LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

UROLOGIJOS KLINIKA

LUKAS MICKEVIČIUS

TRUMPOS IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS IN VIVO POVEIKIS ŽIURKIŲ

INKSTŲ MITOCHONRIJŲ OKSIDACINIAM FOSFORILINIMUI

Baigiamasis magistro darbas

Vientisų medicinos studijų programa

Darbo vadovė: prof. dr. Rasa Banienė

Darbo konsultantas: prof. dr. Mindaugas Jievaltas

KAUNAS, 2016

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

UROLOGIJOS KLINIKA

VIENTISOSIOS MEDICINOS STUDIJOS

Lukas Mickevičius

TRUMPOS IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS IN VIVO POVEIKIS ŽIURKIŲ

INKSTŲ MITOCHONRIJŲ OKSIDACINIAM FOSFORILINIMUI

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas(-ė): __________________________ _________________..___________

(vardas, pavardė) (parašas) (data)

Darbo konsultantas (-ė): ______________________ _________________..___________

(vardas, pavardė) (parašas) (data)

Darbą atliko magistrantas: ______________________ _____________..____________

(vardas, pavardė) (parašas) (data)

KAUNAS, 2016

3

TURINYS

TURINYS ................................................................................................................................................. 3

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 4

SUMMARY ............................................................................................................................................. 5

SANTRUMPOS ....................................................................................................................................... 6

ĮVADAS ................................................................................................................................................... 7

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ...................................................................................... 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA....................................................................................................... 9

1.1. Inkstų struktūra, fiziologija bei funkcijos .................................................................................. 9 1.2. Inkstų pažaida sąlygota išemijos/reperfuzijos ......................................................................... 12

1.3. Mitochondrijų struktūra, funkcija ir išeminio/reperfuzinio proceso poveikis ......................... 14 1.4. Kvėpavimo grandinės mitochondrijose struktūra ir funkcija .................................................. 16

2. TYRIMO METODAI ................................................................................................................... 17 2.1. Eksperimentams naudoti gyvūnai ............................................................................................ 17 2.2. Naudotas žiurkės patinų išemijos/reperfuzijos modelis .......................................................... 17

2.3. Mitochondrijų išskyrimo procesas ........................................................................................... 18 2.4. Mitochondrijų baltymų kiekio nustatymas .............................................................................. 19

2.5. Inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės pajėgumo – kvėpavimo greičio nustatymas ....... 19 2.6. I mitochondrijų komplekso aktyvumo nustatymas .................................................................. 20 2.7. II mitochondrijų komplekso aktyvumo nustatymas ................................................................ 21

2.8. II ir III kartu mitochondrijų kompleksų aktyvumo nustatymas ............................................... 22 2.9. Statistinė duomenų analizė ...................................................................................................... 22

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ........................................................................................... 23 3.1. Inkstų išemijos ir reperfuzijos įtaka glutamato/malato oksidacijai ......................................... 23

3.2. Inkstų išemijos ir reperfuzijos įtaka sukcinato oksidacijai ...................................................... 26 3.3. Trumpos išemijos trukmės įtaka I mitochondrijų komplekso aktyvumui ............................... 28 3.4. Trumpos išemijos trukmės įtaka II ir II + III mitochondrijų kompleksų aktyvumui .............. 29

3.5. Rezultatų aptarimas ................................................................................................................. 31

4. IŠVADOS ..................................................................................................................................... 34

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ........................................................................................................ 35

4

SANTRAUKA

Darbo autorius: Lukas Mickevičius

Darbo pavadinimas: Trumpos išemijos/reperfuzijos in vivo poveikis žiurkių inkstų mitochondrijų

oksidaciniam fosforilinimui

Tikslas: Įvertinti trumpos išemijos/reperfuzijos in vivo poveikį žiurkių inkstų mitochondrijų

oksidaciniam fosforilinimui.

Uždaviniai: Išmatuoti ir įvertinti 20 min išemijos ir 30 min reperfuzijos in vivo poveikį žiurkių inkstų

mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai, I mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksui, II

mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksui bei II + III mitochondrijų kvėpavimo grandinės

kompleksui.

Tyrimo objektas: Tyrimui atlikti buvo naudojami Wistar veislės žiurkių patinai.

Metodai: Žiurkių patinams buvo sukeliama šilta inkstų išemija (37 ° C), užspaudžiant arterijas

kraujagysliniais spaustukais, juos laikant 20 min. Praėjus išemijai skirtam laikui spaustukai atleidžiami ir

30 min vykdoma reperfuzija. Inkstai pašalinami ir diferencinio centrifugavimo būdu išskiriamos inkstų

mitochondrijos. Biuret metodu nustatytas baltymo kiekis ir išmatuotas kvėpavimo greitis, naudojant

Oxygraph-2k aparatą, panaudojant glutamatą/malatą ir sukcinatą kaip substratus. Kompleksų aktyvumas

išmatuotas spektrofotometriškai.

Rezultatai: Atlikto tyrimo rezultatai atkleidžia, kad trumpa išemija (20 min)/reperfuzija (30min) I inkstų

mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substrato glutamato/malato oskidacijai reikšmingos

įtakos neturi. Įvertinus II komplekso substrato sukcinato oksidaciją po 20 min išemijos ir 30 min

reperfuzijos, pastebėta, kad greitis antroje metabolinėje būsenoje išaugo 1,47 karto, tačiau trečioje

metabolinėje būsenoje reikšmingai nepakito. Sukcinato oksidacijos metu 22 % sumažėjęs kvėpavimo

kontrolės indeksas parodo, kad net ir po trumpo išemijos periodo yra pažeidžiama mitochondrijų

membrana. Įvertinus kompleksų aktyvumus matoma, kad I komplekso aktyvumas 67% buvo mažesnis

įvykdžius 20 minučių išemiją ir 30 min reperfuziją.

Išvados: Atlikus tyrimus in vivo buvo nustatyta, kad net ir trumpa išemijos trukmė sukelia žiurkės inkstų

mitochondrijų oksidacinės fosforilinimo sistemos pažaidą. Trumpa išemijos trukmė yra pakankama

pažeisti I mitochondrijų kompleksą.

5

SUMMARY

Author: Lukas Mickevičius

Title of the paper: Effect of short time ischemia/reperfusion in vivo on rat kidney mitochondria oxidative

phosphorylation

The aim of this research: To investigate an effect of short time ischemia/reperfusion in vivo on rat

kidney mitochondria oxidative phosphorylation.

Objectives: To evaluate the effect of 20 min ischemia and 30 min reperfusion on mitochondria oxidative

phosforilation system and investigate rat mitochondrial respiration chain complex I, II and II + III

activity.

Object of this research: Wistar breed rats males were used to perform this research.

Methods: Warm ischemia (37 ° C) to rat kidneys was induced by clamping renal arteries using vascular

clamps. Ischemia was induced for 20 min and after that reperfusion lasted for 30 min. Kidneys were

removed and mitochondria were isolated by using differential centrifugation method. The amount of

proteins was measured via Buret method. Mitochondrial respiration rates were measured by Oxygraph-2k

system and using glutamate/malate and succinate as substrates. Mitochondrial respiration chain

complexes activity was measured spectrophotometrically.

Results: This research results show that short time (20 min) ischemia and reperfusion (30 min) does not

affect the respiration rates when mitochondrial respiration chain complex I substrate glutamate/malate is

being oxidized. This research shows that oxidizing mitochondrial respiration chain complex II substrate

succinate evaluates respiration rate in state two after short-time ischemia 1.47 times but didn’t affect state

three. Oxidizing succinate respiration control index decreases by 22 % which show that even after short-

time ischemia mitochondrial membrane is getting damaged. Complex I activity decreased by 67% after

20 min ischemia and 30 min reperfusion..

Conclusions: Research showed that even short time of ischemia damages mitochondrial oxidative

phosphorylation system. Short-time ischemia decreases mitochondrial respiration chain complex I.

6

SANTRUMPOS

ADP –adedozino 5‘-difosfatas

ATP –adenozino 5‘-trifosfatas

DCPIP – 2,6-dichlorfenolio indofenolis

FAD –flavino adenino dinukleotidas

FADH2- flavino adenino dinukleotidas, redukuota forma

NAD+- nikotinamido adenino dinukleotidas, oksiduota forma

NADH - nikotinamido adenino dinukleotidas, redukuota forma

ROS–aktyvūs deguonies junginiai

SDH – sukcinato dehidrogenazė

7

ĮVADAS

Inkstai yra vieni svarbiausių organų, kurie atlieka šalinimo, homeostazės, endokrininę

funkcijas. Su intensyvia inkstų šalinimo funkcija yra susijusi ir gausi inkstų kraujotaka, o esant jos

nepakankamumui galimi negrįžtami inkstų pakenkimai, nes inkstai yra laba jautrūs deguonies stokai

[1]. Inkstų filtracija vyksta nefronų vingiuotuose kanalėliuose, kur vyksta vandens ir medžiagų jonų

apykaita. Šiems procesams yra labai svarbu energija, kuri naudojama aktyviai pernašai nefronų

kanalėliuose. Normali kraujotaka ir deguonies aprūpinimas užtikrina energijos kiekį [2].

