Low Throughput HLA Typing Protocol - immucor.com Documents/LC1618CEDE.2 - MIA FORA NGS HL… · Primerextension-Analysen (SSP) wurden ebenfalls zur HLA-Typisierung verwendet. Das

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MIA FORA ™NGS HLA Typisierungs-Kit Zur in vitro Diagnostik

INHALTSVERZEICHNIS

Definition von Symbolen………………..…………………… 1 Sammeln und Vorbereiten von Proben ……….. 4

Reagenzien nach Katalognummer………………….…..… 2 Verfahren…………………………………………. 5

Verwendungszweck.………………………………………… 3 A. Zur Verfügung stehende Materialien… 5

Zusammenfassung und Erklärung…………………………. 3 B. Benötigte, aber nicht zur Verfügung gestellte Materialien………………….…

5

Prinzipien des Verfahrens…………………………………… 3 Gebrauchsanleitung……………………………… 5

Reagenzien…………………………………………………… 3 Qualitätskontrolle………………………………… 12

A. Identifizierung…………………….……….……..… 3 Grenzen des Verfahrens………………………… 12

B. Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen………… 3 Spezifische Leistungsmerkmale…………… 13

C. Lagerungsvorschriften…………………..………… 4 Problemlösung…………………………………… 14

D. Reinigung oder Behandlung für den Gebrauch… 4 Beschränkte Lizenzen…………………………… 15

E. Anzeichen für Instabilität…………………….….… 4 Herstellerangaben……………………………… 15

Benötigtes Instrumentarium………………………………… 4 Verwendete Markenzeichen…………………… 15

Definition von Symbolen

Chargennummer

Katalognummer

Temperaturbegrenzung

Verfallsdatum

Seriennummer SN Reicht für <n> Tests

Achtung

Gebrauchsanweisungen

beachten

Hersteller

Autorisierter Vertreter

in der Europäischen Union

In vitro diagnostisches,

medizinisches Gerät Enthält CONT

EU-konform

08 Fall

B E I P A C K Z E T T E L

http://www.gen-probe.com/

http://www.immucor.com/


REAGENZIEN NACH KATALOGNUMMER MIA FORA NGS HLA Master-Kit Artikelnummer SR-800-10377, bestehend aus MIA FORA NGS HLA Typisierungsreagenzien-Kit (SR-800-10365) und Magnetpartikel-Kit (SR-800-10379). MIA FORA NGS HLA Typisierungsreagenzien-Kit (SR-800-10365): a) PCR Reagentien: Bestehend aus neun (9) einzelnen Ampullen

Reagens Produktnummer Füllvolumen Lagerung

24

1 HLA-A PCR Mix SR‐800‐00326

450 µL -20 bis -80 °C

2 HLA-B PCR Mix SR‐800‐00327

3 HLA-C PCR Mix SR‐800‐00328

4 HLA-DPA1 PCR Mix SR‐800‐00329

5 HLA-DPB1 PCR Mix SR‐800‐00330

6 HLA-DQA1 PCR Mix SR‐800‐00331

7 HLA-DQB1 PCR Mix SR‐800‐00332

8 HLA-DRB1-S PCR Mix SR‐-800‐-00333

9 HLA-DRB1-L PCR Mix SR‐-800‐-00334

b) Reagenzien zur Bibliotheksvorbereitung: Bestehend aus zwölf (12) einzelnen Ampullen

Reagens Produktnr. Füllvolumen Lagerung

24

10 Fragmentierungsenzym SR-800-00335 67 µL

-20 bis -80°C

11 Fragmentierungspuffer SR-800-00336 168 µL

12 STOP-Puffer SR-800-00337 225 µL

13 Schlussreparaturenzym-Mix SR-800-00338 34 µL

14 Schlussreparatur-Puffer SR-800-00339 168 µL

15 A-Schwanz-Enzym SR-800-00340 17 µL

16 A-Schwanz-Puffer SR-800-00341 118 µL

17 Ligaseenzym SR-800-00342 34 µL

18 2X Ligasepuffer SR-800-00343 917 µL

19 PCR Enzym/Puffer-Mix SR-800-00344 84 µL

20 Amplifikationsprimer SR-800-00345 12 µL

21 Nuklease-freies Wasser SR-800-00362 85 µL

c) Adapterplatte (SR-800-00349):

Beschreibung Artikelnummer Füllvolumen Lagerung Indexadapterplatte Drei gefüllte Spalten einer 96

Mikrotiterplatte

SR-800-00349 5 µL/Senke -20 bis -80 °C

Magnetpartikel-Kit (SR-800-10379):

a) Magnetpartikel: Bestehend aus einer (1) Ampulle

Beschreibung Artikelnummer Füllvolumen Lagerung

Gefüllte Ampulle, Agencourt® AMPure® XP Partikel

SR-800-00378 5 mL 2 bis 8 °C


VERWENDUNGSZWECK Das MIA FORA

TM NGS HLA Typisierungskit ist zur Amplifikation und Sequenzierung von HLA-Genen HLA -A, -B, -C, -DRB-

1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 und -DPB1 auf der Illumina NGS Sequenzierungsplattform bestimmt. Die MIA FORA Software ist zur Verwendung als Anleitung zur Bestimmung des HLA-Typs aus den mit dem MIA FORA NGS HLA Bibliothekskit erzeugten Daten gedacht. Der Test ist zur Verwendung in einem für den Umgang mit DNA kompetenten Labor zur Amplifikation und Sequenzierung bestimmt.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG Die sequenzbasierte Typisierung von PCR-verstärkten Exonen von HLA-Genen ist ein gängiges Laborverfahren. Die PCR-Amplifikation wird verwendet, um Zielsequenzen anzureichern, die anschließende HLA-Typisierung wird auf die gewählten Regionen angewandt. Andere Methoden wie die sequenzspezifische Oligonukleotidsonde (SSOP) oder sequenzspezifische Primerextension-Analysen (SSP) wurden ebenfalls zur HLA-Typisierung verwendet. Das MIA FORA NGS HLA Typisierungssystem ist eine neue HLA Typisierungsmethode, welche die Fähigkeit verwendet, alle relevanten Regionen der HLA-Loci durch Long Range PCR zu erfassen. Im Kit sind neun PCR Mastermischungen enthalten, welche alle benötigten Komponenten enthalten, um jedes Gen zu verstärken, inklusive Enzyme, Puffer, dNTPs und Primer für long range PCR-Amplifikation. Die verstärkte DNS kann dann unter Verwendung des MIA FORA NGS HLA Bibliothek-Kits verarbeitet werden, um eine DNS-Bibliothek zur Sequenzierung auf der Illumina-Sequenzierungsplattform zu erstellen. Mit dem Kit können bis zu 24 Proben in einem Multiplexverfahren unter Verwendung der Illumina Sequenzierungsplattform sequenziert werden.

PRINZIPIEN DES VERFAHRENS Das MIA FORA NGS HLA Typisierungs-Kit wurde zur Typisierung von Klasse I und Klasse II HLA-Loci durch Sequenzierung des ganzen Gens oder der informativsten Exons und Introns entwickelt. Es verwendet Long Range PCR um wichtige HLA-Gene, HLA -A, -B, -C,-DQA1,-DQB1, -DPA1, -DPB1 und -DRB1/3/4/5 zu erfassen und anzureichern. Das MIA FORA NGS Reagenzien-Kit zur Bibliotheksvorbereitung erstellt eine Bibliothek aus der verstärkten DNS zur Sequenzierung auf der Illumina Sequenzierungsplattform. Die MIA FORA NGS HLA Typisierungssoftware stellt die Sequenz der relevanten HLA-Gen- und Phaseninformation zur Verfügung, um eine hoch auflösende HLA-Typisierung zu erzielen.

REAGENZIEN

A. Identifizierung Die Tabellen im Abschnitt „Reagenzien nach Katalognummer“ enthalten eine vollständige Liste der Produkte und Katalognummern.

B. Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur für die Verwendung zur in vitro Diagnostik innerhalb der Europäischen Union. 2. Ergebnisse dieser Kits sollten nicht als alleinige Grundlage für eine klinische Entscheidung mit Auswirkungen auf den

Patienten dienen. 3. Für Vor- und Nach-PCR-Manipulationen sollten separate Labors oder abgeschlossen Laborbereiche bezeichnet werden. 4. Für Vor- und Nach-PCR-Manipulationen sollten separate Pipetten bestimmt werden. 5. Biogefährdung: Alle biologischen und alle Blutproben sollten als potentiell infektiös behandelt werden. Bei der Handhabung

allgemeine Vorsichtsmaßnahmen anwenden. 6. Pipettieren Sie nie mit dem Mund. Vermeiden Sie Haut- und Schleimhautkontakt mit Reagenzien und Proben. 7. Entsorgen Sie gebrauchtes Material gemäß den Regeln der Institution und/oder lokalen Verordnungen zur Entsorgung von

potentiell biogefährdendem Material. 8. PCR-Technologie reagiert empfindlich auf Verunreinigung, speziell durch sein eigenes Produkt. Aerosole von PCR

Fragmenten, welche während den Nach-PCR-Schritten entstehen, sind eine häufige Quelle von Verunreinigungen. Übermäßiges Spritzen und das Entstehen von Aerosolen sollte deshalb vermieden werden. Während der Verwendung des Kits sollten Standardmaßnahmen für PCR-Laboratorien angewandt werden, wie Abwischen der Arbeitsflächen mit einer frisch zubereiteten 10%-Bleiche vor der Verarbeitung oder Vorbereitung von PCR-Proben, Verwendung von ultraviolettem Licht (UV) in Abdeckhauben oder Biosicherheitsräumen zwischen den Verfahrensschritten, örtliche und zeitliche Trennung von Vor- und Nach-PCR-Aktivitäten, Verwendung von aliquotierten PCR-Reagenzien, Verwendung von positiven und negativen Kontrollen, usw. Die Anwendung einer konsistenten, sorgfältigen Technik in Kombination mit großzügiger Anwendung und Überprüfung von Kontrollen stellt einen wachsamen und proaktiven Ansatz zur Kontrolle und Überprüfung von PCR-Kontaminierung dar.

