcool etilic89,6 g glucoz NNNNNNN. R g alcool etilic

R < E1 x 89,6 H '95 < 18,> g alcool etilic teoretic

olumul de alcool etilic obinut practic:

6,1 x 8E6 H '55 < 16,>8 ml alcool etilic practic

Masa alcoolului etilic din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:

< 9

unde: m < masa )g$ < densitatea )gHml$( pentru alcoolul etilic '55? < 5,>E gHml v < volumul )ml$

antitatea de alcool etilic practic:

- '> -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

18/31

m alcool < 5,>E x 16,>8 < 15,44 g alcool etilic practic

< &56** &6 155 < &6*&

- '9 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

19/31


OBINEREA ACIDULUI GLUCONIC

;cidul gluconic este un acid slab, biodegradabil )E9? n 89 ore$, nu este coroziv, volatil sautoxic.

&n natur, acidul gluconic se gsete n fructe, miere, ceai de Qombuc!a si vin.e poate obine prin oxidarea glucozei sub aciunea glucoz-oxidazei, produs de fung

)6spergillus niger$ sau a glucoz-de!idrogenazei, produs de bacterii )7luconobacter$. ermentaia cu6spergillus niger dateaz de c"teva decenii i este cea mai rentabil metod de obinerea acidulugluconic.

;cidul gluconic i derivaii lui i gsesc aplicaii n numeroase industrii: alimentarfarmaceutic, textil, a detergenilor i cea a produselor de igien.

&n principal, este folosit ca aditiv alimentar )#6>8$ pentru reglarea aciditatii produselor. #imprim un gust proaspt, acidulat multor produse alimentare ca vinul, sucurile de fructe, etc.

@luconatul de sodiu, datorit proprietii de c!elatare a metalelor grele, superioar #%C;-uluii gsete aplicaii n domenii din cele mai variate: n metalugie, pentru prevenirea formrii i curarearuginii, n industria textil, pentru prevenirea formrii depunerilor de fier, n industria detergenilorpentru ndeprtarea depozitelor calcaroase de pe metale i alte suprafee. %e asemenea, mai poate ffolosit ca aditiv la cimentului regl"nd procesul de maturare, cresc"ndu-i duritatea, rezistena la ap, lang!e i la crpare.

@luconatul de calciu este folosit n terapia deficienelor de calciu, n nutriia animalelor, iar pecale in*ectabil, pentru tratarea malariei.

@luconolactona se folosete ca acidifiant slab n panificaie, n procesarea crnii, n coagulareaproteinelor din soia, n industria produselor lactate, pentru creterea stabilitii la fierbere a laptelui pentru obinerea unor tipuri de br"nzeturi.

Microorganismele utilizate frecvent pentru obinerea acidului gluconic sunt:ungi: - 6spergillus niger

- Penicillium chrsogenumacterii: - 6cetobacter aceti

- 6cetobacter gluconicum

- Pseudomonas +luorescens

-Pseudomonas o'alis

+entru obinerea acidului gluconic prin fermentaie se folosete ca materie prim glucoza. #a esteoxidat incomplet sub aciunea glucozo-oxidazei elaborat de microorganismele din culturMetabolizarea glucozei se realizeaz n culturi submerse aerate, sub presiune, randamente mari deproducie )E5-E6?$ put"nd fi obinute cu condiia neutralizrii acidului gluconic din mediu cu carbonade calciu sau !idroxid de sodiu. &n aceste condiii, produsul final se obine sub form de gluconat de asau de 2a, n funcie de natura substanei folosit pentru neutralizare.

Keacia global devine:.13 ).3$8 .3 3

13

.33

;%;%1

131

'H1 31

D

D

D

glucozoxidaza

).3$4.13 . .