Inkstų išemija tai – kraujotakos nepakankamumas, sąlygojantis oksidacinį stresą audiniuose,

ūmų funkcijos nepakankamumą, metabolinių produktų pašalinimo sutrikimą. Išemija gali išsivystyti

dėl patologinių procesų, tokių kaip trombo susidarymas, ūminės embolijos ir kt., bei dėl operacijų,

užspaudžiant inksto kraujagysles [3,4]. Reperfuzija tai – kraujotakos atkūrimas organui ar jo daliai po

tam tikro laiko trukusios išemijos. Kadangi pažeidimas vystosi ne tik tada, kai organas ar jo dalis yra

išemijos sąlygomis, tačiau ir tada, kai atkuriama kraujotaka, todėl pažeidimas vadinamas

išeminiu/reperfuziniu pažeidimu. Reperfuzijos metu pažaida vystosi dėl aktyvių deguonies junginių

(ang. Reactive oxygen species - ROS) susidarymo po atkurtos kraujotakos, staiga padidėjus deguonies

kiekiui ir susidarant peroksidams [5,6].

Abu šie procesai – išemija ir reperfuzija, yra neišvengiami atliekant operacijas. Tai yra būtina,

kuomet rezekuojama dalis inksto, atliekama inkstų transplantacija. Nuo pat užspaudimo pradžios

vystosi išemija, todėl užspaustą inksto arteriją stengiamasi laikyti kuo trumpiau, nes užsitęsus

užspaudimui, prasideda negrįžtami ląstelių pažaidos procesai, o pats išemijos ir reperfuzijos efektas

susijęs su dideliu pacientų mirtingumu ir organų disfunkcijos ryškiu padidėjimu. [7,8].

Mitochondrijos tai – ląstelės organelės, kurių pagrindinė funkcija yra oksidacinio fosforilinimo

metu gaminti ATP, kuris yra darnios viduląstelinio kvėpavimo grandinės veiklos rezultatas. Šiam

tikslui įgyvendinti yra būtinas deguonis. Mitochondrijų skaičius audiniuose labai priklauso nuo

energetinio organo poreikio, būtent dėl to inksto surenkamųjų kanalėlių ląstelėse yra gausu

mitochondrijų [9].

Labai svarbu įvertinti, kokia išemijos trukmė yra nepavojinga inkstam ir galima saugiai laikyti

užspaudus inkstines arterijas. Atlikta nemažai tyrimų šia tema, tačiau vieningos nuomonės nėra prieita,

nes tyrimų rezultatai yra skirtingi. Tad šio darbo tikslas buvo išsiaiškinti išeminio/reperfuzinio

pažeidimo in vivo poveikį inkstų mitochondrijoms po trumpos išemijos (20 min) ir po jos sekančios

reperfuzijos (30 min).

8

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Įvertinti trumpos išemijos/reperfuzijos in vivo poveikį žiurkių inkstų mitochondrijų

oksidaciniam fosforilinimui

Darbo uždaviniai:

1. Įvertinti 20 min išemijos ir 30 min reperfuzijos in vivo poveikį žiurkių inkstų mitochondrijų

oksidacinio fosforilinimo sistemai

2. įvertinti 20 min išemijos ir 30 min reperfuzijos in vivo poveikį žiurkių inkstų mitochondrijų

kvėpavimo grandinės I komplekso aktyvumui.

3. įvertinti 20 min išemijos ir 30 min reperfuzijos in vivo poveikį žiurkių inkstų mitochondrijų

kvėpavimo grandinės II +III komplekso aktyvumui.

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Inkstų struktūra, fiziologija bei funkcijos

Inkstai – tai porinis parenchiminis pupelės formos organas, turintis vidinę vamzdelinę

struktūrą, užimantis retroperitoninę padėtį ir gulintis viršutinėje pilvo ertmės dalyje. Kiekvienas

suaugusio žmogaus inkstas sveria apie 150 g , yra apie 10 cm ilgio, 5cm pločio bei 4cm storio[10].

Fiziologinė inkstų spalva yra raudonai ruda, konsistencija – kietoka. Skiriami 2 inkstų galai –

viršutinis galas bei apatinis galas, taip pat du paviršiai – priekinis paviršius bei užpakalinis paviršius, ir

du kraštai – vidinis kraštas ir išorinis kraštas. Abu inkstus gaubia tiek fibrozinė, tiek riebalinė kapsulės

bei fascija, o kiekviename inkste yra apie 1 milijoną filtruojančių ir išskiriančių šlapimą vamzdelinių

struktūrų – nefronų. Fibrozinė kapsulė esti skaidri, plona, truputį tampri, tačiau stipri [11]. Nesant

patologinių pakitimų inkstuose, ši kapsulė nesunkiai atsiskiria, nes yra suaugusi su inkstų paviršiumi

tik netvirtais jungiamojo audinio pluošteliais. Fibrozinė kapsulė taip pat iškloja inksto ančio vidinį

paviršių. Riebalinė inksto kapsulė prigludusi prie fibrozinės inksto kapsulės, o iš išorės yra dengiama

inksto fascijos ir sudaro riebalinį kūną. Kaip ir fibrozinė kapsulė, taip ir dalis riebalinės kapsulės

įlinksta į inksto antį ir apsupa geldelę, taurelę bei kraujagysles. Riebalinė kapsulė atlieka svarbią

termoreguliacijos funkciją, apsaugodama nuo didelių temperatūrų skirtumų tarp inksto audinio ir

aplinkos, taip pat apsaugo nuo trauminio sužalojimo, atlikdama amortizacinę funkciją bei išlaiko

įprastinę inksto padėtį [11]. Inksto fascija supa kiekvieną inkstą tiek iš priekio, tiek iš galo, tad sudaro

barjerą išsiliejus kraujui arba vystantis pūlingam procesui, išplisti į kitą inkstą. Normaliai nefronų

veiklai yra būtina energija, todėl inkstai suvartoja didelį kiekį ATP, kuris gaunamas iš aerobinio

kvėpavimo.

10

1 pav. Inksto struktūra [12]

Inkstai – vienas svarbiausių organų, organizmo homeostazei palaikyti, nes atlieka šalinimo,

rūgščių bei šarmų pusiausvyros palaikymo, kraujo osmosinio slėgio palaikymo, tarpląstelinio skysčio

tūrio palaikymo, kalio apykaitos, kalcio bei fosforo apykaitos reguliavimo, kraujospūdžio reguliavimo

bei hormoninės reguliacijos funkciją.

Vidinė inksto sandara, kaip ir kiekvieno parenchiminio organo, sudaryta iš stromos bei

parenchimos . Stromą sudaro jungiamasis audinys, įsiterpęs tarp inksto segmentu, skilčių, skiltelių

[11]. Inksto parenchimą sudaro nefronai. Inkstų pjūvyje matyti, kad vidinė inksto struktūra esti iš

dviejų dalių – inksto žievės bei šerdies. Žievė – tai išorinis sluoksnis, prie kurio prigludusi fibrozinė

inksto kapsulė, bei sudarantis didesnę inksto masės dalį. Ji nusitęsia nuo paviršiaus link inksto ančio,

sudarydama inksto šulus, taip pat atskirdama inksto piramides tarpusavyje. Inksto šerdis tai –

nevienalytė, standesnė už žievę struktūra, sudaranti inksto piramides, kurios yra: 5 – 7 ventralinės bei

6 – 7 dorsalinės, kurias tarpusavyje skiria inksto žievė – inksto šulai. Piramidžių viršūnės prie inksto

ančio sudaro inksto spenelius, kuriuos gaubia mažosios taurelės.

Inkstų kraujotaka labai intensyvi, tai – vienas labiausiai krauju aprūpinamų organų organizme,

apie 25 procentai širdies minutinio tūrio atiteka į inkstus, tad per 100 g inkstų audinio prateka apie 350

ml kraujo per minutę, o per parą visas žmogaus kraujas prateka pro inkstus apie 300 kartų, o tai

apytiksliai yra 1500 l kraujo[13]. Inkstą krauju aprūpina inkstų arterija, įtekanti pro inksto vartus ir

toliau skylanti į daugybę smulkesnių šakų [14]. Nuo tarp žievinio ir šerdinio sluoksnių einančių

lankinių arterijų atsišakoja tarpskiltelinės arterijos, einančios per inksto žievę, paviršiaus link. Nuo

11

pastarųjų kraujagyslių atsišakoja įtekančios arteriolės, kurios įeina glomerulus, o iš glomerulų toliau

nueina ištekančiosios arteriolės, skylančios į daugybę smulkių, kanalėlius apraizgančių kapiliarų. Taigi

galima išskirti dvi pagrindines kapiliarines sistemas – glomerulų bei kanalėlių, kurios labai svarbios

inkstų funkcijoms atlikti. Dėl itin aukšto kraujo spaudimo glomeruluose ( apie 45 mm Hg) apie 25

proc. kraujo plazmos persifiltruoja į Baumano kapsulę ir kanalėlius, o iš kanalėlių reabsorbuotas

vanduo, dėl didelio baltymų kiekio kapiliaruose, grįžta į bendrąją kraujotaką.

Nefronas – pagrindinis inkstų struktūrinis vienetas[15]. Nefroną sudaro trys dalys –

glomerulas, kanalėliai ir jukstaglomerulinis aparatas. Taip pat yra inkstų interscinis audinys,

suteikiantis glomerulams, kanalėliams ir kapiliarams atramą. Glomerulinį filtrą sudaro trys dalys,

svarbios pirminio šlapimo filtracijai – endotelio poros, bazinė membrana bei podocitų diafragma.

