Anticorpos anti-HLA

Igen - Instituto de Imunogenética

Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa

São Paulo, SP, Brasil

Renato de Marco

Estrutura do HLA

KLEIN J, SATO A:. The HLA system. First of two parts. N Eng J Med 2000; 343;10: 702-9.

HLA - NOMENCLATURA

A*

01:01:01:01Locus

Nível sorológico

– Grupo de

alelos

Alelo

AleloSubstituição silenciosa

Variantes

intron

NÚMERO DE ALELOS HLA REPORTADOS NO MUNDO

0

4000

8000

12000

16000

20000

IMGT/HLA Database (02/2017)

POLIMORFISMO HLA

Numbers of HLA Alleles

HLA Class I Alleles 12,021

HLA Class II Alleles 4,230

HLA Alleles 16,251

Other non-HLA Alleles 178

HLA Class I

Gene A B C E F G

Alleles 3,830 4,647 3,382 25 22 53

Proteins 2,703 3,408 2,391 8 4 18

Nulls 173 141 119 1 0 2

HLA Class II

Gene DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB

Alleles 7 2,252 77 1,054 44 740 7 13 12 13

Proteins 2 1,661 34 727 22 615 4 7 3 5

Nulls 0 62 2 28 0 19 0 0 1 0

HLA Class II - DRB Alleles

Gene DRB1 DRB2 DRB3 DRB4 DRB5 DRB6 DRB7 DRB8 DRB9

Alleles 2,011 1 130 57 46 3 2 1 1

Proteins 1,465 0 109 46 41 0 0 0 0

Nulls 50 0 4 5 3 0 0 0 0

IMGT/HLA Database (02/2017)

GRUPO DE ALELOS (NÍVEL SOROLÓGICO)

HLA A: 21

HLA B: 43

HLA C: 15

HLA DR: 17

HLA DQ: 7 DQB1 e 6 DQA1

HLA DP: 18 DPB1 e 4 DPA1

COMO UM INDIVÍDUO FORMA ANTICORPOS ANTI-HLA?

Gestação

Transfusão

Transplante

Hipersensibilizados (PRA >80%)

Não Hipersensibilizados (PRA < 80%)

Teste Exato de Fisher

N 493 3.737

TX prévio 199 (40,4%) 266 (7,1%)P<0.0001OR:8,9IC 95%:7,1 – 11,1

Mulheres com gestação prévia

1 a 2 gestações 107( 21,7%)

≥ 3 gestações: 169 (34,3%)

Gestação ≥ 1: 492 (13,2%)

Gestação ≥ 3; 502 (13,4%)

P<0.0001OR:1,8IC 95%:1,4 – 2,3P<0.0001OR:3,4IC 95%:2,7 – 4,2

TransfusõesSanguíneas

N: 1 a 4 = 274 (55,6%)

N ≥ 5=136 (27,6%)

N: 1 a 4 = 1521 (40.7%)

N ≥ 5= 560 (15,0%)

P<0.0001OR: 1,8IC 95%:1,5 - 2,2

P<0.0001OR:2,16IC 95%:1,7 – 2,7

FATORES ASSOCIADOS À CONDIÇÃO DE HIPERSENSIBILIZADOS

Metodologias de Uso Corrente para Detecção de

Anticorpos Anti-HLA

ALTA SENSIBILIDADE

BAIXA SENSIBILIDADE

LUMINEX SA-Ig

Beads recobertas

por antígenos HLA

purificados

Definição da especificidade dos anticorpos

CDC

CDC-AGH

CITOMETRIA DE FLUXO

Crossmatch (XM) contra o doador

HLA doador +

Crossmatch Virtual

CrossmatchLinfócitos do Doador + Soro do Receptor

Método de Linfocitotoxicidade dependente de complemento (CDC)

Linf. do Doador + Soro do Receptor + Complemento + Corante

D

DD

D

D

Y

D

Y D

D D

D

D

D

T

Ficoll

PBMC

30’ 37ºC

Crossmatch30’ 4ºC

5x105céls/tubo

50µL soro/tubo

B

TB

30’ 4ºC

Marcação

PFA 2%

FACSCalibur

Pronase

IgG FITC

CD19 PE

CD3 PE-Cy5

Lavagens

Lavagens

CD19

Tratamento Pronase

FCXM – Crossmatch por Citometria de Fluxo

Fc

FI=1x FI=4x

FI=1x

FI=2x

MFI=4/3=1,33x

FI=5x

FI=6x

MFI=15/3=5x• MFI= Valor médio da leitura, pelo luminex, da fluorescência emitida pelo conjugado.