9. Laboratorien sollten ihre eigenen Reinigungsverfahren validieren. 10. Die Kontaminierung von Reagenzien oder Proben kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen; deshalb sollte die

Kontaminierung dieses Produkts während des Gebrauchs sorgsam vermieden werden. Verwenden Sie keine kontaminierten Reagenzien.

11. Verwenden Sie die mitgelieferten Kit-Flüssigkeiten. Verdünnung oder Veränderung kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Mischen Sie keine Reagenzien unterschiedlicher Chargen.

12. Verwenden Sie keine undichten oder nicht gekennzeichnete Ampullen. 13. Vorher gefrorene Proben oder Reagenzien sollten nach dem Auftauen sorgfältig gemischt und vor dem Testen zentrifugiert

werden. Vermeiden Sie das Entstehen von Schaum oder Blasen in den Proben. 14. Lagern Sie alle Enzyme und Mastermischungen während dem Auftauen auf Eis oder Kryoblöcken (2 - 8° C). 15. Stellen Sie das korrekte Verschließen der Proberöhrchen vor der Amplifikation sicher um einer Verdunstung vorzubeugen.


16. Auf Grund der Geräte-inhärenten Leistungsunterschiede von Thermocyclern können die Ergebnisse variieren, wenn die thermalen Profile zwischen unterschiedlichen Ausführungen und Modellen von Thermocycler-Instrumenten übertragen werden. In bestimmten Fällen kann die Reaktionsspezifität und -sensitivität beeinträchtigt werden, was zu Fehlern in der Interpretation und Berichterstattung von Daten führen kann. Wechselnde Thermocycler und Profile müssen durch den Anwender validiert werden.

17. Inkubationszeiten oder -temperaturen anders als angegeben können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. 18. Abweichungen von den empfohlenen Gebrauchsanleitungen können die Produktleistung beeinträchtigen. Abhängig von der

Natur und Schwere der Untersuchungsabweichungen können Versagen (sowohl einzelne Proben als auch Lauffehler) und/oder fehlerhafte Ergebnisse auftreten. Wir haben beispielsweise festgestellt, dass eine ungenügende/inaktive Partikelreinigung in der Analyse zu einer hohen Inzidenz von Fehlermeldungen des Indexadapters führen kann.

19. Es wird empfohlen, für die Analyse von Produkten der HLA Genamplifikation je nach Größe eine Gel-Elektrophorese durchzuführen. PCR-Produkte sollten mit Ethidiumbromid oder GelRed visualisiert werden; andere Farbstoffe können Bänder möglicherweise nur abgeschwächt anzeigen.

20. Magnetpartikel werden in verschiedenen Schritten des Verfahrens verwendet. Es ist wichtig, dass Ethanol vor dem Schritt der Auswaschung entfernt wird, ohne die Partikel austrocknen zu lassen. Die Oberfläche der Magnetpartikel sollte glasig aussehen und keine Flüssigkeitsansammlungen aufweisen. Die passende Trocknungszeit kann empirisch für jede Laborumgebung bestimmt werden (5-10 Minuten).

21. Verwenden Sie frisch verdünnten 80%-Ethanol für jede Partikelreinigung. 22. Nach jeder Partikelreinigung gibt es einen Anhalte-Punkt, während dem die Proben oder die Bibliothek bis zu 4 Tagen bei -

20 °C gespeichert werden kann. 23. Schützen Sie PicoGreen®-Platten vor Licht um ein Ausbleichen zu vermeiden. 24. Es ist wichtig, dass die Fragmentierungsreaktion 20 Minuten nicht überschreitet und dass die Partikelreinigung sofort

durchgeführt wird um eine korrekte Fragmentbandbreite zu erzielen. 25. Nach der A-Schwanz-Platte muss direkt der Schritt der Adapterligation angeschlossen werden. 26. Tragen Sie beim Hantieren mit der Adapterplatte frische Handschuhe, wenn Sie die Index-Adapterligationsplatte vorbereiten.

Entfernen Sie vorsichtig die Plattenabdichtung. Überprüfen Sie, dass alle Senken in den Spalten 1, 2 und 3 ungefähr 5 µl der Lösung enthalten.

27. Die amplifizierte Bibliothek sollte innerhalb 1 Stunde der Amplifikation gereinigt werden. 28. Die Schritte nach Amplifikation der Bibliothek sollten in einem Sequenzierungsraum oder in einer AirClean PCR-Box

durchgeführt werden, um eine Kontaminierung der indexadapter-ligierten DNS mit Endprodukten zu vermeiden, welche die Illumina-Clustersequenzen enthalten.

29. Das Setup für die Bibliotheksquantifizierung mit qPCR oder Qubit muss in einem PCR-Abzug und mit frischem Verdünnungspuffer für qPCR durchgeführt werden, um eine Kontaminierung zu vermeiden.

30. Führen Sie die Probendenaturierung mit frischem 0.2N Natriumhydroxid durch. 31. Führen Sie alle Sequenzierungsnachlauf- und Wartungsspülungen und regelmäßige Reinigungen durch.

C. Lagerungsvorschriften 1. Lagern Sie das MIA FORA NGS HLA Typisierungs-Kit unter -20 °C in einem Gefriergerät mit manueller Enteisung. 2. Verwenden Sie keine Komponenten über ihr Ablaufdatum hinaus. 3. Lagern Sie Magnetpartikel zwischen 2 und 8 °C.

D. Reinigung oder Behandlung für den Gebrauch Siehe „Sammeln und Vorbereiten von Proben.“

E. Anzeichen für Instabilität 1. Wenn Salze während Versand oder Lagerung aus einer Lösung ausgefällt wurden, so lösen Sie diese vor dem Gebrauch

erneut vollständig durch Verwirbeln bei Raumtermperatur (18 bis 30 °C).

BENÖTIGTES INSTRUMENTARIUM

1. Mit Heizdeckel ausgerüstete Thermocycler, einstellbare Rampenzeiten, Temperaturbereich von mindestens 2 °C bis 100 °C und Genauigkeit von mindestens +/- 0,5 °C. Bedingungen von Thermocycler müssen möglicherweise verändert werden um die Profile zu optimieren. Der Veriti Thermocycler von Applied Biosystems wurde validiert, wenn er im Standardmodus mit einer Rampenzeit von 3,9 °C/s betrieben wird.

2. Entsprechende Fluoreszenzplattenleser mit einem Anregungsfilter ~ 485 nm und einem Emissionsfilter ~535 nm zur Messung der DNS-Konzentration wie z. B. Victor X2, X3 wurden validiert.

3. Eine geeignete Methode/ein geeignetes Gerät zur Isolierung und Reinigung von DNS-Fragmenten im Umfang von ungefähr 400-500

Basenpaaren. Ein Selektionsgerät dieser Größe, das Pippin Prep™-Instrument, wurde validiert.

4. Ein optionales Liquid-Handling-System für den Aufbau einer halbautomatischen Bibliothek. Ein solches System, das Biomek 4000, wurde validiert.

5. Geeignete Methoden/Geräte für die Bibliotheksquantifizierung, wie z. B. qPCR oder Qubit. 6. Die Illumina Sequenzierplattform wurde validiert. 7. MIA FORA NGS Server und Software: Immucor Artikelnummer SR-790-00017.

SAMMELN UND VORBEREITEN VON PROBEN Humangenomische DNS kann aus Vollblut und Buffy Coats aufbereitet werden, wenn eine validierte Methode verwendet wird, welche

untenstehende Kriterien erfüllt. Aus in EDTA konserviertem Blut extrahierte DNS wurde getestet und ergibt in dieser Analyse die erwartete Leistung. Aus in Heparin konserviertem Blut gewonnene DNS kann in dieser Analyse nicht verwendet werden.


Die isolierte DNS sollte in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-9,0 oder in Nuklease-freiem Wasser vorliegen. Wenn ein Komplexbildner wie z. B. EDTA vorhanden ist, sollte die Endkonzentration des Komplexbildners 0,5 mM nicht übersteigen.

Die endgültige DNS-Konzentration sollte zwischen 5 und 15 ng/µL liegen.