Glomerulas yra apgaubtas Baumano kapsulės, į jį atiteka įtekančioji arteriolė, skylanti į daugybę

kapiliarų, o išteka – ištekančioji, vėliau skylanti į daugelį kapiliarų, apraizgančių kanalėlius.

Kanalėliai sudaryti iš trijų pagrindinių dalių: proksimalinio kanalėlio, Henlės kilpos bei distalinio

kanalėlio [16]. Proksimaliniame kanalėlyje vyksta reabsorbcija dėl didelio paviršiaus ploto. Šioje

dalyje reabsorbuojama beveik visa išfiltruota gliukozė, aminorūgštys ir mažos molekulinės masės

baltymai. Nusileidžiančioji Henlės kilpos dalis yra labai laidi vandens molekulėms, o kylančioji –

priešingai – visiškai nelaidi, tačiau čia vyksta aktyvi natrio jonų reabsorbcija. Distaliniuose

(surenkamuosiuose) kanalėliuose vyksta vandens reabsorbcija dėl hipofizės sekretuojamo

antidiurezinio hormono. Visų kanalėliuose vykstančių procesų rezultatas – inksto taureles pasiekiantis

koncentruotas šlapimas.

12

2 pav. Nefrono sandara [17]

1.2. Inkstų pažaida sąlygota išemijos/reperfuzijos

Inkstai yra vieni iš svarbiausių organų, kurie dalyvauja metabolinių medžiagų išskyrime iš

kraujo, todėl užtikrinta ir pakankama inkstų kraujotaka yra labai svarbu visai organizmo homeostazei

[14]. Inkstų ekskrecinei funkcijai palaikyti sunaudojama energija ATP pavidalu. ATP sintezei ląstelėje

sunaudojama apie 90 proc. deguonies. Energija inkstuose sunaudojama aktyviai medžiagų pernašai,

tačiau sutrikus inkstų kraujotakai ir išsivysčius ūmiam inkstų nepakankamumui, sutrinka

kraujospūdžio reguliavimas (kraujospūdžio staigūs kitimai), rūgščių ir šarmų pusiausvyros

reguliavimas (vystosi metabolinė acidozė) bei vandens apykaitos organizme kontrolė (daugėja skysčių

organizme, ryškėja inkstinės kilmės edemų) [26].

Išemija – tai nepakankamas kraujo tiekimas audiniams ar organams, dėl arterinės obstrukcijos,

atsirandančios tiek dėl natūralių patologinių procesų organizme (trombo susidarymas), tiek dėl

chirurginių intervencijų (arterijos užspaudimas chirurginiais spaustukais), ko pasėkoje vystosi

deguonies badas audiniuose, nepakankamas maisto medžiagų aprūpinimas tai sričiai ar organui,

kuriame vystosi išeminė zona, bei nepakankamas metabolinių medžiagų pašalinimas [3,4,27].

13

Reperfuzija – atvirkštinis procesas išemijai, kuomet išemijos paveiktai zonai ar visam organui

palaipsniui ar staiga atkuriama kraujotaka. Reperfuzija įvykti gali taip pat dėl trombo ar kito

patologinio proceso, trikdančio organo kraujotaką, pašalinimo arba dėl chirurginės intervencijos metu

atspausto spaustuko. Tačiau svarbu pažymėti, kad ląstelės mirtis yra sąlygojama dažniausiai ne

išemijos, o kraujotakos atkūrimo – reperfuzijos. Taip yra todėl, kad reperfuzijos metu ima gamintis

aktyviosios deguonies formos (ROS) [4,5,28].

Abu šie procesai – išemija ir reperfuzija, yra neišvengiami atliekant operacijas. Tai yra būtina,

kuomet rezekuojama dalis inksto (dėl tumoro, cistos, kartais dėl inksto akmens ir kitais atvejais),

atliekama inkstų transplantacija, kuomet yra būtina sujungti inksto kraujagysles, o organo šaldymui jau

nebėra galimybių arba užsipildžius inkstui krauju, stebimas kraujagyslių nesandarumas ir reikalingas

pakartotinas užspaudimas. Užspaudimas yra būtinas, siekiant operaciniame lauke išvengti kraujo

priplūdimo ir matomumo sumažėjimo, kas gali lemti operacines komplikacijas ar operacijos nesėkmę.

Nuo pat užspaudimo pradžios vystosi išemija, todėl užspaustą inksto arteriją stengiamasi laikyti kuo

trumpiau, nes užsitęsus užspaudimui, prasideda negrįžtami ląstelių pažaidos procesai, o pats išemijos

ir reperfuzijos efektas susijęs su dideliu pacientų mirtingumu ir organų disfunkcijos ryškiu padidėjimu.

[7,8].

Proksimaliniai inkstų kanalėliai yra jautriausi išemijos poveikiui, todėl ir pažeidžiami yra

greičiausiai ir, užsitęsus išemijai, stipriausiai [13]. Juo trumpesnė išemijos trukmė, tuo mažesnė

pažaida išsivysto, todėl kad inkstai į sumažėjusį pritekamo kraujo kiekį reaguoja mažindami glomerulų

filtracijos greitį ir taip mažinant deguonies poreikį. Tačiau vėliau susidarę aktyvūs deguonies junginiai

vis tiek pažeidžia inksto audinį (reperfuzijos efektas), tad trumpesnis užspaudimo laikas yra labai

svarbus siekiant išvengti negrįžtamo inkstų pažeidimo [14]. Patys aktyvūs deguonies junginiai

pažeidžia ne tik baltymus ir lipidus, tačiau ir DNR, o tai vėliau nulemia ATP sintezės sutrikdymą,

nekrozę ir ląstelės žūtį [29].

Inkstų išeminiam pažeidimui labai didelę įtaką turi kalcio jonų (Ca2+) kiekis ląstelėje.

Išsivysčius išemijai, skatinamas kalcio kiekio didėjimas ląstelėje dėl deguonies kiekio sumažėjimo, o

tai savo ruožtu lemia lipidų peroksidaciją ir kvėpavimo grandinės sutrikimą, ATP gamybos

sumažėjimą. Trūkstant deguonies slopinamas aerobinis kvėpavimas, todėl prasideda anaerobinis

kvėpavimas, kas lemia acidozės išsivystymą dėl pieno rūgšties sintezės suaktyvinimo ir uždegiminių

faktorių išskyrimą iš neutrofilų [27,28].

Kadangi daugelio inkstų operacijų metu išvengti išemijos beveik neįmanoma (nes

technologiškai atlikti operaciją yra labai sunku arba neįmanoma), todėl labai svarbu nustatyti laiką,

14

kuris būtų saugus ir nebūtų pažeista inkstų funkcija [30]. Tyrimais įrodyta, kad saugi išemijos kontrolė

ir nebūdingi negrįžtami pakitimai yra tik tuomet, kai išemija trunka ne daugiau kaip 30 minučių, o

šiam laikui didėjant, formuojasi negrįžtami procesai, galintys sukelti terminalinį inkstų

nepakankamumą [31]. Nors ir atlikta nemažai tyrimų, kuriais siekiama nustatyti saugią išemijos laiko

ribą inkstų operacijų metu, tačiau gauti duomenys yra prieštaringi ir vieningos nuomonės nėra prieita.

To pasekmė – operacijos metu chirurgas pats renkasi išemijos laiko trukmę pagal patirtį [31-34]

1.3. Mitochondrijų struktūra, funkcija ir išeminio/reperfuzinio proceso

poveikis

Mitochondrijos tai – įvairios formos bei dydžio organelės, kurių parametrai gali kisti

priklausomai nuo organo ypatybių, osmosinio terpės slėgio bei organizmo būklės. Mitochondrijų

skaičius varijuoja priklausomai nuo organo, kuriame jos yra, energijos poreikio ir funkcinio aktyvumo.

Bene svarbiausios mitochondrijų funkcijos tai – ATP sintezė (tad jos pasiskirsto taip, kad tenkintų

ląstelės bei organo poreikius ir atliktų funkciją), kalcio (Ca2+) ir geležies (Fe+3) koncentracijų

palaikymas bei pavojaus signalų reguliavimas [15]. ATP sintezė inkstuose vyksta oksidacinio

fosforilinimo būdu, vidinėje mitochondrijų membranoje, išsidėsčiusiuose kvėpavimo grandinės

kompleksuose, kurie sukuria sąlygas ATP sintazės veiklai [9].

Mitochondrijas gaubia dvi membranos, kurias skiria tarpmembraninis tarpas. Membranos

sudarytos iš fosfolipidų bisluoksnio, jų funkcija yra perduoti signalus, palaikyti formą, užtikrinti

medžiagų transportą į ląstelę ir iš ląstelės. Vidinė membrana sudaro įlinkius į vidų, vadinamus

kristomis, kurios padidina vidinio paviršiaus plotą. Dėl didelio paviršiaus ploto galima efektyvesnė

ATP sintezė. Mitochondrijos turi savo DNR, vadinamą mitochondrijų DNR (mtDNR), kurių dėka

mitochondrijos gali savarankiškai atsinaujinti. Mitochondrijų nukleoide yra rRNR ir tRNR, kurios

labai svarbios mtDNR raiškai [18].

Išorinė mitochondrijų membrana laidi daugeliui medžiagų – vandeniui, jonams, nedidelės

molekulinės masės metabolitams. Tačiau pro ją nepraeina stambios molekulės, tokios kaip baltymai.

