LATVIJAS LAUKSAIMNIECĪBAS UNIVERSITĀTE LAUKSAIMNIECĪBAS FAKULTĀTE

Dārzkopības katedra

PŪRES DĀRZKOPĪBAS IZMĒĢINĀJUMU STACIJA

Mag. agr. Līga Lepse

MORFOLOĢISKO KRITĒRIJU UN MOLEKULĀRO MARĶIERU IZMANTOŠANA

GURĶU ŠĶIRNES ‘DINDOŅA ZAĻIE ĶEKARU’ ATJAUNOŠANĀ

USING OF MORPHOLOGICAL CRITERIA AND MOLECULAR MARKERS IN RENEWING

OF CUCUMBER VARIETY ‘DINDOŅA ZAĻIE ĶEKARU’

Promocijas zinātniskā darba kopsavilkums Dr. agr. zinātniskā grāda iegūšanai

Summary of PH. D. Thesis

Jelgava, 2004

Promocijas darbs izstrādāts Pūres Dārzkopības izmēģinājumu stacijā, Čukurovas Universitātes Dārzkopības katedras Biotehnoloģijas laboratorijā (Turcija), LU Bioloģijas institūta Augu ģenētikas laboratorijā. The Thesis is elaborated at the Pūre Horticultural Research Station, the Horticultural Department of Cukurova University in Turkey and in the Laboratory of Plant Genetics of the Institute of Biology, University of Latvia. Darba zinātniskie vadītāji /Thesis scientific supervisors:

Prof., Dr. habil. biol. Īzaks Rašals Prof., Dr. agr. Mirdza Baumane

Darba recenzenti / Reviewers: Dr. agr.

Dr. biol. Edīte Kaufmane Dr. biol. Inese

Promocijas darba aizstāvēšana paredzēta Latvijas Lauksaimniecības universitātes Lauksaimniecības nozares Laukkopības apakšnozares promocijas padomes atklātā sēdē 2004. gada 11. jūnijā plkst. LLU, auditorijā, Lielā ielā 2, Jelgavā

The defence of Thesis in open session of the Promotion Board of Agricultural Sciences will be held on 11 June 2004 at …..a.m. in auditorium..., LUA, Liela str. 2, Jelgava

Ar promocijas darbu var iepazīties LLU Fundamentālajā bibliotēkā, Jelgavā, Lielā ielā 2.

The Thesis is available at the Fundamental Library of the Latvia University of Agriculture, Liela str. 2, Jelgava

Atauksmes lūdzu sūtīt Lauksaimniecības zinātņu Laukkopības apakšnozares

promocijas padomes sekretārei Dr. agr. Maijai Ausmanei, Lielā ielā 2, Jelgavā, LV –3001, fakss: +371 3027238.

References please send to Dr. agr. Maija Ausmane, Lielā str. 2, Jelgava, LV –3001, Latvia, fax: +371 3027238.

SATURS / CONTENT SATURS / CONTENT 3 IEVADS 4 IZMĒĢINĀJUMU MATERIĀLS UN METODES 6

Gurķu šķirnes ‘Dindoņa Zaļie Ķekaru’ inbredlīniju un ģimeņu iegūšana 6 Izmēģinājumu iekārtojums fenotipisko parametru uzskaitei 7 Molekulārajās analīzēs izmantotais materiāls un metodes 9 Genotipu salīdzinājumā iegūto rezultātu matemātiskā apstrāde 10

IZMĒĢINĀJUMU REZULTĀTI UN TO ANLĪZE 11 Izdalīto inbredlīniju un ģimeņu fenotipiskais vērtējums 11

Auga fenoloģiskās pazīmes 12 Auga morfoloģiskās pazīmes 12 Augļa morfoloģiskās pazīmes 13 Genotipu izvērtējums pēc ražības 17

Izdalīto līniju un ģimeņu novērtējums ar molekulāraiem marķieriem 17 Genotipu homogenitātes novērtējums 18 Izdalīto genotipu daudzdimensionālā analīze 22

SECINĀJUMI 25 PATEICĪBA 27 INTRODUCTION 28 MATERIALS AND METHODS 29

Creating of inbredlines 29 Creating of sib-lines 30 Evaluation of phonological, morphological and yield parameters 30 Analyse of molecular markers (RAPD) 32 Mathematic analyse of results 32 Molecular data analysis 32

RESULTS 33 Evaluation of lines in field conditions 33

Morphological traits of plants 33 Fruit morphological traits 34 Yield parameters 35

Lines evaluation by using molecular markers 35 Evaluation of allelic polymorphism 35 Evaluation of lines homogeneity 35

Multidimensional analysis of genotypes 36 Accessions for the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants 37

CONCLUSIONS 37 ACKNOWLEDGEMENTS 38 Zinātnisko publikāciju saraksts / Scientific publications 39

IEVADS

Tēmas aktualitāte Pašreizējā laikmetā pasaulē aizvien lielāka vērība tiek pievērsta augu

ģenētisko resursu uzglabāšanai ex situ. Tas saistīts ar lieliem ieguldījumiem, kas nepieciešami ģenētisko daudzveidību reprezentējošu kolekciju izveidei. Pēdējos gados ir kļuvusi aktuāla paraugu atlases problēma. Kolekcijai ir pilnīgi jāpārstāv pašreiz pieejamā ģenētiskā daudzveidība, paraugiem jābūt viendabīgiem, izlīdzinātiem, savstarpēji nedublējoties, bet arī nezaudējot kādu no ģenētiski atšķirīgiem genotipiem (Hamon et. al, 1995; Swaminathan, 1997). Ir svarīgi saglabāt pēc iespējas plašāku ģenētisko resursu klāstu, tajā skaitā arī sen audzēto (tradicionālo) šķirņu (landraces) un savvaļas augu ģenētiskos resursus, kas nākotnē nodrošinātu iespējas iekļaut tos selekcijas programmās.

Augu ģenētisko resursu apzināšana un paraugu izvērtēšanas kritēriju izstrāde Latvijā uzsākta 1993. gadā. 1997. gadā, izveidojot Latvijas Kultūraugu gēnu banku, pieņemti augu ģenētisko resursu kolekciju izveides kritēriji. Vadoties pēc tiem, veikta paraugu izvērtēšana un atlase kolekcijai. Latvijas Kultūraugu gēnu bankas uzdevums dārzeņu, tāpat kā citu kultūraugu, jomā ir Latvijas izcelsmes ģenētisko resursu saglabāšana (Rashal and Weibull, 1997). Tajā skaitā ietilpst arī četras līdz šim saglabājušās gurķu šķirnes.

Vairāku gadu desmitu audzēšanas laikā Latvijā masu izlases ceļā izveidotas vietējās, tautas selekcijas, kā arī selekcionāru radītas gurķu šķirnes. Iespējams, ka Latvijas izcelsmes gurķu paraugi satur vērtīgus gēnus, piemēram, kas nosaka izturību pret zemām temperatūrām, jo Latvija atrodas tuvu gurķu audzēšanas ziemeļu robežai. Tādēļ Latvijas izcelsmes gurķu ģenētisko resursu daudzveidības izvērtējums un ievietošana gēnu bankā ir nozīmīgs uzdevums.

Darba problemātika

Veicot gurķu ģenētisko resursu apzināšanu un izpēti Pūres dārzkopības izmēģinājumu stacijā, 1994. gadā konstatēts, ka tikai 3% augu, izaudzētu no komerciāli izplatītām šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' sēklām, atbilst šķirnes morfoloģiskajam aprakstam. Ar mērķi homozigotizēt tajā laikā pieejamo un morfoloģiski daudzveidīgo šīs šķirnes populāciju uzsākta inbredizācija, sadalot to atsevišķās līnijās. 1997. gadā paralēli inbredizācijai, veicot kontrolētu tuvradniecisko krustošanu ģimeņu robežās, uzsākta labāko formu ģimeņu izlase.

Izveidoto genotipu homogenitātes un atbilstības šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' izvērtējums ik gadu veikts pēc fenoloģiskajām, morfoloģiskajām un ražas pazīmēm. Tomēr gēnu savstarpējā mijiedarbība un vides – genotipa ietekme apgrūtina ģenētiskās daudzveidības identificēšanu paraugos. Līdz ar to pastāv iespēja kļūdīties, nosakot genotipu pēc fenotipa. Lai gūtu pārliecinošus rezultātus, nepieciešama molekulāro marķieru analīze.

Viens no optimālākajiem risinājumiem ģenētiskās daudzveidības noteikšanai paraugos ar mazu ģenētisko atšķirību (radniecīgas izcelsmes vecākaugu krustojumi) ir RAPD molekulārie marķieri. Tāpēc šī metode tika izvēlēta izveidoto genotipu izvērtēšanai.

