LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

KRISTINA KLUSAVIČIŪTĖ

SUNKIŲJŲ METALŲ POVEIKIO

METALOTIONEINŲ SINTEZEI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI

LABORATORINIŲ PELIŲ ORGANUOSE

ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

LSMU MA Neuromokslų instituto

Molekulinės neurobiologijos laboratorijos vr. m. d.,

MA Biochemijos katedros profesorė

dr. Ilona Sadauskienė

KAUNAS, 2012

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

TVIRTINU: Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, ____________

(parašas)

____________ (data)

SUNKIŲJŲ METALŲ POVEIKIO

METALOTIONEINŲ SINTEZEI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI

LABORATORINIŲ PELIŲ ORGANUOSE

ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

prof. dr. Ilona Sadauskienė ______________ (parašas)

__________ (data)

Recenzentė Darbą atliko

dr. Inga Stanevičienė _______________ magistrantė (parašas)

Kristina Klusavičiūtė ______________

(parašas)

_______________ _____________ (data) (data)

KAUNAS, 2012

3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 4 SANTRUMPOS ....................................................................................................................................... 6 ĮVADAS ................................................................................................................................................... 7 1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ................................................................................................. 9

2. LITERATŪROS APŽVALGA .......................................................................................................... 10 2.1 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas ....................................................................................... 10

2.1.1. Laisvųjų radikalų susidarymas ir poveikis ląstelėms ........................................................... 10 2.2 Ląstelių antioksidacinė sistema .................................................................................................... 13

2.2.1. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai ................................................................... 13

2.2.2. Antioksidaciniai fermentai ................................................................................................... 14 2.2.3. Nefermentiniai antioksidantai .............................................................................................. 15

2.3. Sunkieji metalai. Bendra charakteristika ..................................................................................... 17 2.4 Kadmio poveikis organizmui ....................................................................................................... 19

2.4.1. Kadmio vaidmuo ligų patogenezėje ..................................................................................... 19 2.4.2. Kadmis ir oksidacinis stresas ............................................................................................... 20

2.5. Nikelio poveikis organizmui ....................................................................................................... 21

2.5.1. Nikelio vaidmuo ligų patogenezėje ...................................................................................... 21 2.5.2. Nikelis ir oksidacinis stresas ................................................................................................ 22

2.6. Cinko biologinis poveikis............................................................................................................ 23 2.6.1. Cinko funkcijos organizme .................................................................................................. 23

2.6.2. Cinko antioksidacinio poveikio mechanizmai ..................................................................... 24 3. TYRIMO METODIKA ...................................................................................................................... 25

3.1. Tyrimo objektas ir reagentai ....................................................................................................... 25

3.2. Metalų toksiškumo įvertinimas. Tyrimo modeliai ...................................................................... 26 3.3. Tyrimo metodai ........................................................................................................................... 28

3.3.1. MT koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse ........................ 28 3.3.2. MDA koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse ..................... 28

3.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas ....................................................................................... 29 4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ................................................................................................ 30

4.1. Ūmus kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis MT sintezei pelių kepenyse ir smegenyse .......... 30 4.1.1. Vienkartinis kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis MT sintezei pelių kepenyse ir

smegenyse ...................................................................................................................................... 30 4.1.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis metalotioneinų sintezei

pelių kepenyse ir smegenyse .......................................................................................................... 31 4.2. Ūmus kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir smegenyse

............................................................................................................................................................ 36 4.2.1. Vienkartinis kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir

smegenyse ...................................................................................................................................... 36

4.2.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai

pelių kepenyse ir smegenyse .......................................................................................................... 37

5. IŠVADOS ........................................................................................................................................... 42 LITERATŪROS SĄRAŠAS .................................................................................................................. 43

4

SANTRAUKA

Kristinos Klusavičiūtės magistro baigiamasis darbas „Sunkiųjų metalų poveikio

metalotioneinų sintezei ir lipidų peroksidacijai laboratorinių pelių organuose įvertinimas“; mokslinė

vadovė prof. dr. Ilona Sadauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos,

Neuromokslų instituto, Molekulinės neurobiologijos laboratorija – Kaunas.

Atlikto darbo tikslas buvo įvertinti kadmio, nikelio bei cinko jonų poveikį metalotioneinų

sintezės intensyvumui ir lipidų peroksidacijai laboratorinių pelių organuose – kepenyse ir smegenyse.

Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti uždaviniai: nustatyti metalotioneinų koncentraciją pelių

smegenyse ir kepenyse po vienkartinio (24 val.) ir kartotinio (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų

poveikio; įvertinti ūmų vienkartinį (24 val.) ir kartotinį (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų poveikį lipidų

peroksidacijai pelių smegenyse ir kepenyse; įvertinti cinko jonų gebą apsaugoti smegenų ir kepenų

antioksidacinę sistemą esant toksiniam kadmio ir nikelio jonų poveikiui.

Eksperimentams atlikti naudotos baltosios beveislės laboratorinės pelės. Metalotioneinų

koncentracija nustatatyta pagal Peixoto ir bendraautorių, o malondialdehido – pagal Uchiyama ir

bendraautorių pasiūlytas metodikas.

Tyrimo rezultatai parodė, kad tiek kadmio, tiek ir nikelio jonai pelių kepenyse metalotioneinų

koncentracijos padidėjimą sukėlė ir po vienkartinio 24 val., ir po kartotinio 14 dienų šių jonų poveikio,

o smegenyse – tik praėjus 24 valandoms po kadmio ar nikelio jonų poveikio. Cinko jonai veikdami

kartu su kadmio jonais statistiškai reikšmingą metalotioneinų koncentracijos padidėjimą sukėlė

smegenyse po 14 dienų šių jonų kompleksinio poveikio. Cinko jonams veikiant kartu su nikelio jonais,

statistiškai reikšmingas metalotioneinų koncentracijos padidėjimas taip pat nustatytas smegenyse po 14

dienų šių jonų kompleksinio poveikio. Tad cinko jonai paskatino antioksidaciniu poveikiu

pasižyminčių metalotioneinų sintezę kepenyse ir smegenyse esant toksiniam kadmio ir nikelio jonų

poveikiui.

Kadmio jonai malondialdehido koncentracijos padidėjimą kepenyse sukėlė tik po ūmaus šių

jonų poveikio, o smegenyse – ir po ūmaus, ir po kartotinio. Nikelio jonai kepenyse malondialdehido

koncentracijos padidėjimą sukėlė ir po ūmaus, ir po kartotinio, o smegenyse – tik po ūmaus šių jonų

poveikio. Cinko jonai, esant toksiniam kadmio jonų poveikiui, kepenyse lipidų peroksidaciją slopino ir

po 24 val., ir po 14 dienų, o smegenyse – tik po 14 dienų. Cinko jonai, esant toksiniam nikelio jonų

poveikiui, maliondialdehido koncentracijos sumažėjimo nesukėlė nei kepenyse, nei smegenyse nei po

ūmaus, nei po kartotinio šių jonų poveikio. Tad cinko jonai apsaugojo lipidus nuo peroksidacijos esant

toksiniam kadmio jonų poveikiui, tačiau neapsaugojo esant toksiniam nikelio jonų poveikiui.

5

SUMMARY

Kristinos Klusavičiūtės master thesis „The evaluation of heavy metals influence on

metallothionein synthesis and lipid peroxidation in laboratory mice organs“; supervisor prof. dr. Ilona

Sadauskienė; Laboratory of Molecular Neurobiology, Neuroscience

Institute, Medical Academy,

Lithuanian University of Health Sciences – Kaunas.

The aim of the work was to evaluate the influance of cadmium, nickel and zinc ions on

metallothionein synthesis and lipid peroxidation intensity in mice organs – the liver and brain. The

tasks of the work were: to determine the concentration of MT in mice brain and liver after both acute

(24 hours) and repeated (14 days) influence of cadmium and nickel ions, to evaluate the acute (24

hours) and repeated (14 days) effects of cadmium and nickel ions on lipid peroxidation in mouse brain

and liver and to evaluate the ability of zinc ion to protect the brain and liver antioxidant system from

the toxicity of cadmium and nickel ions.

We used white laboratory mice in our experiments. MT concentration was established

according to Peixot and contributors proposed method and MDA concentration – according to

Uchiyama and contributors proposed method.

The results have shown that both cadmium and nickel ions increased metallothionein

concentration in the liver of mice after a single (24 hours) and after repeated (14 days) exposure of

these ions. The increased metallothionein concentration in the brain was established only 24 hours

after cadmium or nickel ions exposure. Zinc ions in cooperation with the cadmium ions a statistically

significant increase of metallothionein levels caused in the brain 14 days after the complex effects of

these ions. Zinc ions, acting with the nickel ions, a statistically significant increase of metallothionein

concentration caused as well in the brain after 14 days of the complex effect of these ions. Thus, zinc

ions stimulated the synthesis of metallothionein in the liver and in the brain while toxicity of cadmium

and nickel ions.

We have found that in the liver cadmium ions increased the concentration of malondialdehyde

only after a single effect of these ions and in the brain – both after a single and repeated effects of

cadmium ions. Nickel ions in the liver increased malondialdehyde concentration after a single and

after repeated effects of nickel ions and in the brain - just after a single effect of these ions. Zinc ions,

at toxic cadmium exposure, inhibit hepatic lipid peroxidation after 24 hours and after 14 days of these

ions effect, and inhibit the brain lipid peroxidation – just after 14 days of zinc ions effect. Zinc ions,

while toxicity of nickel ions did not decrease maliondialdehyde concentration nor in the liver or brain,

nor after a single or repeated exposure of these ions. Thus, the zinc ions protected from lipid

peroxidation at toxic cadmium exposure, but failed to secure at toxic effect of nickel ions.

6

SANTRUMPOS

Cd-MT

CNS

kadmio-metalotioneino kompleksas

centrinė nervų sistema

ATP adenozino 5-trifosfatas

DTNB 5,5-ditiobisnitrobenzoinė rūgštis

DTT ditiotreitolis

EDTA

FAD

etilendiamintetraacetatas

flavin-adenin-dinukleotidas

Gred glutationo reduktazė

GSH redukuotas glutationas

Gpx glutationo peroksidazė

GSSG oksiduotas glutationas

GST glutationo S-transferazė

GTP guanozino 5-trifosfatas

HEPES

HIF

N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfo rūgštis

hipoksijos indukuojamasis faktorius

HO hemo oksigenazė

Hsp šiluminio šoko baltymai

KAT katalazė

LD50

LOPL

vidutinė mirtina dozė

lėtinė obstrukcinė plaučių liga

MDA malondialdehidas

MT metalotioneinas

PMSF fenilmetilsulfonilfluoridas

SM sunkieji metalai

SOD superoksiddismutazė

TBR tiobarbituro rūgštis

TChA trichloracto rūgštis

TRIS tris (hidroksimetil) aminometanas

7

ĮVADAS

Su sunkiaisiais metalais (SM) žmogus jį supančioje aplinkoje susiduria kiekvieną dieną. Tam

tikri jų kiekiai yra maiste, kurį valgome, vandenyje, kurį geriame, ore, kuriuo kvėpuojame. Kai kurie

metalai (cinkas, varis, manganas ir kt.) kaip mikroelementai yra būtini normaliai organizmo medžiagų

apykaitai, fiziologiniams procesams vykti, kita dalis (kadmis, gyvsidabris ir kt.) neatlieka jokių

biologinių funkcijų. Vis dėlto tiek vienų, tiek kitų elementų kiekio padidėjimas organizme gali sukelti

apsinuodijimus. Toksinis SM poveikis gali pasireikšti iš karto, ar po kelių ar net keliolikos metų (Hall

ir kt., 2007). Intensyvėjanti pramonės įmonių veikla, transporto srautų didėjimas teršia aplinką, vis

didesni SM kiekiai patenka į organizmą, sukelia apsinuodijimus, o jie – įvairių ligų išsivystymą

(Jomova ir kt., 2010). Pasaulyje susidomėjimas sunkiaisiais metalais, jų poveikiu aplinkai ir žmogaus

sveikatai pastaraisiais metais didėja, nes nustatomi aplinkos taršos sąlygojami gyventojų

apsinuodijimų ir net mirties atvejai (Soghoian, 2011).

Kadmis yra vienas toksiškiausių gyviesiems organizmams SM (Bernard 2008).

Apsinuodijama šiuo metalu valgant užterštus maisto produktus, nemaži kadmio kiekiai į organizmą

patenka rūkant, apsinuodyti galima ir dirbant tam tikrose pramonės srityse (Soghoian, 2011).

Apsinuodijimus, lyginant su kitais SM, sukelia labai maži šio SM kiekiai (Ercal ir kt., 2001). Kadmiui

būdingi kancerogeninis, nefrotoksinis, neurotoksinis, genotoksinis poveikiai, kurie pasireiškia keletu

mechanizmų – slopinant ląstelių antioksidacinę sistemą, sutrikdant baltymų sintezę ar tiesiogiai

toksiškai veikiant tam tikras ląstelių struktūras (Casalino ir kt., 2002; Filipič ir kt., 2006). Naujausi

tyrimai rodo, kad kadmis sukelia organizme oksidacinį stresą, kurio metu pažeidžiami ląstelių

komponentai – baltymai, lipidai, DNR dėl ko ir pasireiškia šio metalo įvairiapusis toksinis poveikis

(Amara ir kt., 2011; Bernard 2008). Galima kadmio poveikio organizmui rizika buvo intensyviai

tiriama daugelį metų, dabar turimos žinios nuolat yra gilinamos siekiant nustatyti naujus galimus šio

metalo toksiškumo mechanizmus.

Dar vienas plačiai naudojamas ir potencialiai pavojingas SM yra nikelis. Platus šio metalo

pritaikomumas įvairiose pramonės srityse paskatino domėjimąsi nikeliu. Vis daugiau tyrimų atliekama

siekiant sustatyti, koks tikrasis šio metalo poveikis žmogaus sveikatai, kokia yra rizika su juo

dirbantiems žmonėms. Naujausi tyrimai rodo, kad apsinuodijus nikeliu gali pasireikšti citotoksinis,

genotoksinis, pneumotoksinis, neurotoksinis, kancerogeninis ir kiti poveikiai (Cameron ir kt., 2011)

Nikelio jonų sukeliamas oksidacinis stresas taip pat yra pagrindinis šio SM toksiškumą lemiantis

veiksnys (Chen ir kt., 2003; Das ir kt., 2008). Vis dėlto tiksliai nėra aišku, kuriuos specifinius taikinius

nikeliui veikiant ląstelėse pasireiškia jo toksinis poveikis, ir tai yra perspektyva naujiems tyrimams.

8

Organizmo antioksidacinės sistemos tyrimai, svarbūs nustatant paties organizmo gebą

apsisaugoti nuo oksidacinio streso bei ištirti antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių elementų,

pavyzdžiui, cinko, seleno ir kitų junginių gebą sustiprinti šią antioksidacinę apsaugą (Kunwar ir kt.,).

Dabar jau žinoma, kad sunkiųjų metalų poveikyje ląstelėse susidarantys laisvieji radikalai bei

kiti aplinkoje esantys oksidantai yra labai svarbi paveldimų ligų bei senėjimo proceso organizme,

priežastis (Soghoian, 2011; Costa ir kt., 2002). Todėl ir tyrimai, susiję su įvairių veiksnių, tame tarpe ir

sunkiųjų metalų, ląstelėse sukeliamu oksidaciniu stresu bei antioksidacine sistema yra labai svarbūs ir

kelia vis didesnį susidomėjimą.

Šis darbas tai įnašas į integruotą biologinę intoksikacijos metalais sampratą, pagilinantis

žinias apie SM poveikio organizmui mechanizmus bei padarinius, o tai neabejotinai svarbu klinikiniu

požiūriu. Taigi šio darbo tikslas yra nustatyti sunkiųjų metalų – kadmio ir nikelio jonų poveikį ląstelių

antioksidacinės sistemos aktyvumui ir įvertinti šios sistemos pajėgumus neutralizuojant SM.

Gauti tyrimų rezultatai pristatyti tarptautinėje neuromokslų konferencijoje:

I. Sadauskienė, R. Bernotienė, J. Šulinskienė, K. Klusavičiūtė, L. Ivanovienė, A. Liekis, L.

Ivanov. The content of metallothionein and lipid peroxidation in mouse brain: effects of cadmium

and nickel ions. International Translational Neuroscience Conference: 16-17th June, 2011; Europa

Royale Hotel; Kaunas 2011: 95.

Rezultatai taip pat bus pristatyti birželio mėnesį vyksiančios biochemikų draugijos

konferencijos metu:

I. Sadauskienė, A. Liekis, R. Bernotienė, K. Klusavičiūtė, L. Ivanovienė, L. Ivanov. “Sunkiųjų

metalų poveikio lipidų peroksidacijai smegenyse įvertinimas“. Lietuvos Biochemikų Draugijos

XII-oji Konferencija “Biochemijos studijoms Lietuvoje – 50 metų”: 2012 m. birželio mėn. 28-30

d., Tolieja (Molėtų tajonas).

9

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Įvertinti kadmio, nikelio bei cinko jonų poveikį metalotioneinų sintezės intensyvumui ir lipidų

peroksidacijai laboratorinių pelių organuose – kepenyse ir smegenyse.

Uždaviniai:

1. Nustatyti MT koncentraciją pelių smegenyse ir kepenyse po ūmaus vienkartinio (24 val.) kadmio ir

nikelio jonų poveikio;

2. Įvertinti ūmų vienkartinį (24 val.) kadmio ir nikelio jonų poveikį lipidų peroksidacijai pelių

smegenyse ir kepenyse;

3. Nustatyti MT koncentraciją pelių smegenyse ir kepenyse po kartotinės (14 dienų) kadmio ir nikelio

jonų dozės įvedimo;

4. Įvertinti kartotinės (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų dozės įtaką lipidų peroksidacijos žymens

malondialdehido koncentracijai laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse;

5. Įvertinti cinko jonų gebą apsaugoti smegenų ir kepenų antioksidacinę sistemą esant toksiniam

kadmio ir nikelio jonų poveikiui.