Pagrindiniai baltymai, esantys išoriniame mitochondrijų membranos sluoksnyje yra vadinami porinais.

Per šiuos baltymus difuzijos būdu vyksta hidrofilinių molekulių judėjimas [19]. Mitochondrijoms

svarbių baltymų, koduojamų ląstelės branduolio DNR, pernašą užtikrina membranoje esantis specialus

nešiklis [15].

15

Vidinė mitochondrijų membrana sudaro daugybę kristų – įlinkių, didinančių paviršiaus plotą,

kurių skaičius ir gylis priklauso nuo ląstelės kvėpavimo aktyvumo ir ATP poreikio [20]. Visoje

vidinėje membranoje yra išsidėstę kvėpavimo grandinės komponentai, kurių dėka vyksta oksidacinis

fosforilinimas ir ATP sintezė: ATP sintazė, jonų nešikliai, kvėpavimo fermentai [21].

Tarp vidinės ir išorinės membranos yra tarpmembraninė ertmė, kurioje yra citochromas c, taip

pat yra kreatino kinazė ir adenilatų kinazė.

Vidinė mitochondrijų membrana apgaubia mitochondrijų užpildą, vadinamą matriksu. Matrikse

yra Krebso ciklo fermentai, tokie kaip sukcinato ir malato dehidrogenazė, citrato ir sukcinil KoA

sintazė ir kt. [21]. Mitochondrijų užpilde taip pat yra ribosomos, kurios sintetina baltymus iš

patenkančių amino rūgščių, dvigrandė žiedinę DNR, kurios dėka mitochondrijos gali savarankiškai

dalintis bei daugintis [18].

3 pav. Mitochondrijos struktūra [22]

Nustatyta, kad didžiausia pažaida, sąlygota išemijos/reperfuzijos, išsivysto toms inkstų dalims,

kuriose yra didžiausias energijos pareikalavimas ir iš to sekantis didžiausias mitochondrijų kiekis.

Besivystant išeminiam pažeidimui, mitochondrijų membrana praranda savo funkciją, susiformuoja

nespecifinės pralaidžiosios poros, kurios lemia ląstelės žūtį [23]. Mitochondrijų vidinės membranos

laidumo padidėjimas lemia kaspazių aktyvavimą ląstelės citoplazmoje, dėl ko vėliau aktyvinama

ląstelės žūtis - apoptozė ir nekrozė [24]. Pažaida taip pat lemia mitochondrijų pabrinkimą, kristų

deformaciją ir autofagijos procesą, kurio metu sunaikinamos pažeistos mitochondrijos ar kitos

organelės [25].

16

1.4. Kvėpavimo grandinės mitochondrijose struktūra ir funkcija

Pagrindinis ir svarbiausias kvėpavimo grandinėje susidarantis junginys – ATP, kuris yra

oksidacinio fosforilinimo proceso gautinis junginys. Kvėpavimo grandinė yra išsidėsčiusi

mitochondrijų vidinėje membranoje ir sudaryta iš keturių kompleksų, kuriems tik darniai veikiant

galima ATP energijos sintezė [35,36]. Esant mitochondrijų pažaidai inkstų kanalėliuose, nevyksta

normali ATP energijos gamyba, todėl ima trikti inkstų funkcija. Išeminis/reperfuzinis pažeidimas gali

sąlygoti vieno iš kompleksų disfunkciją ar kelių kompleksų pažaida vienu metu. Kvėpavimo grandinės

sutrikimas ir ATP gamybos nutrūkimas galimas ir trūkstant viduląstelinio aerobinio kvėpavimo

fermentų [37].

4 pav. Elektronų pernašos grandinės struktūra. [38]

17

2. TYRIMO METODAI

2.1. Eksperimentams naudoti gyvūnai

Kadangi tyrimas buvo atliekamas naudojant laboratorinius gyvūnus, todėl darbui atlikti buvo

imtasi visų atsargumo priemonių ir buvo griežtai laikomasi darbo su gyvūnais tvarkos taisyklių.

Tvarka ir kontrolė buvo užtikrinama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos

Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijose, kuriose ir buvo vykdomas šis tiriamasis darbas.

Eksperimentams buvo naudojamos laboratorinių žiurkių patinai (Wistar veislės), kurių svoris buvo 200

gramų (±30 gramų). Siekiant kuo labiau suvienodinti sąlygas, prieš eksperimentą visi žiurkių patinai

buvo laikomi toje pačioje patalpoje, su vienoda oro temperatūra, šeriami vienodu žiurkėms pritaikytu

maistu, buvo duodama reikiamas kiekis vandens.

Šiame darbe buvo svarbu išsiaiškinti trumpos trukmės išemijos poveikį inkstų mitochondrijų

energijos gamybai, todėl eksperimentiniai gyvūnai buvo suskirstyti į dvi grupes: kontrolinę grupę ir

trumpos išemijos grupę, kurioje tiriama 20 minučių išemija ir 30 minučių reperfuzija. Šios grupės

buvo parenkamos atsitiktinai, siekiant tyrimo objektyvumo ir rezultatų patikimumo.

2.2. Naudotas žiurkės patinų išemijos/reperfuzijos modelis

Prieš atliekant eksperimentą buvo užtikrinta rami aplinka tiriamiesiems gyvūnams, tuomet

gyvūnai atsargiai perkeliami iš narvelio į anglies dioksido kamerą, kurioje žiurkių patinai buvo

apsvaiginami. Apsvaigintam gyvūnui greitai suleidžiama barbitūrato (Pentobarbitalio), kuris slopina

smegenų veiklą ir visą centrinę nervų sistemą. Vaistas paprastai skiriamas trumpai anestezijai ir

nedidelių operacijų metu sedacijai sukelti. Pentobarbitalis praskiestas su izotoniniu NaCl tirpalu

(0,9%) iki 20% koncentracijos. Į pilvaplėvę suleista 0,2 ml medikamento (0,1 ml/100g žiurkės masės).

Taip pat naudotas medikamentas ketaminas – vaistas skirtas skausmo malšinimui ir miego

sustiprinimui operacijos metu. 0,2 ml ketamino suleidžiama į raumenį (0,1ml/100 gramų žiurkės

masės). Abu naudoti medikamentai tarpusavio žalingų sąveikų neturi, todėl gali būti vartojami kartu.

Po medikamentų įvedimo į organizmą, gyvūnai buvo dedami atgal į narvelį ir laukiama kol pilnai

pradės veikti suleisti vaistai. Įsitikinus, kad žiurkės bendrinė nejautra pakankama ir ji nereaguoja į

skausminius dirgiklius, nuskutama pjūvio vieta ir pasluoksniui atveriamas pilvas priekiniu viduriniu

18

išilginiu pjūviu (prapjaunama oda, serozinis dangalas, praskiriami raumenys ir pilvaplėvė). Viso

eksperimento metu palaikoma pastovi žiurkės kūno temperatūra, naudojant specialius šildymo padus ir

periodiškai tikrinama rektalinė kūno temperatūra. Atsargiai nustumiant skrandį ir žarnų kompleksą

prieinama prie dešiniojo inksto arterijos, ji atidalijama ir užspaudžiama kraujagysliniu spaustuku, taip

sukeliant išemiją dešiniam inkstui. Tuoj pat po dešinio inksto arterijos užspaudimo, atidalijama kairio

inksto arterija ir taip pat užspaudžiama kraujagysliniu spaustuku. Pradedamas matuoti išemijos laikas,

naudojant laikmatį nustatomas 20 minučių atgalinis skaičiavimas. Išemijos metu pjūvio kraštai

sugretinami ir uždengiami, siekiant išvengti vidaus organu apdžiūvimo ir šilumos nuostolių. Praėjus

išemijai skirtam laikui, atspaudžiami kraujagysliniai spaustukai tokia pačia eilės tvarka kai ir

užspaudžiant – pirmiau dešinės, po to kairės pusės. Nuėmus spaustukus prasideda reperfuzijos laikas ir

laikmatyje užstatoma 30 minučių atgalinis skaičiavimas. Vėl apsaugoma nuo dehidratacijos ir

hipotermijos. Praėjus nustatytam 30 minučių reperfuzijos laikui inkstai atidalijami nuo aplinkinių

audiniu, kraujagyslių ir šlapimtakių ir iškart dedami į 0,9 % 0-4 °C KCl tirpalą. Vengiant gyvūno

kankinimo ir skausmo sukėlimo, suleidžiama mirtina dozė ketamino ir pentobarbitalio, kol sustoja

kvėpavimas ir išnyksta gyvybiniai požymiai. Tuomet žiurkė dedama į medicininių atliekų šaldiklį ir

utilizuojama pagal galiojančius įstaigos reikalavimus. Kontrolinės grupės žiurkių operacinis modelis

buvo toks pats, tik nebuvo taikyta išemija ir reperfuzija, o inkstai šalinami iškart.

