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IN VITRO:
esperimenti su colture cellulari
EX VIVO:
esperimenti su cellule
IN VIVO: esperimenti su animali da laboratorio
Co
lture
ce
llula
ri
2
Sperimentazione preclinica (10 anni)
Sperimentazione preclinica in vitro:
vantaggi e svantaggi delle colture cellulari
Sistemi semplificati e
altamente riproducibili
Consentono l’analisi di
meccanismi cellulari e
molecolari
Controllo ambientale
Economicità e rapidità di
risposta
Disponibilità
Sistemi semplificati
rispetto ad un organismo
integrato
Condizioni di esposizione
alle sostanze diverse da
quelle in vivo
Difficoltà di correlare le
concentrazioni in vitro
con quelle in vivo
Le sostanze somministrate
possono interagire con il
terreno di coltura
3
Applicazione delle colture cellulari
Studio di processi intracellulari (sintesi proteica e
meccanismi di traduzione dei segnali)
Studio di citotossicità
Studio del meccanismo di azione dei farmaci
Studio dei meccanismi di interazione cellula-cellula
Studio di anomalie genetiche (analisi del cariotipo)
Biologia molecolare (mappature, transfezioni, analisi di
mutanti, proteine ricombinanti, anticorpi monoclonali)
Studio di processi infettivi virali
Caratterizzazione di tumori
In campo industriale:
studio di effetti farmacologici e tossici di farmaci 4
6
Colture primarie
VANTAGGI
Mantengono le caratteristiche delle
cellule in vivo
SVANTAGGI
numero finito di divisioni (cicli)
senescenza
popolazione eterogenea
isolamento complesso
Co
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ce
llula
ri
7
Colture secondarie: 1. le cellule discendono da colture primarie trasformate o indotte mediante
agenti chimici, fisici o biologici
2. le cellule discendono direttamente dal tessuto di origine:
una volta consumato il terreno di coltura si deve provvedere ad una
subcoltura in nuovo recipiente con terreno fresco
VANTAGGI
Fedeltà del cariotipo
Presentano più cicli cellulari rispetto alle colture
primarie
SVANTAGGI
Possono differenziarsi in altri tipi cellulari
Co
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ce
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ri
Linee cellulari a vita finita
• Numero limitato di cicli in coltura
• Inibizione da contatto
• Forte dipendenza da siero e fattori di crescita
Linee cellulari continue (trasformate)
• Originano da mutazioni di colture primarie
• Si possono ottenere dai tumori
• Poca dipendenza da siero e fattori di crescita
Linee cellulari clonali
• Derivano da una singola cellula (omogenee)
Linee cellulari: subcoltura
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Co
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9
Trasformazione in linea cellulare continua
- trattamento con cancerogeni
- esposizione a virus
- mutazioni spontanee
Cellule trasformate Cellule immortalizzate
- perdono la capacità di regolare la crescita: crescono
continuamente e quindi hanno durata di vita infinita
- perdono alcune caratteristiche che hanno in vivo (mancata espressione di certi geni)
-richiedono meno siero per la crescita
-hanno tempo di raddoppiamento più breve
Co
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10
Co
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1) Coltura primaria: tempo di crescita lento
2) Linea cellulare primaria: maggiore velocità di crescita
3) Linea cellulare secondaria: tempi di crescita progressivamente
più lunghi (sino alla morte)
4) Linea cellulare stabilizzata (immortalizzata)
11 11
1. European Collection of Cell Culture
www.ecacc.org.uk
• AmericanTissueCultureCentre (USA)
www.atcc.org
• National Cell Culture Center (USA)
www.nccc.com
• German Collection of Microorganism and Cell
Culture
www.dsmz.de
• IZS Centro Substrati Cellulari
www.bs.izs.it
• IST Servizio Biotecnologie
www.biotech.ist.unige.it
Co
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ce
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ri
13 13
The CHO-K1 cell line was derived as a subclone from the
parental CHO cell line initiated from a biopsy of an ovary
of an adult Chinese hamster by T. T. Puck in 1957. The
cells require proline in the medium for growth.
ATCC complete growth medium: The base medium for
this cell line is ATCC-formulated F-12K Medium,
Catalog No. 30-2004. To make the complete growth
medium, add the following components to the base
medium: fetal bovine serum to a final concentration of
10%.
Temperature: 37.0°C
Isolation date: 1957
Co
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ri
14 14
Remove and discard culture medium.
Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin-
0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum
which contains trypsin inhibitor.
Add 2.0 to 3.0 ml of Trypsin-EDTA solution to flask and
observe cells under an inverted microscope until cell layer
is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).
Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting
or shaking the flask while waiting for the cells to detach.
Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to
facilitate dispersal.
Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and
aspirate cells by gently pipetting.
Add appropriate aliquots of the cell suspension to new
culture vessels.
Incubate cultures at 37°C.
Co
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ce
llula
ri
1952: George Gey stabilizzò in coltura la prima linea
cellulare tumorale: Carcinoma della cervice uterina
Linea cellulare HeLa derivata da donna di 31 anni,
Henrietta Lack
Il terreno di coltura era fatto di
sangue di pollo, sali speciali e
placente.
15
Co
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ce
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ri
Non tutte le cellule si dividono
Alcune cellule muoiono
Consumo di sostanze nutritive
Accumulo di cataboliti tossici nel terreno
Limitazione di spazio (piastra/fiasca)
Crescita di una linea cellulare in coltura
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Co
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ce
llula
ri
DEVONO ESSERE DILUITE CON TERRENO FRESCO IN
NUOVE PIASTRE/FIASCHE ALTRIMENTI MUOIONO
LA DENSITA’ RAGGIUNTA A PLATEAU DALLE
CELLULE TRASFORMATE E’ PIU’ ALTA DI QUELLA
DELLE CELLULE NORMALI
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Co
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ri
CAPPA A FLUSSO LAMINARE
INCUBATORE
CENTRIFUGA
MICROSCOPIO INVERTITO
MATERIALE per COLTURE CELLULARI
TERRENI DI COLTURA
EQUIPAGGIAMENTO PER CRIOCONSERVAZIONE
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Co
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ce
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ri
•FORNISCE UN LUOGO DI LAVORO
PULITO PER LE COLTURE CELLULARI;
•UNA PROTEZIONE DAGLI AEROSOL
PER L'OPERATORE.
LA PROTEZIONE È ASSICURATA
DALL’USO DI FILTRI DI HEPA (ARIA
POLVERIZZATA DI ALTA EFFICIENZA).
RAGGI UV ACCESI PRIMA E DOPO IL
LAVORO PER STERILIZZARE LA
SUPERFICIE
LA CAPPA A FLUSSO LAMINARE
IL LIVELLO DI CONTENIMENTO DEL FILTRO (QUINDI DI
PROTEZIONE) VARIA A SECONDA DEL CODICE DI CATEGORIA
DELLA CAPPA.
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Co
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ce
llula
ri
L’INCUBATORE
AMBIENTE RIGOROSAMENTE CONTROLLATO PER LO
SVILUPPO DELLE COLTURE CELLULARI.
TEMPERATURA (37°C)
UMIDITA’ (95%)
LIVELLI DI CO2 (5-10%).
PER EVITARE CONTAMINAZIONI DELL’AMBIENTE
INTERNO:
•INCUBATORI RIVESTITI DI RAME (ATTIVITÀ
ANTIMICROBICA DEL RAME);
•LIQUIDI SPECIFICI DI TRATTAMENTO NELLA VASCA
DELL’ACQUA
OCCORRE UNA PULIZIA REGOLARE
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Co
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ce
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ri
PER LORO STESSA NATURA LE
CENTRIFUGHE PRODUCONO GLI
AEROSOL PER CUI È NECESSARIO
MINIMIZZARE QUESTO RISCHIO PER
L’OPERATORE.
COPERCHIO SIGILLATO CON PARTE
TRASPARENTE IN MODO DA POTERE
OSSERVARE LO STATO DEL CARICO
SENZA APRIRE IL COPERCHIO.
EQUILIBRARE LE PROVETTE CON
ATTENZIONE.
LE CELLULE SI CENTRIFUGANO A
1000-1300 RPM PER 5 MINUTI.
PER TOGLIERE RESIDUI CELLULARI A
VELOCITÀ + BASSA (800 RPM).
LA CENTRIFUGA
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Co
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ri
•La luce proviene dall’alto e
l’obiettivo è posizionato in
basso.
•Consente di osservare cellule
poste in una piastra, cosa
impossibile con un normale
microscopio ottico a causa
dello spessore del contenitore.