Absorptionsmessungen der DNS-Probe bei 260 und 280 nm sollten ein Verhältnis von 1,65 bis 2,0 ergeben.

DNS kann unmittelbar nach erfolgter Isolierung verwendet oder bei -20 °C bis zu einem Jahr gelagert werden.Wiederholtes Einfrieren/Auftauen sollte vermieden werden, weil dies zur Degradation der DNS führen kann.

Für eine erfolgreiche Long Range PCR-Amplifikation müssen mindestens 50 % der genomischen DNS-Proben Fragmente grösser als 10 kb enthalten.

VERFAHREN

A. Enthaltene Materialien (Beachten Sie die Tabelle im Abschnitt „Reagenzien nach Katalognummer“ für spezifische Angaben)

PCR Reagenzien

Reagenzien zur Bibliotheksvorbereitung, für Indexadapter-Platte, Ampure® Magnetpartikel.

B. Benötigte Materialien, Reagenzien und Ausrüstung, welche nicht enthalten sind ● Thermocycler: Der ABI Veriti® Thermocycler wurde validiert ● Magnetische Träger für Niedervolumen-Ausspülung in 96-Mikrotiterplatten: Alpaqua Magnum FLX wurde validiert ● Magnetischer Träger für magnetische Separation von Mikrozentrifugenröhrchen: DynaMag-2 Magnet wurde validiert ● Stationäre Platteschleuder und Mikrozentrifuge-Röhrchenschleuder ● Pipetten, Mehrkanalpipetten und Spitzen (1-20 µL, 20-200 µL, 1000 µL) ● Klebedichtungen für PCR-Platten. Accuseal PCR-Klebefilm (E & K Scientific Katalognr. T796150, 4titude Katalognr. 4ti-0500) wurden

validiert ● 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und PCR Röhrchenband ● Vortex-Mischer ● Hart-, vollerbauhöhe 96-Senken-Halbrahmenplatten (E & K Scientific Katalognr. EK-75012, 4titude Katalognr. 4ti-0770/C) ● 96 Mikrotiterplatte PP Schwarz, v-Unterteil kaminförmig (E & K Scientific Katalognr. 21209, Greiner Bio-One Katalognr. 651209) ● MicroAmp® optische 96-Senken-Reaktionsplatte (ThermoFisher Katalognr. N8010560) ● MicroAmp® optisches Abdichtband, stark haftend (E & K Scientific Katalognr. T796400, ThermoFisher Katalognr. 4311971) ● Behälter für Reagenzien ● Durchsichtige Dichtungsband-Pads ● Aluminium Verschlusstape ● Linsenpapier ● Gefilterte (aerosolbeständige) Einmal-Pipettenspitzen in den Größen 0,1 µL bis 1000 µL ● Ethanol 200 (100% Ethanol) mikrobiologisch hochrein ● 10mM Tris-HCl pH 8,0 ● 100 % Tween 20 ● Natriumhydroxid, 1N ● Nuklease-freies Wasser ● 1,5 % Agarose, farbstofffrei, interne Standards, Pippin Prep

TM, 250bp-1,5kb, (Sage Science, CDF1510)

● PhiX Control, v3 (Illumina Katalognr. FC-110-3001) ● Reagenzien für DNS Fluoreszenzkonzentrationsbestimmung: das Quant-iT™ Picogreen

® DNS-Analyse-Kit wurde validiert

● MiSeq® V2 300 Zyklus-Kit (Illumina Katalognr. MS102-2002) ● MiniSeq® Reagenzienkit mit mittlerer Ausgabe, 300 Zyklen (Illumina Kat.-Nr. FC-420-1004) ● Exakte Bibliotheksquantifizierungsmethode/Gerät: Sowohl das KAPA Blibliothekenquatifizierungskit als auch das Qubit-Fluormeter

wurden validiert

GEBRAUCHSANLEITUNG Die Analyse für einen Durchlauf von 24 Proben kann gemäß dem manuellen Protokoll wie unten beschrieben erfolgen. Detaillierte Automatisierungsprotokolle für 8, 16 oder 24 Proben und automatische Protokolle für 24 Proben unter Verwendung des Biomek 4000 sind bei Ihrem technischen Verkaufsspezialisten von Immucor verfügbar. ANMERKUNGEN:

• Gehen Sie beim Aliquot-Verfahren mit äußerster Vorsicht vor. Verwenden Sie kalibrierte Pipetten, andernfalls kann es zum Verlust des Reagens und Versagen der Analyse kommen.

• Alle Temperaturen müssen exakt eingehalten werden. • Wärmen Sie Magnetpartikel vor Verwendung auf Raumtemperatur an .

• Das amplifizierte Produkt kann vor der Verwendung bis zu 4 Tage bei -20 °C gelagert werden. Das amplifizierte Produkt kann nur einmal gefroren und aufgetaut werden. Wiederholtes Gefrieren und Auftauen kann zur Degradierung des verstärkten Produkts und zu schlechten Ergebnissen führen, wenn damit eine Bibliothek erstellt wird.

A. Genomische DNS-Reinigung Reinigen Sie genomische DNS mit der Methode Ihrer Wahl. Für die DNS-Proben bestehen folgende Anforderungen:

Genomische DNS-Proben müssen mit einer DNS-Extraktionsmethode, die DNS mit hohem Molekulargewicht erzeugen kann, aus Vollblut oder Buffy Coat extrahiert werden.

Die DNS muss in Nuklease-freiem Wasser verdünnt und bei mindestens -20 °C gelagert werden.


Die endgültige DNS-Konzentration sollte zwischen 5 und 15 ng/µL betragen; alle Proben sollten ähnliche Konzentrationen aufweisen. Passen Sie sie nötigenfalls mit Nuklease-freiem Wasser an.

Für eine erfolgreiche Long Range PCR sollten mindestens 50 % der extrahierten genomischen DNS-Fragmente größer als 10 Kb sein.

B. DNS-Amplifikation (PCR)

PCR Einstellung 1. Füllen Sie die Datei für Probenstrichcodes (eine Windows kommagetrennte CSV-Datei) mit Probenbezeichnungen und

Strichcodezuordnungen wie in Abbildung 1 gezeigt aus.

Abbildung 1. Beispiel einer Datei für Probenstrichcodes

2. Erstellen Sie in der MIA FORA-Software ein Projekt, nachdem Sie eine Datei für Probenstrichcodes mit den Probenzeichnungen und den Strichcodes erstellt haben. Die Projektbezeichnung wird für die Bezeichnung des Sequenzer Run benötigt.

3. Bezeichnen Sie drei Hartschalen-halbgerahmte PCR-Mikrotiterplatten mit 96 Senken. 4. Bereiten Sie eine Probenplatte mit 100 µL genomischer DNS pro Senke für jede Probe, mit einer Konzentration von 5-15 ng/µL,

verdünnt in Nuklease-freiem Wasser. Die Probenplatte sollte in den Spalten 1, 2 und 3 einer 96-Senken-Mikrotiterplatte angeordnet werden. Siehe die Probenplatte in

Abb. 2. Senke A1 sollte die 10mM Tris-HCl pH 8.0 negative Kontrolle (NTC) ohne DNS sein, gefolgt von Probe 1 in B1, Probe 2 in C1 bis zu Probe 23 in H3 (Abb. 2 - Probenplatte).

5. Tauen Sie die PCR Mastermischungen (P1-P9) auf, mischen Sie mittels Inversion oder kurzem Schleudern und Drehen. 6. Zentrifugieren Sie die Probenplatte von Schritt 4 in einer Zentrifuge mit Plattenhalter für 2 Min. um sicherzustellen, dass sich die

genomische DNS zuunterst in der Senke befindet. 7. Geben Sie 15 µL der PCR-Mischungen P1-P9 in die Spalten 1-9 jeder der drei Hartschalen-halbgerahmten 96-Senken-PCR-

Platten, so dass jede Vertiefung der Spalte die gleiche PCR-Mischung enthält (Abb. 2). 8. Gehen Sie sorgfältig vor, um Blasen in der PCR-Mastermischung zu vermeiden. 9. Verteilen Sie die Proben der Probenplatte mit einer Mehrkanalpipette wie folgt (Abb. 2):

Spalte 1 der Probenplatte: 10µL NTC und Proben 1-7 in Spalte 1 (A1-H1) in jede der neun Spalten der PCR-Platte 1. Spalte 1 der Probenplatte: 10µL der Proben 8-15 in Spalte 2 (A2-H2) in jede der neun Spalten der PCR-Platte 2. Spalte 1 der Probenplatte: 10µL der Proben 16-23 in Spalte 3 (A3-H3) in jede der neun Spalten der PCR-Platte 3. HINWEIS: Vorsicht beim Mischen der Proben, um Blasen in der PCR Mastermischung zu vermeiden (Abb. 2)

10. Dichten Sie die PCR-Platten mit PCR Klebefilm ab und zentrifugieren Sie sie kurz. Legen Sie sie in 3 separate Thermocycler, und starten Sie das MIA FORA HLA_PCR-Programm mit Heizdeckeleinstellung. Siehe Tabelle 1.