2.3. Mitochondrijų išskyrimo procesas

Inkstas stiklinėje 0,9 % 0 - 4 °C KCl tirpalu atplaunamas nuo kraujo ir perkeliamas į Petri

lėkštelę, esančią ant ledų. Nuo inksto atidalijami pašaliniai audiniai – riebalinio audinio likučiai,

fibrozinis audinys, krešulių likučiai ir kita. Įsitikinus, kad inksto paviršiuje nebeliko pašalinių audiniu,

inkstas sukarpomas ir užpilamas izoliavimo terpe, kurios sudėtis: sacharozė (250 mM); EDTA (1

mM); Tris-HCl (10 mM); bidistiliuotas H2O; pH 7,4, privesta su KOH 0-4 °C temperatūroje ir gautas

mišinys homogenizuojamas. Homogenatas centrifuguojamas 750 × g greičiu hipotermijos sąlygomis

(3°C temperatūroje) 5 minutes. Po centrifugavimo supernatantas prafiltruojamas ir dar kartą

centrifuguojamas 6800 × g greičiu 10 minučių. Antrojo centrifugavimo etapo pabaigoje mėgintuvėlyje

matomi du sluoksniai, o esančiose nuosėdose yra mitochondrijos, kurias ruošiamasi tirti. Šios

nuosėdos atskiriamos ir laikomos šaltomis sąlygomis.

19

2.4. Mitochondrijų baltymų kiekio nustatymas

Baltymo kiekis mitochondrijų suspensijoje nustatomas biureto metodu [68]. Į tiriamą

mėgintuvėlį įpilama 25 µl mitochondrijų suspensijos, 975 µl 0,33 % deoksicholato tirpalo ir 4 ml

Biureto reagento, kurio sudėtis: CuSO4(1 %); K-Na tartratas (0,04 M); NaOH (10 %); bidistiliuotas

H2O. Ruošiant kontrolinį pavyzdį, pilama 1000 µl 0,33 % deoksicholato tirpalo ir 4 ml Biureto

reagento. Gerai sumaišoma ir 30 min inkubuojama vandens termostate 37°C temperatūroje. Tirpalo

optinis tankis matuojamas spektrofotometru Helios α (Thermo Electron, Anglija), bangos ilgis 536 nm.

Baltymo kiekis nustatomas pagal kalibracinę kreivę, sudarytą naudojant standartinį baltymo tirpalą,

pagamintą iš jaučio serumo albumino.

2.5. Inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės pajėgumo – kvėpavimo

greičio nustatymas

Siekiant nustatyti mitochondrijų pažaidą, labai svarbu išmatuoti mitochondrijų kvėpavimo

greitį. Tai atliekama naudojant poliarografinę sistemą Oxygraph-2k (OROBOROS Instruments,

Innsbruck, Austria). Kvėpavimo greitis matuojamas 37 °C temperatūroje terpėje, kurios sudėtis:KCl

(150 mM); tris-HCl (10 mM); KH2PO4(5 mM); MgCl2(1 mM); bidistiliuotas H2O; pH 7,2, privesta su

KOH 37 °C temperatūroje. Į matavimo terpę įvedama I mitochondrijų kvėpavimo grandinės

komplekso (NADH-specifinio) kvėpavimo substratų glutamato (5 mM)ir malato(5mM)arba II

mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso (FADH2-specifinio) kvėpavimo substrato sukcinato

(15 mM), taip pat su sukcinatu pridedant 2 mM amitalio, kuris slopina I kompleksą. Vėliau pridedama

mitochondrijų suspensija (0,25 mg/ml) ir išmatuojamas mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje

metabolinėje būsenoje (V2). Į tiriamąjį tirpalą papildomai įdėjus ADP, registruojamas maksimalus

kvėpavimo greitis(V3). Galiausiai dedama atraktilozido, kuris slopina ADP/ATP nešiklį. Esant

fiziologinei membranos būklei, kvėpavimo greitis labai stipriai sumažėja, nes slopinama ATP sintezė,

tačiau esant membranos pažaidai, greitis nesumažėja arba sumažėja nepakankamai intensyviai.

Pateikiama tipinė mitochondrijų kvėpavimo registravimo kreivė (5 pav) .

20

5 pav. Tipinė mitochondrijų kvėpavimo registravimo kreivė

Siekiant išsiaiškinti, ar izoliuotų mitochondrijų kokybė yra gera, apskaičiuojamas kvėpavimo

kontrolės indeksas, parodantis kvėpavimo grandinėje vykstančio oksidacinio fosforilinimo pajėgumą.

Mitochondrijų membranų pralaidumui įvertinti yra matuojamas citochromo c efektas, nes esant

pažeistai membranai citochromas c pašalinamas iš mitochondrijų.

2.6. I mitochondrijų komplekso aktyvumo nustatymas

Vertinant pirmojo mitochondrijų kvėpavimo komplekso aktyvumą spektrofotometriškai

(bangos ilgis 340 nm), pirmiausia reikia įsitikinti, kad mitochondrijų membrana yra suardyta.

Membranų suardymą garantuoja paeiliui sekantys užšaldymo ir atšildymo ciklai ( 4 kartus šaldant ir

atšildant). Į kiuvetę įpilama KH2PO4 (10 mM) matavimo buferio, paeiliui įvedama kofermento Q (1

mM), antimicino A (1 μg/ml), 0,05 mg/ml suardytų inkstų mitochondrijų. Matavimai atliekami

vertinant NADH oksidaciją, o registravimas turi nepertraukiamai vykti 2 minutes. Po dviejų minučių

nenutrūkstamo matavimo į kiuvetę papildomai įvedama rotenono (10 µM), kuris yra I komplekso

slopiklis, registruojamas rotenonui jautrus greitis.

I komplekso aktyvumas apskaičiuojamas pagal formulę:

21

𝐼 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠𝑜 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑣𝑢𝑚𝑎𝑠 =∆𝐴/∆𝑡

𝜀×𝑉

𝑚× 106,

kur ΔA – šviesos sugerties pokytis; Δt – laiko pokytis (1 min); ε – molinis sugerties

koeficientas (ε340 = 6,22 mM-1cm-1); V – tiriamojo tirpalo tūris (1 ml); m – mitochondrijų baltymo

kiekis (0,05 mg).NADH dehidrogenazės aktyvumas išreiškiamas µmol/min/mg mitochondrijų

baltymo.

2.7. II mitochondrijų komplekso aktyvumo nustatymas

SDH aktyvumas nustatomas spektrofotometriškai, esant 600 nm bangos ilgiui. Į kiuvetę įpilama

KH2PO4, pH 7,4 (50 mM), EDTA (0,1 mM), IV komplekso slopiklio KCN (0,25 nM), II komplekso

substrato sukcinato (10 mM) ir 10 μl arba 20 μl mitochondrijų suspensijos. Inkubuojama kambario

temperatūroje 10 min. Reakcija pradeda vykti pridėjus 1,63 mM fenazino-metosulfato (PMS), kuris

yra tarpinis elektronų akceptorius ir 35 μM 2,6-dichlorfenolio indofenolio (DCPIP), kuris yra galutinis

elektronų akceptorius.

𝑆𝑢𝑘𝑐𝑖𝑛𝑎𝑡𝑎𝑠 + 𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃𝑜𝑘𝑠. + 𝑃𝑀𝑆𝑆𝐷𝐻→ 𝐹𝑢𝑚𝑎𝑟𝑎𝑡𝑎𝑠 + 𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃𝑟𝑒𝑑. + 𝑃𝑀𝑆

Absorbcijos greičio mažėjimas yra proporcingas DCPIP redukcijos greičiui, kuris savo ruožtu

proporcingas SDH aktyvumui, išreiškiamas µmol/min/mg mitochondrijų baltymo.

II komplekso aktyvumas apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑆𝐷𝐻 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑣𝑢𝑚𝑎𝑠 =∆𝐴/∆𝑡

𝜀×𝑉

𝑚× 106,

kur ΔA – šviesos sugerties pokytis; Δt – laiko pokytis (1 min); ε – molinis sugerties

koeficientas (ε340 = 19,1 mM-1cm-1); V – tiriamojo tirpalo tūris; m – baltymo kiekis 10 µl arba 20 μl

mitochondrijų suspensijos.

22

2.8. II ir III kartu mitochondrijų kompleksų aktyvumo nustatymas

II+III kompleksų aktyvumas nustatomas spektrofotometriškai, esant 550 nm bangos ilgiui. Į kiuvetę

įpilama KH2PO4,pH 7,4 (50 mM), EDTA (0,2 mM), IV komplekso slopiklio KCN (0,25 nM), II

komplekso substrato sukcinato (10 mM) ir 10 μl arba 20μl mitochondrijų suspensijos. Kiuvetė

inkubuojama kambario temperatūroje 10 min. Reakcija pradeda vykti pridėjus citochromo c (80 μM).

Nuo SDH elektronai pernešami citochromo bc1 kompleksui, kuris redukuoja citochromą c, todėl

pridėjus II komplekso substrato sukcinato, citochromo c redukcijos greitis yra proporcingas II+III

kompleksų aktyvumui, išreiškiamas µmol/min/mg mitochondrijų baltymo. Citochromo c redukcija

registruojama spektrofotometru.

𝑆𝑢𝑘𝑐𝑖𝑛𝑎𝑡𝑎𝑠 + 𝐶𝑖𝑡 𝑐𝑜𝑘𝑠.𝐼𝐼+𝐼𝐼𝐼 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑒𝑘𝑠𝑎𝑖→ 𝐹𝑢𝑚𝑎𝑟𝑎𝑡𝑎𝑠 + 𝐶𝑖𝑡 𝑐𝑟𝑒𝑑.