LE COLTURE CELLULARI VENGONO
VISUALIZZATE
CON MICROSCOPIO OTTICO INVERTITO:
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Co
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ce
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ri
Sistemi di illuminazione del campione:
a trasmissione (o a campo chiaro): LUCE DIRETTA
a diffusione (o a campo scuro): CONTRASTO DI FASE
CONTRASTO DI FASE
LUCE DIRETTA
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Co
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ri
MATERIALE PER COLTURE CELLULARI
•Vetro (riutilizzabile); viene di volta in volta lavato e
sterilizzato.
•Plastica monouso; disponibile in commercio imballato
monouso e sterile
L'uso di materiale in plastica monouso è da preferirsi
per praticità, sicurezza e qualità.
26
Co
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ri
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terreni
reagenti
siero
pH
temperatura
umidita’ relativa
O2 e CO2
Co
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Fabbisogni nutrizionali/fisici
punti critici:
I terreni piu’ usati sono:
MEM (Minimum Essential Medium),
DMEM (Dulbecco’s Modified MEM),
RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
I terreni variano tra loro per composizione salina e
diverso contenuto di elementi nutritivi.
Per linee cellulari piu’ esigenti esistono terreni piu’
ricchi di metaboliti e vitamine:
ISCOVE (con transferrina, lecitina e albumina)
HAM-F12
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Co
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ce
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30
Come si fa a capire il pH del terreno:
•Quando il pH e’ intorno a 7.3 (valore fisiologico) il
colore del terreno e’ rosso-arancio.
A pH acido (6.8-7.0) il colore vira al giallo: con il
proliferare delle cellule il pH del terreno si acidifica
per la produzione di C02 da parte del metabolismo
cellulare: il terreno va cambiato.
A pH basico (> 7.5 - 7.6) il colore vira al rosso-viola:
tale colorazione indica che le cellule non sono
metabolicante attive. 30
Co
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ri
SIERO FETALE BOVINO (FBS)
Il siero di vitello fetale contiene:
•i fattori di crescita;
•i fattori adesivi;
altre sostanze indispensabili per il metabolismo
cellulare:
•albumina, veicolanti lipidi e vitamine liposolubili.
•colesterolo, acidi grassi, glucocorticoidi
•transferrina
•Cu, Zn, Co, Mo, Se, Va: cofattori enzimatici
31
Co
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ce
llula
ri
L’USO DEL SIERO E’
CONTROVERSO
Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità;
Introduce fattori di crescita ed ormoni;
Veicola lipidi, ferro e molecole organiche;
Favorisce interazione fra cellule e substrato;
Contiene inibitori della tripsina;
Possibile tossicità degli anticorpi;
Variabilità da lotto a lotto;
Inibitori metabolici;
Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari;
32
Co
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ce
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Come mantenere una linea cellulare:
la criopreservazione
Conservate in azoto liquido a -196 °C
Le cellule vitali possono essere recuperate
in qualsisi momento Co
lture
ce
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ri
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Metodica per la crioconservazione
1. Raccogliere le cellule in fase logaritmica
2. Determinare il numero delle cellule
3. Centrifugare la sospensione cellulare
4. Risospendere delle cellule nel medium di
congelamento (20% FBS e 10% DMSO)
5. Dividere in criovials
6. Dare inizio al processo di congelamento
Co
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ce
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ri
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Vantaggi
Ridotto rischio di contaminazione
microbica e di cross contaminazione
Si possono utilizzare linee cellulari a ben
precisi passaggi
Riduzione di costi e tempi
Co
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ri
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Procedura di scongelamento
1. Scongelare la vial nel bagnetto a 37°C
2. Pulire l’esterno con alcool assoluto
3. Aprire la vial sotto cappa e trasferire il contenuto in
una falcon sterile contenente 3-5 ml di mezzo
completo
4. Centrifugare 5 min a circa 1000g/min per eliminare
il DMSO
5. Aspirare il sovranatante
6. Risospendere il pellet cellulare in terreno fresco
7. Seminare in nuove piastre
Co
lture
ce
llula
ri
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Batteri
Funghi (Muffe)
Lieviti (Candida)
Micoplasmi
Virus
PRINCIPALI TIPI DI CONTAMINAZIONI
IN COLTURE CELLULARI:
con
tam
inaz
ion
i
40
Batteri (bacilli) ingrandimento 320x
I batteri appaiono come pulviscolo
negli spazi tra le cellule
con
tam
inaz
ion
i
41
Gli antibiotici il più comunemente usati sono:
Penicillina/Streptomicina (usati insieme)
Gentamicina (spesso usata con kanamicina)
Kanamicina (spesso usata con gentamicina)
Ampicillina
Questi antibiotici risultano efficaci sia contro i batteri
gram-positivi che i batteri gram-negativi.