SICHERER ANHALTEPUNKT

PCR-Produkte können bei -20 °C bis zu 4 Tage bis zum Schritt des Genbalancing gelagert werden.


Abbildung 2. Anordnung der Proben und PCR-Einstellung

Tabelle 1. Bedingungen der Amplifikation für Thermocycler

Zyklen (15) Zyklen (20)

Anfänglicher Halt Denaturierung Hybridisierung Polymerisation Denaturierung Hybridisierung Polymerisation Endgültige

Polymerisation

Halt

94°C/30s 94°C/1:15 m 60°C/30 s 66°C /7:30 m 94°C/30 s 60°C/30 s 66°C/7:30 m 66°C/10 m 4°C/∞

11. Optional: Die Amplifikation kann durch wenige repräsentative Proben auf einem 0,8 % Agarosegel geprüft werden, welches

Ethidiumbromid oder Gel Red enthält.Die Elektrophorese sollte bei 90 Volt für 40 Minuten durchgeführt werden. Die PCR-

Fragmente können zwischen den Proben auf Grund von Unterschieden in den Intronen variieren. Die ungefähre Größe für die

PCR-Produkte ist in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2: Größen der Amplifikationsprodukte

HLA-Locus Größe (kb)

HLA-A 3,2

HLA-B 4,1

HLA-C 4,4

HLA-DPA 5,0

HLA-DPB 5,2

HLA-DQA 5,8

HLA-DQB 6,3

HLA-DRB1 0,9

HLA-DRB2 5,6

C. Abgleichen und Pooling von PCR-Produkten

Die Konzentration jedes PCR-Produkts kann mit einem entsprechenden Fluoreszenzreagens zur DNS-Quantifizierung, wie z. B. PicoGreen® bestimmt werden.


Auf der Grundlage der Fluoreszenzmessungen werden die PCR-Produkte aller neun PCR-Reaktionen für jede Probe gemäß dem

Ergebnis von SironaQuant™, welches auf dem MIA FORA NGS HLA-System verfügbar ist, abgeglichen und geprüft. Die gepoolten

Proben werden dann zur Vorbereitung der Fragmentierung gereinigt.

Abgleichen und Poolen

Abbildung 3. PicoGreen® Analyseeinstellung

1. Quantifizieren Sie die PCR-Produkte mit dem PicoGreen® Reagens: Bringen Sie das PicoGreen®-Reagens auf Raumtemperatur und verdünnen Sie es mit 1X TE Puffer (50 µL PicoGreen®+ 7450 µL 1xTE). Schleudern Sie es zum Mischen und schützen Sie es bis zum Gebrauch vor Licht. Hinweis: Folgen Sie dem Beipackzettel der Reagenzien, falls Sie andere Reagenzien für die PCR-Quantifizierung verwenden.

2. Bereiten Sie seriell verdünnte Standardlösungen in Mikrozentrifugenröhrchen vor. Verwenden Sie dazu die im PicoGreen®-Kit enthaltene 100ng/µL-Kontrolle. Verteilen Sie 20 µL jeder Standardlösung in die Senken A10-E12 der PicoGreen® Platte 1 (schwarze vollgerahmte Messplatten). Siehe Abb. 3. Transferieren Sie 20 µL 1xTE Puffer in die Senken F10, F11 und F12 der PicoGreen®-Platte 1. Siehe Abb. 3.

3. Geben Sie 20 µL verdünntes PicoGreen® in jede Senke der drei PicoGreen®-Platten, inklusive der Standardsenken in Platte 1. Siehe Abb.3.

4. Verteilen Sie 19 µL 1xTE Puffer in drei PicoGreen® Platten im selben Format wie die drei PCR-Platte. Geben Sie 1 µL PCR-Produkte zu den drei PicoGreen®-Platten hinzu, so dass die Anordnung den Original-PCR-Platten entspricht und um eine 1:20 Verdünnung der PCR-Produkte zu erzielen. Das Endvolumen in allen gemessenen Senken beträgt 40 µL

5. Zentrifugieren Sie die Platte und inkubieren Sie sie für mindestens 5 Min. bei Raumtemperatur. Schützen Sie die Platte während der Inkubation vor Licht.

6. Messen Sie die Fluoreszenz mit Anregungsfiltern von ~ 485 nm / Emissionsfiltern von ~ 535 nm, 0,1s (Victor X3). 7. Speichern Sie die Ausgabedei unter Verwendung folgender Namenskonvention: (Hinweis: Windows: Text

tabulatorgetrennt verwenden; MacOS: Windows formatierten Text verwenden). Project_COLUMN1_Date.txt (z. B. ProjectX_COLUMN1_123115.txt) Project_COLUMN2_Date.txt (z. B. ProjectX_COLUMN2_123115.txt) Project_COLUMN3_Date.txt (z. B.. ProjectX_COLUMN3_123115.txt)

Starten Sie das SironaQuant Balancierungsprogramm in der MIA FORA Software. Der empfohlene pmole-Wert liegt zwischen 0,0035 und 0,0009 pmol.

8. Halten Sie die PCR-Platten an und beschriften Sie eine neue Platte für den nächsten Schritt als "“Project_pooled

PCR_date”.

9. Verdünnen Sie die PCR-Produkte von jedem Locus vor dem Pooling mit 10mMTris HCl Puffer pH8.0 gemäss dem SironaQuant-Ergebnis.

10. Konsolidieren Sie PCR-Produkte von allen 9 PCR-Reaktionen für jede Probe durch Übertragen der im SironaQuant-Ergebnis angegebenen Volumina.

11. Verschließen Sie die Platten und speichern Sie sie bei -20 °C und fahren Sie sofort mit dem Partikelreinigungsschritt. fort.

12. Bringen Sie die Magnetpartikel auf Raumtemperatur und mischen Sie sie durch Schleudern zu gleichmäßig resuspendierten Partikeln.

13. Fügen Sie 55 µL Partikel pro Senke konsolidierter Proben hinzu. Mischen Sie DNS und Partikel durch mindestens 10-maliges Hoch- und Runterpipettieren.

14. Inkubieren Sie die DNS-Partikel-Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Transferieren Sie die Platte für 5 Minuten zum Magneten.


15. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, damit die Partikel nicht gestört werden, während die Platte auf dem Magnet steht.

16. Lassen Sie die Platte für die Ethanolwaschschritte auf dem Magneten. Fügen Sie 200µL frisch verdünntes 80 % Ethanol zu jeder Senket hinzu, inkubieren Sie für 30 Sekunden und entfernen und entsorgen Sie dann sorgfältig das Ethanol.

17. Wiederholen Sie die Ethanolauswaschung zwei weitere Male (insgesamt 3 Auswaschungen). Entfernen Sie alle Ethanolspuren nach der dritten Auswaschung.

18. Entfernen Sie die Platte vom Magneten und lassen Sie die Partikel an der Luft trocknen. Die Oberfläche der Magnetpartikel sollte glasig aussehen und keine Flüssigkeitsansammlungen aufweisen. Die passende Trocknungszeit kann in jedem Labor empirisch bestimmt werden (5-10 Minuten).

19. Geben Sie 35 µL auf Raumtermperatur gebrachtes 10 mMTris-HCl pH8,0 in jede Senke. Mischen Sie durch Pipettieren und inkubieren Sie für 5 Minuten.

20. Bringen Sie die Platte auf den Magneten und inkubieren Sie 5 Minuten oder bis die Lösung klar ist. 21. Bringen Sie, während die Platte auf dem Magneten verbleibt, 30 µL des Eluats in die neue 96-Senken-PCRrPlatte, die

wie folgt beschriftet ist: Project_Balanced_clean_date.

SICHERER ANHALTEPUNKT Gepoolte und gereinigte Proben können bei -20 °C bis zu 4 Tage zur Fragmentierung gelagert werden.

D. Konstruktion der Sequenzierungsbibliothek

a. Fragmentierung

1. Stellen Sie vor Schritt 8 einen Labortimer auf 20 Minuten. 2. Aliquotieren Sie 20µL des Stopp-Puffers aus Röhrchen 12 in jede Senke der Spalte 11 der neuen 96-Senken-Platte,

bezeichnet als Fragmentierungsplatte. 3. Bereiten Sie die Fragmentierungs-Mastermischung vor, indem Sie 134 µL aus Röhrchen 11 (Fragmentierungspuffer) in

Röhrchen 10 (Fragmentierungsenzym) transferieren. Mischen Sie gründlich durch Schleudern und zentrifugieren Sie kurz.

4. Pipettieren Sie 23 µL der in Schritt 3 vorbereiteten Fragmentierungs-Mastermischung in jede Senke der Spalte 12 der Fragmentierungsplatte um eine Mastermischungs-"Reservoir"-Spalte zu erstellen.

5. Transferieren Sie 6 µL der Fragmentierungs-Mastermischung aus Spalte 12 in jede Senke der Spalten 1, 2 und 3 der Fragmentierungsplatte.

6. Transferieren Sie 14 µL der Probe aus Spalte 1 der gepoolten, partikelgereinigten Platte aus dem vorangehenden Abschnitt (Project_Balanced_clean_date) in Spalte 1 der Fragmentierungsplatte. Mischen Sie durch 5-maliges Hoch- und Runterpippetieren.