10

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas

2.1.1. Laisvųjų radikalų susidarymas ir poveikis ląstelėms

Laisvieji radikalai – tai daugiausia deguonies (reaktyvios deguonies formos – ROS) ir azoto

(reaktyvios azoto formos – RNS) junginiai, produkuojami įvairių organizmo endogeninių sistemų. Jų

susidarymą lemia tam tikros fizikocheminės sąlygos arba patofiziologiniai procesai, vykstantys

organizme (Valko ir kt., 2006). Šiuos procesus skatina įvairūs egzogeniniai ir endogeniniai veiksniai:

tarša, jonizuojanti spinduliuotė, cigarečių dūmai, išemija, audinių pažeidimai ir uždegiminis atsakas,

ląstelėse vykstanti medžiagų apykaita (elektronų transporto grandinės veikla) ir kt., (Kunwar ir kt.,

2011). Laisvieji radikalai gali pažeisti ląstelių makromolekules – lipidus, baltymus, DNR, o tai gali

būti susiję su senėjimo procesu, širdies-kraujagyslių, neurodegeneracinių, imuninės sistemos,

onkologinių ir kitų ligų išsivystymu (Valko ir kt., 2006; Jomova ir kt., 2010; Soghoian, 2011).

Laisvųjų radikalų susidarymą lemia tai, kad molekulinis deguonis, turintisi du nesuporintus

elektronus sunkiai redukuojasi. Tačiau, esant tam tikroms sąlygoms (veikiant radiacijai, sunkiesiems

metalams), šis procesas labai pagreitėja. Kuo daugiau molekulinis deguonis prisijungia elektronų, tuo

didesnis yra jo reaktingumas (Kunwar ir kt., 2011). Ląstelėse didžiausi kiekiai susidaro superoksido

(O2•‾) ir azoto oksido (NO

•) radikalų, kurie toliau yra paverčiami į stipriomis oksidacinėmis savybėmis

pasižyminčius radikalus – tai hidroksilo (•OH), alkoksi (RO•), peroksilo (ROO

•) radikalus, singuletinį

deguonį (1O2). Kai kurios radikalų rūšys yra paverčiamos molekuliniais oksidantais – vandenilio

peroksidu (H2O2), peroksinitritu (ONOO‾), hipochloritine rūgštimi (HOCl), kurie gali veikti kaip

laisvųjų radikalų šaltiniai. Pavyzdžiui, H2O2 yra verčiamas •OH radikalais vykstant Fentono reakcijai,

o HOCl reaguojant su H2O2, gali susidaryti 1O2. ONOO‾, esant fiziologinei CO2 koncentracijai,

ląstelėse yra karbonato radikalų (CO3•‾) šaltinis (Valko ir kt., 2006). Laisvųjų radikalų susidarymas

vyksta skirtingais keliais, o daugiausia jų susidaro ląstelių mitochondrijose (Circu ir kt., 2011;

Murphy, 2008; Valko ir kt., 2006). Laisvųjų radikalų susidarymo mechanizmai pateikiami 1 pav.

Laisvieji radikalai ląstelėse oksiduoja įvairias molekules. Pavyzdžiui, veikiant O2•‾, lengvai

oksiduojami katecholaminai, askorbo rūgštis, tioliniai junginiai. Aktyviausia vitamino E forma – α-

tokoferolis bei geležies turinčių baltymų molekulių centrai taip pat labai jautrūs šių aktyvių deguonies

formų poveikiui (Valko ir kt., 2005). O2•‾ gali sudaryti kompleksu su Fe

3+ – perferilo radikalus

[Fe3+

O2]•, kurie nėra linkę dalyvauti oksidacijos reakcijose, tačiau gali toliau skilti. Tokiu būdu iš

perferilo radikalų susidaro ferilo radikalai [Fe3+

O]•, kurie yra aktyvūs, turi daug elektronų. Todėl yra

manoma, kad būtent O2•‾ yra pagrindinis junginys, dalyvaujantis susidarant kitoms reaktyvioms

11

molekulėms vykstant lipidų peroksidacijai ir kitų makromolekulių oksidaciniams pažeidimams

(Kunwar ir kt., 2011; Jomova ir kt., 2010). Labai svarbus yra savaiminis O2•‾ skilimas į H2O2 ir O2 ir

šio radikalo geba redukuoti pereinamosios būsenos metalus (Fe, Cu ir kt.) ir jų kompleksus susidarant

kitiems, oksidacinius pažeidimus sukeliantiems, laisviesiems radikalams (Circu ir kt., 2011).

O2•- - superoksido radikalas; SOD – superoksiddismutazė; H2O2 – vandenilio peroksidas; •OH – hidroksilo radikalas; LH –

riebalų rūgštis; L• - lipidinis radikalas; LO• - lipidinis oksi-radikalas; LOO• - lipidinis peroksi-radikalas NO• - azoto oksido

radikalas; ONOO- - peroksinitrito anijonas; ONOOCO2

- - nitrozoperoksikarbonato jonas; CO3•

- - karbonato radikalo

anijonas; MPO – mieloperoksidazė; HOCl – hipochloritinė rūgštis; 1O2 – singletinis deguonis; Cl• - chloro radikalas.

1 pav. Laisvųjų radikalų susidarymo būdai

Iš Free radicals, oxidative stress and importance of antioxidants in human health (Kunwar ir kt., 2011)

Kitas labai reaktyvus radikalas – •OH – yra ypač stirpus oksidatorius. Jis labai nestabilus ir

reaguoja su dauguma biologinių molekulių, turinčių SH grupes ar FeS fragmentus. Tai pats stipriausias

ir aktyviausias oksidantas, kuris efektyviai oksiduoja baltymus, nukleorūgštis ir lipidus. Jo sukeltos

grandininės reakcijos pažeidžia ląstelę (Valko ir kt., 2006). Hidroksilo radikalas susidaro iš H2O2

oksidacijos-redukcijos reakcijose, tokiose kaip Fentono reakcija (Kunwar ir kt., 2011).

Su makromolekulėmis organizme reaguoja ir 1O2. Beveik visų šių reakcijų metu vyksta šios

aktyvios deguonies formos prijungimas prie oksiduojamų junginių konjuguotųjų jungčių. Pavyzdžiui,

dalyvaujant reakcijose riebalų rūgštims, susidaranys produktai yra organiniai peroksidai, sukeliantys

grandinines lipidų peroksidacijos reakcijas (Valko ir kt., 2006; Circu ir kt., 2011).

Laisvųjų radikalų, sukeliančių ląstelių pažeidimus, susidarymą lemia tiek endogeniniai

(uždegiminės reakcijos, medžiagų apykaitos procesai), tiek egzogeniniai veiksniai (metalų jonai,

radiacija, tam tikri ksenobiotikai, pvz., barbitūratai). Jie susidaro dviems pagrindiniais būdais –

veikiant fermentams (NADH dehidrogenazei, ksantinoksidazei, laktatdehidrogenazei,

12

glutationreduktazei, citochromo P-450 fermentams) ir nefermentiniu būdu (Valko ir kt., 2006).

Pavyzdžiui, O2•‾ nefermentiniu būdu susidaro vykstant kai kurių ląstelės komponentų – ubichinonų,

flavinų, tiolinių junginių – savaiminei oksidacijai, elektrofilinėmis savybėmis pasižyminčių chinono

junginių redokso ciklui, OH• susidaro vykstant H2O2 reakcijai su redukuotąja geležimi – Fentono

reakcijai, skylant O2•‾, glutationo peroksidui (Circu ir kt., 2011). Organizmo fagocitinės ląstelės taip

pat yra laisvųjų radikalų susidarymo šaltinis (Kunwar ir kt., 2011). Įvairūs egzogeniai veiksniai

dažniausiai paspartina nefermentinį laisvųjų radikalų susidarymą (Valko ir kt., 2006).

Maži laisvųjų radikalų kiekiai yra būtini normaliai fiziologinių funkcijų veiklai – genų raiškai,

ląstelių augimui, apsaugai nuo infekcijų (Circu ir kt., 2011). Jie taip pat gali veikti kaip ląstelėse

vykstančių biocheminių procesų stimuliatoriai grįžtamai oksiduodami transkripcijos faktorių,

atsakingų už genų raišką ir ląstelių augimą, tam tikras aktyvias sritis ar netiesiogiai indukuodami

transkripcijos faktorius ir aktyvindami signalų perdavimo kelius ląstelėse (Kunwar ir kt., 2011).

Laisvųjų radikalų koncentracijos padidėjimas ląstelėse ir nesugebėjimas jų detoksikuoti,

sukelia organizme oksidacinį stresą. Oksidacinis stresas – tai laisvųjų radikalų ir kitų aktyvių

deguonies ir azoto formų sukelto biomolekulių pažeidimo padarinys (Kunwar ir kt., 2011). Cheminiu

požiūriu oksidacinis stresas – tai žymus ląstelių redukcinio potencialo padidėjimas (redukcinis

potencialas tampa mažiau neigiamas) arba ląstelių redokso porų, pavyzdžiui, redukuoto glutationo

(GSH), redukcinės galios sumažėjimas (Ercal ir kt., 2001). Oksidacinio streso padariniai priklauso nuo

šių pokyčių laipsnio. Ląstelės, veikiant antioksidacinei sistemai, gali atlaikyti nežymius oksidacinės –

redukcinės sistemos stabilumo pakitimus ir atgauti pradinę būseną, tačiau labiau išreikštas oksidacinis

stresas gali sukelti ląstelių žūtį dėl ko atsiranda įvairūs susirgimai (Apel ir kt., 2004; Circu ir kt., 2011).

Vienas iš oksidacinio streso padarinių yra laisvųjų radikų sukelta lipidų peroksidacija, dėl

kurios su šlapimu išsiskiria įvairūs toksiški metabolitai, pvz., malondialdehidas (MDA), formaldehidas

ir kt. (Del Rio ir kt., 2005). MDA yra lipidų peroksidacijos indikatorius ir, esant organizme

oksidaciniam stresui, kepenyse ir kituose organuose yra stebimas jo kiekio padidėjimas. Šis aldehidas

yra polinesočiųjų riebalų rūgščių peroksidacijos galutinis produktas, todėl pagal jo kiekį ląstelėse

galima spręsti apie biologinių struktūrų pažeidimo laipsnį (Grotto ir kt., 2009).

Oksidacinio streso metu taip pat yra paveikiama ląstelių branduolio DNR – didėja genetinio

ląstelės pažeidimo tikimybė, paveikiama antioksidacinė organizmo sistema – sumažėja GSH kiekis

kepenyse ir kituose organuose, sutrikdoma antioksidacinių fermentų veikla (Bernard, 2008).

Laisviesiems radikalams reaguojant su biologinėmis makromolekulėmis – lipidais, baltymais, DNR –

susidaro įvairūs antriniai radikalai, pavyzdžiui, lipidiniai, aminorūgščių, tioliniai radikalai, kurie

veikiant deguoniui virsta peroksi-radikalais, susidaro įvairūs peroksidai. Pastarieji biologinėse

sistemose yra svarbūs tuo, kad sukelia grandinines reakcijas ir dėl to yra pažeidžiamos įvairios ląstelių

struktūros, sutrinka jų funkcija (Del Rio ir kt., 2005).

13

2.2 Ląstelių antioksidacinė sistema

2.2.1. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai

Žmogaus organizmo ląsteles nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio saugo endogeninė

daugiakomponentė antioksidacinė sistema (Valko ir kt., 2006). Antioksidacinėmis savybėmis

pasižymintys junginiai neutralizuoja laisvuosius radikalus juos sujungdami, keisdami struktūrą arba

tiesiog suardydami (Apel ir kt., 2004; Kunwar ir kt., 2011).

2 pav. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai ir jų veikimas Iš Molecular and cellular mechanisms of iron homeostasis and toxicity in mammalian cells (Waisberg

ir kt., 2003)

Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai yra:

1. Antioksidacinio poveikio fermentai: glutationo S-transferazė (GST), superoksiddismutazė (SOD),

katalazė (KAT), glutationo peroksidazė (Gpx), glutationo reduktazė (Gred) (Valko ir kt., 2006).

2. Nefermentiniai antioksidantai – redukcinėmis savybėmis pasižymintys junginiai (glutationas,

askorbo rūgštis, vitaminai A ir E, flavonoidai, kofermentas Q ir kt.). Nefermentiniams

antioksidantams taip pat priklauso baltymai, sujungiantys pereinamųjų metalų jonus, pavyzdžiui

14

transferinas, feritinas, celuplazminas (Kunwar ir kt., 2011; Verma ir kt., 2005; Valko ir kt., 2006; ).

Antioksidacinės sistemos komponentai ir jų veikimo mechanizmai pateikiami 2 pav.

2.2.2. Antioksidaciniai fermentai

Greičiausiai atsakas į laisvuosius radikalus pasireiškia veikiant antioksidaciniams

fermentams. SOD sukelia pirminį antioksidacinį poveikį ir dėl to atlieka labai svarbų apsauginį

vaidmenį. Ji katalizuoja aktyvaus O2•‾ pavertimą H2O2 (Kunwar ir kt., 2011; Murphy, 2008). Šis

fermentas turi keletą izoformų. Žmogaus ir kitų žinduolių ląstelėse randamos trys fermento formos –

tai SOD1, į kurios sudėtį įeina Zn2+

ir Cu2+

ir kuri daugiausia randama ląstelių citoplazmoje, SOD2,

kurios sudėtyje yra Mn2+

ir kuri randama ir veikia ląstelių mitochondrijose. Ląstelių išorėje veikia

trečioji SOD izoforma – SOD3, į kurios sudėtį įeina Zn2+

ir Cu2+

(Valko ir kt., 2005; Jomova ir kt.,

2010). Taigi organizme stingant minėtų elementų ląstelių antioksidacinė apsauga sutrinka.

KAT, kuri pagal savo struktūrą yra hemoproteinas, katalizuoja H2O2 skaidymą į vandenį ir

deguonį. Daugiausia ši reakcija vyksta peroksisomose, kur yra didžiausi KAT kiekiai, tačiau ši reakcija

gali vykti ir ląstelių citoplazmoje, kur fermento kiekiai yra mažesni (Valko ir kt., 2006). KAT

aktyvumą slopina SM jonai, fermento aktyvumui įtakos turi ir kiti ksenobiotikai, patenkantys į

žmogaus organizmą. Pavyzdžiui, cianidai inhibuoja fermento veikimą, nes prisijungia prie jo sudėtyje

esančio hemo (Jomova ir kt., 2010).

Gpx bendrai yra vadinama izofermentų šeima, neutralizuojanti įvairios kilmės peroksidus –

tiek H2O2, tiek organinius hidroperoksidus. Peroksidų redukcijos reakcijoms kaip elektronų donoras

naudojamas GSH, o reakcijų metu susidaro vanduo arba atitinkami alkoholiai (Apel ir kt., 2004;

Margis ir kt., 2008). Žinduolių audiniuose randami 4 pagrindiniai Gpx izofermentai – Gpx1, Gpx2,

Gpx3 ir Gpx4, kurie nustatyti eritrocituose, kepenyse, plaučiuose, inkstuose, virškinamajame trakte,

placentoje, raumenyse. Į Gpx sudėtį įeina selenas, todėl fermento antioksidacinis aktyvumas priklauo

nuo šio mikroelemento kiekio organizme, ir jo trūkstant, ląstelių antioksidacinė apsauga sutrinka

(Margis ir kt., 2008). Gpx daugiausia yra kepenų ląstelėse, kur ji randama ląstelių citoplazmoje ir

mitochondrijų matrikse. Tokiu būdu H2O2, kuris susidaro endoplazminiame tinkle ir mitochondrijose,

daugiausia suardomas Gpx, o H2O2, susidarantis veikiant peroksisomų fermentams, neutralizuojamas

veikiant KAT (Valko ir kt., 2005).

Gred antioksioksidacinį veikimą galima pavadinti netiesioginiu, nes fermentas ne tiesiogiai

inaktyvuoja laisvuosius radikalus, bet, veikiant šiam fermentui, oksiduota glutationo forma (GSSH),

naudojant redukuotą kofermentą NADPH, yra paverčiama GSH, kuris ląstelėse veikia kaip stiprus

antioksidantas (Kunwar ir kt., 2011). Gred sudėtyje yra 2 FAD molukulės, kurios yra redukuotos. Šie

15

redukuoti flavinai, jiems reaguojant su GSSH molekulėmis, yra nedelsiant reoksiduojami. Taigi GSH

kiekis ląstelėse ir jo antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo Gred veikimo. Tokiu būdu pasireiškia

netiesioginis šio fermento antioksidacinis veikimas (Apel ir kt., 2004).

2.2.3. Nefermentiniai antioksidantai

Ląstelių antioksidacinę sistemą sudarantiems nefermentiniams antioksidantams,

prijungiantiems laisvuosius radikalus, priklauso GSH ir kiti redukuoti ląstelės tioliniai junginiai,

askorbo rūgštis, vitaminai A, E, flavonoidai, kofermentas Q (Kunwar ir kt., 2011).

GSH yra laikomas bene svarbiausiu daugiafunkciniu endogeniniu antioksidantu (Valko ir kt.,

2005). Pirmiausia, vykstant oksidacijos-redukcijos reakcijoms, veikiant fermentui Gpx, GSH yra

oksiduojamas, o įvairūs peroksidai – redukuojami ir tokiu būdu nukenksminami (Circu ir kt., 2011;

Valko ir kt., 2006). GSH taip pat gali tiesiogiai reaguoti su laisvaisiais radikalais. Šios reakcijos metu

praradęs elektroną GSH pats tampa reaktyvus, tačiau nedelsiant reaguoja su kita tokia pat reaktyvia

dalele ir susidaro GSSH, kuris veikiant Gred vėl yra paverčiamas į antioksidaciniu poveikiu

pasižyminčią redukuotą formą (Valko ir kt., 2006; Martin ir kt., 2009; Circu ir kt., 2011).