Ņemot vērā gurķu šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' pieejamā sēklas materiāla heterogenitāti, izvirzīts darba mērķis – sadalīt šķirni ģenētiski atšķirīgos genotipos; atlasīt homogēnākās, oriģinālajam šķirnes aprakstam atbilstošākās līnijas un ģimenes, kuras būtu ievietojamas Latvijas Kultūraugu gēnu bankā kā arī izmantojamas šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' sēklaudzēšanā.

Izvirzītā mērķa sasniegšanai uzstādīti vairāki darba uzdevumi: • izveidot inbredlīnijas un tuvradniecīgu krustojumu ģimenes; • pēc morfoloģiskajiem, fenoloģiskajiem un ražas parametriem izvērtēt to

atbilstību šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'; • noteikt līniju homogenitāti izmantojot morfoloģiskos un molekulāros

marķierus. Darbs izstrādāts Pūres Dārzkopības izmēģinājumu stacijā 1994. - 2001. gados.

Molekulāro marķieru analīzes pirmā sērija veikta Čukurovas Universitātes Dārzkopības katedras Biotehnoloģijas laboratorijā (Turcija) 1999. / 2000. gadā NATO zinātnes atbalsta granta ietvaros, kas finansēts no Turcijas Zinātņu padomes (TÜBITAK) līdzekļiem. Otrā molekulāro analīžu sērija veikta LU Bioloģijas institūta Augu ģenētikas laboratorijā 2000. / 2001. gadā.

Darba zinātniskā jaunrade: izveidotas gurķu šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' inbredlīnijas un ģimenes, kuras ir samērā homogēnas un atbilst šķirnes aprakstam; 5 genotipi ievietoti Latvijas Kultūraugu gēnu bankā; inbredizācijas un ģimeņu izlases gaitā noskaidrota pētītā materiāla fenotipisko pazīmju stabilitāte; modificētas esošās DNS izdalīšanas metodes no lapām, pielāgojot tās vietējām materiāli-tehniskajām iespējām; pilnveidota DNS izdalīšanas metode no gurķu sēklām; noteikti polimorfie praimeri, kas izmēģinājumā iekļautajam augu materiālam dod amplifikācijas produktu.

IZMĒĢINĀJUMU MATERIĀLS UN METODES

Gurķu šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' inbredlīniju un ģimeņu iegūšana 1994. gadā pirmās inbredās paaudzes (I1) īpatņu ieguvei kā izejmateriāls

izmantoti gurķu šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' augi, kuri iegūti no tirdzniecībā pieejamām firmas "Kurzemes Sēklas" izplatītām sēklām, un kuriem konstatētas šķirnes aprakstam atbilstošas pazīmes.

Inbredlīniju izveidošana 1994. gadā galvenie augu atlases kritēriji bija augļa pazīmes: forma, krāsa,

mizas virsma, zīmējums, dzeloņu krāsa. Augšanas apstākļi nodrošināti atbilstoši gurķu agroekoloģiskajām prasībām.

I1 paaudzes līnijas iegūtas, astoņiem šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' atbilstīgākajiem augiem veicot piespiedu pašapputi (inbrīdingu).

1995. gadā inbredizācija turpināta astoņām līnijām, kuras iegūtas no 1994. gadā atlasītajiem augiem. Iegūtas astoņas I2 paaudzes inbredlīnijas (A I2, B I2, C I2, D I2, E I2, F I2, G I2, H I2). Katras līnijas robežās visu sēklinieku sēklas tika apvienotas kopējā paraugā.

1996. gadā inbredizācijas darbs netika veikts. 1997. gadā inbredizācija turpināta ar četrām līnijām (C I2, D I2, G I2, H I2).

Piespiedu pašappute veikta vairākiem augiem līnijā, tādējādi izveidojot kopskaitā astoņas I3 paaudzes sublīnijas, kurām doti jauni apzīmējumi:

I3 paaudzes līniju apzīmējumi Līniju izcelsme 1 I3 D I22 I3 D I23 I3 G I24 I3 H I25 I3 H I26 I3 H I27 I3 H I28 I3 H I2

1998. gadā I4 paaudze iegūta no augiem, kuri izstādīti atklātā laukā, līnijas

morfoloģisko, fenoloģisko un ražības parametru izvērtēšanai. Uzsākta līniju dalīšana sublīnijās, t.i. katrā līnijā sēklas ievāktas no atsevišķiem augiem, neapvienojot līnijas robežās kopīgā paraugā.

1999. gadā I5 paaudzes sēklas no atsevišķiem augiem netika apvienotas. Iegūtas 44 sublīnijas.

2000. gadā iegūtas 127 I6 paaudzes sublīnijas. No sešās inbredizācijas paaudzēs iegūtām 127 sublīnijām izlīdzinātības un

savstarpējās atšķirības noteikšanai atlasītas septiņas, pēc galvenajiem parametriem šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' atbilstošākās inbredlīnijas.

Ģimeņu izveidošana Gurķu šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' tuvradniecīgo ģimeņu izveide uzsākta

1997. gadā. Gurķi stādīti ar dēstiem, kuri izaudzēti no 1996. gadā nekontrolētā apputē iegūto tipisko augu sēklu sajaukuma. Tā kā tikai 10 augiem konstatētas šķirnei `Dindoņa Zaļie Ķekaru` tipiskas pazīmes, tad šie 10 augi kļuva par ģimeņu izejmateriālu.

1998. gadā atklātā laukā atsevišķos lauciņos izstādīti no 1997. gada desmit atlasīto augu sēklām izaudzētie dēsti. Veģetācijas periodā atlasīti augi, kuriem konstatētas šķirnei `Dindoņa Zaļie Ķekaru` tipiskas pazīmes. Galvenie atlases kritēriji – augļu morfoloģiskie parametri: augļu izvietojums uz auga (ķekarainība), augļu virsma, mizas krāsa, zīmējums un dzeloņu krāsa. Atlasītajiem augiem veikta savstarpēja apputeksnēšana ģimenes robežās, pielietojot marles izolatorus.

Nākamās paaudzes iegūtas, izsējot ģimeņu robežās apvienoto tipisko augu sēklas. 1998. gadā turpmākai izlasei atstātas sešas tipiskākās ģimenes.

1999. gadā izslēgta 3. ģimene, no 11. ģimenes atdalīta 11z ģimene un 21. ģimene tika sadalīta trīs subģimenēs: 21(3)z, 21(3)t un 21(3)IV, līdz ar to kopskaitā izveidotas deviņas ģimenes. Šo deviņu ģimeņu fenoloģisko, morfoloģisko un ražas parametru izvērtējums veikts 2000. gadā.

Izmēģinājumu iekārtojums fenotipisko parametru uzskaitei

Inbredlīniju fenoloģisko fāžu, morfoloģisko pazīmju un ražas izvērtējums veikts līdz I5 paaudzei, bet ģimenes vērtētas līdz S3 paaudzei. Izmēģinājumi veikti atbilstoši lauka izmēģinājumu metodikai.

2000. gadā salīdzinājumam izmēģinājumā iekļauta šķirne 'Dindoņa Zaļie Ķekaru', kura audzēta no neizlīdzināta sēklas materiāla.

Uzskaites elementi genotipu fenoloģisko, morfoloģisko un ražas

parametru noteikšanai F e n o l oģ i s k ā s f ā z e s katrai paaudzei fiksētas visā veģetācijas periodā.

Izmēģinājumos atzīmēts dienu skaits no sējas līdz sadīgšanai, auga attīstības tempu raksturojošas pazīmes – lapu skaits stādīšanas laikā, vīrišķo un sievišķo ziedu izplaukšanas laiks 10 un 75 % augu, kā arī ražošanas perioda sākums un ilgums. Izmēģinājumā noteikts arī veģetācijas perioda garums, t.i. dienu skaits no sējas līdz augļu novākšanas gatavībai. Fenoloģisko fāžu novērojumi veikti katra genotipa robežās, neizdalot pa atkārtojumiem.

M o r f o l o ģ i s k o p a z īm j u izvērtēšanai lietota 4 ballu skala. Ar 3 ballēm novērtēti augi, kuriem konkrētā pazīme atbilst šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' aprakstā minētajai. Ar 2 ballēm – augi, kuriem konkrētā pazīme tikai nedaudz atšķiras, ar 1 balli – stipri atšķirīga un 0 balli – augi, kuriem konkrētā pazīme pilnīgi netipiska gurķu šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' (1. tabula).