5

5

5

6

6

6

Leitura no Luminex

LUMINEX SINGLE ANTIGEN

EXEMPLO DE SINGLE I

- Paciente não forma anticorpos contra HLA próprio

- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs A, B, C

- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população

EXEMPLO DE SINGLE II

- Paciente não forma antircorpos contra HLA próprio

- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs DRB1, DRB3/45, DQB1, DQA1, DPB1 e DPA1

- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população

PROBLEMAS NO LUMINEX

Reações falso Negativas

Interferência do complemento presente no soro do receptor na reatividade dos

anticorpos anti-HLA testados no SAB

Pre-tratamento do soro com: Aquecimento, DTT ou EDTA

Anti-A2Média de MFIA2=1.170

TRATAMENTO DO SORO

Anti-A2 Aq 1 min.

Média de MFIA2=15.010

INIBIÇÃO DE REATIVIDADE PELO COMPLEMENTO

PROBLEMAS NO LUMINEX

Reações falso-Positivas

Presença de antígenos HLA desnaturados aderidos a Bead do luminex

Experiência do analista para identificar

Não correlacionam com prova cruzada real positiva

Desnaturar antígeno HLA do kit – experimental

Absorção / Eluição - experimental

PRESENÇA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENO HLA

DESNATURADO

Doador: HLA-A*02,31; B*14(B65),49; DRB1*01,13

LINFÓCITOS T LINFÓCITOS B

Controle Negativo Cut-off MCF = 212 Cut-off MCF = 238

Soro da Paciente MCF = 174 (Neg) MCF = 208 (Neg)

Single Antigen Padrão

Single Antigen Antígeno HLA Desnaturado

Reação falso-Positiva

Qual a relação MFI x CDC ?

MFI = 11.761 (Sensibilidade de 89,9% e especificidade de 94,7%)

Qual a relação MFI x Citometria de

Fluxo ?

-5000

0

5000

10000

15000

20000

-200 -100 0 100 200 300 400 500 600

> M

FI D

SA H

LA -

A,B

MCF - Cutoff

Citometria de Fluxo - Linfócitos TMFI do DSA AB mais alto x Delta (MCF - cutoff)

Correlação: 0,93

1500

MFI

Cutoff MFI ≥ 1500

VPN: 98,7%

VPP: 92,0%

Acurácia: 97,5%

NEG POS

Presença de Anticorpos Anti-HLA

nMFI: cut-off # para # objetivos

Crossmatch Virtual Positivo por CDC

POSNEG

Crossmatch Virtual Positivo por CF

POSNEG

Anticorpos Clinicamente Relevantes

POSNEG ? ? ? ? ? ? ?

Ac identificados no soro:

anti-A2, anti-B7, anti-DR1

PRA A,B,DR ou PRA HLA I + II

7 céls+/10: cPRA 70%

% PRA calculado (cPRA) ou “PRA virtual

Painel constituído por fenótipos HLA-A,B,DR de 3600 doadores de

rim tipificados em nosso laboratório

A 01,02; B07,44; DR03,04A 01,03; B08,14; DR15,07A 02, - ; B51,44; DR03,04A 11,24; B51,35; DR16,11A 02,30; B15,38; DR 08,04A 29,31; B13,27; DR 01,09A 23,33; B07,60; DR 01,09A 11,26; B57,41; DR 07,08A 03,32; B18,61; DR 01,14A 02,25; B08,45; DR12,13

PRA A,B ou PRA HLA I

5 céls+/10: cPRA 50%

PRA DR ou PRA HLA II

3 céls+/10: cPRA 30%

Crossmatch virtual contra

os indivíduos do painel

E PORQUE ESTUDAR ANTICORPOS NO TRANSPLANTE DE

MEDULA?

30 % dos casos é encontrado doador HLA idêntico

Presença de DSA aumenta o risco de falha primária do enxerto (PGF)

Taxas de PGF em pacientes que apresentam DSA está entre 24 a 83%

Esses dados levam à recomendação da realização do PRA antes de transplante.

Tissue Antigens, 2013, 81, 1–11

ON THE ROLE OF HLA ANTIBODIES IN HEMATOPOIETIC

STEM CELL TRANSPLANTATION

O QUE PODEMOS AJUDAR?

Quando houver transplante de medula envolvendo alguma

incompatibilidade HLA (quando pelo menos um antígeno do doador

não esteja presente na tipificação HLA do receptor).

- PRA por Luminex

- Definição da presença/ausência de DSA

- Anticorpos contra antígeno HLA não tipificado do doador

- Sugestão de tipificação

- Realização de prova cruzada por citometria de fluxo

Igen - Instituto de Imunogenética

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