GSH taip pat gali reaguoti su oksidacinio streso metu ląstelėse susidariusiais dalinai

oksiduotais baltymų produktais (baltymas-S•) susidarant disulfidiniams junginiams (baltymas-SSG),

kurie vėliau veikiant fermentui Gred ir mažos molekulinės masės baltymams – glutaredoksinui,

tioredoksinui – yra redukuojami susidarant pradinės struktūros baltymams su laisvomis tiolinėmis

grupėmis (Jomova ir kt., 2010).

GSH atlieka dar vieną svarbią funkciją. Jis dėl struktūroje esančios sulfhidrilinės grupės geba

sujungti į organizmą patekusius sunkiuosius metalus, kurie turėdami elektrono donorinių savybių, gali

sudaryti kovalentinius ryšius su baltymų sulfhidrilinėmis grupėmis. Tokiu būdu GSH apsaugo ląstelės

baltymus, peptidus nuo oksidacinių pažeidimų (Martin ir kt., 2009; Jomova ir kt., 2010).

Antioksidacinio poveikiu pasižymi ir vitaminas C, kuris yra vidutiniškai stiprus reduktorius

(Verma ir kt., 2005). Šis antioksidantas geba neutralizuoti 1O2, •OH, O2

•‾, o reakcijų metu susidaro

stabilesni junginiai, kurie yra labai mažai aktyvūs (Kunwar ir kt., 2011). Askorbo rūgštis taip pat

veikia kaip antrinis antioksidantas – redukuoja kito natūralaus antioksidanto – tokoferolio radikalą,

apsaugo fermentus, turinčius pereinamųjų metalų jonų prostetines grupes (Jomova ir kt., 2010).

Vitaminas E ir jo dariniai (tokoferoliai) yra hidrofobinėmis savybėmis pasižymintys

antioksidantai. α-tokoferolis yra pati aktyviausia vitamino E forma randama žmogaus ląstelėse (Valko

ir kt., 2005). Vitamino E pagrindinė antioksidacinė funkcija yra apsaugoti ląstelių membranas nuo

lipidų peroksidacijos. Tokoferoliai veikia sujungdami laisvuosius radikalus, susidarančius lipidų

16

peroksidacijos grandininių reakcijų metu. Šis susidariusių lipidinių radikalų pašalinimas neleidžia

susidaryti naujiems radikalams ir vykti grandininėms reakcijoms, pažeidžiančioms ląstelių membranų

lipidus (Singh ir kt., 2005).

Ubichinolis – redukuota kofermento Q forma – tai antioksidantas kuris saugo lipidus nuo

laisvųjų radikalų poveikio (Quinzii ir kt., 2010). Kaip energijos perdavėjas elektronų transporto

grandinėje kofermentas Q nuolat dalyvauja oksidacijos – redukcijos reakcijose. Redukuotos formos

kofermento Q molekulėje elektronai gana silpnai prisijungę ir tokia molekulė lengvai atiduoda vieną ar

du elektronus, taip pasireiškiant antioksidaciniam jo poveikiui. Kofermentas Q stabdo lipidų

peroksidaciją slopindamas lipidinių peroksi-radikalų susidarymą, jis taip pat slopina [Fe3+

O2]•,

1O2

formavimąsi (Kunwar ir kt., 2011). Taip pat jis geba efektyviai regeneruoti vitaminą E iš oksiduotos į

antioksidaciniu poveikiu pasižyminčią redukuotą formą (Petillo ir kt., 2008).

Baltymams, sujungiantiems pereinamųjų metalų jonus, priklauso baltymai, dalyvaujantys

metalų apykaitoje organizme ir galintys sujungti sunkiųjų metalų jonus, pavyzdžiui, transferinas,

laktoferinas, ceruloplazminas. Transferinas ir ceruloplazminas yra serumo baltymai, pasižymintys

lipidų peroksidaciją slopinančiu poveikiu (Verma ir kt., 2005). Transferinas dalyvauja geležies

apykaitoje, sujungia laisvą geležį. Tokiu būdu slopinamos Fentono reakcijos, kurių metu susidaro

laisvieji radikalai (Esposito ir kt., 2003). Ceruloplazminas pasižymi fermentiniu aktyvumu, jis

katalizuoja reakciją, kurios metu Fe2+

oksiduojami į Fe3+

, būtent tokiu pavidalu šiuos jonus prijungia

pernašos baltymas transferinas (Verma ir kt., 2005).

Nefermentiniams antioksidantams taip pat galima priskirti metalotioneinus (MT). Tai yra

daug cisteino turintys mažos molekulinės masės baltymai, gebantys sujungti SM ir tokiu būdu juos

nukenksminti. Keletas atliktų tyrimų parodė, kad MT taip pat gali tiesiogiai neutralizuoti SM

poveikyje susidarančius laisvuosius radikalus – O2•‾, •OH, H2O2, NO, ONOO‾. MT sintezę skatina

sunkieji metalai, hormonai, uždegiminiai procesai, vaistai, įvairūs oksidantai ir prooksidantai (Cai ir

kt., 2000).

MT randami daugelyje stuburinių gyvūnų organų. Kepenyse ir inkstuose būna didžiausia jų

koncentracija, nes šiuose organuose MT kaupiasi organizmui senstant (Bobillier-Chaumont ir kt.,

2006). Yra atrastos 4 pagrindinės MT izoformos: MT-I ir MT-II randamos visuose audiniuose, tačiau

didžiausi jų kiekiai yra aptinkami kepenyse, inkstuose, žarnyne, MT-III izoforma nustatyta tik

smegenyse, MT-IV – epitelio ląstelėse (Jacob ir kt., 2002). MT skirtingų tipų ląstelėse, kaip ir

skirtinguose organuose, pasiskirsto taip pat pakankamai nevienodai. Pavyzdžiui, kepenyse MT

randami hepatocituose, o fibroblastuose ar kitose ląstelėse jų neaptinkama. Nustatyta, kad MT

koncentracija skirtingų organizmų tuose pačiuose organuose taip pat skiriasi (Park ir kt., 2001).

MT pasižymi antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu, jie taip pat slopina įvairius

patofiziologinius procesus ląstelėse. Šie apsauginiai baltymai reguliuoja cinko absorbciją ir dėl to yra

17

svarbūs įvairių fermentų, transkripcijos veiksnių veiklai, baltymų sintezės procesui (Park ir kt., 2001).

MT taip dalyvauja cinko apykaitoje organizme – jie geba sujungti, o reikiant atpalaiduoti cinko jonus,

tokiu būdu veikdami kaip pagrindiniai šio mikroelemento reguliaciniai komponentai ląstelėje. Ši MT

funkcija yra ypatingai svarbi smegenyse (Cai ir kt., 2000). Eksperimentų su gyvūnais metu nustatyta,

kad MT veiksmingai slopina oksidacinį stresą smegenyse in vivo sąlygomis. Antioksidacinis jų

poveikis pasireiškia slopinant lipidų peroksidaciją, azoto oksido susidarymą – reiškinius, kurie sukelia

neuronų pažeidimus ir ląstelių žūtį (Feng ir kt., 2005).

Antioksidacines MT savybes lemia juos sudarančių cisteino molekulių tiolinių grupių

nukleofiliškumas ir MT gebėjimas sudaryti su metalais kompleksinius junginius. MT gali sujungti

pakankamai didelį metalų jonų kiekį – iki 7 kadmio, gyvsidabrio ir cinko, 12 vario, 18 sidabro. MT

ypatingai svarbūs kadmio detoksikavimo procese, o Cd2+

yra stiprūs MT sintezės induktoriai (Park ir

kt., 2001). MT, surišdami laisvus SM jonus, juos detoksikuoja, neleisdami sukelti oksidacinių

pažeidimų. SM turi didelį afinitetą tiolines grupes turintiems junginiams. MT, kurių sudėtyje cisteino

kiekis siekia ne mažiau 20-30%, taip pat turi laisvų tiolinių grupių, prie kurių ir prisijungia SM jonai.

Taip sumažėja SM geba difunduoti pro ląstelių sieneles į ląstelių vidų ir mažėja jų toksiškumas (Haq ir

kt., 2003). Svarbu paminėti ir tai, kad patekę į organizmą SM, ypač kadmis, yra saugomi sujungti su

MT kompleksinių junginių pavidalu kepenyse. Iš ten šie kompleksai bėgant laikui patenka į kitus

audinius, kuriuose iš kompleksų su MT atpalaiduoti SM jonai vėl gali būti sujungiami MT. Trūkstant

šių apsauginių baltymų, kai SM jonai lieka laisvi, gali pasireikšti toksinis jų poveikis (Kang ir kt.,

2006, Kara ir kt., 2005). Metalų atpalaidavimo mechanizmas iš komplekso su MT nėra visiškai aiškus.

Manoma, kad metalai gali būti atlaisvinami nuo MT oksiduojant šiuos baltymus (Haq ir kt., 2003).

2.3. Sunkieji metalai. Bendra charakteristika

SM – tai grupė cheminių elementų, kurių tankis didesnis nei 5 g/cm3. Kai kurie šių metalų –

kobaltas, varis, molibdenas, cinkas, stroncis labai mažais kiekiais yra būtini žmogaus organizmui.

Kobaltas įeina į vitamino B12, mielino sudėtį, kuris svarbus kraujodarai (Jomova ir kt., 2010). Varis

reikalingas organizmo fermentų veiklai, elastino, kolageno gamybai, svarbus normaliai skydliaukės

veiklai (Angelova ir kt., 2011; Fraga, 2003). Molibdenas reikalingas kraujodaros procesui organizme,

veikia kaip įvairių fermentų, kofaktorius (Fraga, 2003). Cinkas taip pat reikalingas fermentų veiklai

organizme – jis yra beveik šimto fermentų kofaktorius, svarbus imuninės sistemos veiklai, baltymų,

DNR sintezei, skatina žaizdų gijimą (Prasad, 2008). Stroncis reikalingas elementas kaulų

mineralizacijai – jis pasižymi anaboliniu poveikiu kaulams (Bonjour ir kt., 2009). Dalis metalų – stibis,

18

švinas, nikelis, alavas mikro kiekiais taip pat randami žmogaus organizme, tačiau jie neturi biologiškai

aktyvaus poveikio (Hall ir kt., 2007).

SM šaltiniai yra natūralūs (gamtiniai) ir antropogeniniai. Natūraliai aplinkoje SM randami dėl

uolienų ir dirvožemio erozijos, atmosferinių nuosėdų. Antropogeniniai SM šaltiniai yra pramonės

įmonių, žmogaus ūkinė bei gamybinė veikla. Metalai į žmogaus organizmą gali patekti įvairiais

keliais: per kvėpavimo takus, per virškinamąjį kanalą, tiesiogiai per odą (Soghoian, 2011).

Tam tikros sunkiųjų metalų koncentracijos gali sukelti ūminį ar lėtinį apsinuodijimą, o jų

toksiškumas gali pasireikšti sutrikusia centrinės nervų sistemos (CNS) veikla, pvz, atminties

susilpnėjimu, energijos trūkumu, kraujo sudėties pokyčiais, plaučių, kepenų, inkstų ir kitų gyvybiškai

svarbių organų pažeidimais (Kurowska ir kt., 2010). Ilgas buvimas sveikatai žalingoje aplinkoje, kai į

organizmą nuolat patenka nedideli minėtų sunkiųjų metalų kiekiai, gali sukelti lėtai progresuojančius

fizinius ir neurologinius degeneracinius procesus, tokius kaip Alzheimerio liga, Parkinsono liga,

raumenų distrofija ar išsėtinė sklerozė. Alergijos dėl sunkiųjų metalų poveikio pasireiškia labai retai,

tačiau pakartotinis ilgalaikis kontaktas su kai kuriais sunkiaisiais metalais, pavyzdžiui, kadmiu, nikeliu

ar jų junginiais gali sukelti netgi vėžį (Soghoian, 2011).

SM toksiškumą lemia keletas veiksnių. Specifiniai apsinuodijimo simptomai priklauso nuo

konkretaus metalo, patekusios į organizmą, dozės ir nuo poveikio trukmės. Apsinuodijimo sunkumas

taip pat priklauso ir nuo apsinuodijusio asmens amžiaus (Soghoian, 2011).

Neigiamas SM poveikis organizmui pasireiškia keletu mechanizmų, vienas jų - aktyvuojant

oksidacinio streso sistemą. SM yra vieni laisvųjų radikalų susidarymą skatinančių veiksnių.

Molekulinio deguonies redukcijos procesas, veikiant SM jonams labai pagreitėja (Kunwar ir kt., 2011).

SM patekimas padidina nefermentį laisvųjų radikalų susidarymą vykstant redokso ciklo reakcijoms.

Tai aiškinama tuo, kad SM yra geri deguonies molekulės redukcijos vienu elektronu katalizatoriai

(Valko ir kt., 2006). Esant organizme SM jonų, laisvųjų radikalų susidarymas, dalyvaujant

fagocitinėms ląstelėms (makrofagams, leukocitams), taip pat suintensyvėja (Kunwar ir kt., 2008). Dėl

šių priežasčių biologinėse sistemose SM veikia kaip oksidacinio biologinių makromolekulių pažeidimo

katalizatoriai ir todėl pasižymi įvairiapusiu toksiniu poveikiu, keliančiu grėsmę gyvajai gamtai ir

žmonių sveikatai (Valko ir kt., 2005; Hengstler ir kt., 2003). Dėl SM sukelto laisvųjų radikalų

susidarymo pažeidžiamos lipidų, baltymų molekulės, DNR ir tokiu būdu sukeliami įvairūs patologiniai

procesai žmonėms ir gyvūnams (Valko ir kt., 2006). Visa tai lemia, kad SM poveikio tyrimas yra

tinkamas modelis jų toksiškumo gyviesiems organizmams ir ląstelių antioksidacinės sistemos

aktyvumo įvertinimui. 3 pav. pateikiami sunkiųjų metalų jonais sukeliamo oksidacinio streso keliai

organizme ir galimos jo pasekmės.

19

3 pav. Metalų jonais sukelto oksidacinio streso keliai organizme

Sudaryta autorės

2.4 Kadmio poveikis organizmui

2.4.1. Kadmio vaidmuo ligų patogenezėje

Kadmis (Cd) – sunkusis metalas, periodinės elementų lentelės IIB grupėje esantis tarp cinko ir

gyvsidabrio. Jis įeina į įvairių lydinių sudėtį, naudojamas galvanizacijai, graviravimui, atominėje

pramonėje, nikelio – kadmio elementams, šarminiams akumuliatoriams, dažams, gaminti, jo yra

cigarečių dūmuose (Fraga, 2003).

Kadmis yra vienas toksiškiausių SM žmogaus organizmui (Shadi ir kt., 2001; Sharma ir kt.,

2008; Hall ir kt., 2007). Remiantis PSO rekomendacijomis, šio SM paros dozė žmogaus organizme

neturėtų viršyti 70 µg. Vis dėlto, manoma, kad dėl plataus vartojimo per parą į žmogaus organizmą

gali patekti dvigubai didesni šio metalo kiekiai (Satarug ir kt., 2009). Kadmio toksiškumą sustiprina

tai, kad jo eliminacijos iš organizmo laikas yra labai ilgas – 13-40 metų (Waisberg ir kt., 2003).

20

Šis metalas yra labai nuodingas ir kelia rimtą pavojų gyvybei kai patenka į organizmą per

virškinamąjį traktą ar kvėpavimo takus. Ūmi intoksikacija pasireiškia į organizmą patekus 15 mg/kg

kadmio (Kurowska ir kt., 2010).

Eksperimentiniams gyvūnams šis metalas sukelia kvėpavimo sistemos, urogenitalinės

(prostatos, sėklidžių), kraujodaros sistemų navikus. Tyrimų su gyvūnais metu taip pat nustatytas

nefrotoksinis, neurotoksinis šio metalo poveikiai. (Lin ir kt., 2009; Mendez-Armenta ir kt., 2007).

Kadmio ir jo junginių toksiškumas gali pasireikšti ir susilpnėjusia imuninės sistemos funkcija – ūmios

intoksikacijos kadmio junginiais metu eksperimentiniams gyvūnams susilpnėja humoralinis imuninis

atsakas, sumažėja makrofagų aktyvumas, vystosi užkrūčio liaukos atrofija, splenomegalija. Dėl visų

šių poveikių kadmio ir jo junginių intoksikacijos metu sumažėja organizmo atsparumas infekcijoms

(Neelima ir kt., 2008).

Žmonėms ūmių apsinuodijimų kadmiu metu pasireiškia kvėpavimo takų funkcijos sutrikimas

– išsivysto plaučių edema, pneumonija (Bernard, 2008). Lėtinės intoksikacijos kadmio junginiais

atveju taip pat pasireiškia kvėpavimo takų organų pažeidimai ir jų disfunkcija – gali išsivystyti plaučių

emfizema, lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL), taip pat gali pasireikšti plaučių jungiamojo audinio

irimas, išsivystyti plaučių navikai (Satarug ir kt., 2009; Waisberg ir kt., 2003). Lėtinius apsinuodijimus

šiuo sunkiuoju metalu dažnai sukelia cigarečių dūmai (Kurowska ir kt., 2010).

2.4.2. Kadmis ir oksidacinis stresas

Kadmis organizme sukelia oksidacinį stresą, kuris pasireiškia keliais mechanizmais:

1. Ląstelių apsauginių sistemų aktyvinimas (MT, GSH sintezė) ir poveikis tioliniams junginiams;

2. Lipidų peroksidacijos sukėlimas;

3. Žalingas poveikis ląstelių fermentams (Ercal ir kt., 2001; Mahmodabady ir kt., 2006).