Pirmo divu inbredlīniju paaudžu sēklas līnijas robežās apvienotas, līdz ar to morfoloģiskās pazīmes uzskaitītas līnijas vidējam paraugam. Sākot ar I3 paaudzi

sēklas sētas no katra auga atsevišķi (izdalītas sublīnijas) un arī katrs izmēģinājumā iekļautais augs izvērtēts atsevišķi. Ģimenēs no S1 paaudzes katrs augs izvērtēts atsevišķi. Tātad pēdējās trīs paaudzēs auga ziedēšanas tips un zarošanās, augļu izvietojums uz auga (ķekarainība), krāsa, virsmas kārpainība un virsmas apmatojuma krāsa noteiktas katram līnijas un ģimenes augam atsevišķi. Savukārt augļu forma, to šķērsgriezuma forma, sēklu ligzdas diametrs, zīmējums, kā arī augļu garšas vērtējums noteikts vidējam paraugam (5 augļiem no genotipa).

1.tabula Morfoloģisko pazīmju vērtējuma skala

Bal les Paz īme

0 1 2 3 Auga

zarojums krūmveida

forma galvenā

vasa 0.5 – 0.7 m

gara

galvenā vasa

0.7 – 1.15 m gara

galvenā vasa virs

1 .15 m

Ķekarain ība 1 augl is vasas

mezglā

2 aug ļ i vasas

mezglā

3 aug ļ i vasas

mezglā

4 un vairāk aug ļ i

mezglā Aug ļa

z īmē jums iz teik ts

punktē jums visam augl im

sv ī t ras un punktē jums visa aug ļa

garumā

vā j i iz te ik ts

sv ī t rojums un

punktē jums

izteik tas sv ī t ras

1 /3 - 1 /2 aug ļa

garuma Aug ļu krāsa

gaiš i za ļa, ar

sp īdumu

gaiš i za ļa za ļa tumši za ļa

Apmatojuma t ips

augl is g luds

v ienkāršs jaukts sa l ikts

Dzeloņu krāsa

melna brūna dzel tena bal ta

Virsmas kārpain ība

kārpas s īkas, b l īvas

g luda virsma

kārpas rupjas , re tas

kārpas rupjas , v idē j i b l īvas

Kopējā atbilstība šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' uz lauka noteikta vizuāli,

ņemot vērā visu šķirni raksturojošo pazīmju kopējo izpausmi. Degustācijā vērtēts augļu izskats un garšas īpašības.

R a ž a s u z s k a i t e veikta visu ražošanas laiku. Augļi vākti divas reizes nedēļā. Fiksēts 1. šķiras un nestandarta produkcijas apjoms, izsverot ražu no katra varianta un atkārtojuma.

Molekulārajās analīzēs izmantotais materiāls un metodes

Molekulārās analīzes veiktas divās sērijās: Pirmā sērija – DNS izdalīta no 4 – 6 vienas līnijas augu zaļajām lapām

kopējā paraugā. Izvērtētas septiņas I5 paaudzes inbredlīnijas (2I5 inbredlīnijai analizētas divas sublīnijas) un deviņas S3 paaudzes ģimenes. Ģenētiskās distances samērojamības noteikšanai analīzēs tika iekļauta arī pēc izcelsmes attāla šķirne ‘Grīvas’.

Otrā sērija - DNS izdalīta no 4 – 6 vienas līnijas sēklām, turpmāk analizējot DNS no katras sēklas atsevišķi. Izvērtēti septiņu I6 paaudzes inbredlīniju, septiņu S4 paaudzes ģimeņu, kā arī nekontrolētā apputē iegūtās gurķu šķirnes ‘Dindoņa Zaļie Ķekaru’ augi.

Abām analīžu sērijām pilnveidota DNS izdalīšanas metode. Pirmā analīžu sērija veikta Čukurovas Universitātes (Adana) Dārzkopības katedras Biotehnoloģijas laboratorijā Turcijā. Otrā analīžu sērija veikta LU Bioloģijas institūta (Salaspils) Augu ģenētikas laboratorijā.

DNS izdalīšana no zaļajām lapām (pirmā analīžu sērija) DNS izdalīšnai ņemti lapu paraugi no otrās – trešās lapas, sajaukti kopā no

katra genotipa četriem augiem. Kopējais lapu parauga svars no līnijas vai ģimenes 2 – 3 grami. Paraugs sasmalcināts šķidrā slāpekļa vidē. Turpmāk DNS ekstrakcija veikta pēc standarta protokola (Dellaporta, et. al., 1983).

DNS izdalīšana no atsevišķām sēklām (otrā analīžu sērija) DNS tika izdalīta no katra genotipa 6 sēklām atsevišķi un RAPD analīzes

veiktas a tsevišķ iem augiem. Protokols DNS izolēšanai no sēklām sastādīts, piemērojot protokolu miežu DNS izdalīšanai no sēklām (Roder et. al., 1998), to nedaudz modificējot. DNS izolēta no sasmalcināta sēklas dīgļa.

Saskaņā ar modificētu "Master mix" recepti (Staub et.al., 1996), visiem paraugiem tika sagatavots reakcijas maisījums 1.5 ml ependorfa stobriņā (2. tab.).

PCR produkta elektroforēze veikta 2% (pirmajā sērijā) un 1% (otrajā sērijā) agarozes gelā, 3 h (pirmajā sērijā) un 1 h (otrajā sērijā) laikā. DNS joslu vizualizēšanai izmantots etīdija bromīds: DNS joslas luminiscē UV gaismā. Rezultāti tika fiksēti fotografējot ar "Polaroid" kameru (pirmajā sērijā) vai ar digitālo kameru (otrajā sērijā).

2. tabula Table 2

PCR reakcijas sastāvs PCR reaction composition

Komponents/

Component Izejvielas koncentrācija/

Stock solution Tilpums vienai reakcijai/ One reaction volume (µl)

pirmā sērija 1st series

otrā sērija 2nd series

pirmā sērija 1st series

otrā sērija 2nd series

H2O – – 7.5 12.5 10x Buferis/ Buffer

10x 10x 2.5 2.5

MgCl2 25mM 25 mM 2.0 2.0 dNTPs 0.2mM 0.2 m M 2.0 2.0 Praimeris / Primer

20ng 20 ng 1.0 1.0

Taq polimerāze/ polimerase

5u/µl 5 u/µl 0.125 0.125

Kopā / Total – – 15 20 DNS paraugs / Template

2ng 1 ng 10 5

Kopā reakcijai/ Total for reaction

– – 25 25

Genotipu salīdzinājumā iegūto rezultātu matemātiskā apstrāde

Fenoloģisko, morfoloģisko un ražas datu apstrāde Fenoloģisko novērojumu datu analīze katram genotipam veikta visās

paaudzēs, apkopojot konkrētos parametrus. Līniju un ģimeņu salīdzinājumam pēc pazīmēm, kuras iespējams noteikt

atklātā laukā augošiem individuāliem augiem (auga kopējā atbilstība šķirnei, ķekarainība, augļa mizas krāsa, augļa kārpainība, augļa dzeloņu krāsa), izmantota dispersijas analīze. Visiem genotipiem katrā paaudzē aprēķināts procentuālais augu sadalījums pēc to vērtējuma ballēs. Tas raksturo līnijas vai ģimenes homogenitāti pēc konkrētās morfoloģiskās pazīmes, kā arī pazīmes izmaiņas vai stabilitāti vairākās paaudzēs. Genotipu grupējums pēc morfoloģiskajām pazīmēm veikts ar klāsterizācijas metodi, izmantojot augu vērtējumu ballēs.

Ražas rādītāju analīzei izmantota dispersijas analīze. Atšķirība starp genotipiem novērtēta ar robežstarpību, lietojot Stjūdenta kritēriju.

Molekulāro analīžu datu apstrāde Fotoattēlā vai datora failā fiksētie gela attēli pārvērsti skaitliskā izteiksmē.

Viena bāžu pāru garuma (smaguma) DNS joslas uzskatāmas par lokusu ar "+" (ja josla gēlā ir) vai "–" (ja attiecīgās joslas gēlā nav) aleli. DNS fragmentu izvietojums gelā tika atzīmēts tabulā, kurā "+" alele ierakstīta kā 1, bet "–" alele kā 0. Šī tabula izmantota parpamatu turpmākai ģenētiskajai analīzei.

Ģenētiskās līdzības koeficients aprēķināts, izmantojot NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) (Rohlf, 1998) un EXCEL datorprogrammas. Tas rēķināts pēc Nei un Lī vienādojuma (1) (Nei and Li, 1979):

Sij = 2Nij / Ni + Nj, (1)

kur Sij – ģenētiskās līdzības koeficients starp i un j paraugiem

Nij – i un j paraugu kopīgo aleļu skaits Ni – i parauga alleļu skaits Nj – j parauga alleļu skaits.

Pēc šīs formulas iegūta matrica ar līdzības koeficientiem starp visu paraugu

iespējamiem pāriem. Genotipu un praimeru polimorfisma raksturošanai izmantots heterogenitātes

indekss HI (2). Tas ir lielums, kurš raksturo polimorfisma pakāpi konkrētos lokusos (Nei, 1973).