II+III kompleksų aktyvumas apskaičiuojamas pagal formulę:

𝐼𝐼 + 𝐼𝐼𝐼 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠ų 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑣𝑢𝑚𝑎𝑠 =∆𝐴/∆𝑡

𝜀×𝑉

𝑚× 106,

kur ΔA – šviesos sugerties pokytis; Δt – laiko pokytis (1 min); ε – molinis sugerties

koeficientas (ε340 = 21,1 mM-1cm-1); V – tiriamojo tirpalo tūris; m – baltymo kiekis 10 µl arba 20 μl

mitochondrijų suspensijos

2.9. Statistinė duomenų analizė

Atliekant statistinę duomenų analizę buvo naudojama SigmaPlot 12.5 programa. Pateikiami 3-

5 eksperimentų vidurkiai ir pateikiama standartinė paklaida. Buvo naudojamas Stjudento t ir Mann-

Whitney U testai, siekiant įvertinti duomenų skirtumo patikimumą. Statistiškai reikšmingas duomenų

skirtumas buvo kai p<0,05.

23

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Inkstų išemijos ir reperfuzijos įtaka glutamato/malato oksidacijai

Daugelio inkstų operacijų metu nepavyksta išvengti arterijos užspaudimo, siekiant geresnio

operacinio lauko matomumo. Tačiau tokiu atveju sukeliama išemija, o vėliau ir reperfuzija, kurių

žalojantis poveikis tiesiogiai priklauso nuo užspaudimo laiko. Todėl siekiant išsiaiškinti išminio

pažeidimo įtaką inkstams, būtina ištirti inkstų mitochondrijas ir jų funkcinį pajėgumą, nes jos yra

vienos jautriausių išeminiam/reperfuziniam pažeidimui.

Išeminio/reperfuzinio pažeidimo įtaką galima stebėti išmatuojant mitochondrijų kvėpavimo

greitį, kada oksiduojamas pirmojo komplekso substratas glutamatas/malatas. Tai įvertinus galima

spręsti kokią pažaidą inkstų mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai turi išemija/reperfuzija

(6 pav.)

Mitochondriju

kve

pavi

mo g

reitis

pm

olO

/s/m

g b

altym

o

0

50

100

150

200

250

Kontrole

I20/R30

V2 V3 V cyt c V ATR

6 pav. Išeminio/reperfuzinio pažeidimo įtaka glutamato/malato oksidacijos greičiui inkstų

mitochondrijose

24

V2 – Kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje.

V3 – Kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje įdėjus ADP

V Cyt c - kvėpavimo greitis inkstų mitochondrijose įdėjus citochromo c

V ATR - kvėpavimo greitis inkstų mitochondrijose, įdėjus ATP/ADP nešiklio slopiklio

atraktilozido

Gautus rezultatus (6 pav.) po 20 minučių išemijos ir vėliau sekusios 30 minučių reperfuzijos

galima įvertint atskirai.

Antrojoje metabolinėje būsenoje kontrolinių inkstų mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo 67 ±

7 pmolO/s/mg baltymo, o po 20 minučių išemijos ir 30 minučių reperfuzijos kvėpavimo greitis buvo

67 ± 4 pmolO/s/mg baltymo kiekio, todėl galima teigti, kad trumpa išemija/reperfuzija nekeičia (20

min/30 min) reikšmingai kvėpavimo greičio antrojoje metabolinėje būsenoje oksiduojant I kvėpavimo

grandinės komplekso substratus glutamatą + malatą.

Trečiojoje metabolinėje būsenoje inkstų mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo 210 ± 17

pmolO/s/mg baltymo, o po 20 minučių išemijos ir 30 minučių reperfuzijos kvėpavimo greitis buvo 205

± 19 pmolO/s/mg baltymo, todėl galima teigti, kad ir trečioje metabolinėje būsenoje trumpa išemija

reikšmingai mitochondrijų kvėpavimo greičio nekeičia.

Siekiant įvertinti mitochondrijų energetinį aktyvumą (t.y. kaip efektyviai sintezuojama ATP

mitochondrijose), apskaičiuojamas kvėpavimo kontrolės indeksas (7 pav.). Vertinant gautus rezultatus

matyti, kad trumpas išemijos ir reperfuzijos laikas (išemija 20 min, reperfuzija 30 min) reikšmingos

įtakos inkstų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės indeksui neturi (kontrolėje jis lygus 3,34 ± 0,27, po

išemijos 20/reperfuzijos 30 minučių - 3,08 ± 0,34). Taigi trumpa inkstų išemija funkcinei

mitochondrijų būklei, oksiduojant glutamatą/malatą, reikšmingos įtakos neturi.

25

Kvë

pavi

mo k

ontr

olë

s indeksas

0

1

2

3

4

Kontrole

I20/R30

7 pav. Išemijos/reperfuzijos poveikis kvėpavimo kontrolės indeksui inkstų

mitochondrijose.

Išeminio/reperfuzinio pažeidimo metu pažeidžiamos inkstų mitochondrijų membranos, kurios

ima trūkinėti. Šis membranų pažeidimo laipsnis yra tiesiogiai proporcingas žalojančio veiksnio

trukmei. Tad siekiant išsiaiškinti membranų pažaidą po trumpos išemijos, matuojama kvėpavimo

greitis, pridėjus citochromo c.

Citochro

mo c

efe

kta

s

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Kontrole

I20/R30

8 pav. Išemijos/reperfuzijos poveikis citochromo c efektui

26

Įvertinus gautus duomenų rezultatus matyti, kad reikšmingo poveikio citochromo c efektui,

oksiduojant glutamatą/malatą, trumpa išemija/reperfuzija neturi (P = 0.475).

Įvertinus glutamato/malato oksidaciją ir gautus rezultatus, tampa aišku, kad trumpa išemija,

siekianti 20 minučių ir 30 minučių trunkanti reperfuzija reikšmingų pakitimų nelemia. Tačiau svarbu

pažymėti, kad glutamato/malato oksidacijos metu antras inkstų mitochondrijų kvėpavimo kompleksas

nėra aktyvus, todėl norint ištirti išemijos/reperfuzijos poveikį kvėpavimo grandinės aktyvumui reikia

įvertinti mitochondrijų kvėpavimo greitį pridėjus antrojo komplekso substrato – sukcinato.

3.2. Inkstų išemijos ir reperfuzijos įtaka sukcinato oksidacijai

Sukcinatas Krebso cikle yra verčiamas į fumaratą, o reakcijos metu susidaro FADH2, kurį

oksiduoja antrasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas

Mitochondriju

kve

pavi

mo g

reitis

pm

olO

/s/m

g b

altym

o

0

100

200

300

400

500

600

Kontrole

I20/R30

V2 V3 V Cyt c V ATR

9 pav. Išeminio/reperfuzinio pažeidimo įtaka sukcinato oksidacijos greičiui inkstų

mitochondrijose

27

Antrojoje metabolinėje būsenoje inkstų mitochondrijų kvėpavimo greitis po 20 minučių

išemijos ir 30 minučių reperfuzijos reikšmingai padidėjo (P<0,05) 1,47 karto (nuo 153,06 ± 19,99 iki

225,05 ± 17,33), lyginant su kontroline grupe.

Trečiojoje metabolinėje fazėje išaugęs mitochondrijų kvėpavimo greitis nebuvo reikšmingas

(P>0,05).

Citochro

mo c

efe

kta

s

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Kontrole

I20/R30

10 pav. Išemijos/reperfuzijos poveikis citochromo c efektui

Lyginant su kontroline grupe, išemijos/reperfuzijos grupėje citochromo c efektas turėjo

tendenciją didėti, tačiau reikšmingo pokyčio nebuvo.

Vertinant kvėpavimo indekso matavime gautus rezultatus matyti, kad trumpas išemijos ir

reperfuzijos laikas (išemija 20 minučių , reperfuzija 30 minučių) 22 procentais sumažino kvėpavimo

kontrolės indeksą (kontrolė 2,49 ± 0,27, išemija 20/reperfuzija 30 minučių - 1,95 ± 0,18). Taigi, gauti

rezultatai rodo, kad oksiduojant sukcinatą, jau po 20 min. išemijos/30 min. reperfuzijos pastebėjome

vidinės mitochondrijų membranos pažaidą, kas atsispindėjo kvėpavimo kontrolės koeficiento

sumažėjime (11 pav).

28

Kvë

pavi

mo k

ontr

olë

s k

oeficie

nta

s

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Kontrole

I20/R30

11 pav. Išemijos/reperfuzijos poveikis kvėpavimo kontrolės indeksui mitochondrijose.

Pastebima, kad oksiduojant glutamatą/malatą, po trumpos trukmės išemijos ir reperfuzijos,

reikšmingo pažeidimo oksidacinio fosforilinimo sistemai nėra. Oksiduojant sukcinatą jau po 20 min.

išemijos/30 min. reperfuzijos pastebėjome vidinės mitochondrijų membranos pažaidą, kas atsispindėjo

kvėpavimo kontrolės koeficiento sumažėjime.

Siekiant įvertinti minėtos trukmės išemijos/reperfuzijos įtaką atskiriems inkstų mitochondrijų

kvėpavimo grandinės komponentams, buvo tirtas pirmojo komplekso aktyvumas (NADH

dehidrogenazė) ir antro bei trečio komplekso aktyvumas (sukcinato/citochromo c oksidoreduktazė).

