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LEUCOCITOSI
PARAFISIOLOGICHE
E PATOLOGICHE
Raffaela Mazzone
S.S. Ematologia e Coagulazione
Dipartimento di Diagnostica
ASO OIRM Sant’Anna
Torino 11/02/2011
Nostro target : valutazione dei Globuli Bianchi non solo quantitativa, soprattutto qualitativa
MIDOLLO OSSEO
Analisi morfologiche
ANALISI CITOFLUORIMETRICHE
3-GRAN
2-MONO
1-LYMPH
4-BLAST
5-ERY
Analisi citogenetiche..
PHILADELPHIA
1969
….e molecolari
Morfologia normale
Anomalie degli eosinofili e dei monociti
Revue : “Aspect cytologique normal et pathologique du sang chez le nouveau-né et le jeune enfant “
Ann Biol Clin 2006;64(1):17-36
multinuclearità
IPOGRANULARITA’
LEUCOCITOSI NEUTROFILA POLIGLOBULIA INCREMENTO Hb ed Ht MACROCITOSI
RETICOLOCITOSI AUMENTATA
LEUCOCITOSI PARAFISIOLOGICHE : NEONATO NORMALE
Morfologia del neonato normale
Neutrofilia ,eritrocitosi,policromasia
LEUCOCITOSI PARAFISIOLOGICHE : GRAVIDANZA
LEUCOCITOSI NEUTROFILA
Talora presenza in circolo di precursori mieloidi
conteggio WBC
…nella “norma”..
….??!!
Solo allarme morfologico, non alterazioni numeriche : LLA
WBC : 6.68
CCCCCC
Al m.o.linfociti attivati e grandi linfociti
reattivi:10%
Solo allarme morfologico, non alterazioni numeriche :VIROSI EBV
WBC normali LINFOCITOSI modesta LLA
Importanza delle proporzioni tra le popolazioni leucocitarie
Ambulatoriale esterno: febbricola persistente MI
Al m.o.: linfociti attivati e grandi
Linfociti reattivi: 17%
WBC normali no linfocitosi ma flag morfologico : EBV
DEA : FEBBRE
LLA in LEUCOPENIA
NEUTROFILIA > 7.500 /8.000 / mm3
LINFOCITOSI > 9.000 lattanti
> 7.500 bambini
> 4.000 adulti
EOSINOFILIA 500-1.500 lieve –moderata
> 1.500 severa
MONOCITOSI bambini > 1.200
adulti > 1.000
BASOFILIA > 100
#
%
HARRISON
NEUTROFILIA ASSOLUTA mesi 24
INFEZIONE BATTERICA ACUTA
…..DOPO 3 GIORNI POST ANTIBIOTICI
EMOCROMO e F.L.nella norma per l’età
Nel bambino spesso la NEUTROFILIA
si accompagna a PIASTRINOSI reattiva
linfocitosi:>7.500/mm3
BAMBINO VIROSI NON EBV
MESI 19
linfocitosi:> 7.500/mm3
Nel bambino : virosi EBV
Anni 4
Anni 18 ricovero per trauma alle molinette
Conta WBC nella norma ma: linfocitosi assoluta , spiccata neutropenia
Al m.o. : 44 % di blasti di aspetto linfoide : LLA
linfocitosi:> 4.000/mm3 Anni 18
linfocitosi:>4000/mm3
Nell’adulto: disordine linfoproliferativo cronico
adulto
WBC normali LINFOCITOSI modesta LLA
Importanza delle proporzioni tra le popolazioni leucocitarie
WBC normali LINFOCITOSI modesta LLA
Importanza delle proporzioni tra le popolazioni leucocitarie
Definizione
Valori
normali
Eosinofilia
lieve
Eosinofilia
moderata
Eosinofilia
grave
Neonato < 700/mmc 700-1000/mmc 1000-3000/mmc >3000/mmc
Valori
normali
Eosinofilia
lieve
Eosinofilia
moderata
Eosinofilia
grave
Bambino < 350/mmc 350-1500/mmc 1500-5000/mmc > 5000/mmc
Patel L. Acta Paediatr, 1994
Rotenberg ME. Annu Rev Immunol, 2006
EOSINOFILIA E MONOCITOSI RELATIVE e TRANSITORIE
POST CHEMIOTERAPIA
Anni 3 EOSINOFILIA severa transitoria, regredita al controllo dopo 3 settimane
•Unico data anamnestico : antibiotico terapia per una parotite ( ?):
al m.o. linfociti reattivi
SOSPETTA GASTRITE EOSINOFILA
Sospetta forma idiopatica
DIFFICILE DIAGNOSI DI JMML
LEUCOCITOSI con NEUTROFILIA
CRITERIO DI DIAGNOSI PER JMML
splenectomia
MONOCITOSI ASSOLUTA CRITERIO DI DIAGNOSI PER JMML
Mattere caso di Raso Gaia
ASPETTI MORFOLOGICI DI
JMML
PROBLEMATICA DEI VALORI DI RIFERIMENTO
SESSO
ETA’
ETNIA
Condizioni e abitudini di vita
Es.gravidanza, periodo neo e perinatale
IMPORTANZA FONDAMENTALE DI VALORI PRECEDENTI DI QUEL
SINGOLO PAZIENTE
“RIFERIMENTO CON SE STESSI!”