3S -%-gluconolactona

glucoza

31

;%

catalaza

13

acid %-gluconic

).3$8.13

- 'E -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

20/31

DDD

D

13

glucoza

.3).3$8.13 'H1 31 .13 ).3$8acid gluconic

.33

.33acid gluconic

).3$8.131 .a.34 .31T.13 ).3$8 .33U1.a

gluconat de calciu

Pre'ararea i,"c#l#l#i !e$spergillus niger+entru nsm"narea mediului de fermentaie la nivel de laborator se folosete o suspensie de

microorganisme, dezvoltat pe mediu solid.Mediul solid pentru obinerea conservului vegetativ are urmtoarea compoziie: must de mal

1?, agar 1?, p

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

21/31

oluia obinut )denumit edetat de 2a i Mg$ din flaconul )1$ se adaug n flaconul )'$ ceconine proba de titrat pentru observarea corect a vira*ului culorii )magneziul adugat intensificculoarea fr s modifice rezultatul deoarece este titrat$.

oluia reunit se titreaz cu #%C;-2a15,56M p"n la coloraia albastr, not"ndu-se volumutotal folosit.


oncentraia n gluconat de calciu din mediul de fermentaie se calculeaz cu formula:

unde: ; < volumul de #%C; cu care s-a titratf < factorul soluiei de #%C; 5,56Mn < numrul de ml prob luai n lucru

antitatea de acid gluconic existent n mediul de cultur sub form de gluconat de calciu secalculeaz conform urmtorului raionament:

845 g gluconat de calciu NNNNNNN 1 x 'E= g acid gluconic A g gluconat de calciu obinut NNNN O g acid gluconic

O g acid gluconic < 1 x 'E= x A H 845oncentraia de acid gluconic sub form de gluconat )?$ < O x '55

&. Prel#crarea e!i#l#i !e fere,$a)ie

Mediul de biosintez obinut n finalul fermentaiei gluconice se prelucreaz pentru izolareaacidului gluconic format pe parcursul bioprocesului i calculul randamentului.

&n scopul neutralizrii complete a acidului gluconic rezultat n urma oxidrii glucozei, sprocedeaz la tratarea mediului de fermentaie cu !idroxid de calciu )carbonat de calciu carbonat dcalciu sau carbonat de calciu.$. ;cesta se adaug cu o spatul, n proporie de '5? )'5 g carbonat decalciu sau !idroxid de calciu la '55 ml mediu$. +entru definitivarea reaciei de neutralizare se nclzeteamestecul la =5->55, timp de 45 de minute, sub agitare continu. %up neutralizare, amestecul dereacie se filtreaz fierbinte, pe filtru rm"n"nd biomasa i excesul de carbonat de calciu rmasnereacionat.

oluia perfect limpede obinut dup filtrare se rcete pe baie de g!ea, sub agitare continutimp de '-1 ore pentru cristalizarea gluconatul de calciu din soluie. uspensia obinut se filtreaz nvederea separrii precipitatului. Curta de gluconat de calciu se esoreaz corespunztor, se usuc n etuvn curent de aer cald la 85-655, timp de 8-6 ore, se c"ntrete i se calculeaz randamentul de obinere.

- 1' -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

22/31


BIOREACTOARE

1. Bi"reac$"r#l !isc",$i,## !e $i' Bra#,

1.1. Descrierea i "'erarea /i"reac$"r#l#i ?, sis$e /a$c3

+entru obinerea produselor biote!nologice, la nivel micropilot se utilizeaz diverse tipuri debioreactoare, n funcie de tipul microorganismului utilizat, de natura produselor obinute i deproductivitatea urmrit.

ioreactoarele, n funcie de modul de operare pot fi conduse n regim discontinuu, semicontinuusau continuu.

"ioreactorul "&69:este un bioreactor cu funcionare discontinu )/sistem batc!0$, caracterizaprin operarea n ar*e, ceea ce presupune ncrcarea reactanilor, iar dup un interval de timp determinatdescrcarea produilor de reacie.

;cesta reprezint o construcie modular format din corpul bioreactorului i trei module deautomatizare )figura 6$.

orpul bioreactorului este alctuit din dou tronsoane: unul din sticl, reprezentat de vasul dinsticl i unul metalic reprezentat de capacul bioreactorului. asul din sticl are forma cilindric i ocapacitate total de 6 l )capacitate util de 8 l$ este prevazut la partea superioar cu un capac metalicformat dintr-un disc solid de inox fixat de vasul din sticl cu a*utorul unui inel metalic.