Į organizmą patekęs kadmis indukuoja MT, kurie suriša Cd2+

, sintezę. Susidarę kadmio – MT

kompleksai (Cd-MT) saugomi kepenyse. Iš kepenų šie kompleksai laikui bėgant patenka į inkstus,

kitus audinius. Inkstuose jie filtruojami ir reabsorbuojami proksimaliniuose kanalėliuose. Cd-MT

kompleksai yra metabolizuojami lizosomose. Šio proceso metu yra išlaisvinami Cd2+

, kurie vėl

jungiasi prie MT molekulių arba, būdami laisvi, Cd2+

gali toksiškai veikti audinius (Ercal ir kt., 2001;

Kang, 2006). Kadmis daugiausia kaupiasi kepenyse ir inkstuose, ten ir yra nustatomi didžiausi MT

kiekiai (Klaasen ir kt., 2009).

Kadmis keičia ir GSH kiekį ląstelėse. Bet koks šio tripeptido kiekio pokytis rodo oksidacinės

sistemos būsenos sutrikimą. Kai ląstelės yra paveikiamos sunkiųjų metalų jonų, GSH sintezė

suintensyvėja, tokiu būdu siekiant neutralizuoti SM ir jų poveikyje susidarančius laisvuosius radikalus

21

bei atkurti įprastą ląstelės oksidacinę būseną. Neigiamas kadmio poveikis tioliniams junginiams

pasireiškia Cd2+

jungiantis prie tiolinių grupių turinčių baltymų molekulių ir slopinant jų aktyvumą

(Pacheco ir kt., 2008; Templetom ir kt., 2010).

Patekęs į organizmą kadmis sukelia ir lipidų peroksidaciją. Šio proceso suintensyvėjimas

aiškinamas GSH ir MT išeikvojimu. Kai šių junginių pradeda trūkti ląstelėse, Cd2+

nėra sujungiami ir

inaktyvuojami, o tai lemia laisvųjų deguonies radikalų susidarymą, kurie atakuoja ląstelių membranų

lipidus (Ercal ir kt., 2001; Grotto ir kt., 2009). Kadmio gebėjimą sukelti lipidų peroksidaciją rodo tai,

kad šiam metalui patekus į organizmą, kepenyse ir inkstuose yra stebimas MDA kiekio padidėjimas

(Ercal ir kt., 2001). Pagal šio aldehido kiekį ląstelėse galima spręsti apie biologinių struktūrų

oksidacinio pažeidimo laipsnį, todėl MDA kiekio tyrimas dažnai taikomas eksperimentuose vertinant

kadmio sukeltus pažeidimus (Grotto ir kt., 2009). Lipidų peroksidacija yra žalinga ląstelėms ne tik dėl

ląstelės struktūrinių pažeidimų. Susidaręs MDA nėra neutralus junginys, jis geba reaguoti su DNR

nukleotidais susidarant tam tikriems cheminiams junginiams. Tokie pokyčiai DNR molekulėse lemia

mutageninį MDA poveikį žmogaus ląstelėms (Filipič ir kt., 2006).

Cd2+

taip pat neigiamai veikia ir ląstelių fermentus. Ypač stipriai šis metalas slopina du

pagrindinius antioksidacinės sistemos fermentus – KAT ir SOD (Ercal ir kt., 2001). SOD2 inhibavimas

yra susijęs su Mn2+

pakeitimu Cd2+

jonais fermento aktyviajame centre, o SOD1 inakyvinimas

siejamas ne su Zn2+

pakeitimu Cd2+

, bet su fermento ir Cd2+

tarpusavio sąveika. KAT inhibavimas

vyksta dėl fermento molekulės struktūrinių pokyčių, kurių katalizatorius yra Cd2+

. Jiems veikiant

imidazolo liekana jungiasi su His-74 liekana, kuri yra būtina H2O2 skaidymo reakcijose ir tokiu būdu

fermentas netenka aktyvumo (Ercal ir kt., 2001; Casalino ir kt., 2002).

Kaip matyti iš 3 pav. pateiktos schemos, kadmio ir kitų SM patekimas į organizmą lemia ir

DNR pažeidimus (Risso-de Faverney ir kt., 2004). Cd2+

slopinant ląstelių antioksidacines sistemas

susidaro laisvieji radikalai. Aktyvių deguonies formų susidarymas skatina DNR-baltymų ir DNR-

amino rūgščių kompleksų susidarymą dėl ko sutrinka DNR reparacijos sistema, gali įvykti mutacijos

(Nzengue ir kt., 2008; Pal ir kt., 2011; Filipič ir kt., 2006). Taip pat gali būti slopinamas DNR sintezės

procesas, sutrikdoma genų raiška, baltymų sintezės procesai (Hsiao ir kt., 2004; Sandalio ir kt., 2009).

2.5. Nikelio poveikis organizmui

2.5.1. Nikelio vaidmuo ligų patogenezėje

Dar vienas šiais laikais pramonėje plačiai naudojamas metalas yra nikelis. Jis pritaikomas

įvairioms reikmėms: galvanizacijai, elektroninės įrangos, plieno, keramikos, nikelio – kadmio

22

elementų gamybai (Kasprzak ir kt., 2003). Tai taip pat sunkusis metalas, kuris, patekęs į organizmą per

kvėpavimo takus, odą ar virškinamąjį traktą, gali sukelti ūminius ir lėtinius apsinuodijimus (Forti ir kt.,

2011). Natūraliai aplinkoje nikelio yra labai maži kiekiai. Ten, kur šis metalas yra naudojamas

pramoniniais tikslais, jo koncentracija gali būti žymiai didesnė. Dėl to pagrindinė apsinuodijimų

nikeliu priežastis yra pramonės įmonių veikla. Nikelis pasižymiu stipriu kancerogeniniu poveikiu,

todėl yra labai pavojingas su juo dirbantiems žmonėms (Raymond ir kt., 2005).

Ūmiai apsinuodijama nikelio junginiams patekus į organizmą per kvėpavimo takus ar

virškinamąjį traktą. Jis kaupiasi plaučiuose, kepenyse, inkstuose. Tyrimų su gyvūnais metu nustatyta,

kad jis taip pat gali kauptis širdies raumenyje, riebaliniame ir periferiniame nerviniame audiniuose,

smegenyse (Das ir kt., 2008). Atliktų tyrimų metu nustatyta, kad nikelio junginiai žmonėms sukelia

negrįžtamus plaučių audinio pažeidimus ir funkcijos sutrikimus, inkstų kanalėlių nekrozę, anemiją,

eozinofiliją, nosies pertvaros išopėjimą (Chen ir kt., 2003). Ūmiai apsinuodijus taip pat gali pasireikšti

miokarditas, encefalopatija, o nikelio junginiams patekus ant odos gali prasidėti alerginės reakcijos,

dermatitas. Labai pavojingas yra ūmus apsinuodijimas organiniu nikelio junginiu -

tetrakarbonilnikeliu, kuris susidaro reaguojant CO su aktyviu nikeliu (Kasprzak ir kt., 2003).

Nikeliui patekus į organizmą stebimi fiziologinių ir cheminių procesų pokyčiai organizme –

tai sumažėjęs azoto sulaikymas, gliukozurija, fosfaturija, kalcio ir cinko išsiskyrimas su šlapimu (Das

ir kt., 2008). Ni2+

taip pat slopina ATP‘azės – fermento, dalyvaujančio ląstelių energijos apykaitoje,

aktyvumą, o tai gali sukelti neurologinius sutrikimus, traukulius, komą (Kurowska ir kt., 2010). Lėtinis

apsinuodijimas nikeliu pasireiškia redukuoto kofermento nikotinamido – NADH, kuris yra būtinas

oksidacinio fosforilinimo procesui mitochondrijose vykti, kiekio sumažėjimu. Tokiu būdu sutrinka

energijos atpalaidavimas ląstelėse dėl ko gali pasireikšti nuovargis, imuniteto susilpnėjimas, apatija,

pagreitėjęs širdies ir kitų ligų progresavimas (Denkhaus ir kt., 2002; Demir ir kt., 2011).

2.5.2. Nikelis ir oksidacinis stresas

Bendrai, kaip ir kadmio, nikelio toksiškumas pasireškia sukeliamu oksidaciniu stresu

ląstelėse, kuriam būdinga laisvųjų deguonies radikalų susidarymas, baltymų sulfhidrilinių grupių

sujungimas, glutationo kiekio sumažėjimas, dėl ko ir pasireiškia citotoksinis, genotoksinis ir kiti šio

metalo poveikiai (Chen ir kt., 2003; Costa ir kt., 2002).

Lyginant su variu, geležimi, kobaltu ar kitais redokso-aktyviais metalais, nikelio poveikyje

susidaro santykinai mažiau, tačiau pakankamas kiekis ląstelių pažeidimus sukeliančių laisvųjų radikalų

(Chen ir kt., 2003). Šių reaktyvių junginių susidarymą skatina tiek vandenyje tirpūs, tiek netirpūs

nikelio junginiai (Kurowska ir kt., 2010).

23

Nikelis, kaip ir kadmis, sukelia lipidų peroksidaciją (Valko ir kt., 2006). Šio proceso metu

oksiduojamos nesočiosios riebiosios rūgštys dėl ko pažeidžiamos ląstelių membranos, o susidarę

reaktyvūs lipidiniai peroksi-radikalai gali sukelti tolesnius ląstelių pažeidimus. Tai yra ūmaus nikelio

toksiškumo pasekmė, o tyrimų su graužikais metu nustatyta, kad intensyviausiai lipidų peroksidacija

Ni2+

poveikyje indukuojama kepenyse, inkstuose, kraujo ląstelėse, raumenyse, sėklidėse (Doreswamy

ir kt., 2004; Chen ir kt., 2003). Svarbu ir tai, kad nikelio junginiams patekus į organizmą stipriai

slopinamas antioksidacinių fermentų – SOD, KAT, Gpx, Gred aktyvumas, dėl ko lipidų peroksidacija,

veikiant Ni2+

, dar labiau suintensyvėja (Doreswamy ir kt., 2004, Cameron ir kt., 2011).

Nikelio junginiai, patekę į organizmą, sukelia ir baltymų, atliekančių daug gyvybiškai svarbių

funkcijų, oksidaciją (Valko ir kt., 2006). Oksidacijos metu gali susidaryti baltymų hidroperoksidai, gali

būti hidroksilinamos aminorūgščių aromatinės grupės ir šoninės grandinės, nitrinamos aromatinės

aminorūgščių liekanos, oksiduojamos sulfhidrilinės grupės, amino rūgščių liekanos konvertuojamos į

karbonilines grupes. Taip pat oksidacijos metu gali skilti baltymų molekulių polipeptidinės grandinės

ir tarp jų gali formuotis skersinės jungtys. Visi šie procesai keičia peptidų, baltymų molekulių struktūrą

dėl ko pakinta jų aktyvumas ir funkcijos (Jha ir kt., 2011).

Ni2+

poveikyje susidarę laisvieji radikalai taip pat gali pažeisti DNR azotines bazes ir sukelti

genetines modifikacijas, o jos – įvairių navikų išsivystymą (Das ir kt., 2008; Cameron ir kt., 2011).

2.6. Cinko biologinis poveikis

2.6.1. Cinko funkcijos organizme

Cinkas kaip mikroelementas organizme yra svarbus įvairiems medžiagų apykaitos procesams

vykti. Jis reikalingas normaliai imuninės sistemos veiklai, augimui, vystymuisi, taip pat skatina žaizdų

gijimą, pasižymi priešuždegiminiu poveikiu (King, 2011). Vidutinis šio mikroelemento trūkumas

pasireiškia augimo sulėtėjimu ir vyrų hipogonadizmu paauglystėje, trūkstant cinko būna šiurkšti oda,

prastas apetitas, susilpnėjusi atmintis, pablogėjęs žaizdų gijimas (Osredkar ir kt., 2011). Sunkus cinko

trūkumas sukelia dar rimtesnių sveikatos sutrikimų – gali išsivystyti pūslelinis dermatitas, alopecija,

emociniai sutrikimai, svorio netekimas, gretutinės infekcijos dėl susilpnėjusio ląstelinio imuninio

atsako. Taip pat gali pasireikšti neurosensoriniai sutrikimai, vyrams – hipogonadizmas. Jei sunkus

cinko trūkumas nėra laiku nustatomas ir gydomas, jis gali būti netgi mirtinas (Prasad, 2008).

Cinkas svarbus normaliai ląstelių, atsakingų už įgimtą imunitetą, neutrofilų ir „natūralių

žudikių“ ląstelių, T ir B imuninės sistemos ląstelių diferenciacijai ir funkcijai. Šis mikroelementas

reikalingas ir makrofagų subrendimui, fagocitozės procesui vykti, citokinų gamybai (Prasad, 2009).

24

Cinkas ląstelėse atlieka daug svarbių funkcijų (Cousins ir kt., 2003). Būdamas daugiau nei

100 fermentų kofaktorius, cinkas atlieka labai svarbią katalizinę funkciją (King, 2011). Šis metalas

įeidamas į baltymų molekulių sudėtį atlieka struktūrinę funkciją. Keturių aminorūgščių cisteino arba

histidino molekulės ir cinkas formuoja tetraedrinius „cinko pirštų“ kompleksus. Tokie kompleksai

aptinkami įvairių baltymų, dalyvaujančių ląstelių diferenciacijos, proliferacijos, signalų perdavimo,

ląstelių adhezijos ar transkripcijos procesuose, struktūroje (Osredkar ir kt., 2011). Trečia labai svarbi

cinko atliekama funkcija yra reguliacinė. Šis metalas reguliuoja kai kurių genų raišką (Peixoto ir kt.,

2003; Cousins ir kt., 2003). Cinkas taip pat dalyvauja baltymų, DNR sintezės ir ląstelių dalijimosi

procesuose, pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, geba stabilizuoti ląstelių membranas. Šis poveikis

rodo, cinko gebėjimą užkirsti kelią laisvųjų radikalų sukeltai žalai uždegiminių procesų metu (Cousins

ir kt., 2003). Antioksidacinis šio metalo poveikis gali apsaugoti nuo senėjimo, įvairių ligų atsiradimo,

taip pat padeda paspartinti gijimo procesą po įvairių traumų (Prasad, 2009; Osredkar ir kt., 2011).

2.6.2. Cinko antioksidacinio poveikio mechanizmai

Cinko antioksidacinis poveikis pasireiškia keletu mechanizmų. Pirmiausia, jis slopina laisvųjų

radikalų susidarymą, inhibuodamas fermentą NADPH oksidazę (Prasad, 2009). Šis fermentas

dalyvauja pernešant elektronus per ląstelės membraną nuo redukuoto kofermento NADPH

molekuliniam deguoniui. Proceso metu vyksta ir O2•‾ susidarymas. Inhibuodamas NADPH oksidazę

cinkas slopina oksidacinio streso pasireiškimą ir jo sukeliamus ląstelių, audinių ir organų pažeidimus

(Kuroda ir kt., 2010).

Cinkas įeina į antioksidaciniu poveikiu pasižyminčio fermento – SOD – vienos iš izoformų,

kuri dalyvauja neutralizuojant laisvuosius radikalus, sudėtį (Valko ir kt., 2006). SOD1 yra

metalofermentas, kurio struktūroje yra vario ir cinko jonai. SOD1 randamas ląstelių citozolyje,

branduolyje, peroksisomose, mitochondrijose – ląstelių organoiduose, kuriuose susidaro laisvieji

radikalai, ir kuriuos reikia greitai inaktyvuoti. Šis fermentas neutralizuoja labai aktyvius superoksido

radikalus (Kunwar ir kt., 2011; Circu ir kt., 2011).

Cinkas taip pat skatina MT – baltymų, dalyvaujančių neutralizuojant laisvuosius radikalus,

sintezę (Prasad, 2009). Nors variui ir kadmiui MT turi didesnį giminingumą negu cinkui, šie baltymai

normaliomis sąlygomis organizme randami susijungę būtent su šiuo metalu. Viena MT molekulė gali

prijungti iki 7 Zn2+

(Feng ir kt., 2005; Nemec ir kt., 2009). Apsinuodijus sunkiaisiais metalais,

pavyzdžiui, kadmiu, nikeliu MT geba sujungti šiuos metalus neleisdamas jiems skatinti laisvųjų

radikalų susidarymo ir sukelti oksidacinių pažeidimų. (King, 2011).

25

3. TYRIMO METODIKA

3.1. Tyrimo objektas ir reagentai

Eksperimentai atlikti su nelinijinėmis 4-6 savaičių amžiaus baltosiomis laboratorinėmis

pelėmis, sveriančiomis 20-25 g (4 pav.). Moksliniai tyrimai atlikti remiantis Lietuvos Respublikos

gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Žin., 1997, Nr. 108-2728) 14 straipsniu, Valstybinės

veterinarijos tarnybos 1998 m. gruodžio 31 d. įsakymu Nr. 4-361 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo,

dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ ir 1999 m. sausio 18 d. įsakymu

Nr. 4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ bei sveikatos apsaugos

ministro 1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių

neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“, o taip pat Europos etikos komiteto darbui su

laboratoriniais gyvūnais nustatytų reikalavimų. Darbui su laboratoriniais gyvūnais gavome leidimą,

kurį išdavė Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir

veterinarijos tarnybos (leidimo Nr. 0200).

Eksperimentams naudotos baltosios laboratorinės pelės iš LSMU VA vivariumo ir 7 dienas

laikytos karantino sąlygomis. Patinai ir patelės laikyti atskiruose narveliuose, sudarant optimalias

laikymo sąlygas: patalpų temperatūra ~20°C, santykinė oro drėgmė 55±10 proc., natūralus šviesos

(diena/naktis) režimas. Pakratams naudotos medienos drožlės ir šienas, kuriuos kiekvieną dieną

keitėme švariais. Peles šėrėme „Kauno grūdų“ pilnaverčiu maistu graužikams ir girdėme vandentiekio

vandeniu ad libitum.