3.3. Trumpos išemijos trukmės įtaka I mitochondrijų komplekso

aktyvumui

I kvėpavimo grandinės kompleksas – NADH dehidrogenazė – oksiduoja NADH, kuris

susidaro Krebso ciklo metu.

29

NA

DH

oksid

acija

, µ

mol/m

in/m

g

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Kontrole

I20/R30

12 pav. Trumpos išemijos/reperfuzijos įtaka inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės I

komplekso aktyvumui

Gauti rezultatai rodo, kad net ir po trumpos išemijos/reperfuzijos (I20/R30 min), inkstų

mitochondrijų kvėpavimo grandinės I komplekso gebėjimas oksiduoti NADH patikimai (p<0,05)

sumažėjo. Kontrolinės grupės I komplekso aktyvumas vidutiniškai siekė 11,79 ± 1,61 µmol/min/mg

baltymo, o po 20 minučių išemijos ir 30 reperfuzijos grupės I komplekso aktyvumas siekė tik 7,95 ± 1.

3.4. Trumpos išemijos trukmės įtaka II ir II + III mitochondrijų

kompleksų aktyvumui

II mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, kuris yra

Krebso ciklo fermentas ir katalizuoja sukcinato oksidaciją.

30

DC

PIP

redukcija

, µ

mol/m

in/m

g

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Kontrole

I20/R30

13 pav. Trumpos išemijos/reperfuzijos įtaka inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės

II komplekso aktyvumui

Gauti rezultatai parodo, kad reikšmingos įtakos II komplekso aktyvumui trumpa 20 minučių

trukmės išemija ir 30 minučių trukmės reperfuzija neturėjo. Kontrolinės grupės mitochondrijų II

kvėpavimo komplekso aktyvumas vidutiniškai siekė 0,097 ± 0,02 µmol/min/mg baltymo, o po

trumpos išemijos/reperfuzijos - 0,095 ± 0,018 µmol/min/mg baltymo. Tad reikšmingo pokyčio II

komplekso aktyvumui nėra.

Pagal gautus duomenis galima spręsti, kad reikšmingo II komplekso veiklos susilpnėjimo nėra,

todėl reikalinga tirti II + II komplekso aktyvumą.

II ir III kompleksai susiję, kadangi sukcinato dehidrogenazė oksiduoja sukcinatą, o elektronai

pernešami citochromo kompleksui ir vyksta citochromo c redukcija.

31

Citochro

mo c

redukcija

, µ

mol/m

in/m

g

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Kontrole

I20/R30

14 pav. Trumpos išemijos/reperfuzijos įtaka inkstų mitochondrijų kvėpavimo grandinės

II+III kompleksų aktyvumui

Iš atliktų tyrimų matoma, kad trumpos 20 minučių trukmės išemija ir 30 minučių reperfuzija

reikšmingos įtakos II+III kompleksų aktyvumui neturėjo. Kontrolinių mitochondrijų grupėje

vidutiniškai II + III kompleksų aktyvumas buvo 0,091 ± 0,025 µmol/min/mg baltymo, o trumpos

išemijos/reperfuzijos grupėse vidutiniškai 0,086 ± 0,017 µmol/min/mg baltymo.

3.5. Rezultatų aptarimas

Vertinant atliktus tyrimus ir remiantis mokslininkų sukauptais duomenimis matyti, kad inkstų

išemija ir reperfuzija turi labai didelę įtaką mitochondrijų funkciniam pajėgumui [30]. Dėl šios

priežasties yra labai svarbu apibrėžti tiksliai laiką, kurio metu būtų galima saugiai atlikti išemiją ir po

jos sekančią reperfuziją. Yra atlikta nemažai eksperimentų, siekiant įvertinti skirtingą laiko trukmės

įtaką inkstų mitochondrijoms ir funkciniam pajėgumui bei pačių inkstų funkcijai. Šio darbo tikslas

buvo įvertinti trumpos išemijos (20 min trukmės) ir reperfuzijos (30 min trukmės) įtaką inkstų

mitochondrijų funkcijoms ir pabandant atsakyti ar trumpa išemijos trukmė gali būti saugi, atliekant

urologines operacijas.

Įvertinus šio darbo rezultatus galima teigti, kad net ir trumpa išemija (20 min) ir reperfuzija (30

min) lemia mitochondrijų funkcijų pablogėjimą, kas gali turėti įtakos inkstų funkcinei būklei.

32

Vertinant kvėpavimo greičius antroje bei trečioje metabolinėje būsenoje, oksiduojant pirmojo

komplekso substratą glutamatą/malatą, reikšmingo kvėpavimo greičio sumažėjimo nestebima.

Vertinant kvėpavimo kontrolės koeficiento kitimą, oksiduojant glutamatą/malatą, reikšmingo pokyčio

nestebima. Tačiau lyginant duomenis su jau atliktais tyrimais [39] tampa aišku, kad jau po 30 min

trukmės išemijos atsiranda reikšmingi mitochondrijų kvėpavimo greičio sumažėjimo požymiai. Taip

pat remiantis Japonijos mokslininkų duomenimis [40], kurie nustatė, kad po 15 min išemijos,

oksiduojant glutamatą/malatą, reikšmingo funkcijos pablogėjimo nestebima, galima daryti išvadą, kad

20 minučių išemijos ir 30 minučių reperfuzijos yra ta laiko riba, kurią viršijus atsiranda rizika inkstų

funkcijos pablogėjimui atsirasti ir gali pradėti vystytis negrįžtamas inkstų pakenkimas.

Įvertinus kvėpavimo greičius oksiduojant sukcinatą, galima pastebėti, kad antrojoje

metabolinėje būsenoje inkstų mitochondrijų kvėpavimo greitis po 20 minučių išemijos ir 30 minučių

reperfuzijos reikšmingai padidėjo 1,47 karto (nuo 153,06 ± 19,99 iki 225,05 ± 17,33), lyginant su

kontroline grupe. Lyginant gautus duomenis su literatūroje aprašytais tyrimų rezultatais, kuomet tirta

30 minučių išemija ir 10 minučių reperfuzija, pastebima priešingi rezultatai – antroje metabolinėje

būsenoje kvėpavimo greitis sumažėjo 39% [39]. Ištyrus citochromo c efektą, oksiduojant tiek

glutamatą/malatą, tiek sukcinatą reikšmingo pokyčio nestebėta, nors literatūroje yra duomenų, kad net

ir po 10 minučių trukusios išemijos stebėtas citochromo c efekto padidėjimas, o tai rodo išorinės

mitochondrijų membranos pažaidą ir citochromo c trūkumą [41]. Tačiau vertinant kvėpavimo

kontrolės koeficientą, matyti, kad trumpas išemijos ir reperfuzijos laikas 22 procentais sumažino

kvėpavimo kontrolės indeksą (kontrolė 2,49 ± 0,27, išemija 20/reperfuzija 30 minučių - 1,95 ± 0,18),

kas parodo, kad net ir po trumpo išemijos periodo yra pažeidžiama mitochondrijų membrana.

Įvertinus tirtų kompleksų aktyvumus pastebima, kad I komplekso (SDH) aktyvumas patikimai

kito nuo 11,79 ± 1,61(kontrolinėje grupėje) iki 7,95 ± 1 (trumpos išemijos grupėje). Pirmasis

kompleksas yra jautresnis išemijos poveikiui, jame procesai vyksta maksimaliu pajėgumu ir požymiai

išryškėja greičiau. II + III kompleksų aktyvumui trumpa išemija (20 min) ir reperfuzija (30 min)

reikšmingos įtakos neturėjo. Labai panašius rezultatus aprašė ir Rouslin [42], tiriant širdies

mitochondrijų I ir III kompleksų aktyvumus pastebėjo, kad jau po 20 minučių išemijos stebėtas I

komplekso aktyvumo sumažėjimas, o didinant išemijos trukmę aktyvumas toliau mažėjo.

Literatūroje aprašoma, kad tokį I komplekso aktyvumo sumažėjimą, o II komplekso pokyčio

nebuvimą, galima paaiškinti vykstančiomis kompensacinėmis reakcijomis, kurių metu siekiama

sunaudoti kuo mažiau deguonies, kurio, išeminėmis sąlygomis, ima trūkti [43]. Tokiu atveju, I

33

komplekso aktyvumui sumažėjus jau po ganėtinai trumpo išemijos laiko, II kompleksas ima veikti

didesniu rėžimu ir didėja oksidacinio fosforilinimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje.

Taigi apžvelgiant gautus tyrimo rezultatus matoma, kad operacijų metu sukeltas išeminis

reperfuzinis efektas yra glaudžiai susijęs su mitochondrijų pažaida. Gauti rezultatai patvirtina, kad

mitochondrijų funkcinis sutrikimas stebimas jau po 20 minučių trunkančios išemijos ir po jos 30

minučių trunkančios reperfuzijos. Remiantis literatūros duomenimis, ilginant išemijos trukmę pažaidos

sunkumas didėja. Taigi apibendrinant visą medžiagą galima teigti, kad siekiant išvengti galimos inkstų

mitochondrijų pažaidos ir to pasekmėje išsivysčiusio inkstų negrįžtamo pažeidimo, operacijų metu

sukeliama išemija neturėtų viršyti 20 minučių saugios ribos.

34

4. IŠVADOS

1. Trumpas išemijos/reperfuzijos laikas (išemija 20 min/reperfuzija 30

min) pažeidžia žiurkės inkstų mitochondrijų membraną

2. 20 min išemija ir 30 min reperfuzija slopina I mitochondrijų kvėpavimo

grandinės komplekso aktyvumą.