+e capac se gsesc montate dou buoane, unul pentru electrodul de p i unul pentru cel deoxigen si = racorduri: dou pentru introducerea inoculului i c"te unul pentru evacuarea aerului, pentruprelevarea probelor, pentru traductorul de temperatur i pentru intrarea aerului.

Bi"reac$"r#l BRAUN

asul de biosintez este de asemenea prevzut cu un condensator metalic, vertical, montat pecapac, av"nd rolul de a condensa vaporii de ap eliberai n timpul procesului de biosintez din mediulde cultur sau care sunt antrenai de aerul ce iese permanent din bioreactor )n cazul fermentaiiloraerobe$. +icturile de ap sunt returnate n mediul de fermentaie evit"ndu-se astfel o eventualconcentrare a acestuia n timpul biosintezei. ondensatorul este prevzut cu o manta de nclzire-rcireutilizat numai pentru rcire, fiind cuplat permanent la o surs de ap rece.

ioreactorul este prevazutcu un plon*on, dispozitiv cu a*utorul cruia se recolteaz probe dinmediul de fermentaie )prin creterea presiunii n vasul de biosintez$. +lon*onul const ntr-o eav de

inox care intr prin capacul bioreactorului i a*unge p"n la fundul vasului. +entru o mai bun colectarea probelor, plon*onul este curbat la partea inferioar.apacul bioreactorului mai este prevazut cu 8 racorduri de diametru mai mic, utilizate pentru

diverse adaosuri, cum ar fi: soluie acid sau bazic bazic, antispumant, componente de mediu.;daosurile se efectueaz cu a*utorul a trei pompe peristaltice, anexe bioreactorului i grupat

ntr-un modul de sine-stttor. ;ceste pompe funcioneaz manual sau automat, fiind prevazute cu tuburspeciale de silicon i vase de adaos sterilizabile. +rincipiul de funcionare al pompelor peristaltice sebazeaz pe o micare de contracie i una de relaxare a tubului de silicon, ceea ce creeaz o diferen depresiune care asigur deplasarea lic!idului din vasul de adaos n bioreactor, prin tubul de silicon.

- 11 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

23/31

ioreactorul este prevazut cu un rotametru, pentru masurarea debitului de aer furnizat dcompresor. Intre compresor i rotametru se interpune un filtru de aer prevzut cu vat de sticl)prefiltrare aer$( ntre rotametru i vasul de cultur este fixat un filtru Millipore sterilizabil, cu diametruporilor mai mic de 5,1 mm, care asigur sterilizarea aerului.

+e capacul bioreactorului este montat i sistemul de agitare, format dinntr-un motor, un cuplametalic de fixare i axul agitatorului. Curaia agitatorului variaz ntre 5-'155 rpm, la o capacitate avasului de 6 l. "nd vasul de biosintez este nlocuit cu unul similar, dar de capacitate de '5 l, turaiamaxim este de =55 rpm.

1.&. Sis$e#l !e a#$"a$i(are i c",$r"l al /i"reac$"r#l#i

a$ Modulul de automatizare i control al agitriiioprocesul poate fi condus la o turaie constant, care se fixeaz la nceput, potrivi

recomandrilor biote!nologului sau la o turaie variabil )n anumite perioade de timp$. Curaiagitatorului pe parcursul biosintezei poate fi programat pe panoul modulului.

b$ Modulul de automatizare i control al parametrilor de proces: temperatur, p, agitareconcentraie de31i antispumant

+e panoul acestui modul se programeaz parametrii de bioproces, urm"nd ca acetia s fiemeninui la valoarea introdus iniial n memoria calculatorului.

c$ Modulul de control i automatizare al pompelor peristaltice )pentru adaosul soluiilonecesare coreciei p-ului i soluii de nutrieni$.