HI = (1- ∑ pi2 ), (2)

kur pi – katras aleles frekvence katrā lokusā Genotipu grupēšana pēc to ģenētiskās tuvības tika veikta ar klāsterizācijas

palīdzību. Pēc molekulāro analīžu rezultātiem līnijas grupētas, izmantojot līdzības koeficienta matricu. Abās sērijās klāsteri veidoti pēc UPGMA metodes (unweighted pair-group method of arithmetic average – nesvērtā pāru grupēšana pēc aritmētiskā vidējā).

IZMĒĢINĀJUMU REZULTĀTI UN TO ANALĪZE

Izdalīto inbredlīniju un ģimeņu fenotipiskais vērtējums

Lauka izmēģinājumā reģistrēto pazīmju vērtēšanas mērķis – noteikt genotipu izlīdzinātību un atbilstību šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' oriģinālajam aprakstam. Genotipu vērtēšanas gaitā noskaidrotas pazīmju izpausmes izmaiņas izlases laikā. Izdalīto genotipu fenotipisko pazīmju vērtējums veikts atklātā laukā, jo šķirne 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' pieder pie lauka gurķu grupas. Analizētas 8 inbredlīniju un 8 ģimeņu izlīdzinātība un savstarpējā atšķirība. Morfoloģisko

pazīmju vērtējums izteikts ballēs pēc pazīmju vidējā vērtējuma (3. tabula) kā arī pēc tipisko augu īpatsvara dinamikas pa gadiem (1. att.).

Auga fenoloģiskās pazīmes. Apkopojot datus par pārbaudīto genotipu fenoloģiskajām pazīmēm, redzams, ka tie vides apstākļu ietekmē uzrādīja augstu mainību: gados ar augšanai un attīstībai nelabvēlīgiem apstākļiem atšķirības starp genotipiem bija mazāk izteiktas, nekā gados ar labvēlīgiem augšanas apstākļiem. Tomēr kādas likumsakarīgas tendences genotipu fenoloģiskajā vērtējumā netika konstatētas. Izmēģinājuma gaitā novērota nenoliedzami spēcīga vides un genotipa mijiedarbība. Tā īpaši izpaudās fenoloģisko pazīmju rādītājiem.

Auga morfoloģiskās pazīmes. Zarošanās un vasas garums ir tās divas pazīmes, pēc kurām līnijas

un ģimenes bija izlīdzinātas jau sākotnēji. Turpinot inbredizāciju kā arī tuvradniecisku krustošanu ģimeņu robežās, netipiski augi praktiski neizskaldījās. Visām izmēģinājumā salīdzinātajām līnijām un ģimenēm auga garums neatšķīrās no šķirnei tipiskā. Līdz ar to genotipi pēc šīs pazīmes uzskatāmi par izlīdzinātiem. Galvenās vasas garumu gurķiem nosaka dominantais gēns T. Iespējams, ka tieši šī gēna esamība salīdzināmo līniju un ģimeņu genomā nosaka šīs īpašības noturību.

Ziedēšanas t ips visām līnijām un visās paaudzēs reģistrēts vienāds − pārsvarā vīrišķais. Tātad inbredīnijas un ģimenes arī pēc šī rādītāja bija izlīdzinātas un savstarpēji neatšķīrās. Tas skaidrojums ar to, ka visi šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' vecākaugi ('Muromskij', 'Borovskij' un 'Kūlenkampa') ir pārsvarā vīrišķā ziedēšanas tipa. Tāpēc iespējams, ka vīrišķo ziedēšanu noteicošā alēle a (recesīvā) ir homozigotiskā stāvoklī.

Ķ e k a r a i n īb a , atšķirībā no divām iepriekš analizētajām pazīmēm, kā pa gadiem, tā arī starp genotipiem (inbredlīnijām un ģimenēm) ir būtiski variējusi. Šī pazīme ir viena no šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' raksturīgākajām. Pēc šīs pazīmes izmēģinājuma gaitā panākts krass genotipu uzlabojums. Īpaši strauja augu skaldīšanās pēc šīs pazīmes genotipos novērota I3 un I4 paaudzēs, kā arī S2 un S3 paaudzēs. Augstāko novērtējumu ballēs pēc šīs pazīmes visās trijās paaudzēs uzrādīja 2. inbredlīnija un 3. inbredlīnija − divās paaudzēs (3. tabula). Pēc procentuālā sadalījuma lielāko tipisko augu īpatsvaru uzrādīja 2 I4 un 3 I4 inbredlīnijas (1. att). Novērots arī, ka ķekarainības izpausmē liela nozīme ir selekcijas metodei. Ja inbredlīnijās bija vērojama augsta ķekarainības mainība gan starp līnijām, gan starp augiem līnijās, gan arī pa paaudzēm, tad ģimenēs bija vērojama nedaudz savādāka aina. Salīdzinot ģimenes savstarpēji, būtiskas atšķirības ķekarainības vērtējumā bija vērojamas tikai divās pēdējās paaudzēs, bet analizējot pa visiem gadiem kopā, būtiskas atšķirības starp ģimenēm nav konstatētas 95 % ticamības robežās. Straujā ķekaros augošo augu īpatsvara palielināšanās genotipos (1. att.) skaidrojama ar to, ka līniju un ģimeņu izveidei augi tika atlasīti galvenokārt pēc šīs pazīmes.

Literatūrā minēts, ka sievišķo ziedu attīstību ķekaros nosaka dominantā alēle Mp-2, bet tai ir vairāki modificētājgēni. Var pieņemt, ka inbredizācijas un

izlases gaitā eliminēti augi ar recesīvo alēli homozigotiskā stāvoklī, kas nosaka vienu sievišķo ziedu posmā. Iespējams, izlases gaitā novērsta modificētājgēnu ietekme uz šo alēli.

3. tabula Table 3

Pazīmju vidējais vērtējums 1998. − 2000. gados, ballēs Average score of morphological traits in 1998-2000

Ķekarainība /

Fruits development in clustersAugļa krāsa / Fruit colour

1998.g 1999.g 2000.g 1998.g 1999.g 2000.g Inbredlīnijas/ Inbredlines

1 0.75 0.67 1.79 2.63 2.89 2.70 2 0.90 2.64 2.76 2.52 2.83 2.84 3 0.57 1.51 2.27 2.91 2.58 2.83 4 0.52 0.26 2.22 2.80 2.33 2.45 6 0.72 0.26 0.68 2.67 2.62 2.68 7 0.14 0.22 1.42 2.27 2.08 2.07 8 0.70 0.67 1.55 2.48 2.03 2.44

*γ 0.05 genotipiem / genotypes 0.53 0.44 1.00 0.36 0.85 0.51

gadiem / years – 0.86 – – – – Ģimenes/ Sib-lines

5. 0.71 0.46 2.69 2.79 2.69 2.38 6. 0.39 0.64 1.99 2.50 2.54 2.85

11. 0.78 0.64 2.86 2.83 2.81 2.19 11z 0.78 0.74 2.74 2.83 2.53 2.55 15. 0.66 0.60 2.50 2.38 2.58 2.73 20. 0.54 1.00 2.82 2.39 2.30 2.61

21(3)z 0.88 1.33 2.52 2.53 2.74 2.89 21(3)t 0.88 1.33 2.69 2.53 2.74 2.84

21(3)IV 0.88 1.33 2.71 2.53 2.74 2.48 DZĶ – – 2.21 – – 2.92 *γ 0.05

genotipiem / genotypes – – – – – –

gadiem / years – 0.43 – – – – * tabulā uzrādītas tikai statistiski ticamās kritiskās starpības / only statisticaly significant differences are shown

3. tabulas nobeigums End of table 3

Augļa kārpainība /

Warts Dzeloņu krāsa / Prickles colour

1998.g 1999.g 2000.g 1998.g 1999.g 2000.g Inbredlīnijas/ Inbredlines

1 2.18 2.89 2.51 2.39 2.57 1.65 2 2.16 3.00 2.81 2.29 2.50 2.24 3 1.84 2.80 2.97 2.92 2.89 2.66 4 2.20 2.15 2.50 2.65 3.00 2.67 6 2.19 2.03 1.00 2.58 2.94 1.93 7 1.48 1.25 2.34 2.69 3.00 2.68 8 2.44 2.12 2.62 2.61 3.00 2.82

*γ 0.05 genotipiem / genotypes – – – 0.39 0.51 1.30

gadiem / years – – – – 0.38 – Ģimenes/ Sib-lines

5. 2.00 2.73 2.02 2.58 3.00 2.20 6. 2.65 2.56 2.78 2.87 2.94 2.58

11. 2.48 2.71 2.43 2.83 2.87 2.62 11z 2.48 2.80 2.39 2.83 2.95 2.32 15. 2.12 2.68 2.38 2.93 2.82 2.11 20. 3.44 2.86 2.95 3.00 2.96 2.98

21(3)z 2.61 2.79 2.94 2.97 2.86 3.00 21(3)t 2.61 2.79 2.78 2.97 2.86 2.89

21(3)IV 2.61 2.79 2.76 2.97 2.86 2.64 DZĶ – – 2.95 – – 2.90 *γ 0.05

genotipiem / genotypes – – – – – –

gadiem / years – – – – 0.32 – * tabulā uzrādītas tikai statistiski ticamās kritiskās starpības / only statisticaly significant differences are shown

Augļa morfoloģiskās pazīmes. Augļu morfoloģiskās pazīmes noteiktas tehnisko gatavību sasniegušiem augļiem. Pēc dažām pazīmēm genotipi savstarpēji atšķiras diezgan krasi.