4 pav. Tyrimo objektas

Eksperimentams naudojome šiuos reagentus: Tris, tiobarbituro rūgštis (TBR), nikelio

chloridas (NiCl2×6H2O) – firmos „Sigma“ (JAV); fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), etanolis, 5,5-

ditiobisnitrobenzoinė rūgštis (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); 2-merkaptoetanolis, kalio

chloridas (KCl), druskos rūgštis (HCl), ortofosforo rūgštis (H3PO4), – firmos „Merck“ (Vokietija);

natrio chloridas (NaCl), kadmio chloridas (CdCl2), cinko sulfatas (ZnSO4) – firmos „Lachema“

26

(Čekija); trichloracto rūgštis (TChA), n-butanolis, chloroformas – Rusija. Tirpalams gaminti

naudojome dejonizuotą vandenį.

3.2. Metalų toksiškumo įvertinimas. Tyrimo modeliai

Medžiagos toksiškumas dažniausiai vertinamas vidutine mirtina doze (LD50). Tai yra

mažiausia jos koncentracija, nuo kurios žūva 50 proc. visų bandomųjų gyvūnų. Kiekvieno tirto metalo

toksiškumui įvertinti, nustatėme atitinkamą LD50 dozę baltosioms laboratorinėms pelėms. Ji

išreiškiama miligramais metalo, tenkančiais bandomojo gyvūno vienam kūno masės kilogramui. Šią

dozę paskaičiavome vadovaujantis Ašmarino ir Vorobjovo pateikiama metodika (Ашмарин ИП,

1962). LD50 dozės nustatymui kiekviename narvelyje dešimčiai pelių į pilvo ertmę sušvirkštėme tam

tikrą metalo druskos (CdCl2, NiCl2, ZnSO4) tirpalo kiekį (5 pav.). Po paros laiko vertinome, kiek

procentų sudarė kritusios ir išgyvenusios pelės. Jei kritusios ir išgyvenusios pelės sudarė po 50 proc.,

tai fiziologiniame tirpale esantis metalų kiekis mg ir yra LD50. Jei kritusių ir išgyvenusių pelių skaičius

nevienodas, LD50 paskaičiuojama pagal formulę (Ашмарин ir kt., 1962):

lgLD50 = lgDN – δ(ΣLi – 0,5)

DN – eksperimente panaudota maksimali medžiagos dozė, δ – panaudotų dozių santykio

logoritmas, Li – kritusių ir visų pelių, kurioms buvo įvedama medžiagos dozė, santykis, ΣLi – Li

reikšmių, paskaičiuotų visoms panaudotoms dozėms, suma.

Nustatėme tokias metalų dozes, atitinkančias LD50:

CdCl2 – 3,2 mg Cd (28 µmol) vienam kūno masės kilogramui;

NiCl2 – 11,2 mg Ni (190 µmol) vienam kūno masės kilogramui;

ZnSO4 – 10,3 mg Zn (157 µmol) vienam kūno masės kilogramui.

Metalų jonų poveikį laboratorinėms pelėms įvertinome 2 pasirinktais modeliais:

1. Ūmios vienkartinės intoksikacijos modelis (n=50): pelėms į pilvo ertmę (5 pav.)

švirkštėme vienodą fiziologinio tirpalo tūrį, kuriame buvo ištirpintas reikalingas CdCl2, NiCl2 arba

ZnSO4 kiekis. Organizmo veikimo metalų jonais trukmė buvo 24 val. Metalų intoksikacijai, peles

suskirstėme į grupes:

pelės, kurioms švirkštėme CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

pelės, kurioms švirkštėme NiCl2 (5,6 mg (95 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

27

pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių NiCl2 (5,6 mg (95 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

kontrolinėms pelėms švirkštėme atitinkamą fiziologinio tirpalo tūrį.

2. Kartotinės 14 dienų trukmės intoksikacijos modelis (n=50): 14 dienų vieną kartą per

dieną pelėms į pilvo ertmę švirkštėme (5 pav.) vienodą fiziologinio tirpalo tūrį, kuriame buvo

ištirpintas reikalingas CdCl2, NiCl2 arba ZnSO4 kiekis. Metalų intoksikacijai, peles suskirstėme į 6

grupes:

pelės, kurioms švirkštėme CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

pelės, kurioms švirkštėme NiCl2 (1,12 mg (19 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių NiCl2 (1,12 mg (19 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

kontrolinėms pelėms švirkštėme atitinkamą fiziologinio tirpalo tūrį.

Praėjus numatytai intoksikacijos trukmei, pelėms buvo atlikta cervikalinė dislokacija ir

dekapitacija. Tyrimams buvo išimti pelių organai, praplauti šaltu (4 ºC) fiziologiniu tirpalu ir patalpinti

į Petri lėkštelę, atšaldytą ant ledo.

5 pav. Metalų druskų tirpalų sušvirkštimas į pelės pilvo ertmę

28

3.3. Tyrimo metodai

3.3.1. MT koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse

MT koncentraciją nustatatėme pagal Peixoto ir bendraautorių pasiūlytą metodiką (Peixoto ir

kt., 2003). Pelių kepenis ir smegenis pasvėrėme ir susmulkinome (homogenizavome) 4 tūriuose

(lyginant su kepenų ir atitinkamai smegenų mase) buferinio tirpalo (20 mM Tris-HCl (pH 8,6), 0,5 M

PMSF (proteazių slopiklis), 0,01 proc. β-merkaptoetanolio (merkapto grupių reduktorius)).

Homogenatą centrifugavome 17000×g pagreičiu 30 min. Beckman J2-21 centrifuga (JAV). Gautą

supernatantą naudojome MT koncentracijos nustatymui tiriamuose organuose.

Į 1 ml gauto supernatanto įpylėme 1,05 ml šalto (–20°C) absoliutaus etanolio ir 80 µl

chloroformo. Šį gautą mišinį centrifugavome 6000×g pagreičiu 10 min. K-24 centrifuga. Po

centrifugavimo nupylėme vandeninį sluoksnį, į kurį įpylėmė trigubą tūrį (lyginant su supernatanto

frakcija) šalto etanolio (–20 °C) ir laikėme –20 °C temperatūroje 1 val. Nuosėdas surinkome centri-

fuguodami 6000×g pagreičiu 10 min. K-24 centrifuga, tirpinome etanolio ir 1 proc. chloroformo

tirpaluose. Tuomet mišinį centrifugavome 6000×g pagreičiu 10 min. ir gautas nuosėdas tirpinome 150

µl 0,25 M NaCl, 15 µl 1 M HCl tirpaluose. Po to kambario temperatūroje įpylėme 4,2 ml 2 M NaCl

(pH 8,0) buferinio tirpalo ir centrifugavome 3000×g pagreičiu 5 min. K-24 centrifuga. MT

koncentraciją gautame supernatante nustatėme spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 412 nm

banga, naudojant molinį sugerties koeficientą 13600. MT koncentracija išreiškiama μg/gramui kepenų

ir smegenų masės.

3.3.2. MDA koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse

MDA koncentraciją nustatėme pagal Uchiyama ir bendraautorių pasiūlytą metodiką

(Uchiyama ir kt., 1978). Pelių kepenis ir smegenis pasvėrėme ir susmulkinome 9 tūriuose (lyginant su

kepenų ir smegenų svoriu) šalto 1,15 proc. KCl tirpalo. Į 0,5 ml gauto homogenato įpylėme 3 ml 1

proc. H3PO4 ir 1 ml 0,6 proc. TBR vandeninio tirpalo. Mišinį maišėme stikline lazdele ir inkubavome

45 min. verdančio vandens vonioje, po to atšaldėme ledo vonioje 10 min. Į atšaldytą mišinį įpylėme 4

ml n-butanolio, stipriai sumaišėme ir centrifugavome 8000×g pagreičiu 10 min. K-24 centrifuga. Po

centrifugavimo nusiurbėme viršutinį sluoksnį ir tirpalo sugertį nustatėme spektrofotometriškai ties 535

ir 520 nm banga. Iš kalibracinės kreivės apskaičiuojama MDA koncentracija (1,1,3,3-

tetrahidroksipropanas naudojamas kaip standartas), kuri išreiškiama μmol/gramui kepenų ir smegenų

masės (Uchiyama ir kt., 1978).

29

3.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas

Gautus duomenis analizavome Statistikos 6.0 paketu. Duomenų patikimumą vertinome pagal

Stjudento t-testą (Swiergosz-Kowalewska, 2001). Skirtumai statistiškai reikšmingi, kai reikšmingumo

lygmuo p0,05.

30

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

4.1. Ūmus kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis MT sintezei pelių kepenyse ir

smegenyse

4.1.1. Vienkartinis kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis MT sintezei pelių

kepenyse ir smegenyse

Darbe nustatėme MT koncentraciją pelių kepenyse ir smegenyse 24 val. po CdCl2, NiCl2 ir

ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo (6 ir 7 pav.). Tyrimo atlikimui pelės buvo suskirstytos į 6 grupes.

Kiekvienai grupei buvo sušvirkšti atitinkami tirpalai: 1 – CdCl2 (14 μmol/kg); 2 – NiCl2 (95 μmol/kg);

3 – ZnSO4 (24 μmol/kg); 4 – ZnSO4 (24 μmol/kg) ir po 20 min. CdCl2 (14 μmol/kg); 5 – ZnSO4 (24

μmol/kg) ir po 20 min. NiCl2 (95 μmol/kg); 6 – kontrolinė grupė (fiziologinis tirpalas).

Gauti rezultatai (6 pav.) parodė, kad praėjus 24 val. po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo, MT

koncentracija pelių kepenyse padidėjo 30 proc. (p<0,05), o po NiCl2 tirpalo sušvirkštimo – 35 proc.

(p<0,05), lyginant su kontrolinių pelių grupe. Zn2+

neturėjo įtakos MT sintezei tirtu laiko tarpsniu –

MT koncentracija pelių kepenyse po 24 val. buvo kontrolės lygyje. Tuo tarpu pelių, kurioms buvo

sušvirkšti CdCl2 ir ZnSO4 tirpalai, kepenyse po 24 val. buvo stebimas 27 proc. (p<0,05), lyginant su

kontrolinių pelių grupe, MT koncentracijos padidėjimas – tai yra MT koncentracija padidėjo praktiškai

tiek pat, kiek ir pelių, paveiktų vien tik Cd2+

, kepenyse. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20 minučių iki

NiCl2 tirpalo sušvirkštimo lėmė 41 proc. (p<0,05), lyginant su kontrolinių pelių grupe, MT

koncentracijos padidėjimą, tačiau jis nėra statistiškai reikšmingas, lyginant su Ni2+

paveiktų pelių

grupe.

6 pav. Metalotioneinų koncentracija pelių kepenyse 24 valandos po CdCl2; NiCl2 ir/arba ZnSO4,

tirpalų sušvirkštimo

Metalotioneinų koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (40 nmol/g kepenų) prilyginta 100 proc., n=6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

31

Eksperimentų rezultatai (7 pav.) parodė, kad 24 val. po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo, MT

koncentracija pelių smegenyse padidėjo 19 proc. (p<0,05), o po NiCl2 tirpalo sušvirkštimo – 9 proc.

(p<0,05) lyginant su kontrolinių pelių grupe. Pelių, kurioms buvo sušvirkšta ZnSO4 tirpalo, smegenyse

MT koncentracijos padidėjimas nenustatytas – ji buvo kontrolės lygyje. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas

20 minučių iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo nepadidino MT koncentracijos smegenyse – MT kiekis po

24 val. jose buvo kontrolės lygyje, o tai yra 18,5 proc. (p<0,05) mažesnė MT koncentracija nei

nustatyta pelių smegenyse, kurioms buvo sušvirkšta tik CdCl2 tirpalo. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20

minučių iki NiCl2 tirpalo sušvirkštimo taip pat nesukėlė MT koncentracijos smegenyse padidėjimo –

jose buvo stebimas netgi 22 proc. (p<0,05), lyginant su kontrolinių pelių grupe, MT koncentracijos

sumažėjimas.

7 pav. Metalotioneinų koncentracija pelių smegenyse 24 valandos po CdCl2; NiCl2 ir/arba ZnSO4,

tirpalų sušvirkštimo

Metalotioneinų koncentracija kontrolinių pelių smegenyse (32 nmol/g smegenų) prilyginta 100 proc., n=6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

4.1.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis

metalotioneinų sintezei pelių kepenyse ir smegenyse

Tolesniuose tyrimuose įvertinome MT koncentraciją pelių kepenyse ir smegenyse po 14 dienų

CdCl2 (14 μmol/kg); NiCl2 (19 μmol/kg); ZnSO4 (24 μmol/kg); CdCl2 (14 μmol/kg) ir ZnSO4 (24

μmol/kg) bei NiCl2 (19 μmol/kg) ir ZnSO4 (24 μmol/kg) tirpalų sušvirkštimo.

Gauti rezultatai (8 pav.) parodė, kad praėjus 14 dienų po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo MT

koncentracija pelių kepenyse padidėjo 392 proc. (p<0,05) lyginant su kontrolinių pelių grupe. Ni2+

kaip ir Cd2+

kepenyse sukėlė MT koncentracijos padidėjimą – ji padidėjo 57 proc. (p<0,05), lyginant

su kontroline grupe. Zn2+

taip pat sukėlė MT koncentracijos kepenyse padidėjimą, kuris siekė 32 proc.

(p<0,05), lyginant su kontrolinių pelių grupe, tačiau buvo mažesnis nei MT koncentracijos padidėjimas

sukeltas Cd2+

ar Ni2+

. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20 minučių iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo lėmė 400

32

proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MT koncentracijos pelių kepenyse padidėjimą, tačiau jis nėra

statistiškai reikšmingas, lyginant su Cd2+

paveiktų pelių grupe. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20

minučių iki NiCl2 tirpalo sušvirkštimo lėmė 8 proc. (p<0,05), lyginant su kontrolinių pelių grupe, MT

koncentracijos pelių kepenyse padidėjimą, tačiau jis taip pat nėra statistiškai reikšmingas, lyginant su

Ni2+

paveiktų pelių grupe.

8 pav. Metalotioneinų koncentracija pelių kepenyse 14 dienų po CdCl2; NiCl2 ir/arba ZnSO4, tirpalų

sušvirkštimo

Metalotioneinų koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (38 nmol/g kepenų) prilyginta 100 proc., n= 6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

Eksperimentuose taip pat vertinome ir kartotinį 14 dienų Cd2+

, Ni2+

, Zn2+

poveikį MT

koncentracijai laboratorinių pelių smegenyse (9 pav.). Gauti rezultatai parodė, kad, praėjus 14 dienų po

CdCl2 tirpalo sušvirkštimo, smegenyse buvo stebimas MT koncentracijos sumažėjimas, kuris siekė 10

proc. (p<0,05) lyginant su kontrolinių pelių grupe. Ni2+

taip pat sukėlė MT koncentracijos sumažėjimą,

tačiau jis buvo statistiškai nereikšmingas. ZnSO4 tirpalo švirkštimas 14 dienų smegenyse sukėlė 118

proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MT koncentracijos padidėjimą. ZnSO4 tirpalo švirkštimas 20

minučių iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo lėmė 55 proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MT

koncentracijos pelių smegenyse padidėjimą. Šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas lyginant ir su

Cd2+

paveiktų pelių grupe. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20 min. iki NiCl2 tirpalo sušvirkštimo taip pat

paskatino MT sintezę smegenyse – buvo nustatytas 79 proc. (p<0,05) lyginant su kontrole MT

koncentracijos padidėjimas, kuris taip pat yra yra statistiškai reikšmingas lyginant su Ni2+

paveiktų

pelių grupe.

33

9 pav. Metalotioneinų koncentracija pelių smegenyse 14 dienų po CdCl2; NiCl2 ir/arba ZnSO4

tirpalų sušvirkštimo

Metalotioneinų koncentracija kontrolinių pelių smegenyse (36 nmol/g smegenų) prilyginta 100 proc., n=6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

•- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su Cd2+

paveiktų pelių grupe

# - statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su Ni2+

paveiktų pelių grupe

Savo darbe nustatėme, kad Cd2+

, praėjus 24 val. po vienkartinio šio metalo tirpalo

sušvirkštimo, sukėlė MT koncentracijos pelių kepenyse padidėjimą, o praėjus 14 dienų po kartotinių

šio metalo tirpalo injekcijų MT koncentracija šiame organe buvo dar labiau padidėjusi. Literatūroje yra

duomenų, apie Cd2+

sukeliamą MT genų raiškos žiurkių kepenyse padidėjimą (Banni ir kt., 2010).

Banni ir bendraautorių (2010) atliktas tyrimas parodė, kad ilgalaikis (35 dienų) Cd2+

poveikis MT

koncentraciją žiurkių kepenyse padidino 238 proc. Šis rezultatas yra mažesnis nei mūsų nustatytas MT

kiekis kepenyse, tačiau koreliuoja su mūsų gautais duomenimis – 392 proc. MT koncentracijos

padidėjimu po ilgalaikio – 14 dienų Cd2+

poveikio. Kitų tyrėjų atliktų tyrimų rezultatai taip pat parodė,

kad ilgalaikė lėtinė Cd2+

intoksikacija skatina MT sintezę kepenyse, inkstuose, žarnyne, smegenyse

taip slopinant kadmio sukeliamus kepenų ir kitų organų pažeidimus (Borges ir kt., 2008; Sabolic ir kt.,

2010; Kim ir kt., 2009). Zhang ir bendraautorių (2012) atliktas ilgalaikio (3 savaičių) 1 mg/kg Cd2+

poveikio žiurkių kepenims ir inkstams tyrimas taip pat parodė, kad kadmis padidino MT koduojančių

genų raišką ir šių baltymų sintezę šiuose organuose.