7. Transferieren Sie 14 µL der Probe aus Spalte 2 der gepoolten, partikelgereinigten Platte aus dem vorangehenden Abschnitt (Project_Balanced_clean_date) in Spalte 2 der Fragmentierungsplatte. Mischen Sie durch 5-maliges Hoch- undRrunterpippetieren.

8. Transferieren Sie 14 µL der Probe aus Spalte 3 der gepoolten, partikelgereinigten Platte aus dem vorangehenden Abschnitt (Project_Balanced_clean_date) in Spalte 3 der Fragmentierungsplatte. Mischen Sie durch 5-maliges Hoch- und Runterpppetieren.

9. STARTEN SIE DEN TIMER und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Es ist wichtig dass die Reaktion 20 Minuten nicht überschreitet.

10. Transferieren Sie unmittelbar nach 20 Minuten Inkubation 5 µL STOPP-Puffer aus Spalte 11 in die Spalten 1, 2 und 3 und mischen Sie gründlich durch 5-maliges Hoch- und Runterpipettieren nach jedem Hinzufügen.

11. Pipettieren Sie 200 µL auf Raumtemparatur gebrachte Magnetpartikel in jede Senke der Spalte 10 der Fragmentprobenplatte oder in einen sauberen PCR Röhrchenstreifen.

12. Fügen Sie aus Spalte 10 40 µL Magnetpartikel in jede Senke der fragmentierten DNS und mischen Sie langsam durch 10-maliges Hoch- und Runterpipettieren. Inkubieren Sie die DNS-Partikel-Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten.

13. Bringen Sie die Platte für 5 Minuten zum Magneten, um die Partikel an die Seiten der Senke zu binden und entfernen Sie den Überstand sorgfältig mit einer Pipette.

14. Lassen Sie die Platte für die Ethanolwaschschritte auf dem Magneten. Waschen Sie jede Senke mit 200 µL 80 % Ethanol, inkubieren Sie für 30 Sekunden und entfernen Sie die Flüssigkeit sorgfältig mit einer Mehrkanalpipette, ohne die Partikel zu stören.

15. Wiederholen Sie die Ethanolauswaschung ein weiteres Mal (insgesamt 2 Auswaschungen). 16. Entfernen Sie die Platte vom Magneten und lassen Sie sie an der Luft trocknen, bis das überschüssige Ethanol

verdampft ist und die Pellets aus Magnetpartikel glasig erscheinen. 17. Entfernen Sie die Platte vom Magneten. Fügen Sie 20 µL von auf Raumtemperatur gebrachten 10mM Tris-HCl Puffer

pH8,0 zu den Partikeln hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und inkubieren Sie für 5 Minuten weg vom Magneten. 18. Bringen Sie die Platte auf den Magneten und inkubieren Sie für 5 Minuten. 19. Bringen Sie 15 µL des Eluates in die neue 96-Senken-Hartschalen-PCR-Platte, beschriftet als

Project_Fragmented_Clean_Date und verschließen Sie die Platte. Die Proben sind nun bereit für den Schritt der Endreparatur.


SICHERER ANHALTEPUNKT Die fragmentierten und gereinigten Proben können bei -20 °C gelagert werden, bis der Schritt der Endreparatur bereit ist. Die gut verschlossene fragmentierte und gereinigte Platte kann bei -20 °C sicher bis zu 4 Tagen gelagert werden.

b. Endreparatur

1. Beschriften Sie die zuvor fragmentierte und gereinigte Platte neu als: Project_Endrepair_Date 2. Bereiten Sie die Endreparatur-Mastermischung durch Hinzufügen von 136 µL aus Röhrchen 14 (Endreparatur-Puffer)

zu Röhrchen 13 (Endreparatur-Enzym), schleudern Sie sie kurz. 3. Pipettieren Sie 18,5 µL der in Schritt 1 vorbereiteten Endreparatur-Mastermischung in Spalte 12 der Schlussreparatur-

Platte, bezeichnet als Project_Endrepair_date, um eine „Reservoir“-Spalte zu erstellen. 4. Transferieren Sie 5 µL der Endreparatur-Mastermischung aus Spalte 12 in die Spalten 1, 2 und 3 der fragmentierten

und gereinigten DNS, bezeichnet als Project_Fragmented_Clean_Date, die im vorhergehenden Abschnitt vorbereitet wurde und mischen Sie durch 5-maliges Pipettieren

5. Verschließen Sie die Platte mit PCR-Klebefilm und zentrifugieren Sie kurz um sicherzustellen, dass sich alle Flüssigkeit auf dem Boden der Senke befindet.

6. Bringen Sie die Endreparatur-Platte, bezeichnet als Project_Endrepair_Date, in einen Thermocycler und führen Sie das MIA_FORA_Endreparaturprogramm durch, wie in Tabelle 3 gezeigt.

7. Halten Sie die Platte bei -20 °C bis zur Polyadenylierung.

SICHERER ANHALTEPUNKT Die Endreparatur-Platte kann bei -20 °C für bis zu 4 Tage gelagert werden, bis der Schritt der Polyadenylierung bereit ist.

Tabelle 3: Thermocycling-Programm für die Endreparatur

MIA FORA_End_Repair

20 °C für 30 Min.

70 °C für 10 Min.

4 °C ∞ Halt

c. Polyadenylierung

1. Bereiten Sie die Polyadenylierung-Mastermischung durch Hinzufügen von 85 µL aus Röhrchen 16 (Polyadenylierungs-Puffer) zu Röhrchen 15 (Polyadenylierungs-Enzym) und schleudern Sie sie kurz.

2. Pipettieren Sie 12 µL der in Schritt 1 vorbereiteten Polyadenylierungs-Mastermischung in Spalte 11 der Endreparatur-Platte, um eine „Reservoir“-Spalte zu erstellen.

3. Transferieren Sie 3 µL der Polyadenylierungs-Mastermischung aus Spalte 11 in die Spalten 1, 2 und 3 der Endreparatur-Platte, bezeichnet als Project_Endrepair_Date, die im vorhergehenden Abschnitt vorbereitet wurde und mischen Sie durch 5-maliges Hoch- und Runterpipettieren. Platte neu mit Project_Atail_Date beschriften.

4. Bringen Sie die Platte in einen Thermocycler und starten Sie das MIA_FORA_Polyadenylierungsprogramm, wie in Tabelle 4 gezeigt.

5. GEHEN SIE innerhalb von 30 Minuten ZUM SCHRITT DER INDEXADAPTOR-LIGATION über.

Tabelle 4: Thermocycling-Programm für die Polyadenylierung

MIA FORA_A-tail

37 °C für 30 Min.

75 °C für 20 Min.

4 °C ∞ Halt

d. Indexadapter-Ligation

1. Verwenden Sie frische Handschuhe, während Sie mit der Adapterplatte hantieren. Drehen Sie die Adapterplatte kurz,

bevor Sie den Plattenverschluss entfernen. Entfernen Sie ie Plattenabdichtung vorsichtig von der Adapterplatte. Überprüfen Sie, dass alle Senken in den Spalten 1, 2 und 3 ungefähr 5 µl der Lösung enthalten.

2. Bereiten Sie die Ligation-Mastermischung durch Hinzufügen von 850 µL aus Röhrchen 18 zu Röhrchen 17 (Ligase-Enzym) zu und schleudern Sie sie kurz.

3. Pipettieren Sie 95 µL der in Schritt 2 vorbereiteten Ligations-Mastermischung in Spalte 10 der A-Schwanz-Platte, bezeichnet als Project_Atail_Date aus dem vorhergehenden Abschnitt, um eine „Reservoir“-Spalte zu erstellen, Platte neu beschriften mit Project_Ligation_Date“.

4. Transferieren Sie 26 µL der Ligations-Mastermischung aus Spalte 10 in die Spalten 1, 2 und 3 der Polyadenylierungs-Platte und mischen Sie durch 5-maliges Hoch- und Runterpipettieren.

5. Bringen Sie 2,5 µL des Adapters in die entsprechenden Senken der Ligations-Platte. 6. Mischen Sie gründlich und verschliessen Sie die Platte mit einem PCR-Klebefilm. Kurz zentrifugieren. 7. Bringen Sie die Ligations-Platte in einen Thermocycler und starten Sie das MIA FORA_Ligationsprogramm, wie in

Tabelle 5 gezeigt.


Tabelle 5: Thermocycling-Programm für die Adapter-Ligation

MIA FORA_Ligation

25 °C für 30 Min.

65 °C für 10 Min.

4 °C ∞ Halt

e. Konsolidierung von Adapter-ligierten Produkten

1. Kombinieren Sie 20 µL aus jeder Senke der Project_Ligation_Date-Platte aus dem vorangehenden Abschnitt in ein einziges 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen. Beschriften Sie das Röhrchen mit „Project-Date-Consolidated“

2. Fügen Sie 865 µL magnetische Partikel in das mit Project-Date-Sonsolidated beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie gründlich mittels verwirbeln. Inkubieren Sie für 10 Minuten.