Izmērs un formas indekss visu līniju un ģimeņu augļiem ietilpst šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' atbilstoša izmēra diapazonā. Izņēmums ir I2

0

20

40

60

80

100

3 4 5Inbredpaaudze / Inbred-generation

Tipi

sko

augu

īpat

svar

s, %

Prop

ortio

n of

typi

cal p

lant

s

1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I

0

20

40

60

80

100

1 2 3Ģimenes paaudze / Sib-generation

Tipi

sko

augu

īpat

svar

s, %

Prop

ortio

n of

typi

cal p

lant

s

3561115202121(3)Iz21(3)III21(3)IVDZK

1.att. Inbredlīniju (I3 - I5 inbredpaaudzēs) un ģimeņu (S1 - S3 paaudzēs)

ķekarainības vērtējuma dinamika Fig. 1. Dynamic of plants with clustered fruits for inbredlines (I3 to I5

generations) and sib-lines (S1 to S3 generations)

paaudze, kurā augļu garuma / platuma attiecība ir lielāka nekā turpmākajās inbredpaaudzēs. Iegūtie rezultāti ļauj secināt, ka augļu garuma/platuma attiecība inbredizācijas gaitā samazinās.

Au g ļu šķ ē r s g r i e z u m a f o r m a , atšķirībā no augļu formas, starp genotipiem variē. Apkopojot datus par genotipu augļu šķērsgriezuma formas mainību, var secināt, ka vairums inbredlīniju pēc šīs pazīmes ir homozigotiskas, izņemot 5. un 7. inbredlīnijas, kuras ir heterozigotiskas. Ģimenēm arī vērojama neliela augļu šķērsgriezuma formas mainība pa gadiem. Tā skaidrojama ar iespējamo genotipu heterozigotitāti.

A p m a t o j u m a ( d z e l oņu ) k rā s a reģistrēta katram augam līnijā. Līdz ar to bija iespējams veikt matemātisku pazīmes analīzi starp genotipiem kā arī pazīmes mainību pa gadiem. Inbredlīnijām šīs pazīmes vērtējums ir variabls tomēr augu īpatsvaram ar baltiem dzeloņiem ir vērojama tendence samazināties vai svārstīties. Ģimenēs ir novēroti līdzīgi procesi – augu īpatsvars ar baltiem dzeloņiem pēdējo divu paaudžu laikā ir nozīmīgi samazinājies.

Melno dzeloņu krāsu nosaka dominantā alēle B (Pierce and Wehner, 1990). Netipisku augu īpatsvara palielināšanās inbredizācijas un ģimeņu izlases rezultātā, domājams, notikusi vairāku iemeslu dēļ: sākotnējā izejas forma ir bijusi heterogēna un notikusi nejauša svešappute; šo pazīmi nosaka vairāki lokusi mijiedarbojoties un līdz ar to tās iedzimšana ir sarežģīta.

Kārpu izmērs un to izvietojums ir tās pazīmes, pēc kurām šķirnei atbilstošu augu īpatsvars ar katru paaudzi samazinās vai paliek nemainīgs. Pēc šīm pazīmēm šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' aprakstam atbilstošo augu īpatsvars inbredizācijas gaitā būtiski palielinājies tikai 3. un 7. inbredlīnijām. Savukārt vairumam ģimeņu šo pazīmju izmaiņas pēdējo trīs paaudžu laikā nav notikušas. Izņēmums – 3., 6. un 11. ģimenes, kurām ir vērojama tipisko augu īpatsvara samazināšanās. 2000. gadā 21(3) z ģimenei panākts šo pazīmju uzlabojums salīdzinot ar 1998. gadu.

Apkopojot visu genotipu datus par kārpainību, var secināt, ka, veicot inbredizāciju un tuvradniecīsko krustošanu, notiek šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' netipisku genotipu izskaldīšanās. Tas skaidrojams ar to, ka netipiskus genotipus (sīkas kārpas) nosaka recesīvās alēles s, s-2 un s-3, kuras inbredizācijas rezultātā nonākušas homozigotiskā stāvoklī un izpaužas fenotipiski.

A t b i l s t īb a š ķ i r n e i ' D i n d oņa Z a ļ i e Ķ e k a r u ' - līniju un ģimeņu izvērtējums pēc visu morfoloģisko pazīmju kopuma, ir vissubjektīvākais, jo pazīmju summas ietekme uz auga kopējo izskatu objektīvi grūti nosakāma. Līniju homogenizācijas gaitā līnijām konstatēta šī kritērija izmaiņā izteikta tendence– augu īpatsvars ar novērtējumu 3 balles ar katru paaudzi palielinās. I5 paaudzē vairumam inbredlīniju konstatēts augsts šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' aprakstam atbilstošu augu īpatsvars. Šķirnei atbilstošu ģimeņu skaits palielinājies straujāk par inbredlīnijām.

Genotipu izvērtējums pēc ražības. Apkopojot ražības izvērtējumu, secināts, ka vairums genotipu pēc ražības būtiski neatšķiras, vienīgi 2. inbredlīnija abos pēdējos salīdzinājuma gados ir bijusi statistiski ticami ražīgāko inbredlīniju skaitā. Visiem genotipiem lielāka ietekme uz ražības rādītājiem ir bijusi vides faktoriem, nekā genotipam.

Apkopojot visu lauka izmēģinājumā uzskaitīto parametru vērtējumu, var secināt, ka par visizlīdzinātākajām uzskatāmas 2. un 3. inbredlīnijas I5 paaudzē, kā arī 20. un 21(3)z ģimenes S3 paaudzē. Pēdējo trīs paaudžu inbredlīniju un ģimeņu atbilstība šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' pēc izvērtētajām pazīmēm ir atšķirīga. Tas skaidrojams ar to, ka morfoloģisko pazīmju izpausme cieši saistīta ar pazīmes iedzimstības dabu, ko nosaka šķirnes vecākaugu genotips (Hartwig, 1984). Fenoloģisko un morfoloģisko pazīmju analīzē gandrīz pie katras pazīmes novērota arī ārējo vides faktoru ietekme. Tas liek domāt par to, ka vadoties vienīgi pēc morfoloģiskajām un fenoloģiskajām pazīmēm objektīvs genotipu izvērtējums nav iespējams. Tātad genotipu izvērtēšanai nepieciešams lietot precīzākas metodes, kuras nav pakļautas vides apstākļu ietekmei. Šādiem kritērijiem atbilstošas ir molekulāro marķieru metodes.

Izdalīto līniju un ģimeņu novērtējums ar molekulārajiem marķieriem (RAPD)

Genotipu izvērtējums ar molekulārajiem marķieriem veikts divās sērijās. Pirmajā RAPD analīžu sērijā (kopējais DNS paraugs), papildus literatūrā minētajiem praimeriem, pārbaudīti vēl divi “Operon” praimeru komplekti: OPE (OPE-01 – OPE-20, izņemot OPE-15) un OPAI (OPAI-01 – OPAI-20). Kopskaitā pārbaudīti 53 praimeri. PCR produkts iegūts ar 27 praimeriem (4. tab.), ar pārējiem amplifikācija nenotika. No produktīvajiem praimeriem polimorfismu uzrādīja 26, viens praimeris (OPAC-09) izrādījās monomorfs. Polimorfisma līmenis produktīvajiem praimeriem pirmajā RAPD analīžu sērijā variēja no 50 % līdz 100 %, bet otrajā sērijā – 100 %. Amplifikācijas produktu garums konstatēts starp 250 un 3000 bp (bāžu pāriem). Arī lielākā daļa publikāciju norāda uz to, ka ar RAPD metodi sintezēto DNS fragmentu garums gurķiem ir šajās robežās. Vairumam praimeru PCR produkta bāžu pāru garums bijis vienā diapazonā, tomēr daļai praimeru otrajā RAPD analīžu sērijā vairāk amplificēti garie DNS fragmenti. Bez tam otrajā RAPD sērijā iegūts lielāks dažādu garumu DNS fragmentu skaits salīdzinot ar pirmo sēriju. Šāds rezultāts ir likumsakarīgs, jo viena no RAPD analīžu īpatnībām ir salīdzinoši zemā atkārtojamība. To nosaka PCR apstākļi (reaģentu atšķirība, dažādas paraugu sagatavošanas metodes, dažādu modifikāciju termocikleri, kā arī reakcijas ciklu garuma un skaita atšķirība). Kā nozīmīgs atšķirību iemesls varētu būt arī apstāklis, ka otrajā RAPD sērijā DNS tika izolēta no sēklām, bet pirmajā – no lapām. Pastāv neliela iespējamība, ka otrajā analīžu sērijā analizējot katra auga DNS atsevišķi, katra parauga (auga) DNS īpatsvars PCR reakcijas sastāvā bija lielāks, salīdzinot ar pirmo sēriju, kur PCR reakcijā izmantots piecu augu DNS maisījums un līdz ar to ir amplificēts lielāks konkrētā

garuma DNS fragmentu daudzums no katra auga. Tādēļ tie spēcīgāk luminiscēja etīdija bromīdā. Bez tam atšķirības iespējamas tādēļ, ka otrajā sērijā analizēta nākamā inbredlīniju un ģimeņu paaudze.