Atlikto darbo rezultatai parodė, kad Cd2+

paskatino MT sintezę ir pelių smegenyse – praėjus

24 val. po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo buvo nustatytas 19 proc., lyginant su kontrole, MT

koncentracijos padidėjimas. Vis dėlto, praėjus 14 dienų po kartotinio Cd2+

poveikio, MT

koncentracijos padidėjimo smegenyse nenustatyta. Literatūroje yra duomenų apie kadmio gebėjimą

indukuoti MT sintezę smegenyse, o tai yra labai svarbus procesas, slopinant šio metalo sukeliamą

neurotoksiškumą. Taip pat yra nustatyta, kad Cd2+

sukeliamos MT sintezės intensyvumas įvairiose

smegenų dalyse skiriasi (Mendez-Armenta ir kt., 2003). Mendez-Armenta ir bendraautoriai (2003)

parodė, kad 1 mg/kg kadmio dozė padidino MT koncentraciją pelių smegenyse praėjus 5 ir 15 dienų

po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo. Taip pat buvo nustatyta, kad labiausiai MT sintezė buvo indukuojama

34

striatum stityje. Vis dėlto savo darbe, praėjus 14 dienų po CdCl2 tirpalo švirkštimo, smegenyse

statistiškai reikšmingo MT koncentracijos padidėjimo nenustatėme – ji buvo kontrolės lygyje. Tai gali

būti susiję su tuo, jog Cd2+

kaupimasis smegenyse priklauso nuo gyvūno amžiaus. Buvo nustatyta, kad

kuo jaunesnis gyvūnas, tuo Cd2+

smegenyse susikaupia daugiau (Choudhuri ir kt., 1996). Tą lemia

nepilnai susiformavęs jų hematoencefalinis barjeras (Mendez-Armenta ir kt., 2007). Mūsų atlikto

tyrimo metu buvo naudotos 4-6 savaičių amžiaus pelės, o Mendez-Armenta ir bendraautorių tyrimo

metu – 13 dienų amžiaus žiurkės, todėl jų smegenyse galėjo susikaupti daugiau Cd2+

, indukuojančių

MT sintezę.

Tyrimų metu nustatėme, kad, veikiant Cd2+

, tiek po 24 val., tiek po 14 dienų MT

koncentracija pelių smegenyse buvo mažesnė nei kepenyse. Tai gali būti paaiškinama tuo, jog Cd2+

kaupimasis kepenyse ar inkstuose yra žymiai didesnis nei kituose audiniuose, pavyzdžiui, smegenyse,

ir tuo, jog skirtinguose audiniuose randamos skirtingos MT izoformos (Klaassen ir kt., 2009).

Literatūroje yra duomenų apie nikelio gebėjimą didinti MT sintezę audiniuose ir apie

apsauginį MT poveikį, esant nikelio sukeltiems oksidaciniams pažeidimams (Nemec ir kt., 2009).

Nustatyta, kad labiausiai MT sintezę Ni2+

indukuoja hepatocituose ir kvėpavimo takų epitelio ląstelėse.

Taip pat yra duomenų, kad šių apsauginių baltymų sintezę indukuoja didelės nikelio dozės. Vis dėlto

šio metalo gebėjimas indukuoti MT sintezę yra daug mažesnis nei kadmio ar cinko (Waalkes ir kt.,

2009), o tai ir atsispindi mūsų gautuose rezultatuose. Nemec ir bendraautorių (2009) in vitro atlikto

tyrimo metu nustatyta, kad Ni2+

MT genų raišką, o kartu ir šių baltymų sintezę kvėpavimo takų epitelio

ląstelėse labiausiai padidino praėjus 4 val. po Ni2+

patekimo į ląsteles. MT sintezė buvo indukuojama

ir vėlesniais laiko momentais – praėjus 8, 24, 48 val., tačiau MT koduojančių genų raiška šiomis

tirtomis valandomis nuosekliai mažėjo. Iš to galima spręsti apie greitą, nuo laiko priklausomą Ni2+

sukeltą MT sintezės indukciją.

Savo darbe nustatėme, kad praėjus 24 val. po NiCl2 tirpalo sušvirkštimo MT koncentracija

pelių kepenyse padidėjo 35 proc. Praėjus 14 dienų po kartotinio NiCl2 tirpalo švirkštimo, MT

koncentracija kepenyse padidėjo 57 proc., o tai yra kur kas mažiau nei Cd2+

sukeltas MT

koncentracijos padidėjimas (392 proc.). Tokie rezultatai gali būti susiję su mažesniu nikelio gebėjimu

indukuoti MT sintezę (Kobayashi ir kt., 2007).

Laboratorinių pelių smegenyse tiek, praėjus 24 val. po vienkartinio NiCl2 tirpalo

sušvirkštimo, tiek, praėjus 14 dienų po kartotinio NiCl2 tirpalo švirkštimo, statistiškai reikšmingo,

lyginant su kontrolinių pelių grupe, MT koncentracijos padidėjimo nenustatyta.

ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas neturėjo didelės įtakos MT koncentracijai pelių kepenyse pirmą

parą po Zn2+

poveikio. Literatūroje yra duomenų, kad kartotinis Zn2+

sušvirkštimas didina MT

koncentraciją (El-Maraghy ir kt., 2001; Park ir kt., 2001). Mūsų atlikto tyrimo metu po 14 dienų Zn2+

35

poveikio pelių kepenyse buvo nustatytas statistiškai reikšmingas, lyginant su kontrolinių pelių grupe,

32 proc. MT koncentracijos padidėjimas.

Literatūroje taip pat yra informacijos, kad Zn2+

ir Cd2+

veikdami kartu labiau indukuoja MT

sintezę nei atskirai tik Zn2+

ar Cd2+

(Ding-fu ir kt., 2009). Šis dėsningumas buvo stebimas ir mūsų

darbe – praėjus 14 dienų po kartotinio CdCl2 ir ZnSO4 tirpalų švirkštimo kepenyse nustatėme 400

proc., lyginant su kontrole, MT koncentracijos padidėjimą. Vis dėlto šis skirtumas nebuvo statistiškai

reikšmingas lyginant su Cd2+

sukeltu MT koncentracijos padidėjimu (392 proc.). Šis rezultatas gali

būti susijęs su tuo, kad MT genų raišką reguliuoja ne tik metalų jonai, ji priklauso ir nuo kitų

viduląstelinių veiksnių, tad negali būti indukuojama neribotai. Todėl Zn2+

poveikis šiam nustatytam

Zn2+

ir Cd2+

sukeltam MT koncentracijos padidėjimui (400 proc.) gali būti didesnis nei atrodo lyginant

jį su Cd2+

sukeltu MT koncentracijos padidėjimu.

Zn2+

ir Ni2+

veikdami kartu taip pat labiau padidino MT koncentraciją kepenyse nei atskirai

Zn2+

ar Ni2+

. Tačiau šis poveikis buvo stebimas tik praėjus 24 val. po kompleksinio šių jonų poveikio,

o MT koncentracijos padidėjimas, kuris siekė 41 proc. nebuvo statistiškai reikšmingas lyginant su Ni2+

paveikta pelių grupe. Kompleksinis Zn2+

ir Ni2+

poveikis didinant MT koncentraciją po 14 dienų

trukusio šių jonų poveikio kepenyse nebuvo nustatytas – MT koncentracija buvo kontrolės lygyje.

Pirmą parą Zn2+

neturėjo didelės įtakos MT koncentracijos padidėjimui ir pelių smegenyse,

tačiau, praėjus 14 dienų, statistiškai reikšmingas MT koncentracijos padidėjimas buvo nustatytas 3

eksperimentinėse grupėse. 118 proc. MT koncentracija padidėjo tų pelių smegenyse, kurioms buvo

sušvirkšta ZnSO4 tirpalo. Pelių, kurioms buvo sušvirkšta ZnSO4 tirpalo, o po 20 minučių CdCl2 tirpalo,

smegenyse nustatėme 55 proc. MT koncentracijos padidėjimą. 79 proc. MT koncentracija padidėjo ir

tų pelių smegenyse, kurioms buvo sušvirkšta ZnSO4 tirpalo, o po 20 minučių NiCl2 tirpalo. Tai taip pat

statistiškai reikšmingas skirtumas, rodantis Zn2+

apsauginį poveikį smegenyse, esant ilgalaikiam šio

mikroelemento poveikiui.

Gali būti, kad smegenyse Zn2+

aktyvinama MT sintezė vyksta lėčiau nei kituose organuose,

pavyzdžiui, kepenyse, nes praėjus 24 val. nei vienoje iš 3 eksperimentinių grupių, kurioms buvo

švirkšta ZnSO4 tirpalo (1. – ZnSO4; 2 – ZnSO4 + CdCl2; 3 – ZnSO4 + NiCl2), MT koncentracija

nebuvo padidėjusi – ji buvo kontrolės lygyje arba žemiau nei kontrolės lygis.

36

4.2. Ūmus kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių

kepenyse ir smegenyse

4.2.1. Vienkartinis kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai

pelių kepenyse ir smegenyse

Atliktuose eksperimentuose įvertinome vienkartinį ūmų Cd2+

, Ni2+

ir Zn2+

poveikį MDA

koncentracijai labortorinių pelių kepenyse (10 pav.) ir smegenyse (11 pav.). Šiuo tikslu pelėms į pilvo

ertmę buvo švirkščiami atitinkami sunkiųjų metalų druskų tirpalai – CdCl2 (14 μmol/kg), NiCl2 (19

μmol/kg), ZnSO4 (24 μmol/kg), CdCl2 (14 μmol/kg) ir ZnSO4 (24 μmol/kg), NiCl2 (19 μmol/kg) ir

ZnSO4 (24 μmol/kg). Po atitinkamo laiko buvo nustatoma MDA koncentracija pelių organuose.

Gauti rezultatai (10 pav.) parodė, kad, praėjus 24 val. po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo, MDA

koncentracija kepenyse, lyginant su kontrole, padidėjo 118 proc. (p<0,05). Ni2+

, praėjus 24 val. po

NiCl2 tirpalo sušvirkštimo, lėmė 282 proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MDA koncentracijos

padidėjimą. Zn2+

24 val. po ZnSO4 tirpalo sušvirkštimo sukėlė 226 proc. (p<0,05), lyginant su

kontrole, MDA koncentracijos pelių kepenyse padidėjimą. Vis dėlto ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20

min. iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo po 24 val. lėmė 19 proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MDA

koncentracijos sumažėjimą, kuris taip pat yra statistiškai reikšmingas lyginant su Cd2+

paveiktų pelių

grupe. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20 min. iki NiCl2 tirpalo sušvirkštimo po 24 val. MDA

koncentracijos sumažėjimo kepenyse nesukėlė – ji netgi buvo 536 proc. (p<0,05), lyginant su kontrole,

padidėjusi (10 pav.).

10 pav. Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse 24 valandos po CdCl2; NiCl2 ir/arba ZnSO4

tirpalų sušvirkštimo

MDA koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (76 nmol/g kepenų) prilyginta 100 proc., n=6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

•- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su Cd2+

paveiktų pelių grupe

37

Tolimesniuose eksperimentuose vertinome vienkartinį Cd2+

, Ni2+

ir Zn2+

poveikį lipidų

peroksidacijai pelių smegenyse (11 pav.). Gauti rezultatai parodė, kad šiame organe, intraperitonealiai

sušvirkštus CdCl2 tirpalo, MDA koncentracija po 24 val. padidėjo 58 proc., o sušvirkštus NiCl2 tirpalo

– 53 proc. (p<0,05) lyginant su kontrole. Praėjus 24 val. po ZnSO4 tirpalo sušvirkštimo, pelių

smegenyse buvo nustatytas 33 proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MDA koncentracijos padidėjimas.

ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20 minučių iki CdCl2 ar NiCl2 tirpalų sušvirkštimo, praėjus 24 val.,

smegenyse nesumažino MDA koncentracijos, kuri šiame organe buvo atitinkamai 68 proc. (p<0,05) ir

90 proc. (p<0,05) didesnė nei kontrolės lygis.

11 pav. Malondialdehido koncentracija pelių smegenyse 24 valandos po CdCl2, NiCl2 ir/arba ZnSO4

tirpalų sušvirkštimo

MDA koncentracija kontrolinių pelių smegenyse (80 nmol/g smegenų) prilyginta 100 proc., n=6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

4.2.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų

peroksidacijai pelių kepenyse ir smegenyse

Šiame darbe vertinome ir ūmų kartotinį 14 dienų Cd2+

, Ni2+

, Zn2+

poveikį lipidų

peroksidacijai laboratorinių pelių kepenyse (12 pav.) ir smegenyse (13 pav.). MDA koncentracijos

nustatymui pelėms į pilvo ertmę 14 dienų švirkštėme CdCl2 (14 μmol/kg), NiCl2 (19 μmol/kg), ZnSO4

(24 μmol/kg), CdCl2 (14 μmol/kg) ir ZnSO4 (24 μmol/kg) bei NiCl2 (19 μmol/kg) ir ZnSO4 (24

μmol/kg) tirpalus, o po 14 dienų nustatėme MDA koncentraciją.

Gauti rezultatai (12 pav.) parodė, kad, praėjus 14 dienų po kartotinio kadmio, nikelio ir cinko

tirpalų švirkštimo, kepenyse stebima MDA koncentracijos mažėjimo tendencija 3 iš 5 eksperimentinių

grupių. MDA koncentracija 12 proc. (p<0,05) sumažėjo tų pelių kepenyse, kurioms 14 dienų buvo

švirkščiamas CdCl2 tirpalas. ZnSO4 tirpalo švirkštimas 14 dienų taip pat lėmė MDA koncentracijos

kepenyse sumažėjimą, kuris, lyginant su kontrolės lygiu, siekė 21 proc. (p<0,05). Pelių, kurioms buvo

38

švirkščiama ZnSO4 tirpalas ir po 20 minučių CdCl2, kepenyse po 14 dienų buvo nustatytas 27 proc.

(p<0,05) MDA koncentracijos, sumažėjimas, kuris yra statistiškai reikšmingas, lyginant tiek su

kontroline, tiek su Cd2+

paveiktų pelių grupe. Pelių, kurioms buvo švirkščiamas NiCl2 tirpalas,

kepenyse po 14 dienų buvo stebimas 28 proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MDA koncentracijos

padidėjimas, tačiau jis statistiškai reikšmingas nebuvo. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20 minučių iki

NiCl2 tirpalo sušvirkštimo kepenyse nesumažino MDA koncentracijos, kuri buvo didesnė už kontrolės

lygį 37 proc. (p<0,05).

12 pav. Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse 14 dienų po CdCl2, NiCl2 ir/arba ZnSO4

tirpalų sušvirkštimo

MDA koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (91 nmol/g kepenų) prilyginta 100proc., n=6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

•- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su Cd2+

paveiktų pelių grupe

Eksperimentuose taip pat vertinome Cd2+

, Ni2+

, Zn2+

poveikį lipidų peroksidacijai

laboratorinių pelių smegenyse. Jose, skirtingai nei kepenyse, MDA koncentracijos sumažėjimas buvo

stebimas 2 iš 5 eksperimentinių grupių. Gauti rezultatai (13 pav.) parodė, kad praėjus 14 dienų po

NiCl2 tirpalo švirkštimo, smegenyse MDA koncentracija sumažėjo 19 proc. (p<0,05) lyginant su

kontrole. MDA koncentracija 26 proc. (p<0,05) sumažėjo ir pelių, kurioms 14 dienų buvo švirkšiami

CdCl2 ir ZnSO4 tirplai, smegenyse. Šis koncentracijos sumažėjimas yra statistiškai reikšmingas

lyginant tiek su kontroline, tiek su Cd2+

paveiktų pelių grupe. Po CdCl2 tirpalo švirkštimo praėjus 14

dienų, pelių smegenyse MDA koncentracija padidėjo 16 proc. (p<0,05) lyginant su kontrole. Kartotinis

14 dienų ZnSO4 tirpalo švirkštimas taip pat lėmė 73 proc. (p<0,05), lyginant su kontrole, MDA

koncentracijos padidėjimą. ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas 20 minučių iki NiCl2 tirpalo sušvirkštimo taip

pat neapsaugojo lipidų nuo peroksidacijos – MDA koncentracija pelių smegenyse buvo didesnė už

kontrolės lygį 38 proc. (p<0,05).

39

13 pav. Malondialdehido koncentracija pelių smegenyse 14 dienų po CdCl2, NiCl2 ir/arba ZnSO4

tirpalų sušvirkštimo

MDA koncentracija kontrolinių pelių smegenyse (100 nmol/g smegenų) prilyginta 100 proc., n=6-8

*- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrolinių pelių grupe

•- statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su Cd2+

paveiktų pelių grupe

Savo eksperimentuose nustatėme, kad kadmis suaktyvino lipidų peroksidacijos procesą

kepenyse esant trumpalaikiam poveikiui – 24 val. po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo MDA koncentracija

pelių kepenyse padidėjo 118 proc. o smegenyse – 58 proc. Literatūroje yra duomenų, kad po

vienkartinės 0,5 ar 2 mg/kg CdCl2 dozės Cd2+

kaupiasi tam tikruose žiurkių audiniuose (kepenyse,

inkstuose, sėklidėse ir kraujyje) 24 val. po Cd2+

poveikio, o tai lemia MDA koncentracijos padidėjimą

(Casalino ir kt., 2002; El-Maraghy ir kt., 2001). Šio straipsnio autoriai nustatė, kad minėtos Cd2+

koncentracijos sukelia MDA koncentracijos padidėjimą kepenyse atitinkamai 248 proc. ir 321 proc.