3. Bringen Sie das Röhrchen zum magnetischen Rack, bis die Lösung klar ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. 4. Belassen Sie das Röhrchen auf dem Magneten und fügen Sie 1 mL 80 % Ethanol hinzu und inkubieren Sie für 30

Sekunden. Entfernen Sie das 80 % Ethanol ohne die gebundenen Magnetpartikel zu stören. 5. Wiederholen Sie die Ethanolauswaschung (Schritt 4) ein weiteres Mal (insgesamt 2 Auswaschungen). Entfernen Sie

soviel Ethanol aus dem Röhrchen wie möglich. 6. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magnet-Rack und lassen Sie die Partikel 5-10 Minuten an der Luft trocknen, bis die

Pellets aus Magnetpartikel glasig erscheinen. 7. Resuspendieren Sie die Partikel in 63 µL in auf Raumtemperatur gebrachtem 10mMTris-HCl pH8,0. Schleudern und

inkubieren Sie für 5 Minuten. 8. Bringen Sie das Röhrchen auf den Magneten, bis die Lösung klar ist, und transferieren Sie 60 µL des Eluates, welches

die gereinigten Adapter-ligierten Proben enthält, in ein sauberes Mikrozentrifugen-Röhrchen.

SICHERER ANHALTEPUNKT Gepoolte und gereinigte Adapter-ligierte Proben (Bibliothek) können für 4 Tage bei -20 °C gelagert werden, bis die Größenselektion bereit ist.

f. Größenselektion und Amplifikation der größenselektierten Bibliothek (Pippin Prep)

HINWEIS: Die amplifizierte Bibliothek sollte nach der Amplifikation innerhalb 1 Stunde gereinigt werden 1. Führen Sie eine geeignete Größenselektions-Methode an der Bibliotheksvorbereitung durch, um Fragmente von

ungefähr 400-500 Basenpaaren zu isolieren.Folgen Sie der Gebrauchsanleitung des Produkts, falls Sie nicht Pippin Prep verwenden.

2. Mischen Sie 30 µL der Bibliothek mit 10 µL eines geeigneten Markers und laden Sie es in eine Spur einer Pippin-Kasette. 3. Erstellen und starten Sie ein Programm, um eine Bibliothek mit Fragmentgröße von 400-500 bp zu wählen. 4. Tauen Sie Amplifikationsmodule, aus den Röhrchen 19, 20 und 21 der Bibliotheksvorbereitungs-Kits auf, setzen Sie die

Reaktion wie folgt in einem 0,2 mL PCR Röhrchenband zusammen: Mischen Sie 25 µL Amplifikationsmischung aus Röhrchen 19, 2 µL Primer aus Röhrchen 20, 18 µL nuklease-freies Wasser aus Röhrchen 21 und 5 µL des größenselektierten Eluates.

5. Mischen Sie leicht und drehen Sie das Röhrchen. Bringen Sie es in einen Thermocycler und amplifizieren Sie mit MIA FORA_Library_PCR wie in Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6: Thermocycler-Programm

Zyklus (1) Zyklen (12) Zyklus (1)

Erster Halt Denaturierung Hybridisierung Polymerisation Endpolymerisation Halt

98 0C /30 s 98 0C /15 s 65 0C /30 s 72 0C /30 s 72 0C/5 m 4 0C ∞

E. Sequenzierungsvorbereitung

HINWEIS: Führen Sie alle Nach-Amplifikationsschritte in einem dafür bestimmten Bereich des Labors, vorzugsweise in einem PCR-sicheren Laborabzug, aus, um einer Kontaminierung der Arbeitsoberflächen und der Sequenzierreagenzien vorzubeugen.

1. Transferieren Sie 50 µL der amplifizierten Bibliothek in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 50 µL auf Raumtemperatur gebrachte Magnetpartikel zur Bibliothek hinzu. Mischen Sie gründlich und inkubieren Sie für 10 Minuten.

2. Legen Sie das Röhrchen nach 10 Minuten in einen magnetischen Röhrchenhalter, bis die Lösung klar ist, 5-8 Minuten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.

3. Belassen Sie das Röhrchen auf dem Magneten, fügen Sie 200 µL 80 % Ethanol hinzu und inkubieren Sie für 30 Sekunden. Entfernen Sie das 80 % Ethanol ohne die gebundenen Partikel zu stören.

4. Wiederholen Sie die Ethanolauswaschung (Schritt 3) zwei Mal (total zwei Auswaschungen). Entfernen Sie soviel Ethanol aus dem Röhrchen wie möglich.

5. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetrack und lassen Sie die Partikel an der Luft für 5-10 Minuten trocknen bis die Pellets der Magnetpartikel glasig erscheinen.

6. Resuspendieren Sie die Partikel in 17 µL auf Raumtemperatur gebrachtes 10mMTris-HCl pH8.0. Mischen Sie und inkubieren Sie für 5 Minuten.

7. Legen Sie das Röhrchen auf den Magneten bis die Lösung klar ist und transferieren Sie 15 µL des Eluats, welches die gereinigte, amplifizierte Sequenzierbibliothek in eine sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.


SICHERER ANHALTEPUNKT Eluierte Proben können für 4 Tage bei -20 °C gelagert werden.

8. Bestimmen Sie die Konzentration der Bibliothek mit einer Methode, welche die DNS-Konzentration exakt misst. Immucor

empfiehlt entweder qPCR- oder Qubit-Methoden, um die Konzentration der Bibliothek zu schätzen. 9. Aufgrund der Beschaffenheit des Sequenzierers, sollte die Konzentration der Sequenzierungsbibliothek über 10 nM liegen.

Die Größenverteilung der Bibliothek kann durch Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese oder eines beliebigen anderen Kapillarelektrophorese-Systems bestimmt werden, um die Größe der resultierenden Bibliothek zu verifizieren.

10. Verdünnen Sie die Bibliothek auf 4 nM und bereiten Sie dann eine 8 pM (Qubit) oder 12 pmM (qPCR) endgültig denaturierte Bibliothek für die MiSeq®- und 1,3 pM (Qubit) endgültig denaturierte Bibliothek für den MiniSeq® vor. Die Bibliothek kann, falls gewünscht, mit 5 % PhiX Spike-Kontrolle versehen werden.

11. Laden Sie die deanturierte Bibliothek in die Kasette und führen Sie sie auf dem Sequenzierer aus. 12. Befolgen Sie die Illumina-Anleitung zur Sequenzierung der Bibliothek. Stellen Sie sicher, dass der Dateiname im Probenblatt

dem während der Langzeit-PCR-Einstellung erstellten Projektnamen entspricht.

F. Datenanalyse

Die vom Sequenzierinstrument erstellten fastq-Dateien sollten mit der MIA FORA Software analysiert werden, um das HLA-Typing zu erzeugen. Das Probenblatt mit den Probennamen und Barcodes, und die entsprechenden fastq-Dateien sollten in die Projektdatei der MIA FORA Software geladen werden. Befolgen Sie für den Gebrauch der MIA FORA Software die Bedienungsanleitung der Software.

ERGEBNISSE

1. PCR Amplifikation: Die Agarose-Gelanalyse sollte keine Produkte in der Negativkontrolle (NTC) des Durchlaufs aufweisen um gültig zu sein. Agarosegel von amplifizierten Produkten kann auf Grund unterschiedlicher Intron-Sequenzen in der Größe variieren. Beachten Sie Tabelle 2 für ungefähre Größe der Bänder.

2. Bibliotheksvorbereitung: Das Bibliotheks-Kit sollte eine Bibliothek erstellen, wenn das Input-DNS-Niveau in SironaQuant zwischen 0,0009 und 0,0035 pmol liegt. Die endgültige Konzentration der Bibliothek sollte bei mindestens 10 nM liegen und sollte vor der Sequenzierung exakt quantifiziert werden. Bibliotheken sollten vor der Denaturierung auf 4 nM verdünnt werden. Das Clustering auf MiSeq®- und und MiniSeq®-Kits kann abhängig von der Genauigkeit der Quantifizierung variieren. Typischerweise sollten Clusterdichten von 8-12 pM Bibliotheken im Bereich von 600-800 K/mm

2 auf dem MiSeq®- und 160-

220 K/mm2 auf dem MiniSeq® liegen.

Es muss darauf geachtet werden, dass die Bibliohek genau quantifiziert wird. Alle Nach-Adapter-ligierten Produkte müssen in einem PCR-Abzug oder einer dafür bestimmten Zone gehalten werden und frische Verdünnungsreagenzien müssen zur Verhinderung einer Kontamination zubereitet werden.

3. HLA-Typisierung wird durch die MIA FORA NGS Software erzeugt und wird in einem Bericht bereitgestellt. Befolgen Sie die MIA FORA Software-Benutzeranleitung für HLA-Typisierungs-Datenanalyse.