Valori Hb correlati
al peso alla nascita
Valori Hb per etnia
VALORI DI RIFERIMENTO
Linee guida SIMEL 2007
Il laboratorio deve fare diagnosi
Nostri strumenti :
1. Colloquio con il clinico
2. Dati anamnestici sintomi e segni
3. Numeri e flags strumentali
4. Osservazioni della microscopia ottica s.p. midollo
5. Citochimica citofluorimetria citogenetica biologia molecolare
PERCORSO DIAGNOSTICO IN LABORATORIO
CONTAGLOBULI di ultima generazione
•Nella CONTA delle cellule gli strumenti sono estremamente
più ACCURATI e PRECISI dell’uomo
•Nell’ interpretazione, valutazione al m.o. e stesura
del REFERTO l’uomo rimane insostituibile
CONTA WBC
ICEBERG di un fenomeno: in circolo è presente solo una minima parte della popolazione totale !!
STUDI di CINETICA sulla granulocitopoiesi: 4 compartimenti:
– MITOTICO MIDOLLARE
– POSTMITOTICO MIDOLLARE ( maturativo e di deposito o di riserva )
– VASCOLARE o EXTRAMIDOLLARE
– ( PMN circolanti e marginali, adesi all’endotelio)
– TESSUTALE
CONTA WBC : metodi di lettura
strumentali • IMPEDENZIOMETRICO ( corrente
elettrica continua a bassa frequenza: volume cellulare )
– RADIO FREQUENZA ( corrente elettrica alternata ad alta frequenza : caratteristiche interne)
– OTTICO ( luce laser con scatter frontale e laterale )
– SCATTER a FLUORESCENZA (illuminazione in fluorescenza di acidi nucleici.)
– CITOCHIMICA automatizzata mieloperossidasi sudan nero
CONTA WBC : metodi di lettura
Gli strumenti, secondo le varie filosofie analitiche, producono NUMERI analizzati da sofisticati software, espressi in CURVE GAUSSIANE , CITOGRAMMI e SCATTERGRAMMI caratteristici per i diversi tipi cellulari
Da cui definizione di
– Popolazioni normali
– Flags di allarme
N.B.: i contaglobuli nella conta delle cellule sono circa 4 volte più precisi di metodi manuali: azzerano quasi l’errore statistico di campionamento contando circa 10.000 elementi per campione!
CONTA WBC : metodi di lettura
Il MEDICO LABORATORISTA ha una più completa visione del campione rispetto ai dati che arrivano al clinico.
Valuta i MESSAGGI DI ALLARME:
– QUANTITATIVI: >o < ai range di riferimento impostati o della linearità di conta dell’analizzatore
– INTERFERENZIALI: mancata separazione di clusters cellulari normali a causa di cellule patologiche o di altre interferenze
– MORFOLOGICI: allarme per cellule immature o atipiche
Schema Scattergram
Principi e Tecnologie : scatter a fluorescenza
Determinazione finale dell'area di Linfociti, Granulociti, Monociti e Ghost
Analisi dei Cluster
Immature Gran
Blasts/ Atypical Lymph
Left Shift
PLT Clumps
Side Scatter
Flu
ore
sce
nza
Segnalazioni Aree Canale Diff
NRBC
Neutrofili
+
V
O
L
U
M
E
-
- Attività perossidasica + Citochimica
automatizzata
Linfociti
+
V
O
L
U
M
E
-
- Attività perossidasica + Citochimica
automatizzata
Monociti
+
V
O
L
U
M
E
-
- Attività perossidasica +
LUC: linfociti
Atipici/ Blasti
+
V
O
L
U
M
E
-
- Attività perossidasica +
Il referto ematologico
In casi selezionati e filtrati dagli allarmi strumentali da:
un attento esame microscopico!
il processo conclusivo di tutto l’iter diagnostico è
Morfologia strumentale +
morfologia al microscopio ottico
• Camere di Reazione “sporche”
• Campione emolizzato
• Eritroblasti (eritroblastosi)
• Eritrociti lisi-resistenti
• Agglutinati Piastrinici
Citoematologia e Automazione III incontro 6-2-1986 Pitfalls e Pseudopitfalls in citometria
L. Pasini, P. Cappelletti, G. Briani, P. Doretto
False Leucocitosi
V.Rocco Benevento
Sovrastima dei
WBC da
Campione
Emolizzato
È dovuto alla
presenza di
stromi cellulari
che vengono
contati, a causa
della loro
disposizione sui
citogrammi, come
WBC.