Kiti tyrėjai parodė, kad vienkartinės 3 mg/kg kadmio dozės, praėjus 24 val., MDA koncentraciją

žiurkių kepenyse padidino 220 proc. (Matovic ir kt., 2012). Mūsų gauti rezultatai koreliuoja su

pastarojo tyrimo rezultatais – dvigubai mažesnė sušvirkšta kadmio dozė (1,6 mg/kg) sukėlė atitinkmai

dvigubai mažesnį MDA koncentracijos padidėjimą. Tandon ir bendraautorių (2003) atlikto tyrimo

metu nustatyta, kad po 5 dienų trukmės 1,5 mg/kg kadmio dozės MDA koncentracija žiurkių kepenyse

padidėjo 392 proc., o smegenyse – 223 proc. Kiti tyrėjai taip pat parodė, kad vienkartinės CdCl2 dozės

skatina lipidų peroksidaciją žiurkių eritrocitų membranose, šis procesas taip pat nustatytas kepenyse,

inkstuose, smegenyse ir sėklidėse – organuose, kuriuose MDA yra naudojamas kaip oksidacinio

pažeidimo žymuo (Kara ir kt., 2005).

Amara ir bendraautoriai (2011) parodė, kad ilgalaikis (30 dienų) Cd2+

poveikis sukelia MDA

koncentracijos žiurkių smegenyse padidėjimą (Amara ir kt., 2011). Savo darbe mes taip pat nustatėme

16 proc. MDA koncentracijos pelių smegenyse padidėjimą po kartotinio 14 dienų šio sunkiojo metalo

poveikio. Literatūroje taip pat yra duomenų apie Cd2+

sukeliamą MDA koncentracijos žiurkių

kepenyse, inkstuose ir kituose organuose padidėjimą, kuris skiriasi netgi priklausomai nuo graužikų

lyties. Nustatyta, kad pavyzdžiui, 1 mg/kg CdCl2 dozė praėjus 24 val. po CdCl2 tirpalo sušvirkštimo

40

MDA koncentraciją žiurkių patinų kepenyse padidino vidutiniškai 362 proc., o patelių – 300 proc.

(Kara ir kt., 2005). Šis aspektas taip pat yra svarbus vertinant kadmio sukeliamą lipidų peroksidaciją.

Literatūroje yra duomenų, kad Cd2+

didina lipidų peroksidaciją žiurkių kepenyse, tačiau jei

metalo poveikis tęsiasi ilgesnį laiką (2 savaites), MDA kiekis mažėja ir tai gali būti susiję su ląstelės

prisitaikymu prie Cd2+

poveikio (El-Maraghy ir kt., 2001). Ši MDA koncentracijos mažėjimo

tendencija buvo nustatyta ir šiame darbe. Ląstelių prisitaikymu galima laikyti MT koncentracijos

padidėjimą, kurį sukelia Cd2+

ir kuris taip pat buvo nustatytas šio darbo metu. Kitų antioksidacinės

sistemos komponentų veikla taip pat gali būti svarbi mažinant kadmio toksiškumą. El-Maraghy ir

bendraautoriai (2001) parodė, kad dvi savaites žiurkes veikiant Cd2+

, MDA koncentracija jų kepenyse

buvo sumažėjusi 30 proc., lyginant su kontoline grupe. Vis dėlto savo darbe, vertinant MDA

koncentraciją po 14 dienų trukmės Cd2+

poveikio, tokio žymaus šio aldehido koncentracijos

sumažėjimo nei pelių kepenyse (12 pav.), nei smegenyse (13 pav.) mes nenustatėme. Kepenyse MDA

koncentracija buvo sumažėjusi iki 88 proc., o smegenyse ji buvo 16 proc. padidėjusi. Gali būti, kad

kadmio gebėjimas ląstelėse sukelti oksidacinį stresą sumažėja todėl, kad jo patekimas padidina MT

koduojančių genų raišką ir didžiąją dalį Cd2+

sujungia būtent šie baltymai. Kadangi smegenyse,

skirtingai nei kepenyse, Cd2+

nesukėlė tokio didelio MT koncentracijos padidėjimo, dalis Cd2+

buvo

laisvi ir galėjo lemti laisvųjų radikalų, sukeliančių lipidų peroksidaciją, susidarymą, dėl ko smegenyse

MDA koncentracija ir buvo statistiškai reikšmingai padidėjusi.

Literatūroje yra duomenų apie nikelio gebėjimą įvairiuose audiniuose sukelti lipidų

peroksidaciją ir padidinti MDA koncentraciją. Nustatyta, kad žiurkėms, parenteraliai skyrus NiCl2

tirpalo, intensyviausiai lipidų peroksidaciją ir MDA koncentracijos padidėjimą Ni2+

sąlygoja kepenyse,

inkstuose ir plaučiuose (Das ir kt., 2008). Tyrimo metu nustatėme, kad nikelis, taip pat kaip ir kadmis,

lipidų peroksidaciją labiau suaktyvino esant trumpalaikiam jo poveikiui. Praėjus 24 val. po NiCl2

tirpalo sušvirkštimo, MDA koncentracija laboratorinių pelių kepenyse buvo padidėjusi 282 proc., o

smegenyse – 53 proc. Tuo tarpu nustačius MDA koncentraciją pelių organuose po 14 dienų, ji buvo

padidėjusi tik kepenyse 28 proc. Rui ir bendraautorių (2011) atliktas tyrimas parodė ilgalaikio (30

dienų) Ni2+

poveikio sukeltą lipidų peroksidacijos žiurkių kepenyse padidėjimą. Mahmoud ir

bendraautoriai (2012) taip pat parodė ilgalaikės (21 dienos) Ni2+

ekspozicijos sukeltą 30 proc. MDA

koncentracijos padidėjimą žiurkių kepenyse. Šis rezultatas atitiko mūsų gautus rezultatus (28 proc.).

Taigi, šie duomenys leidžia teigti, kad Ni2+

kepenyse sukelia lipidų peroksidaciją esant tiek

trumpalaikiam, tiek ilgalaikiam jo poveikiui, o smegenyse nustatytas MDA koncentracijos padidėjimas

tik po 24 val. trukmės šio metalo poveikio rodo trumpalaikį Ni2+

sukeliamą lipidų peroksidacijos

aktyvinimą. Gali būti, kad šie rezultatai susiję su tuo, jog, esant ilgalaikiam Ni2+

poveikiui, smegenyse

intensyviai įsijungia kiti detoksikacijos mechanizmai, pvz., GSH, kurių savo darbe mes nevertinome.

41

Mes nustatėme, kad antioksidaciniu poveikiu pasižymintis cinkas sumažino Cd2+

sukeltą

lipidų peroksidaciją pelių kepenyse 24 val. ir 14 dienų po ZnSO4 ir CdCl2 tirpalų sušvirkštimo, nors

smegenyse šis poveikis, buvo stebimas tik praėjus 14 dienų po kompleksinio Cd2+

ir Zn2+

poveikio. Tai

galima paaiškinti tuo, kad Zn2+

ir Cd2+

kepenyse praėjus 24 val. ir 14 dienų po ZnSO4 ir CdCl2 tirpalų

sušvirkštimo sukėlė statistiškai reikšmingą MT koncentracijos padidėjimą. Cd2+

buvo sujungti į

kompleksus, buvo slopinamas aktyvių deguonies formų susidarymas ir lipidų peroksidacija. Tokiu

būdu pasireiškė cinko apsauginis poveikis lipidams. Tuo tarpu smegenyse ZnSO4 tirpalo sušvirkštimas

20 min. iki CdCl2 tirpalo sušvirkštimo praėjus 24 val. nesukėlė MT koncentracijos padidėjimo, todėl

būdami laisvi Cd2+

galėjo sukelti oksidacinius lipidų pažeidimus ir todėl smegenyse buvo nustatytas

MDA kiekio padidėjimas. Vis dėlto cinkas sumažino Cd2+

sukeltą lipidų peroksidaciją ir MDA

koncentraciją pelių smegenyse prėjus 14 dienų po ZnSO4 ir CdCl2 tirpalų sušvirkštimo, taip

pasireiškiant antioksidaciniam jo veikimui.

Cinko antioksidacinis poveikis slopinant Ni2+

sukeltą lipidų peroksidaciją nebuvo stebimas

nei smegenyse nei kepenyse nei po 24 val., nei po 14 dienų trukmės Zn2+

poveikio. Gali būti, kad Zn2+

,

esant toksiniam Ni2+

poveikiui, nepakankamai paskatina MT sintezę, nes net 3 iš 4 eksperimentinių

grupių, paveiktų Zn2+

ir Ni2+

, MT koncentracijos padidėjimas buvo mažesnis nei sukeltas atskirai tik

Zn2+

ar Ni2+

. Tad dėl nepakankamos MT sintezės dalis Ni2+

nebuvo sujungti, o būdami laisvi jie ne tik

paskatino laisvųjų radikalų, pažeidžiančių lipidus, susidarymą, bet taip pat lėmė antioksidacinių

fermentų – SOD, KAT, Gred, Gpx inhibavimą, dėl ko susidarę laisvieji radikalai nebuvo

nenukenksminti, o lipidų peroksidacija dar labiau suintensyvėjo.

42

5. IŠVADOS

1. Metalotioneinų koncentracija kepenyse padidėjo praėjus 24 val. po kadmio ir nikelio jonų poveikio,

o smegenyse – tik po kadmio jonų poveikio.

2. Ir kadmio, ir nikelio jonai po 24 val. lipidų peroksidaciją ir MDA koncentracijos padidėjimą sukėlė

tiek kepenyse, tiek smegenyse.

3. Kartotinės (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų dozės metalotioneinų koncentracijos padidėjimą sukėlė

tik kepenyse.

4. Kartotinės (14 dienų) kadmio jonų dozės lipidų peroksidaciją ir MDA koncentracijos padidėjimą

sukėlė tik smegenyse, o kartotinės (14 dienų) nikelio jonų dozės – tik kepenyse.

5. Cinko jonai paskatino antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių metalotioneinų sintezę kepenyse ir

smegenyse esant toksiniam kadmio ir nikelio jonų poveikiui, apsaugojo lipidus nuo peroksidacijos

esant toksiniam kadmio jonų poveikiui, tačiau neapsaugojo lipidų nuo peroksidacijos esant

toksiniam nikelio jonų poveikiui.

43

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Amara S, Douki T, Garrel C, et al. Effects of static magnetic field and cadmium on oxidative stress

and DNA damage in rat cortex brain and hippocampus. Iš Toxicology and Industrial Health

[interaktyvus]. 2011, kovas [žiūrėta 2012-03-14]. Prieiga per internetą: <http://tih.sagepub.com>.

2. Angelova M, Asenova S, Nedkova V, et al. Copper in the human organism. Iš Trakia Journal of

Sciences [interaktyvus]. 2011 [žiūrėta 2011-10-07]. Prieiga per internetą: <http://tru.uni-

sz.bg/tsj/>.

3. Apel K, Hirt H. Reactive oxygen species: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction.

Iš Plant Biology [interaktyvus]. 2004, birželis [žiūrėta 2011-11-21]. Prieiga per internetą:

<http://www.annualreviews.org>.

4. Ашмарин ИП, Воробьев АА. Ϲтатические методы в микробиологиеских иследования.

Государственное издательство медицинской литературы. Ленинград; 1962.

5. Banni M, Messaoudi I, Said L, et al. Metallothionein gene expression in liver of rats exposed to

cadmium and supplemented with zinc and selenium. Iš Archives of Environmental Contamination

and Toxicology [interaktyvus]. 2010, spalis [žiūrėta 2012-02-17]. Prieiga per internetą:

<http://www.springerlink.com>.

6. Bernard A. Cadmium and it‘s adverse effects on human health. Iš Indian Journal of Medical

Research [interaktyvus]. 2008, spalis [žiūrėta 2011-10-07]. Prieiga per internetą:

<http://www.ijmr.org.in>.

7. Bobillier-Chaumont S, Maupoil V, Berthelot A. Metallothionein induction in the liver, kidney,

heart and aorta of cadmium and isoproterenol treated rats. Iš Journal of Applied Toxicology

[interaktyvus]. 2006, sausis/vasaris [žiūrėta 2011-10-07]. Prieiga per internetą:

<http://onlinelibrary.wiley.com>.

8. Bonjour JP, Gueguen L, Palacios C, et al. Minerals and vitamins in bone health: the potential value

of dietary enhancement. Iš British Journal of Nutrition [interaktyvus]. 2009, balandis [žiūrėta

2011-10-07]. Prieiga per internetą: <http://journals.cambridge.org>.

9. Borges LP, Brandao R, Godoi B, et al. Oral administration of diphenyl diselenide protects against

cadmium-induced liver damage in rats. Iš Chemico-Biological Interactions [interaktyvus]. 2008,

sausis [žiūrėta 2012-02-17]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

10. Cai L, Klein JB, Kang YJ. Metallothionein Inhibits Peroxynitrite – induced DNA and Lipoprotein

Damage. Iš The Journal of Biological Chemistry [interaktyvus]. 2000, gruodis [žiūrėta 2011-12-

09]. Prieiga per internetą: <http://www.jbc.org>.

11. Cameron KS, Buchner V, Tchounwou PB. Exploring the Molecular Mechanisms of Nickel-

Induced Genotoxicity and Carcinogenicity: A Literature Review. 2011, rugsėjis [interaktyvus]. Iš

44

National Center for Biotechnology Information [žiūrėta 2011-10-04]. Prieiga per internetą:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.

12. Casalino E, Calzaretti G, Sblano C, et al. Molecular inhibitory mechanisms of antioxidant enzymes

in rat liver and kidney by cadmium. Iš Toxicology [interaktyvus]. 2002, rugsėjis [žiūrėta 2011-11-

11]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com/>.

13. Chen CY, Wang YF, Huang WR, et al. Nickel induces oxidative stress and genotoxicity in human

lymphocytes. Iš Toxicology and Applied Pharmacology [interaktyvus]. 2003, liepa [žiūrėta 2011-

11-17]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

14. Choudhuri S, Liu WL, Berman NE, et al. Cadmium accumulation and metallothionein expression

in brain of mice at different stages of development. Iš Toxicology letters [interaktyvus]. 1996,

kovas [žiūrėta 2012-03-22]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

15. Circu ML, Yee Aw T. Reactive oxygen species, cellular redox systems and apoptosis. Iš Free

Radical Biology and Medicine [interaktyvus]. 2011, kovas [žiūrėta 2011-09-18]. Prieiga per

internetą: <http://www.sciencedirect.com/>.

16. Costa M, Salnikow K, Sutherland JE, et al. The role of oxidative stress in nickel and chromate

genotoxicity. Iš Molecular and Cellular Biochemistry [interaktyvus]. 2002, gegužė [žiūrėta 2011-

09-18]. Prieiga per internetą: <http://www.springerlink.com>.

17. Cousins RJ, Blanchard RK, Motore JB, et al. Regulation of zinc metabolism and genomic

outcomes. Iš The Journal of Nutrition [interaktyvus]. 2003, gegužė [žiūrėta 2011-11-22]. Prieiga

per internetą: <http://jn.nutrition.org>.

18. Das KK, Das SN, Dhundasi SA. Nickel, its adverse health effects & oxidative stress. Iš Indian

Journal of Medical Research [interaktyvus]. 2008, spalis [žiūrėta 2012-02-24]. Prieiga per

internetą: <http://icmr.nic.in>.

19. Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic

molecule and biological marker of oxidative stress. Iš Nutrition, Metabolism and Cardiovascular

Diseases [interaktyvus]. 2005, rugpjūtis [žiūrėta 2012-02-04]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com>.

20. Demir TA, Isikli B, Ürer SM, et al. Nickel exposure and its effects. Iš BioMetals [interaktyvus].

2004, gruodis [žiūrėta 2011-11-27]. Prieiga per internetą: <http://www.springerlink.com/>.

21. Denkhaus E, Salnikow K. Nickel essentiality, toxicity and carcinogenicity. Iš Critical Reviews in

Oncology/Hematology [interaktyvus]. 2002, balandis [žiūrėta 2011-09-28]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com/>.

22. Ding-fu X, Bin Z, Zhong-yi L, et al. Effects of different stress factors on induction of

metallothionein synthesis in mouse liver. Iš Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica

[interaktyvus]. 2009, vasaris [žiūrėta 2012-01-24]. Prieiga per internetą: <http://en.cnki.com.cn>.

45

23. Doreswamy K, Shrilatha B, Rajeshkumar T, et al. Nickel-induced oxidative stress in testis of

mice: evidence of DNA damage and genotoxic effects. Iš Journal of Andrology [interaktyvus].

2004, lapkritis/gruodis [žiūrėta 2011-11-22]. Prieiga per internetą:

<http://www.andrologyjournal.org>.

24. El-Maraghy SA, Gad MZ, Fahim AT, et al. Effect of cadmium and aluminum intake on the

antioxidant status and lipid peroxidation in rat tissues. Iš Journal of Biochemical and Molecular

Toxicology [interaktyvus]. 2001, liepa [žiūrėta 2012-01-14]. Prieiga per internetą:

<http://onlinelibrary.wiley.com>.

25. Ercal N, Gurer-Orhan H, Aykit-Burns N. Toxic Metals and Oxidative Stress Part I: Mechanisms

Involved in Metal induced Oxidative Damage. Iš Current Topics in Medicinal Chemistry

[interaktyvus]. 2001, gruodis [žiūrėta 2011-11-10]. Prieiga per internetą: <http://web.mst.edu>.

26. Esposito BP, Breuer W, Sirankapracha P, et al. Labile plasma iron in iron overload: redox activity

and susceptibility to chelation. Iš blood [interaktyvus]. 2003, birželis [žiūrėta 2011-11-20]. Prieiga

per internetą: <http://bloodjournal.hematologylibrary.org>.

27. Feng W, Cai J, Pierce WM, et al. Metallothionein transfers zinc to mitochondrial aconitase

through a direct interaction in mouse hearts. Iš Biochemical and Biophysical Research Commun

ications [interaktyvus]. 2005, liepa [žiūrėta 2011-10-28]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com>.

28. Filipič M, Fatur T, Vudrag M. Molecular mechanisms of cadmium induced mutagenicity. Iš

Human and Experimental Toxicology [interaktyvus]. 2006, vasaris [žiūrėta 2011-10-20]. Prieiga

per internetą: <http://het.sagepub.com>.