QUALITÄTSKONTROLLE Eine negative Kontrolle und eine optionale bekannte Kontrolle müssen mit jedem Test durchgeführt werden, so wie z. B. ein Reinwassertest und eine früher typisierte Probe. Beim Entfernen der Plattenabdichtungen muss mit extremer Vorsicht vorgegangen werden, und die Platten müssen vor dem Öffnen nach unten gedreht werden. Für jeden Schritt, bei dem Platten verschlossen werden müssen, sind neue Plattenverschlüsse zu verwenden. Die verwendeten Pipettenspitzen sollten in geeignete Sammelbehälter gelegt und entsorgt werden. Die PCR-Vorbereitung muss in einem Vor-PCR-Raum durchgeführt werden, welcher von den Räumen getrennt ist, wo mit amplifizierten Produkten hantiert wird. Alle genomische DNS muss mit nuklease-freiem Wasser verdünnt werden. Nach der DNS-Grössenselektion und Amplifikation muss mit der amplifizierten Bibliothek in einem separaten Bereich hantiert werden, vorzugsweise in einem PCR-Abzug, und es muss ein separater Satz von Pipetten verwendet werden. Es muss streng darauf geachtet werden, dass die Arbeitsflächen nicht mit amplifizierten Bibliotheken kontaminiert werden. Die Analyse sollte wie in dieser Produktbeilage beschrieben durchgeführt werden und mit beliebigen andern Qualitätssicherungsverfahren begleitet werden, welche durch lokale, staatliche, bundesstaatliche und/oder andere Akkreditierungsbehörden vorgeschrieben sind.

GRENZEN DES VERFAHRENS 1. Die in dieser Produktbeilage beschriebene PCR und Analyse setzt präzise kontrollierte Bedingungen voraus. Abweichungen von

validierten Parametern können zu einem Versagen des Produkts führen. 2. Wenn mindestens 50% der initialen DNA-Fragmente kleiner als 10 kb sind, kann möglicherweise keine genügende Menge der

Breitband-PCR-Produkte erzielt werden. 3. Wenn die Bibliothekskonzentration am Ende unter 10 nM liegt, können möglicherweise keine genauen Sequenzierungsergebnisse

erzielt werden. 4. Im 4. Feld werden auf Grund der fehlenden Deckung in der Intron-Region Doppeldeutigkeiten auftreten. 5. Zusätze in der PCR-Mischung können mit häufig in der Agarose Gelelektrophorese verwendeten nicht-toxischen Alternativen von

Ethidiumbromid interferieren und können zu einer reduzierten Bandintensität führen. 6. SYBR®Green-gefärbte Agarosegels eignen sich nicht für PCR-Produkte. Für die Visualisierung von PCR-Produkten sollte

Ethidiumbromid oder GelRed ™verwendet werden. 7. Der DPB1 Primer amplifiziert nicht Exon 1 und Exon 5. Deshalb werden alle bekannten Polymorphismen in diesen Exons nicht

sequenziert und werden im Bericht als mehrdeutig aufgeführt.


8. Das Fehlen von genomischen Referenzsequenzen für DPB1 und die tiefen Niveaus von Polymorphismen in Intron 2 (zwischen Exon 2 und 3) erschwert die Durchführung von Phasenanalysen für heterozygote Proben. Deshalb können ein Genotyp-Mehrdeutigkeiten vorliegen, welche nicht aufgelöst werden können.

9. Die Vorwärts-Primer für DPB1 überlappen mit den ersten paar Basen auf Exon 2. Deshalb werden Polymorphismen in diesen Sequenzen durch Sequenzierung nicht identifiziert.

10. Die DRB loci werden als zwei Fragmente amplifiziert – eines, welches Exon 1 amplifiziert und ein anders, welches die Exone 2 bis 6 amplifiziert. Intron 1 wird nicht in seiner Gesamtheit amplifiziert. Ein Phasing des gesamten Locus ist deshalb für DRB1/3/4/5 nicht möglich und ein in Intron 1 vorhandener Polymorphismus wird zu Feld 4-Doppeldeutigkeiten führen.

11. Der reverse Primer für DRB Exone 2 bis 6 überlappen das 3'-Ende von Exon 6, weshalb Polymorphismen in diesen Sequenzen durch Sequenzieren nicht bestimmt werden.

12. In den meisten Fällen decken sich die Amplifizierungsprodukte von Exon 1 von DRB1/3/4/5 schlecht mit Exon 1 der bekannten Referenzsequenzen von DRB5; daher, wird der Zusammenhang für das Exon 1 für DRB5 wahrscheinlich nicht erzeugt werden. Weil keine bekannten Exon 1 Polymorphismen für DRB5 bekannt sind, führt dies zu keinen Doppeldeutigkeiten in der HLA-Typisierung für DRB5.

13. Auf Grund der komplexen Natur der HLA-Typisierung sollte qualifiziertes Personal die Dateninterpretation und die Typisierungsaufgaben überprüfen.

SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE Klinische Studien werden an drei Standorten durchgeführt, um die Leistung des MIA FORA NGS HLA Typisierungs-Kits zu analysieren. Die Leistung der Analyse wurde it früheren Typisierungen verglichen, welche hochauflösende sequenzbasierte Typisierung (SBT) beinhaltete (falls verfügbar), und niedriger auflösende Typisierung, wo SBT nicht verfügbar war. Die Proben wurden durch die Teststandorte ausgewählt um einen Querschnitt von HLA-Typen darzustellen, welche im Normalbetrieb typischerweise auftreten. Insgesamt wurden von den Standorten 206 Proben mit jeweils 3 Durchläufen unter Verwendung von 2 Chargen der Reagenzien getestet. Die HLA-Typisierung wurde durchgeführt für die Loci HLA-A, -B, -C, DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1, und -DRB 1/3/4/5. Insgesamt wurden in diesen 206 Proben 3692 Allele untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die in der MIA FORA Analyse gefundenen HLA-Typen ohne Testwiederholung von Versagern und diskordanten Loci 99,34 % betrug. Nach Testwiederholung der Versager und der diskordanten Loci, betrug die Gesamtübereinstimmung 99,74 %.

Tabelle 8: Zusammenfassung der Gesamtübereinstimmung

Standort Anzahl der Proben

Anzahl der getesteten Loci

Anzahl der Allele für Konkordanzanalyse

Konkordanz n. Testwiederholung

Standort 1 68 748 1223 1220 (99,75%)

Standort 2 69 759 1064 1063 (99,91%)*

Standort 3 69 759 1241 1236 (99,59%)

* An diesem Standort wurde keine Testwiederholung durchgeführt. Ein DQB1 Locus wies ungenügende Daten auf. Tabelle 9: Zusammenfassung der klinischen Tests pro Locus

HLA Loci Erste Konkordanz Konkordanz n. Testwiederholung**

HLA-A 100,00% 100,00%

HLA-B 99,76% 99,76%

HLA-C 99,51% 100,00%

DPA1 99,72% 100,00%

DPB1 99,44% 99,72%

DQA1 99,26% 100,00%

DQB1 98,48% 99,27%

DRB1 98,54% 99,03%

DRB3/4/5 99,43% 100,00%

Gesamt 99,34% 99,74%

** Testwiederholungen beinhalten Aufrufe, welche für die Überprüfung markiert und nicht durch manuelle Inspektion der Daten aufgelöst werden konnten. Aufrufe, welche wegen ungenügender Daten nicht durchgeführt werden konnten (11/1854 Amplifikationen) wurde ebenfalls erneut getestet.

Hinweis: Für detaillierte spezifische Leistungsmerkmale wenden Sie sich bitte an Immucor Transplant Diagnostics, Inc. unter 1- 888-329-0255.


PROBLEMLÖSUNG

PROBLEM MÖGLICHE URSACHE LÖSUNG

Keine Bänder auf dem

Gel nach PCR-Amplifikation

DNS-Qualität oder -Qualität

OD 260/280 Verhältnis unter 1,65 DNS erneut reinigen, um Verunreinigungen zu entfernen

Fragmentierte DNS Mindestens 50 % der DNS sollte größer als 10kb sein

DNS erneut aus der Probe extrahieren

DNS verdünnt in Tris-HCl oder TE Proben in Wasser verdünnen

Tiefe Konzentration der DNS-Vorlage Sicherstellen, dass die DNS-Konzentration 50-150 ng/Reaktion beträgt

Ethidium-Alternativen in Agarosegel verwendet

Ethidiumbromid verwenden, wenn Bänder auf Agarosegel schwach sind, weil einige Fluoreszenzfarbstoffe wegen der Zusammensetzung der PCR-Mischung unterdrückt werden können

Amplifikations-Dropout

PCR für Amplifikationsdropouts mit den übrig gebliebenen Reagenzien (ausreichend für vier Proben) wiederholen Übrig gebliebene und bei 2-8 °C gelagerte Ragenzien bleiben für eine Woche stabil.

Multiple Bänder oder

verwischte Bänder nach PCR-Amplifikation

Zustand des Thermocyclers

Rampenraten Sicherstellen, dass die Rampenraten den Vorgaben im Protokoll entsprechen

Temperatur PCR-Maschine kalibrieren, um die Leistung der PCR-Maschine zu überprüfen

DNS-Qualität Sicherstellen, dass DNS in Wasser verdünnt und frei von Kontaminationen ist

Niedrige Fluoreszenzrate für

alle Loci

PicoGreen®-Reagens

Fotobleichung des PicoGreen®

Reagens

Herstelleranleitungen genau befolgen. Reagenzien müssen vor Licht geschützt sein

Inkorrekte Verdünnung des Reagens PicoGreen® Reagens gemäss den Anleitungen verdünnen

Standards nicht korrekt verdünnt Standards gemäss den Anleitungen verdünnen

Inkorrekte DNS-Größenselektion

Pippin-Instrument

Elutionsprofil prüfen um sicherzustellen, dass Elution ohne

Fehler stattfand

Dem Sage Science Handbuch zur Fehlersuche folgen, um zu prüfen, ob die Instrumentenleistung den Spezifikationen entspricht.