Tā kā katra RAPD sērija veikta ar citu mērķi, identisku RAPD analīžu rezultātu sasniegšana nebija nepieciešama, tā pat būtu neloģiska. Pirmajā sērijā noteikts līniju savstarpējās saistības ciešums, kā arī atlasīti polimorfie praimeri, bet otrājā noteikta nākamās paaudzes genotipu homogenitāte.

Genotipu homogenitātes novērtējums Pamatojoties uz RAPD otrās sērijas DNS analīžu datiem, kuri iegūti no

katra auga atsevišķi, noteikts inbredlīniju un ģimeņu polimorfisms. Šajā nolūkā izmantots līdzības koeficients starp augiem genotipa robežās. Kā zināms, ja tas ir augsts, genotips ir homogēns, bet ja zems – heterogēns.

Noskaidrots, ka vairumam genotipu polimorfisms svārstījās 0 – 40 % robežās atkarībā no praimera. Bija genotipi, kuriem tas bija mazāks – 1 I6, 8 I6 un 6 S4, piemēram, 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' nekontrolētas apputes materiālam.

4. tabula Table 4

RAPD analīzēs lietotie praimeri Primers, used in RAPD analysis

Lokusu skaits / Number of loci

Polimorfo lokusu skaits /

Number of polimorphi

c loci

Polimorfo lokusu

īpatsvars / Proportion of polymorphic

loci, %

Praimeris / Primer

Nukleotīdu sekvence / Nucleotides sequencis

1. sē

rija

/ 1st

serie

s

2. sē

rija

/ 2nd

serie

s

1. sē

rija

/ 1st

serie

s

2. sē

rija

/ 2nd

serie

s

1. sē

rija

/ 1st

der

ies

2.

sērij

a /

2nd se

ries

OPAI-01 GGCATCGGCT 13 21 10 21 76.9 100.0 OPAI-05 GTCGTAGCGG 10 – 8 – 80.0 – OPAI-07 ACGAGCATGG 6 10 6 10 100.0 100.0 OPAI-08 AAGCCCCCCA 11 20 10 20 90.9 100.0 OPAI-09 TCGCTGGTGT 8 16 8 16 100.0 100.0 OPAI-10 TCGGGGCATC 8 – 7 – 87.5 – OPAI-11 ACGGCGATGA 13 18 11 18 84.6 100.0 OPAI-12 GACGCGAACC 2 – 1 – 50.0 – OPAI-13 ACGCTGCGAC 7 – 5 – 71.4 – OPAI-15 GACACAGCCC 12 14 9 14 75.0 100.0

4. tabulas nobeigums End of Table 4

Lokusu skaits / Number of loci

Polimorfo lokusu skaits /

Number of polimorphic

loci

Polimorfo lokusu

īpatsvars / Proportion of polymorphic

loci, %

Praimeris / Primer

Nukleotīdu sekvence / Nucleotides sequencis

1. sē

rija

/ 1st

serie

s

2. sē

rija

/ 2nd

serie

s 1

. sēr

ija /

1st se

ries

2. sē

rija

/ 2nd

serie

s 1.

sērij

a /

1stse

ries

2. sē

rija

/ 2nd

serie

s

OPE-03 CCAGATGCAC 13 – 9 – 69.2 – OPE-04 GTGACATGCC 9 – 4 – 44.4 – OPE-12 TTATCGCCCC 5 – 1 – 20.0 – OPE-14 TGCGGCTGAG 6 – 5 – 83.3 – OPE-16 GGTGACTGTG 7 – 4 – 57.1 – OPE-18 GGACTGCAGA 6 – 5 – 83.3 – OPAC-09 AGAGCGTACC 1 – 0 – 0.0 – OPAF-07 GGAAAGCGTC 7 17 7 17 100.0 100.0 OPAF-17 TGAACCGAGG 9 14 9 14 100.0 100.0 OPAF-15 CACGAACCTC 8 – 6 – 75.0 – OPAG-01 CTACGGCTTC 3 – 2 – 66.6 – OPAH-14 TGAGTCCGCA 7 – 5 – 71.4 – OPAJ-01 ACGGGTCAGA 8 – 6 – 75.0 – OPAJ-06 GTCGGAGTGG 3 – 2 – 66.6 – OPAJ-18 GGCTAGGTGG 15 14 15 14 100.0 100.0 OPAK-05 GATGGCAGTC 9 – 9 – 100.0 – OPAK-16 CTGCGTGCTC 6 – 5 – 83.3 –

Šāds polimorfo aleļu īpatsvara sadalījums skaidrojams ar to, ka nekontrolētas apputes materiālā nav veikta inbredizācija vai tuvradnieciska krustošana ģimenes robežās, līdz ar to šis materiāls nav sadalīts tik atšķirīgos genotipos.

Analizējot līdzības koeficientus, kuri aprēķināti pēc RAPD analīžu rezultātiem, redzams, ka pirmajā molekulāro analīžu sērijā atšķirības starp līnijām un ģimenēm nav izteikti lielas (5. tab.). Savstarpēji vistuvāk (0.91) atrodas 5S3 un 6S3 ģimenes. Savukārt visattālāk – 2 I5 inbredlīnija un 15 S3 ģimene (0.66). Inbredlīniju līdzības koeficients bija intervālā starp 0.69 un 0.84, bet ģimenēm – starp 0.71un 0.91. Kā redzams, inbredlīniju augiem tas atrodas nedaudz šaurākā diapazonā, salīdzinot ar ģimenēm. Tomēr atšķirība ir tik neliela, ka neliecina par

izteiktām likumsakarībām attiecībā uz analizēto genotipu savstarpējo saistību ciešumu.

5. tabula Table 5

Ģenētiskās līdzības koeficienti pēc pirmās RAPD analīžu sērijas rezulātiem Coefficients of genetic similarity obtained from the 1st RAPD series analysis

Inbredlīnmijas/ Inbredlines Ģimenes/ sib-lines 1 I5 2 I5 3 I5 4 I5 5 I5 6 I5 7 I5 8 I5 5. 6. 11 11z . 15. 20. 21z. 21t. 2 I5 0.84 3 I5 0.83 0.79 4-I5 0.79 0.78 0.80 5 I5 0.72 0.72 0.77 0.77 6 I5 0.70 0.69 0.71 0.75 0.78 7 I5 0.71 0.72 0.75 0.79 0.78 0.76 8 I5 0.70 0.69 0.72 0.80 0.81 0.79 0.75 5. 0.77 0.81 0.76 0.80 0.76 0.78 0.79 0.72 6. 0.75 0.80 0.73 0.78 0.74 0.74 0.79 0.71 0.91 11. 0.74 0.73 0.75 0.80 0.78 0.78 0.79 0.77 0.81 0.80 11z. 0.78 0.76 0.77 0.79 0.81 0.77 0.79 0.76 0.81 0.81 0.80 15. 0.72 0.66 0.72 0.68 0.75 0.72 0.71 0.74 0.71 0.71 0.74 0.76 20. 0.79 0.74 0.77 0.79 0.79 0.78 0.76 0.77 0.77 0.75 0.79 0.79 0.74 21z. 0.76 0.77 0.73 0.76 0.74 0.77 0.77 0.72 0.82 0.81 0.75 0.75 0.71 0.82 21t. 0.75 0.78 0.76 0.78 0.77 0.77 0.77 0.73 0.84 0.86 0.80 0.81 0.74 0.80 0.90 21. 0.76 0.74 0.74 0.74 0.76 0.73 0.78 0.78 0.81 0.78 0.79 0.81 0.75 0.79 0.79 0.81

Inbredlīniju un ģimeņu iekšējā homogenitāte izvērtēta, analizējot līdzības

koeficientus, kas iegūti pēc otrās RAPD analīžu sērijas rezultātiem, jo DNS analizēta no a t s e v i šķ i e m inbredlīniju un ģimeņu augiem. Otrajā RAPD analīžu sērijā ir iegūti mazāki līdzības koeficienti starp genotipiem. Tas liecina par inbredizācijas un tuvradniecīgas krustošanas ietekmi uz savstarpēju inbredlīniju un ģimeņu ģenētisku attālināšanos. Pēc pirmās RAPD sērijas rezultātiem iegūtie līdzības koeficienti bija tuvāk literatūrā minētajam diapazonam, kāds ir bijis, piemēram, ASV analizētajiem gurķu paraugiem – 0.48 līdz 0.74. Te gan jāmin, ka literatūrā minētie pētījumi veikti ar citiem gurķu genotipiem un pat pasugām (C. hardwicii (Royle) Alef) (Staub and Ivandic, 1999).