Nella maggior parte
dei casi, inficia la
conta dei Monociti e
dei Polimorfonucleati
(sovrastima)
Sangue
Midollare
Sovrastima dei WBC da Eritroblastosi
NRBC
Sovrastima dei
WBC da
Eritroblastosi
N
E
O
N
A
T
O
Eritroblastosi fetale e neonatale Il conteggio dei NRBC può
riflettere l’ entità dell’eritropoiesi inefficace
La conta dei NRBC correla con il benessere
neonatale
Un numero alto di NRBC riflette
la gravità e la durata dell’ IPOSSIA Nicolaides et al, Am J Obstet Gynecol 1989
Phelan JP et al Obstet Gynecol 1998
S.Perrone, G. Buonocore Arch Dis Fetal Neonatal 2004
Entità di RETICOLOCITOSI e di ERITROBLASTOSI:
buon indice prognostico
nella malattia emolitica da Rh,
al contrario di quello osservato nella alloimmunizzazione da Ag Kell
Vaughan et al,1994; Weiner et Widness,1996
FALSE LEUCOCITOSI : ERITROBLASTOSI
FALSA IPERLEUCOCITOSI
ERITROBLASTOSI neonatale
ERITROBLASTOSI neonatale
FALSE LEUCOCITOSI :
Eritroblastosi al m.o.
Spiccata eritroblastosi in
alloimmunizzato anti D a basso titolo
e anti ag privato
AL M.O.: NRBC 300/100 WBC
WBC corretti: 10.82 / mm3
FALSE LEUCOCITOSI : ERITROBLASTOSI
FALSE LEUCOCITOSI : ERITROBLASTOSI in Hb S omozigote
WBC CORRETTI: 13.000
NRBC : 53/100 WBC
Pseudoleucocitosi
(pseudolinfocitosi)
da incompleta lisi
dei Globuli Rossi
NRBC
FALSE LEUCOCITOSI
WBC perox
27.940
WBC Baso
17,400
N 29%
E 1%
L 63%
M 7%
PMN 59%
MN 41%
I casi in cui ricorre questa interferenza sono :
• campioni ad alto contenuto di azoto ureico o bilirubina
• campioni di soggetti in trattamento dialitico
• emoglobinopatie con elevato contenuto di HbF (non
confermato da ricerche mirate)
• campioni di neonati o prematuri
• Hb Hammersmith
• Eritrocitosi
• campioni ad elevato contenuto di emoglobina
• HEMPAS
Agglutinati Piastrinici
Un caso relativamente frequente di sovrastima leucocitaria
incorre in presenza di agglutinati piastrinici.
Le variazioni riguardano:
• Le piastrine che sono fortemente ridotte
• Il numero dei leucociti contati sul canale perox che risulta
falsamente aumentato
FALSE LEUCOCITOSI
Sovrastima
WBC da
Agglutinati
Piastrinici
WBC perox 9.920
Nrbc +
Aggregati +
WBC Baso 8.070 PLT 48.000
Grandi PLT ++
MPV 11.6
PDW 80.6
LEUCOCITOSI spiccata LAM
Campione dal DEA : febbre , linfoadenopatia :MI
Al m.o.:linfociti attivati e grandi
Linfociti reattivi :14%
LEUCOCITOSI LINFOCITOSI EBV
LEUCOCITOSI spiccata
LINFOCITOSI spiccata LLA
d
i
a
CCCCCC
LEUCOCITOSI LINFOCITOSI LLA
RUOLO FONDAMENTALE del MICROSCOPIO OTTICO
SPESSO L’ALLARME STRUMENTALE
“ LINFOCITI ATIPICI” è ASSOCIATO
ALL’ALLARME “ BLASTI”
IL LABORATORIO E’ CHIAMATO
OGNI GIORNO A NUMEROSE
DIAGNOSI DIFFERENZIALI
FRA PATOLOGIE INFETTIVE E
ONCOLOGICHE
Allarme Atipici Attivazione linfocitaria
Bambina, 5 anni. MNI. Igrandi linf.reattivi 10%, mielociti 2% Segni di disgranulocitosi a carico dei neutrofili
Uomo, 27 anni. Epatite. linfociti attivati 4%
Donna, 45 anni. Virosi CMV Linfociti attivati.