Instrument nicht kalibriert

2 µL von 1kb plus Leiter (ThermoFisher) mit Excisionsprotokoll für 400-600 Basenpaaren laufen lassen. 15 µL des eluierten Produkts auf Agarosegel laufen lassen, um Elution eines 500 bp Fragments zu visualisieren

Wiederverwendung der Pippin-Kassette

Pippin-Kassette sollte nur ein Mal verwendet werden

qPCR R2 < 0,95 KAPA PCR

Verursacht durch einen klaren

Ausreißer Analyse unter Auslassung des Ausreißers wiederholen

Kontamination in den Reagenzien KAPA PCR mit frischen Standards wiederholen

Niedrige Konzentration der

amplifizierten Bibliothek

Reinigung der

Magnetpartikel

Ethanol nicht vollständig entfernt Ethanol entfernen, während Platten auf dem Magnethalter sind. Alle Ethanolspuren entfernen, besonders nach der letzten Auswaschung.

Partikel nicht korrekt gespeichert Partikel zwischen 2 und 8 °C lagern – NICHT EINFRIEREN

Ethanol nicht frisch zubereitet 80 % Ethanol sollte vor jeder Verwendung frisch zubereitet werden

Austrocknen der Partikel Trocknungszeit hängt von Umgebungstemperatur undeuchtigkeit ab. Partikel genau überprüfen um sicherzustellen, dass Partikel nicht austrocknen und das Protokoll nötigenfalls anpassen.

Falsche Konzentration von Tris-HCl verwendet Sicherstellen, dass Tris-HCl Puffer 10 mM und pH 8,0 beträgt.

Pippin Prep eluiert

keine DNS

Prae- und Postelution für Adapter-ligierte Produkte prüfen

1 µL Pre-Pippin gepoolte Bibliothek mit der Hälfte der Reagenzienmenge für eine Bibliotheksamplifikation amplizieren. Amplifizierte Produkte (keine Reinigung benötigt) auf einem 2 % Agarosegel laufen lassen, um zu bestimmen, ob eine Fragmentverschmierung vorliegt.

Verlust amplifizierter Produkte während Partikelreinigung

Nochmalige Amplifikation von 5 µL der Elution. Falls Bibliothek > 25 nM, können Produkte mit Durchlauf von 5 µL auf Agarosegel visualisiert werden.

Fehler in Fragmentierung

durch Ligationsschritte

Fragmentierungsprobleme 20 µL 2-3 ligierter Proben reinigen und NTC unter Verwendung des Partikelreinigungsprotokolls mit 36 µL Partikeln reinigen. Produkte in 10 µL eluieren und Fragmentierung auf 2 % Agarosegel prüfen. Falls die Fragmentierung nicht stattfindet, fordern Sie weitere Anleitungen zur Problemlösung vom technischen Support an.

MiSeq® Clustering geringer als erwartet

Inkorrekte Quantifizierung der Bibliothek

Kapa qPCR Anweisungen des Herstellers befolgen unter besonderer Berücksichtigung der Verdünnungen, und verifizieren, dass die Standardkurve korrekt ist und Ct-Werte innerhalb des linearen Bereichs der Standardkurve liegen.

Qubit fluorometer

Anweisungen des Herstellers befolgen unter besonderer Berücksichtigung der Verdünnungen. Frische Standardverdünnungen verwenden.

Wenn die Probe aus der Standardkurve der Breitbereichsreagienzen fällt, mit dem hochempfindlichen Assay wiederholen.

Illumina Reagenzien Flusszelle, Instrument oder Reagenzprobleme

Technischen Support von Illumina kontaktieren um Reagenzien und Instrumentenprobleme zu lösen


BESCHRÄNKTE LIZENZ

WICHTIG – SORGFÄLTIG LESEN: Diese Markenlizenzvereinbarung („Vereinbarung“) ist der legale Vertrag zwischen Ihnen (nachfolgend „Lizenznehmer“)

und Immucor Transplant Diagnostics, Inc. („Immucor“) (individuell, eine „Parte“" oder zusammen, die „Parteien“), für die Verwendung der hier aufgeführten

Reagenzien „Reagenzien“). Durch die Verwendung der Reagenzien stimmt der Lizenznehmer zu, dass er an die hier folgenden Bedingungen gebunden ist. 1. Verwendung der Reagenzien durch den Lizenznehmer. Immucor erteilt dem Lizenznehmer ein nicht-exklusives, nicht übertragbares Recht, nur die übertragene Menge an Reagenzien in Übereinstimmung mit den in der beigefügten Marke festgelegten Verfahren und dem Inhalt der hier beschriebenen

Einschränkungen zu verwenden. Die Rechtstitel der Reagenzien werden nicht auf den Lizenznehmer übertragen. Immucor behält alle hier nicht ausdrücklich gewährten Rechte, und es werden keine stillschweigenden Lizenzen übertragen. 2. Ausgeschlossene Verwendungen. Hiermit wird dem Lizenznehmer keine Berechtigung erteilt, die Reagenzien anders als in Abschnitt 1 dieser Vereinbarung

zu nutzen.Im Speziellen wird dem Lizenznehmer keine Berechtigung erteilt, Reagenzien zum Zweck der Übertragung, des Verkaufs, der Weitergabe oder des Gewährens eines andern Zugangs zu den Reagenzien oder den Mia Fora Produkten an jegliche Drittpartei. Der Lizenznehmer hat nicht das Recht, Derivate von einem beliebigen Reagens zu produzieren oder eine beliebige Drittpartei zu autorisieren, Reagenzien oder Derivate der Reagenzien zu verwenden oder zu

verkaufen. Der Lizenznehmer weiß, dass bestimmte Reagenzien und deren Verwendung den Patenten von Drittparteien unterliegen und von Immucor lizenziert sind. Der Lizenznehmer darf die Reagenzien nicht anders verwenden als hier ausdrücklich erlaubt. 3. Missbrauch der Reagenzien und Schandersatzbedingungen. Der Lizenznehmer wird im rechtlich zulässigen Rahmen Immucor, Immucors

Tochtergesellschaften, deren Manager, Direktoren, Kaderangehörigen, Angestellten, Sponsoren und Agenten (kollektiv die „freigestellten Parteien“) gegen jegliche Haftung, Verlust, Schaden, Ansprüche oder Ausgaben, inklusive Anwaltskosten (kollektiv die "entschädigten Verluste"), die aus oder in Verbindung mit dieser Vereinbarung entstehen, inklusive und ohne Einschränkung entschädigte Verluste, welche aus der Verwendung durch oder im Auftrag des

Lizenznehmers entstehen, verteidigen, entschädigen und schadlos halten. Der Lizenznehmer wird die freigestellten Parteien entschädigen und schadlos halten gegenüber allen und jeglichen entschädigten Verlusten, welche aus oder in Verbindung mit Verletzungen dieser Vereinbarung durch den Lizenznehmer entstanden sind; sowie gegen die Behauptung einer Drittpartei, dass die Verwendung der Reagenzien durch den oder die Lizenznehmer irgendein Patent,

Urheberrechte, Markenrechte, Handelsgeheimnis oder anderes geistiges Eigentum einer solchen Drittpartei verletzt oder veruntreut. 4. Diese Vereinbarung bezieht sich ausschließlich auf die Reagenzien. Jegliche Verwendung der Mia Fora Software ist Inhalt des maßgeblichen Endbenutzerlizenzvertrags. Diese Vereinbarung wird entsprechend den Gesetzen des Staates New York in den Vereinigten Staaten ausgelegt und

durchgesetzt. Falls der Käufer nicht bereit ist, die Bedingungen dieser Vereinbarung zu akzeptieren, stimmt Immucor der Rückgabe des Produkts zu.

Hergesteller: Immucor, 35 Technology Drive, Suite 100, Warren, NJ 07059 USA. Telefon: +1 (908) 226-8200, Fax: +1 (908) 226-0800

Autorisierter Vertreter: lmmucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Straβe 32, 63303 Dreieich, Deutschland Telefon: +49-607 4-84200, Fax: +49-607 4-842099 Europäischer Technischer Service: Telefon: +32 (0)3 385 47 91

Dieses Dokument wurde letztmals revidiert und ausgegeben: Rev 2, 03. November 2016

VERWENDETE MARKENZEICHEN

MIA FORA und SIRONAQUANT sind Markenzeichen von Sirona Genomics, Inc. Agencourt und Ampure sind registrierte Markenzeichen von Beckman Coulter, Inc. Alle anderen Markenzeichen sind Eigentum ihrer jeweiligen Besitzer.