Genotipu robežās aprēķinātas vidējās līdzības koeficientu vērtības, lai uzskatāmi varētu salīdzināt genotipus savstarpēji un arī genotipu homogenitāti (6. tabula). No tabulas redzams, ka otrajā RAPD analīžu sērijā genotipi ir bijuši samērā homogēni. Inbredlīnijas bija izlīdzinātākas, salīdzinot ar ģimenēm. Piemēram, 8 I6 inbredlīnijas līdzības koeficients vidēji starp augiem līnijā bija 0.83.

6. tabula Table 6

Ģenētiskās līdzības koeficientu vidējās vērtības pēc otrās RAPD analīžu sērijas rezultātiem/

Average values of coefficients of similarity obtained from 2nd RAPD series

Inbredlīnijas/ Inbredlines – I6 Ģimenes/ Sib-lines – S4

1 2 3 4 6 7 8 5 6 11 11z 15 20 21(3

D

ZĶ

1I6 0.70 0.58 0.39 0.52 0.22 0.25 0.21 0.16 0.31 0.32 0.32 0.26 0.24 0.17 0.22 2I6 0.68 0.38 0.47 0.28 0.31 0.29 0.18 0.30 0.26 0.28 0.21 0.17 0.18 0.19 3I6 0.46 0.52 0.21 0.20 0.18 0.16 0.27 0.21 0.20 0.16 0.13 0.14 0.16 4I6 0.64 0.21 0.20 0.19 0.17 0.30 0.24 0.28 0.20 0.14 0.16 0.16 6I6 0.63 0.59 0.48 0.42 0.32 0.31 0.25 0.21 0.19 0.19 0.11 7I6 0.67 0.42 0.41 0.33 0.32 0.27 0.24 0.23 0.26 0.15 8I6 0.83 0.57 0.30 0.32 0.28 0.25 0.16 0.15 0.14 5S4 0.66 0.18 0.19 0.14 0.16 0.14 0.14 0.13 6S4 0.73 0.67 0.37 0.32 0.24 0.24 0.23 11S4 0.75 0.35 0.32 0.26 0.23 0.24 11zS4 0.51 0.41 0.15 0.15 0.19 15S4 0.50 0.13 0.12 0.16 20S4 0.57 0.55 0.14 21(3)S4 0.55 0.13 DZĶ 0.62

No sešiem inbredlīnijas 8 I6 analizētajiem augiem starp četriem pastāv ļoti cieša līdzība (0.91), starp atsevišķiem augiem līdzības koeficients svārstījās 0.67 - 0.94 robežās. Savukārt no ģimenēm visizlīdzinātākā ir 11 S4, kur līdzības koeficients starp augiem svārstās robežās no 0.57 līdz 0.86. Līdzības koeficienti ģimenes robežās ir zemāki nekā inbredlīnijās. No tā var secināt, ka inbredlīnijas ir homogēnākas par ģimenēm. Vadoties pēc otrajā RAPD analīžu sērijā iegūtajiem līdzības koeficientiem, par homogēnāko atzīstama 8 I6 inbredlīnija (vidējais līdzības koeficients starp augiem 0.83) un 11 S4 ģimene (vidējais līdzības koeficients starp augiem 0.75) (6. tabula).

Izmēģinājumā veiktie molekulāro analīžu rezultāti apstiprina darba sākumā izvirzīto pieņēmumu, ka tikai pēc morfoloģiskajām pazīmēm nav iespējams objektīvi izvērtēt genotipu homogenitāti.

Izdalīto genotipu daudzdimensionālā analīze Lai novērtētu genotipu savstarpējo saistību, veikta genotipu klāsterizācija

pēc morfoloģisko pazīmju vērtējuma (ballēs) un molekulāro analīžu rezultātā aprēķinātajiem līdzības koeficientiem. 2. attēlā parādīts līniju un ģimeņu grupējums dendrogrammā pēc morfoloģiskajām pazīmēm. Samērā skaidri iezīmējas genotipu saistība pēc izcelsmes un krustošanas veida. Lielākā daļa inbredlīniju ir morfoloģiski atšķirīgas no ģimenēm, t.i. vājāk saistītas ar tām. Tas norāda, ka, veicot tuvradniecīgu krustošanu, sākotnējais izejas materiāls sadalās mazāk atšķirīgās līnijās, nekā veicot inbredizāciju. Lai precizētu genotipu grupējumu, klāsterizācijas analīze veikta arī balstoties uz līdzības koeficientiem, kuri iegūti no RAPD analīžu rezultātiem.

Pēc pirmās RAPD analīžu sērijas rezultātiem izveidotā dendrogramma redzama 3. attēlā. Šai dendrogrammai vērojama līdzība ar morfoloģisko pazīmju dendrogrammu, jo šīs abas klāsterizācijas veiktas vienas un tās pašas paaudzes augiem. Līdzīgi genotipu morfoloģisko pazīmju dendrogrammai ļoti cieša saistība parādās arī 21z un 21t ģimenēs. Tajā pat atzarā atrodas 5 S3, 6 S3 un 21 S3 ģimenes. Kā redzams, te pastāv zināma līdzība ar morfoloģisko pazīmju dendrogrammas vidējo zaru. Pārējo genotipu grupējums un saistības ciešums atšķiras no morfoloģisko pazīmju dendrogrammas.

Dendrogramma, kura veidota pēc otrās RAPD sērijas rezultātiem (autorreferātā nav ievietota tās lielā izmēra dēļ), uzskatāmi pierāda, ka ģenētiski visizlīdzinātākā ir 8I6 inbredlīnija – visi seši tās analizētie augi ir ar salīdzinoši ciešu līdzību. Genotipu robežās līdzīgi ir arī 4 I6 un 11 S4 augi. 3 I6 inbredlīnijas augu izvietojums dendrogrammā ļoti uzskatāmi ilustrē tās augsto heterogenitāti. Ģenētiskās līdzības koeficients starp otro un trešo šīs līnijas augu ir tikai 0.09. 3I6 inbredlīnijas augstā heterogenitāte domājams skaidrojama ar to, ka tā sākotnēji izlasīta no ļoti augsti heterozigota auga. Inbredizācijas sešās paaudzēs līnijā izskaldījušies genotipiski ļoti atšķirīgi īpatņi. Šo pieņēmumu apstiprina arī morfoloģisko pazīmju izvērtējums pēc atbilstības šķirnei.

Salīdzinot abu RAPD analīžu sēriju rezultātā izveidotās dendrogrammas, ir vērojamas zināmas sakritības, tomēr ir arī daži izņēmumi. Inbredlīniju un ģimeņu izvietojums otrās RAPD sērijas dendrogrammā ir nesistemātiskāks. Tas izskaidrojams ar to, ka inbredlīnijās un ģimenēs analizēti atsevišķu augu DNS paraugi, nevis vairāku vienas inbredlīnijas vai ģimenes augu DNS sajaukums, kā tas bija pirmajā RAPD sērijā. Līdz ar to iegūta objektīvāka inbredlīniju un ģimeņu saistības aina. Bez tam otrā RAPD sērija ir veikta nākamajai paaudzei. Līdz ar to inbredizācijas rezultātā līniju un ģimeņu genotips ir nedaudz mainījies.