E’ sconsigliato aggiungere a colture contaminate cocktail
di molti antibiotici perché usati insieme possono
provocare un effetto tossico cumulativo sulle cellule.
con
tam
inaz
ion
i
44
I due agenti antimicotici più comunemente usati sono:
anfotericina B (Fungizone). Il Fungizone è in genere molto
tossico nei sistemi di coltura cellulare e dovrebbe essere
usato solo all’effettiva occorrenza (0.2 µg/ml e 2 µ/ml).
mycostatina (Nystatin). Non si tratta di una soluzione ma
di una sospensione colloidale per cui deve essere
mescolata completamente prima di essere aggiunta ai
terreni di coltura (100 U/ml e 250 U/ml)
Nota importante: gli antibiotici ordinariamente usati quali
penicillina/streptomicina, gentamicina e kanamicina non
sono efficaci contro i funghi o le muffe.
con
tam
inaz
ion
i
46
Come combattere il micoplasma
Gentamicina e kanamicina marginalmente
efficaci contro i micoplasmi.
Si preferisce: TIAMULIN
MINOCICLINA
VANCOMICINA
Il modo migliore rimane comunque
l’eliminazione della coltura inquinata!!!
con
tam
inaz
ion
i
COLTURE CELLULARI:
MODALITA’ DI COMPORTAMENTO
1) il laboratorio di colture cellulari deve essere ad uso
esclusivo delle colture
2) usare cappe a flusso laminare sterile, verticale.
3) sostituire periodicamente prefiltri e filtri della cappa.
4) il piano di lavoro deve essere pulito prima di iniziare a
lavorare e dopo aver finito di lavorare con alcool
denaturato.
5) quando gli operatori SONO ASSENTI accendere gli
UV germicidi nel piano di lavoro e nella stanza.
6) tutto il materiale utilizzato, vetro o plastica, soluzioni,
deve essere rigorosamente sterili 47
Co
lture
ce
llula
ri
7) Indossare i guanti.
8) usare un pipettattore elettrico.
9) colture inquinate vanno isolate, incubate con un
disinfettante e quindi autoclavate;
10) sterilizzazione del materiale delle soluzioni:
a secco (2h, 180 °C);
in autoclave (120 °C, 30’);
per filtrazione, con eventuale sistema di
aspirazione.
48
Co
lture
ce
llula
ri
50
Linee cellulari di ratto derivate da intestino tenue fetale o neonatale Caco-2
MODELLI CELLULARI PER LO STUDIO
DELL’ ASSORBIMENTO INTESTINALE
Origine Adenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in
monostrato
Crescita cellule epiteliali in monostrato
Differenziamento 14-21 dopo la confluenza
morfologia Cellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola
apicale
Parametri elettrici Resistenza elettrica elevata
Enzimi digestivi Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell’intestino tenue
Trasporto attivo Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni….
Trasporto ionico di
membrana
Na+,K+ ATPasi, H+,K+ ATPasi, scambiatore Na+,H+,
cotrasportatore Na+,K+, Cl-, canali apicali per Cl-
Trasportatori non ionici di
membrana P-glicoproteina, MRPs, LRP
Recettori Vitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio
(GLUT1,3,5 e SGLT1)
CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2
Origine Adenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in
monostrato
Crescita cellule epiteliali in monostrato
Differenziamento 14-21 dopo la confluenza
morfologia Cellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola
apicale
Parametri elettrici Resistenza elettrica elevata
Enzimi digestivi Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell’intestino tenue
Trasporto attivo Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni….
Trasporto ionico di
membrana
Na+,K+ ATPasi, H+,K+ ATPasi, scambiatore Na+,H+,
cotrasportatore Na+,K+, Cl-, canali apicali per Cl-
Trasportatori non ionici di
membrana P-glicoproteina, MRPs, LRP
Recettori Vitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio
(GLUT1,3,5 e SGLT1)
CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2
STUDI METABOLICI IN VITRO
FRAZIONE EPATICA S9 (supernatante a 9000 giri )
MICROSOMI
EPATOCITI
in sospensione
in coltura
parent compound concentration (before incubation)
% parent compound disappearance
1 −
parent compound concentration (after incubation)
= X 100