;cest modul cuprinde at"t cele trei pompe peristaltice c"t i sistemul de automatizare aferent"nd se intenioneaz adugarea automat a unei soluii, programarea pompei se realizeaz pe modulude automatizare i control. %e exemplu, dac se dorete meninerea p-ului la o anumit valoare, c"ndacesta se modific fa de valoarea prescris, pompa peristaltic se declaneaz automat adug"nd nmediu soluie acid sau bazic pentru corecie.

3peraiile necesare conectrii aparatului sunt urmatoarele:- pregtirea aparatului- calibrarea pompelor - dup autoclavarea vasului de cultur, conectarea electrozilor- reglarea parametrilor de masur i controlaractensticile te!nice ale bioreactorului sunt urmatoarele:- capacitate total: 6 '- capacitate util: 8 '- debit aer furnizat: 5-185 'H!- temperatura de lucru: 15-=55- suprapresiune: 5,1-5,6 atm- presiune de sterilizare: 1 bar- temperatura de sterilizare: '155- turaie agitator: 5-'155 rpm

1.*. Pre+a$irea /i"reac$"r#l#i ?, 9e!erea efec$#%rii #,ei arJe !e /i"si,$e(%

&nainte de efectuarea unei ar*e de biosintez se procedeaz la sterilizarea bioreactorului i aanexelor acestuia dup procedeul descris n continuare. asul bioreactorului se demonteaz i sesterilizeaz gol n autoclav la '155, timp de 15 minute )o dat cu bioreactorul se sterilizeaz i filtrul daer$. %up rcire, vasul bioreactorului se umple cu mediu de cultur i se sterilizeaz in nou prinautoclavare.

%up rcire la 15-855, corpul bioreactorului se aeaz pe masa de laborator asigurand unmonta* corespunzator unei bune funcionari, se fixeaz motorul i apoi se introduc electrozii de p i deoxigen.

- 14 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

24/31

e inoculeaz mediul cu microorganismul specific, n conditii sterile i se fixeaz parametrii delucru )temperatur, debit de aer, p, concentraie de oxigen$.

Ba nc!eierea procesului, se va decupla instalaia i se va proceda la descrcarea, splarea igienizarea utila*ului.

%up operaiile de splare i igienizare, vasul se va terge cu tifon uscat, apoi se vor cura toateracordurile i se vor unge cu vaselin siliconic numai suprafeele de etanare, pregtind astfel vasupentru un nou experiment.

1.. C",$r"l#l 'H:#l#i ?, /i"reac$"r

1.%.1. &oiuni generale

&ntr-o soluie apoas, concentraia absolut a ionilor de !idrogen are valori mici i este incomodde intrebuinat n practic. &n anul 'E5E, . orensen, a propus s se foloseasc pentru calculuconcentraiei ionior de !idrogen dintr-un mediu lic!id, logaritmul zecimal cu semn sc!imbat numiexponent de hidrogensaup;. ;stfel, p-ul se poate defini:

p < F lg T43D < lg )' H T43D$&n mod analog se definete i exponentul ionilor de hidroxil:

p3 < F lg T3- < lg )' H T3-$3 soluie de l '2 are o concentraie a ionilor de !idrogen de ' ion gHl.

T43D < ' p < F lg l < 5&ntruc"tprodusul ionic al apeieste T43D x T3- < '5-'8,

T3- < '5-'8ion gH'+entru concentraia unei baze se poate raiona n mod analog.;stfel, rezult c n solutii apoase, concentraia ionilor de !idrogen poate varia ntre ' si '5 -'8ion

gH'.%ac se logaritmeaz expresia produsului ionic al apei se obtine:

F lg T43D F lg T3- < F lg '5-'8

p D p3 < '8u a*utorul acestei relaii se poate exprima aciditatea sau bazicitatea unei soluii apoase.&n concluzie, n soluiile apoase, p-ul poate varia ntre 5 si '8. &ntr-o soluie cu p zero

concentraia ionilor de !idrogen este ', iar cea a ionilor !idroxil este '5 -'8. Kezult astfel c soluia estacid. &n mod asemnator, c"nd concentraia ionilor !idroxil este ', p-ul este '8, iar soluia estebazic. &n acest caz, concentraia ionilor de !idrogen este '5-'8.