Allarme “Blasts?”
LMA Blasti
LA Blasti
AREB Blasti
AREB Disgranulocitosi
• Presenza di “linfociti atipici, attivati,grandi
linfociti reattivi “ in strisci di
• sangue periferico
• Aumento del n.° di linfociti nel sangue
(Linfocitosi) , la monocitosi ci può essere o no
ma non è il marcatore morfologico!
Nelle prime due / tre settimane di malattia
CF: aumento del n.° assoluto dei linfociti T CD8+ DR+ attivi contro il virus e causa dei sintomi
MONONUCLEOSI INFETTIVA
Le vecchie dizioni:
Non dovrebbero più essere usate
m.o. linfociti “ normali”
EBV : diversi aspetti morfologici….
…nello stesso paziente
Aspetti monocitoidi
Eterogeneità morfologica
EBV : diversi aspetti morfologici….
EBV : diversi
aspetti morfologici….
Atipie
nucleo-citoplasmatiche
..un altro caso
…un altro caso
elementi attivati in corso di virosi non EBV
elementi attivati in corso di virosi non EBV
LINFOCITI IN
APOPTOSI
Diagnosi differenziale con linfoblasti: con occhi esperti potrebbe
bastare la morfologia
È l’ “ insieme” che fa fare diagnosi ,quasi mai la singola cellula!
S.P.: piccoli blasti linfoidi
Midollo : monomorfismo cellulare
LLA FAB L1
LLA FAB L2
LLA FAB L2: Linfoblasto attenzione alla singola cellula !
Grande linfocita reattivo
emocromi normali??
DIAGNOSI : LLA
FALSA BASOFILIA
emocromi normali??
DIAGNOSI : LLA e
HCL Aspirato midollare : tappeto di linfoblasti
41 ANNI
GRAVIDANZA 15°
SETT
HAIRY CELL
LEUKEMIA
emocromi normali??
F.I. anni 41 16° settimana di gravidanza : cellula capelluta HCL
…quando tutto si complica!!
WBC :124.000
ATTENZIONE!: MORFOLOGIA DA LMA ,
IMMUNOFENOTIPO due cloni uno CALL e uno PREPRE B
con traslocazione 9-22 ( striscio periferico ) Caso 2
Caso 2
Caso 2
Caso 2
CONCLUSIONI DIAGNOSTICHE caso 2
MORFOLOGIA ( DA DISCUTERE! ) : agoaspirato
midollare : midollo osseo completamente invaso da cellule
leucemiche con 2 popolazioni morfologiche: la più numerosa blasti
di piccole e medie dimensioni riconducibili a serie linfoide
( Perossidasi negativi, PAS positivi), l’altra blasti di grosse
dimensioni ,assai immaturi, con rare granulazioni citoplasmatiche,
(Perox neg, PAS debole pos),compatibili con blasti di natura
mieloide ( quella più rappresentata nel periferico!)
IMMUNOFENOTIPO (DA DISCUTERE! ):
ha evidenziato due cloni: uno CALL pos e
uno pre-preB,con pos del marcatore mieloide CD33
CITOGENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE
Positività per il riarrangiamento BCR-ABL t( 9;22) con
espressione di p190
DIAGNOSI DEFINITIVA :
LEUCEMIA ACUTA LINFOBLASTICA ( FAB L2) Ph+,
con coespressione morfologica e
citofluorimetrica di blasti più immaturi esprimenti marcatori mieloidi
TERAPIA : è stato seguito il protocollo EsPhALL ( protocollo europeo per LLA Ph+)
Fase I induzione + Glivec , Blocchi 1-2-3 + Glivec
TMO allogenico il 9/8/2006 da fratello HLA identico
Ancora attualmente remissione continua anche molecolare ( p190 neg)
BUON USO DEI TEST DI LABORATORIO : EBM
.. .. RA Moore, Evidence –based Medicine Jan/Febr 1998 pp 7-8
Think like a clinician! I asked David Sackett, as physician practicing evidence based medicine ,
what he wanted from evidence-based biochemistry.
Sackett expressed 3 desires:
• to discuss a patient’s illness with a colleague
•To abandon reporting of normal ranges
•To have evidence available to support the validity,
importance and clinical usefulness of
biochemical tests
Grazie per l’attenzione!
New Zealand