3. 20 min išemija ir 30 min reperfuzija II + III komplekso aktyvumui

reikšmingos įtakos neturi.

35

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Lote .C.J., Principles of Renal Physiology, DOI 10.1007/978-1-4614-3785-7_2.

2. Biersack H.J., Freeman L.M., Zuckier L.S., Grunwald F., Glomerular Filtration

Function. Clinical Nuclear Medicine 2007; 7: 172.

3. Van der Worp HB, van Gijn J Clinical practice. Acute ischemic stroke. N Engl J Med.

2007; 357:572–9.

4. Serviddio G, Romano A, Gesualdo L, Tamborra R, Palma AM, Rollo T, Altomare E,

Vendemiale G. Postconditioning is an effective strategy to reduce renal

ischaemia/reperfusion injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 2008; 23(5):1504-

1512.

5. Silachev DN, Plotnikov EY, Pevzner IB, Zorova LD, Babenko VA, Zorov SD, Popkov

VA, Jankauskas SS, Zinchenko VP, Sukhikh GT, Zorov DB. The mitochondrion as a

key regulator of ischaemic tolerance and injury. Heart Lung Circ. 2014; 23(10):897-

904.

6. Quinlan CL, Orr AL, Perevoshchikova IV, Treberg JR, Ackrell BA, Brand MD.

Mitochondrial complex II can generate reactive oxygen species at high rates in both the

forward and reverse reactions. J Biol Chem. 2012; 287:27255.

7. Lee JW, Kim H, Choo M, Park YH, Ku JH, Kim HH, Kwak C. Different methods of

hilar clamping during partial nephrectomy: Impact on renal function. Int J Urol. 2014;

21(3):232-6.

8. Claudio E. Ponticelli.The impact of cold ischemia time on renal transplant outcome.

Kidney International 2015; 87(2):272–275.

9. Lanza IR, Nair KS. Mitochondrial function as a determinant of life span. Pflugers

Archiv:European Journal of Physiology 2010; 459, 277-289.

10. Curry RA,Bates B.Sonography– Introduction to Normal Structure and Function, 4th

edition. Elsevier, Philadelphia, USA. 2015; 736p.ISBN10 0323322840 p. 271-274.

11. Česnys G, Tutkuvienė J, Barkus A, Gedrimas VL, Jankauskas R, Rizgelienė R,

Žukienė J.Žmogaus anatomija 1. Vilniaus universiteto l-kla, Vilnius.2008; 658p.UDK

611 ISBN 978-9955-33-361-6, p. 462-470

12. Thibodeau, G.A, Paton kevin, T. The Urinary system. Structure & Function of the

Body. 2012;14(2): 395).

36

13. Munshi R, Hsu C, Himmelfarb J.Advances in understanding ischemic acute kidney

injury. BMC Med. 2011; 9:11.

14. Sutton TA. Alteration of microvascular permeability in acute kidney injury. Microvasc

Res. 2009; 77:4-7.

15. Tábara LC, Poveda J, Martin-Cleary C, Selgas R, Ortiz A, Sanchez-Niño MD.

Mitochondria-targered therapies for acute kidney injury. Expert Rev Mol Med.

2014;16:e13.

16. Reilly RF, Bulger RE, Kriz W.Structural–functional relationships in the kidney,

diseases of the kidney and urinary tract. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia

2007; p. 2–53.

17. Thibodeau, G. .A, Paton kevin, T. The Urinary system. Structure & Function of the

Body. 2015;15(956): ISBN-13: 978-0323341127 p. 413

18. Bogenhagen DF. Mitochondrial DNA nucleoid structure.Biochim Biophys Acta. 2012;

1819:914-920

19. De Pinto V, Messina A, Lane DJ, Lawen A. Voltage-dependent anion-selective channel

(VDAC) in the plasma membrane. FEBS Lett. 2010; 584(9):1793-9

20. Song DH, Park J, Maurer LL, Lu W, Philbert MA, Sastry AM. Biophysical significance

of the inner mitochondrial membrane structure on the electrochemical potential of

mitochondria. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2013; 88(6): 062723.

21. Lee Know ND.Life - The Epic Story of Our Mitochondria– How the original probiotic

dictates your health, illness, ageing, and even life itself. FriesenPress 2014;264p.ISBN-

10: 1460251814. p. 14-19.

22. Moini, J. Cells. Anatomy and Physiology for Health Professionals. 2016;1(387): 52

23. Bernardi P, Rasola A, Forte M, Lippe G.The mitochondrial permeability transition

pore: channel formation by F-ATP synthase, integration in signal transduction, and role

in pathophysiology. Physiol Rev. 2015;95(4):1111-55.

24. Linkermann A, Bräsen JH, Darding M, Jin MK, Sanz AB, Heller JO, De Zen F,

Weinlich R, Ortiz A, Walczak H, Weinberg JM, Green DR, Kunzendorf U, Krautwald

S. Two independent pathways of regulated necrosis mediate ischemia reperfusion

injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110(29):12024-9.

25. Congcong He, Daniel J Klionsky. Regulation Mechanisms and Signaling Pathways of

Autophagy. Annu Rev Genet. 2009; 43:67

37

26. Miglinas M. Inkstų ligos. UAB „Vaistų žinios“, Vilnius. 2003;474p. ISBN 99-55-23-0,

p.14-20.

27. Beiral HJ, Rodrigues-Ferreira C, Fernandes AM, Gonsalez SR, Mortari NC, Takiya

CM, Sorenson MM, Figueiredo-Freitas C, Galina A, Vieyra A. The impact of stem cells

on electron fluxes, proton translocation, and ATP synthesis in kidney mitochondria

after ischemia/reperfusion. Cell Transplant 2014; 23(2):207-20.

28. Salvadori M, Rosso G, Bertoni E. Update on ischemia-reperfusion injury in

kidneytransplantation: Pathogenesis and treatment. World J Transplant 2015;5(2):52-

67.

29. Dare AJ, Bolton EA, Pettigrew GJ, Bradley JA, Saeb-Parsy K, Murphy MP. Protection

against renal ischemia–reperfusion injury in vivo by the mitochondria targeted

antioxidant MitoQ. Redox Biol. 2015; 5:163-168.

30. Lane BR, Babineau DC, Poggio ED, Weight CJ, Larson BT, Gill IS, Novick AC.

Factors predicting renal functional outcome after partial nephrectomy. J Urol. 2008;

180:2363–8, discussion 2368–9.

31. Szeto HH, Liu S, Soong Y, Birk AV. Improving mitochondrial bioenergetics under

ischemic conditions increases warm ischemia tolerance in the kidney. Am J Physiol

Renal Physiol. 2015; 308(1):F11-21.

32. Thompson RH, Lane BR, Lohse CM, Leibovich BC, Fergany A, Frank I, Gill IS, Blute

ML, Campbell SC. Every Minute Counts When the Renal Hilum Is Clamped During

Partial Nephrectomy. Eur Urol. 2010; 58(3):340-5.

33. Thompson RH, Frank I, Lohse CM, Saad IR, Fergany A, Zincke H, Leibovich BC,

Blute ML, Novick AC. The impact of ischemia time during open nephron sparing

surgery on solitary kidneys: a multi-institutional study. The Journal of Urology. 2007;

177(2):471-476.

34. Bhayani SB, Rha KH, Pinto PA, Ong AM, Allaf ME, Trock BJ, Jarrett TW, Kavoussi

LR. Laparoscopic partial nephrectomy: effect of warm ischemia on serum creatinine. J

Urol 2004; 172:1264–6.

35. Ha EE, Frohman MA.Regulation of mitochondrial morphology by lipids, Biofactors.

2014; 40(4): 419–424.

36. Rutter J, Winge DR, Schiffman JD.Succinate dehydrogenase - assembly, regulation and

role in human disease. Mitochondrion 2010; 10:393–401.

38

37. Padmaraj D, Pande R, Miller JH Jr, Wosik J, Zagozdzon-Wosik W. Mitochondrial

membrane studies using umpedance spectroscopy with parallel pH monitoring. PLoS

ONE 2014; 9(7):e101793.

38. Granata S., Gassa A.D., Tomei P., Lupo A., Zaza G. Mitochondria: a new therapeutic

target in chronic kidney disease. Nutrition and Metabolism 2015; (DOI: 10.1186/s1

2986-015-0044-z.

39. Gonzalez-Flecha B, Boveris A. Mitochondrial sites of hydrogen peroxide production in

reperfused rat kidney cortex. Biochim Biophys Acta 1995; 1243(3):361-6.

40. Matsuzaki S, Szweda LI, Humphries KM. Mitochondrial superoxide production and

respiratory activity: biphasic response to ischemic duration. Arch Biochem Biophys.

2009;484(1): 87–93.

41. Hall AM, Rhodes GJ, Sandoval RM, Corridon PR, Molitoris BA.In vivo multiphoton

imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney Int.

2013; 83(1):72-83.

42. Rouslin W. Mitochondrial complexes I, II, III, IV, and V in myocardial ischemia and

autolysis.Am J Physiol. 1983;244(6):H743-8.

43. Lukyanova LD, Kirova YI. Mitochondria-controlled signaling mechanisms of brain

protection in hypoxia. Front Neurosci. 2015; 9:320.