T43D < '5-> T3- < '5-> p < >;tunci c"nd concentraia ionilor de !idrogen este egal cu cea a ionilor !idroxil, p-ul este >, ia

soluia este neutr.Kezult c la valori de p mai mari de > soluiile sunt bazice, iar dac p-ul este mai mic de >,

soluiile sunt acide. "nd p-ul crete cu o unitate, concentraia ionilor de !idrogen descrete de '5 ori.Ba determinarea p-ului un factor important l constituie temperatura de lucru. %e pild, punctu

neutru scade o dat cu creterea temperaturii. &n general, c"nd nu se specific, masurarea p-ulusoluiilor se face la 165 )temperatura ambiant$.

%eterminarea p-ului n soluie se realizeaz cu !"rtii indicatoare sau cu electrozi de p.

1.%.2. Electrodul de pH-'ngo'd

Principiul de ac#iune

%eterminarea p-ului cu a*utorul electrozilor se realizeaz prin msurarea potenialului delectrod al pilelor. ora electromotoare a unei pile se datoreaz diferenelor de potenial aprute lainterfaa electrod-soluie. ;ceast diferen de potenial se numete potential de electrod i apar

- 18 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

25/31

deoarece ionii metalici din soluie au un potenial diferit fa de cel al ionilor din metal, astfel c ntreacetia se stabilete un ec!ilibru.

&ntruc"t potenialul unui singur electrod nu se poate determina se alege prin convenie unelectrod de referin, al crui potenial, se consider zero. a electrozi de comparaie se folosesc frecvenelectrodul de !idrogen, electrodul de calomel, etc.

&n anul 'E8>, dr. Verner Ingold a introdus pe pia modelul electrozilor combinai, acetia fiindutilizai astzi n toat lumea. &n electrodul combinat, electrodul de sticl i cel de referin formeaz uncorp comun. #lectrodul de referin ncon*oar electrodul de sticl coaxial, iar electrolitul vine n contacelectric cu proba prin intermediul unei membrane.

#lectrozii combinai sunt de obicei formai din electrozi de calomel sau de argint. &n cazuelectrozilor sterilizabili, utilizai la msurarea p-ului n bioreactoare, se folosete electrodul de argint;cesta se noteaz simbolic prin:

;g H ;gl solid H Jl )soluie$ sau l#lectrodul de argint const dintr-o plac de argint, n contact cu clorur de argint, n soluie de

acid clor!idric. Ba electrod au loc reacii inverse, mai nt"i de dizolvare a argintului solid i reacia lui cuionii de clor pentru a forma clorura de argint, insolubil, pentru ca apoi clorura de argint s se dizolve s reformeze argintul solid.

;g W ;gDD e-

;gDD l-W ;glKeacia global devine: ;gl D e-W ;g D l-

lorura de potasiu care ncon*oar electrodul mpiedic creterea concentraiei ionilor de arginla electrozi, care ar putea face electrodul mai pozitiv i l-ar polariza.

&n biote!nologie, p-ul constituie un parametru bioc!imic deosebit de important pentrudesfurarea diferitelor procese biologice, ceea ce impune controlul i corecia lui permanent lavaloarea indicat n te!nologie.

#lectrodul de p Ingold

Pstrarea electrodului

+entru o bun funcionare, electrodul de p nu se pstreaz n atmosfer uscat )n aer liber$, cse menine permanent n soluia electrolitului de referin )Jl$.

%up o perioad lung de stocare, membrana de sticl trebuie reactivat cu acid fluor!idricproced"ndu-se astfel: membrana electrodului se introduce ' minut, ntr-o soluie concentrat de acidfluor!idric, apoi se menine '1 ore n soluia stoc.

(alibrarea electrodului de p; a+erent bioreactorului "raun

#lectrodul de p trebuie calibrat, nainte de a-l folosi ntr-un proces de fermentaie n bireactor#lectrodul de p Ingold utilizat pentru controlul p-ului n bioreactor este sterilizabil )suportsterilizare termic umed$.