29. Forti E, Salovaara S, Cetin Y, et al. In vitro evaluation of the toxicity induced by nickel soluble

and particulate forms in human airway epithelial cells. Iš Toxicology in Vitro [interaktyvus].

2011, kovas [žiūrėta 2011-10-18]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com/>.

30. Fraga CG. Relevance, essentiality and toxicity of trace elements in human health. Iš Molecular

Aspects of Medicine [interaktyvus]. 2003, rugpjūtis [žiūrėta 2011-10-07]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com/>.

31. Grotto D, Santa Maria L, Valentini J, et al. Importance of the lipid peroxidation biomarkers and

methodological aspects for malondialdehyde quantification. Iš Química Nova [interaktyvus]. 2009

[žiūrėta 2011-11-19]. Prieiga per internetą: <http://quimicanova.sbq.org.br>.

32. Hall AH, Shannon MW. Other Heavy Metals. In: Shannon MW, Borron SW, Burns M, editors.

Haddad and Winchester's Clinical Management of Poisoning and Drug Overdose, 4th ed.

Philadelphia: Saunders/Elsevier; 2007. p. 1164.

46

33. Haq F, Mahoney M, Koropatnick J. Signaling events for metallothionein induction. Iš Mutation

Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis [interaktyvus]. 2003, gruodis

[žiūrėta 2011-11-29]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

34. Hengstler JG, Bolm-Audorff U, Faldum A, et al. Occupational exposure to heavy metals: DNA

damage induction and DNA repair inhibition prove co-exposures to cadmium, cobalt and lead as

more dangerous than hitherto expected. Iš Carcinogenesis [interaktyvus]. 2003, rugsėjis [žiūrėta

2011-09-29]. Prieiga per internetą: <http://carcin.oxfordjournals.org>.

35. Hsiao CJ, Stapleton SR. Characterization of Cd-induced molecular events prior to cellular damage

in primary rat hepatocytes in culture: activation of stress activated signal protein JNK and

transcription factor AP-1. Iš Journal of Biochemical and Molecular Toxicology [interaktyvus].

2004, liepa [žiūrėta 2011-11-27]. Prieiga per internetą: <http://onlinelibrary.wiley.com>.

36. Jacob ST, Majumder S, Ghoshal K. Suppression of metallothionein-I/II expression and its

probable molecular mechanisms. Iš Environmental Health Perspectives [interaktyvus]. 2002,

spalis [žiūrėta 2011-11-05]. Prieiga per internetą: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>.

37. Jha R, Rizvi SI. Carbonyl formation in erythrocyte membrane proteins during agingin humans. Iš

Biomedical Papers [interaktyvus]. 2011, kovas [žiūrėta 2011-11-22]. Prieiga per internetą:

<http://biomed.papers.upol.cz/>.

38. Jomova K, Vondrakova D, Lawson M, et al. Metals, oxidative stress and neurodegenerative

disorders. Iš Molecular and Cellular Biochemistry [interaktyvus]. 2010, rugpjūtis [žiūrėta 2011-

12-09]. Prieiga per internetą: <http://www.springerlink.com>.

39. Kang YJ. Metallothionein Redox Cycle and Function. Iš Experimental Biology and Chemistry

[interaktyvus]. 2006, spalis [žiūrėta 2011-11-10]. Prieiga per internetą:

<http://ebm.rsmjournals.com>.

40. Kara H, Karatas F, Canatan H. Effect of single dose cadmium chloride administration on oxidative

stress in male and female rats. Iš Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences

[interaktyvus]. 2005 [žiūrėta 2012-01-12]. Prieiga per internetą: <http://journals.tubitak.gov.tr>.

41. Kasprzak KS, Sunderman WF Jr., Salnikow K. Nickel carcinogenesis. Iš Mutation

Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis [interaktyvus]. 2003, spalis

[žiūrėta 2011-09-18]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com/>.

42. Kim YJ, Kwon S, Kim MK. Effect of Chlorella vulgaris intake on cadmium detoxification in rats

fed cadmium. Iš Nutrition Research and Practice [interaktyvus]. 2009, birželis [žiūrėta 2012-01-

17]. Prieiga per internetą: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.

43. King JC. Zinc: an essential but elusive nutrient. Iš The American Journal of Clinical Nutrition

[interaktyvus]. 2011, rugpjūtis [žiūrėta 2011-10-17]. Prieiga per internetą: <http://www.ajcn.org>.

47

44. Klaassen CD, Liu J, Diwan BA. Metallothionein protection of cadmium toxicity. Iš Toxicology

and Applied Pharmacology [interaktyvus]. 2009, rugpjūtis [žiūrėta 2011-11-27]. Prieiga per

internetą: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.

45. Kobayashi K, Kuroda J, Shibata N et al. Induction of metallothionein by manganese is completely

Dependent on Interleukin-6 Production. Iš The Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics [interaktyvus]. 2007, vasaris [žiūrėta 2011-11-18]. Prieiga per internetą:

<http://jpet.aspetjournals.org>.

46. Kunwar A, Priyadarsini KI. Free radicals, oxidative stress and importance of antioxidants in

human health. Iš Journal of Medical and Allied Sciences [interaktyvus]. 2011, liepa [žiūrėta 2011-

10-27]. Prieiga per internetą: <http://jmas.in>.

47. Kuroda J, Agoa T, Matsushima S, et al. NADPH oxidase 4 (Nox4) is a major source of oxidative

stress in the failing heart. Iš Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States

of America [interaktyvus]. 2010, rugpjūtis [žiūrėta 2012-01-17]. Prieiga per internetą:

<http://www.pnas.org>.

48. Kurowska E, Bal W. Recent advances in molecular toxicology of cadmium and nickel. Iš

Advances in Molecular Toxicology [interaktyvus]. 2010, gegužė [žiūrėta 2011-10-07]. Prieiga per

internetą: <http://www.sciencedirect.com/>.

49. Lin W, Jin C, Dawei Ch, et al. Role of oxidative stress, apoptosis, and intracellular homeostasis in

primary cultures of rat proximal tubular cells exposed to cadmium. Iš Biological Trace Element

Research [interaktyvus]. 2009, sausis [žiūrėta 2011-12-09]. Prieiga per internetą:

<http://www.springerlink.com>.

50. Mahmodabady ABZ, Saberi M, Eimani H, et al. Cytotoxic and oxidative stress caused by

cadmium and lead on human skin fibroblast Cells. Iš Yakhteh Medical Journal [interaktyvus].

2006, rugsėjis [žiūrėta 2012-02-07]. Prieiga per internetą: <http://www.celljournal.org>.

51. Mahmoud KE, Shalahmetova T, Deraz S et al. Combined effect of vanadium and nickel on lipid

peroxidation and selected parameters of antioxidant system in liver and kidney of male rat. Iš

African Journal of Biotechnology [interaktyvus]. 2011, gruodis [žiūrėta 2012-01-14]. Prieiga per

internetą: <http://www.academicjournals.org>.

52. Margis R, Dunand C, Teixeira FK. Glutathione peroxidase family – an evolutionary overview. Iš

The Febs Journal [interaktyvus]. 2008, rugpjūtis [žiūrėta 2011-11-21]. Prieiga per internetą:

<http://onlinelibrary.wiley.com>.

53. Martin HL, Teismann P. Glutathione — a review on its role and significance in Parkinson’s

disease. Iš The Faseb Journal [interaktyvus]. 2009, spalis [žiūrėta 2011-11-10]. Prieiga per

internetą: <http://www.fasebj.org>.

48

54. Matovic V, Buha A, Bulat Z, et al. Route-dependent effects of cadmium/cadmium and magnesium

acute treatment on parameters of oxidative stress in rat liver. Iš Food and Chemical Toxicology

interaktyvus]. 2012, kovas-balandis [žiūrėta 2012-01-16]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com\>.

55. Mendez-Armenta M, Rios C. Cadmium neurotoxicity. Iš Environmental Toxicology and

Pharmacology [interaktyvus]. 2007, gegužė [žiūrėta 2011-12-09]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com/>.

56. Mendez-Armenta M, Villeda-Hernandez J, Barroso-Moguel R, et al. Brain regional lipid

peroxidation and metallothionein levels of developing rats exposed to cadmium and

dexamethasone. Iš Toxicology Letters [interaktyvus]. 2003, rugsėjis [žiūrėta 2012-01-19]. Prieiga

per internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

57. Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species. Iš Biochemical Journal

[interaktyvus]. 2008, gruodis [žiūrėta 2011-10-27]. Prieiga per internetą:

<http://www.biochemj.org>.

58. Neelima P, Shashi K. Impact of cadmium in T lymphocyte subsets and cytokine expression:

Differential regulation by oxidative stress and apoptosis. Iš BioMetals [interaktyvus]. 2008,

balandis [žiūrėta 2011-12-09]. Prieiga per internetą: < http://www.springerlink.com>.

59. Nemec AA, Leikauf GD, Pitt BR, et al. Nickel mobilizes intracellular zinc to induce

metallothionein in human airway epithelial cells. Iš American Journal of Respiratory Cell and

Molecular Biology [interaktyvus]. 2009, liepa [žiūrėta 2012-02-19]. Prieiga per internetą:

<http://ajrcmb.atsjournals.org/>.

60. Nzengue Y, Steiman R. Oxidative stress and DNA damage induced by cadmium in the human

keratinocyte HaCaT cell line: role of glutathione in the resistance to cadmium. Iš Toxicology

[interaktyvus]. 2008, sausis [žiūrėta 2011-12-09]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com/>.

61. Osredkar J, Sustar N. Copper and zinc, biological role and significance of copper/zinc imbalance.

Iš Journal of Clinical Toxicology [interaktyvus]. 2011, spalis [žiūrėta 2011-12-12]. Prieiga per

internetą: <http://omicsonline.org>.

62. Pacheco CC, Passos JF, Castro, AR, et al. Role of respiration and glutathione in cadmium-induced

oxidative stress in Escherichia coli K-12. Iš Archives of Microbiology [interaktyvus]. 2008, kovas

[žiūrėta 2011-12-09]. Prieiga per internetą: < http://www.springerlink.com>.

63. Pal S, Kim JY, Park SH, et al. Quantitative classification of DNA damages induced by

submicromolar cadmium using oligonucleotide chip coupled with lesion-specific endonuclease

digestion. Iš Environmental Science & Technology [interaktyvus]. 2011, balandis [žiūrėta 2011-

11-09]. Prieiga per internetą: <http://pubs.acs.org>.

49

64. Park JD, Liu Y, Klaasen CD. Protective effect of metallothionein against the toxicity of cadmium

and other metals. Iš Toxicology [interaktyvus]. 2001, birželis [žiūrėta 2012-02-12]. Prieiga per

internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

65. Peixoto NC, Roza T, Flores EMM, et al. Effects of zinc and cadmium on HgCl2-δ-ALA-D

inhibition and Hg levels in tissues of suckling rats. Iš Toxicology Letters [interaktyvus]. 2003,

gruodis [žiūrėta 2012-02-12]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

66. Petillo D, Hultin HO. Ubiquinone – 10 as an antioxidant. Iš Journal of Food Biochemistry

[interaktyvus]. 2008, balandis [žiūrėta 2011-11-18]. Prieiga per internetą:

<http://onlinelibrary.wiley.com>.

67. Prasad AS. Zinc in human health: effect of zinc on immune cells. Iš Molecular Medicine

[interaktyvus]. 2008, gegužė/birželis [žiūrėta 2012-02-17]. Prieiga per internetą:

<http://www.molmed.org>.

68. Prasad AS. Zinc: role in immunity, oxidative stress and chronic inflammation. Iš Current Opinion

in Clinical Nutrition & Metabolic Care [interaktyvus]. 2009, lapkritis [žiūrėta 2012-02-17].

Prieiga per internetą: <http://journals.lww.com>.

69. Quinzii CM, Lopez LC, Gilkerson RW, et al. Reactive oxygen species, oxidative stress, and cell

death correlate with level of CoQ10 deficiency. Iš The Faseb Journal [interaktyvus]. 2010, gegužė

[žiūrėta 2011-11-10]. Prieiga per internetą: <http://www.fasebj.org>.

70. Raymond CS, Azman J, Cuthbert ES, et al. Inhalational nickel carbonyl poisoning in waste

processing workers. Iš Chest [interaktyvus]. 2005, liepa [žiūrėta 2011-10-18]. Prieiga per

internetą: <http://chestjournal.chestpubs.org>.

71. Risso-de Faverney C, Orsini N, De Sousa G, et al. Cadmium-induced apoptosis through the

mitochondrial pathway in rainbow trout hepatocytes: involvement of oxidative stress. Iš Aquatic

Toxicology [interaktyvus]. 2004, liepa [žiūrėta 2011-11-27]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com>.

72. Rui Z, Li S, Ying-biao S, et al. Effect of nickel sulfate on the protein expression of caspase-3, Bax

and Bcl-2 in rat liver cells. Iš Industrial Health and Occupational Diseases [interaktyvus]. 2011,

sausis [žiūrėta 2012-02-17]. Prieiga per internetą: <http://en.cnki.com.cn>.

73. Sabolic I, Breljak D, Mario Škarica M, et al. Role of metallothionein in cadmium traffic and

toxicity in kidneys and other mammalian organs. Iš BioMetals [interaktyvus]. 2010, spalis [žiūrėta

2012-02-17]. Prieiga per internetą: <http://www.springerlink.com>.

74. Sandalio LM, Rodriguez-Serrano M, del Rio LA, et al. Reactive oxygen species and signaling in

cadmium toxicity. 2009 [interaktyvus]. Iš SpringerLink [žiūrėta 2011-10-19]. Prieiga per

internetą: <http://www.springerlink.com>.

50

75. Satarug S, Garrett SH, Sens MA, et al. Cadmium, Environmental Exposure, and Health Outcomes.

Iš Environmental Health Perspectives [interaktyvus]. 2009, spalis [žiūrėta 2011-09-29]. Prieiga

per internetą: <http://ehp03.niehs.nih.gov>.

76. Shadi AH, Minder S, Keith GJ, et al. Cadmium accumulation in aortas of smokers. Iš

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology [interaktyvus]. 2001, gegužė [žiūrėta 2011-

10-07]. Prieiga per internetą: < http://atvb.ahajournals.org>.

77. Sharma SS, Dietz KJ. The relationship between metal toxicity and cellular redox imbalance. 2008,

gruodis [interaktyvus]. Iš Sciencedirect [žiūrėta 2011-12-09]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com/>.

78. Singh U, Devaraj S, Jialal I. Vitamin E, oxidative stress and inflammation. Iš Nutrition

[interaktyvus]. 2005, liepa [žiūrėta 2011-11-21]. Prieiga per internetą: <Error! Hyperlink

reference not valid..

79. Soghoian S. Heavy metal toxicity. 2011, gegužė [interaktyvus]. Iš Medscape [žiūrėta 2011-10-19].

Prieiga per internetą: <http://emedicine.medscape.com>.

80. Swiergosz-Kowalewska R. Cadmium distribution and toxicity in tissues of small rodents. Iš

Microscopy Research and Technique [interaktyvus]. 2001, lapkritis [žiūrėta 2012-02-12]. Prieiga

per internetą: <http://onlinelibrary.wiley.com>.

81. Tandon SK, Singh S, Prasad S, et al. Reversal of cadmium induced oxidative stress by chelating

agent, antioxidant or their combination in rat. Iš Toxicology Letters [interaktyvus]. 2003, gruodis

[žiūrėta 2012-03-14]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

82. Templetom DM, Liu Y. Multiple roles of cadmium in cell death and and survival. Iš Chemico-

Biological Interactions [interaktyvus]. 2010, kovas [žiūrėta 2011-09-18]. Prieiga per internetą:

<http://www.sciencedirect.com/>.

83. Uchiyama M, Mihara M. Determination of malondialdehyde precursor in tissues by thiobarbituric

acid test. Iš Analytic Biochemistry [interaktyvus]. 1978, gegužė [žiūrėta 2012-02-04]. Prieiga per

internetą: <http://www.sciencedirect.com>.

84. Valko M, Morris H, Cronin MTD. Metals, toxicity and oxidative stress. Iš Current Medicinal

Chemistry [interaktyvus]. 2005, gegužė. [žiūrėta 2011-10-25]. Prieiga per internetą:

<http://www.ingentaconnect.com>.

85. Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, et all. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-

induced cancer. Iš Chemico-Biological Interactions [interaktyvus]. 2006, sausis [žiūrėta 2011-11-

10]. Prieiga per internetą: <http://www.sciencedirect.com/>.

86. Verma VK, Ramesh V, Tewari S, et al. Role of bilirubin, vitamin C and ceruloplasmin as

antioxidants in coronary artery disease (CAD). Iš medIND [interaktyvus]. 2005, vasaris [žiūrėta

2011-11-20]. Prieiga per internetą: <http://medind.nic.in/>.

51

87. Waalkes MP, Liu J. Metallothionein in inorganic carcinogenesis. Iš Metallothioneins and Related

Chelators. In: Sigel A, Sigel H, Sigel RKO, editors. Metal ions in life sciences, Volume 5. United

Kingdom: Royal Society of Chemistry; 2009. p. 399-412.

88. Waisberg M, Joseph P, Hale B, et al. Molecular and cellular machanisms of cadmium

carcinogenesis. Iš Toxicology [interaktyvus]. 2003, lapkritis [žiūrėta 2011-09-18]. Prieiga per

internetą: <http://www.sciencedirect.com/>.

89. Zhang D, Gao J, Zhang K, et al. Effects of Chronic Cadmium Poisoning on Zn, Cu, Fe, Ca, and

Metallothionein in liver and kidney of rats. Iš Biological Trace Element Research [interaktyvus].

2012, kovas [žiūrėta 2012-02-17]. Prieiga per internetą: <http://www.springerlink.com>.