- 16 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

26/31

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

27/31

3xigenul difuzeaz prin membran la catod, unde reacioneaz i produce un curent electric ntreanod i catod, proporional cu presiunea parial a oxigenului n mediul de fermentaie.

Sc3ea $ra,sfer#l#i !e "i+e, !i, e!i# la ca$"!#l elec$r"!#l#i !e as#r%

&n funcie de debitul de alimentare a mediului, de proprietile fizico-c!imice ale lic!idului i deproporia de utilizare a oxigenului de ctre microorganisme, stratul de lic!id ce ncon*oar membrana dmsur a electrodului formeaz o interfa ntre electrodul solid i lic!idul de msurat.

%up cum rezult si din figura >, eliberarea i transmiterea moleculelor deoxigen din mediu sprcatod se realizeaz prin procese de transfer de mas. &ntruc"t nu exist o micare propriu-zis a fluiduluprin membran sau prin soluia de electrolit, ci exist o micare redus prin pelicula de lic!id de lainterfaa membranei, n cazul operrii cu sonda electrodului oxigenul difuzeaz prin grosimea acestepelicule de lic!id. ;cest proces necesit o perioad mai lung de timp i este cunoscut sub denumirea dtimp de rspuns al electrolitului. %urata acestuia poate fi masurat prin transferarea rapid a sondedintr-un mediu saturat cu azot ntr-un saturat cu oxigen. Cimpul de rspuns este definit ca timpunecesar aparatului pentru a indica =4? din valoarea total a concentraiei de oxigen dizolvat n mediude masurat. #lectrozii comercializai la ora actual au timpi de rspuns cuprini ntre '5-'55 secunde.

Cimpul de rspuns al electrodului de oxigen poate fi mbuntit prin urmatoarele aciuni:- agitarea intens a lic!idului n care se msoar concentraia de oxigen dizolvat- micorarea grosimii peliculei de lic!id de la suprafaa membranei- micorarea catodului, deci a cantitii deoxigen consumat, prin utilizarea de microsonde;mbele tipuri de electrozi, galvanic si polarografic, msoar, presiunea parial aoxigenului sau

tensiunea de oxigenn mediul de fermentaie i nu direct concentraia de oxigen dizolvat.+entru convertirea acestora n concentraie de oxigen dizolvat este necesar cunoatere

solubilitiioxigenului n lic!idul de msurat, la temperatura i presiunea la care au loc msurtorile.%eterminarea concentraiei de oxigen din mediile de fermentaie se realizeaz cu a*utorul unu

electrod tip Mettler Coledo. ;cest se compune din:a$ Senzorul de baza (lark, polarografic, care const dintr-un electrod de lucru )catodul$, un

electrod de numrare i unul de referin )anodul$ i o membran permeabil pentru oxigen, care separelectrodul, de mediul analizat.

b$ 4ransmi#torul, care se aplic la catod )tensiune de polarizare$ i asigur un volta* ntre 665 s>65 m.

c$oleculele de oxigencare migreaz prin membrana permeabil. ;cestea sunt reduse la catod.acelai timp, la anod are loc un proces de oxidare, unde metalul anodic oxidat este transferat n electro#lectrolitul nc!ide circuitul electric dintre anod si catod )conductivitate ionic$.

urentul produs de reacia descris la punctul c$ este msurat de transmitor. ;cest curent esteproporional cu presiunea parial deoxigen din mediul de cultur.

Operarea electrodului

and se lucreaz prima dat cu sistemul sau c"nd senzorul a fost deconectat de la sursa detensiune pentru o durat mai mare de 6 sau '5 minute, acesta trebuie polarizat nainte de calibrare, prin

- 1> -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

28/31

conectare la transmitorul de oxigen sau la un modul de polarizare Mettler. enzorul este polarizat gata de operare dup = ore de polarizare. Mai puin de = ore vor fi suficiente dac senzorul a fosdeconectat numai pentru c"teva minute.

(alibrarea electrodului

#lectrodul trebuie recalibrat nainte de fiecare msuratoare. %ac senzorul lucreaz cu untransmitor Mettler tip '>5, este suficient numai o calibrare simpl ntr-un punct, ntr-un mediu saturacu oxigen sau ntr-o incint cu aer saturat n vapori de ap. ;ducerea la zero nu este necesar.

%ac lucrul se desfaoar n condiii sterile, sistemul trebuie calibrat dup sterilizare, deoarecetemperatura poate modifica panta senzorului. %up rcire, fermentatorul este aerat. Ba calibrare, dupa ce

semnalul s-a stabilizat, se a*usteaza potentiometric XpantaX pentru a aduce pe ecran valoarea doritModificarea pantei poate atinge c"teva procente c"nd se utilizeaz un modul cu membrana nouModificarea pantei este de obicei foarte mic.

#xemple:Y Cransmitor Mettler tip '>5? aer( domeniu XmediuX L valoare setat pe displa7 la '55?

saturare aer(Y Cransmitor Mettler tip '>5? 31, domeniu XmediuX L valoare setat pe displa7 la 15,E?

saturare 31(Y Cransmitor Mettler tip '>5? 31ppm, domeniu XmediuX L valoare setat pe displa7 la '',16

mg 31Hl apa la '5Z si '5'4 mbarH' atm.%ac senzorul lucreaz cu alte tipuri de transmitori Mettler trebuie efectuat o calibrare n 1

puncte. &n mod particular, aceasta se recomand pentru msurtori la presiuni pariale deoxigenfoartsczute.

&n timpul calibrrii punctului zero, senzorul trebuie sa fie plasat ntr-un gel de punct zero sau ntrun alt mediu care nu conine oxigen )ex. EE,E9? azotsau dioxid de carbon$. %ac soluia analizat poatfi eliberat complet de oxigen prin saturare cu azot sau dioxid de carbon6aceasta poate fi utilizat drepetalon pentru calibrarea punctului zero. %upa '5 minute citirea ar trebui sa fie stabil i punctul zeropoate fi setat. alibrarea pantei poate fi efectuat n ap saturat cu aer sau ntr-o incinta cu aer saturat nvapori de apa. erificarea calibrrii se face periodic pentru validarea punctului zero, cu a*utorul unusimulator de oxigenMettler.

%ntretinerea electrodului

&nainte de fiecare calibrare se inspecteaz vizual membrana pentru a evidenia eventualdeteriorri. %ac membrana este murdar, aceasta se terge cu atenie, utiliz"nd o bucat de c"rp moalefin. &n funcie de natura mediului, electrolitul poate fi sc!imbat periodic. ;cesta nu ar trebui utilizat mamult de = luni.

Modulul membranei trebuie sc!imbat c"nd arat semne de mbtr"nire sau dereglri cum ar fi:- un timp de rspuns prea mare- citiri zgomotoase sau eronate- imposibilitatea de a fi calibrat- distrugeri mecanice

%nspectarea electroduluie recomand msuratori periodice ale punctului zero pentru verificarea funcionrii corecte a

senzorului. ;ceasta se poate face utiliz"nd gelul de zero sau gaze pure )EE,E9? azot sau dioxid dcarbon$.

%up ' minut ntr-un mediu liber de oxigen senzorul ar trebui s afieze mai puin de '5? dinconinutul n oxigen al aerului i dup nc '5 minute, mai puin de '? din valoarea dedus a oxigenuludin aer. alori mai mari sugereaz o distrugere a electrolitului sau a membranei.

Pstrarea electrodului

- 19 -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

29/31

#lectrodul poate fi pstrat c"teva luni, asigur"ndu-ne c este plin cu oxigen electrolitic i cmembrana este acoperit cu manonul de protecie. +entru a evita polarizarea, senzorul poate fi pstrat laun modul de depozitare Mettler.

- 1E -

7/25/2019 LP BTH Generala 2014-2015

30/31

Lucrarea practica nr.

Documents

LP BTH Generala 2014-2015