Liniju un gimenu saistibas ciesums

6 I5

11z S3

11 S3

5 S3

15 S3

4 I5

21(3)IV S3

20 S3

6 S3

3 I5

DZK 21(3) t S3

21(3) z S3

2 I5

8 I5

7 I5

1 I5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

2. att. / Fig. 2. Inbredlīniju un ģimeņu grupējums pēc morfoloģisko pazīmju vērtējuma ballēs 1999. gadā /

Grouping of inbred- and sib-lines for morphological score in 1999

S a istīb as c ie šum s

0 .7 3 0 .7 7 0 .8 2 0 .8 7 0 .9 1

1 I5

2 I5-1

2 I5-5

3 I5

11 S 3

7 I5

4 I5

11 z S 3

20 S 3

5 S 3

6 S 3

21 z S 3

21 t S 3

21 S 3

6 I5

8 I5

G rīvas

15 S 3

3. att. / Fig. 3. Inbredlīniju un tuvradniecīgu krustojumu ģimeņu grupējums dendrogrammā pēc pirmās RAPD sērijas

līdzības koeficienta Dendrogramm generated from the similarity coefficient obtained from the 1st RAPD series data

Tātad pēc otrās RAPD analīžu sērijas rezultātu daudzdimensionālās analīzes 8 I6 un 4 I6 inbredlīnijas, kā arī 11 S4 ģimene ir ģenētiski homogēnas.

Kopumā RAPD analīžu rezultātu izvērtējums apstiprina iepriekš pieņemto hipotēzi, ka inbredizācijas procesā, salīdzinājumā ar ģimeņu izlasi, notiek straujāka populācijas homogenizācija. RAPD analīžu rezultātā iegūtās genotipu klasifikācijas atšķirība no klasifikācijas pēc morfoloģiskajiem datiem, iespējama vairāku iemeslu dēļ. Tas skaidrojams gan ar vides un genotipa ietekmi, gan arī ar subjektīvā faktora ietekmi, jo vērtētas pārsvarā kvalitatīvās morfoloģiskās pazīmes. Literatūrā minēts, ka gurķiem un melonēm novērota cieša saistība starp morfoloģiskajiem un molekulārajiem marķieriem (McGreigh, 2000). Darbā nelielas atšķirības tomēr konstatētas. Tam varētu būt vairāki iemesli: iespējamā līniju un ģimeņu iekšējā heterogenitāte; iespēja, ka RAPD analīzēs amplificētie DNS fragmenti nekontrolē tās pazīmes, pēc kurām līnija izvērtēta morfoloģiski; RAPD metodes jutība. Tomēr iegūtie rezultāti uzskatāmi pierāda molekulāro un morfoloģisko marķieru nozīmi homogenitātes un ģenētisko saistību pētījumos.

Genotipu ievietošana Latvijas Kultūraugu gēnu bankā Pamatojoties uz fenotipisko un ģenētisko pētījumu rezultātiem, izvēlēti

pieci genotipi ievietošanai Latvijas Kultūraugu gēnu bankā kā arī šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' sēklaudzēšanai. Izvēlētie genotipi no pārējiem atšķīrās ar augstu tipisko pazīmju izpausmes pakāpi, kā arī ar viendabību. 2002. gadā Latvijas Kultūraugu gēnu bankā ievietotas trīs inbredlīnijas – 2 I5, 3 I5 un 8 I6 un divas ģimenes – 20 S3 un 21(3)z S3. Šos pašus genotipus ieteicams izmantot gurķu šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' sēklaudzēšanā.

SECINĀJUMI

1. Gurķu šķirnes 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' homogenizācijas gaitā izveidotas

127 inbredlīnijas un 21 tuvradniecisko krustojumu ģimene. No tām astoņas inbredlīnijas un astoņas tuvradniecisko krustojumu ģimenes pēc galvenajiem parametriem atbilst šķirnei 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' un atlasītas detalizētai fenotipa analīzei lauka apstākļos un genotipa analīzei pielietojot molekulāros marķierus (RAPD).

2. Uzsākot pētījumus noskaidrots, ka izejas materiāls bija šķirnei 'Dindoņa Zaļie

Ķekaru' atbilstošs pēc fenoloģiskajām pazīmēm (dienu skaits no sējas līdz sadīgšanai, lapu skaits stādīšanas laikā, laiks, kad vīrišķie un sievišķie ziedi izplaukuši 10 un 75 % augiem lauciņā, kā arī ražošanas perioda sākums un garums), auga zarojuma un ziedēšanas tipa. Šīs pazīmes saglabājās homozigotizācijas laikā, kas liecina par izejas materiāla homogenitāti pēc šīm pazīmēm.

3. Šķirnes homogenizācijas sākumā augļu attīstība ķekaros bija izteikta ļoti vāji. Izlases gaitā vairumam genotipu pēc šīs pazīmes bija vērojama izteikta reakcija uz izlasi – ķekarainība pēdējās paaudzēs ir strauji pieaugusi.

4. Inbredizācijas un ģimeņu izlases rezultātā konstatēts nozīmīgs netipisko,

melndzeloņaino augu īpatsvara pieaugums. Šādu izlases rezultātu ir grūti izskaidrot. Iespējamie iemesli varētu būt divi: a) dzeloņu krāsu gurķiem nosaka vairāki lokusi ar sarežģītu mijiedrabību; b) notikusi nekontrolēta appute ar melni dzeloņoto augu putekšņiem.

5. Genotipu izvērtējums pēc fenotipa ir apgrūtināts, jo visas fenoloģiskās pazīmes,

kā arī augļu izmēru, mizas zīmējumu un ražu spēcīgi ietekmē ārējās vides apstākļi.

6. No 53 pārbaudītajiem atlasīti 26 praimeri, kuri izmantojami gurķu molekulāro

marķieru (RAPD) analīžu veikšanai. Tie nodrošina kvalitatīvu amplifikācijas produktu un pietiekoši augstu alēļu polimorfismu. No 12 pēc literatūras atlasītajiem praimeriem pirmajā analīžu sērijā viens nedeva amplifikācijas produktu (OPAC-09).

7. Izstrādāta metodika DNS izdalīšanai no gurķu sēklām. Arī no vienas sēklas var

izdalīt pietiekošas kvalitātes un daudzuma DNS, lai veiktu katras atsevišķas sēklas genotipa analīzi. Salīdzinājumā ar DNS izdalīšanu no lapām, šī metode ir mazāk darbietilpīga, tai ir zemākas analīžu izmaksas.

8. Abu RAPD sēriju rezultāti nav identiski. Izmantojot RAPD analīzēs no sēklām

izdalīto DNS, amplificēts lielāks lokusu skaits, nekā analizējot DNS, kas izdalīts no gurķu lapām.

9. Atkārtojamība starp abām RAPD analīžu sērijām bija būtiska: no deviņiem

praimeriem, kuri atkārtoti izmantoti otrajā analīžu sērijā, septiņiem praimeriem kopīgo lokusu skaits abās analīžu sērijās ir lielāks par 65 %, kas RAPD marķieru analīzei ir samērā augsta atkārtojamība.

10. Molekulāro marķieru (RAPD) sadalījuma daudzdimensionālā analīze parādīja,

ka apvienotajā paraugā līdzības koeficienti starp genotipiem svārstās robežās no 0.66 līdz 0.91. Turpretī, analizējot katru augu atsevišķi, šie koeficienti svārstās robežās no 0.08 līdz 0.94. Tas nozīmē, ka ar katru nākamo paaudzi vairums inbredlīniju un ģimeņu sadalās arvien atšķirīgākos genotipos. Tajā pat laikā atsevišķām inbredlīnijām ir augsta homogenitāte, par ko liecina augsti līdzības koeficienti starp augiem genotipa robežās.

11. Pēc fenotipisko pazīmju kopvērtējuma homogēnākās ir divas inbredlīnijas – 2 I5 un 3 I5, kā arī divas ģimenes – 20 S3 un 21(3)z S3. Inbredlīnija 2 I5 un ģimenes 20 S3 un 21(3)z S3 uzrāda arī samērā augstu izlīdzinātību pēc molekulāro marķieru analīzes.

12. RAPD marķieru sadalījuma daudzdimensionālā analīze parādīja, ka ģenētiski

visizlīdzinātākā ir 8 I6 inbredlīnija. 13. Izvērtējot fenotipisko pazīmju un molekulāro marķieru analīzes rezultātus,

Latvijas Kultūraugu gēnu bankā, kā šķirni 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' reprezentējošas, ievietotas trīs šīs šķirnes inbredlīnijas – 2 I5, 3 I5 un 8 I6 un divas ģimenes – 20 S3 un 21(3)z S3. Šos pašus genotipus ieteicams izmantot arī šķirnes sākotnējā sēklaudzēšanā.

PATEICĪBA

Sirsnīgi pateicos savam dzīvesbiedram Jānim par profesionālo un morālo atbalstu darba rakstīšanas laikā, kā arī saviem bērniem Robertam un Elzai par pacietību māmiņas aizņemtības brīžos.

Liels paldies Pūres DIS kolēģiem par atsaucību dažādu ar disertāciju saistītu jautājumu risināšanā. Īpaši pateicos Larisai Bitei par atbalstu darba sākotnējo posmu veikšanā. Tāpat liela pateicība Latvijas Universitātes Bioloģijas institūta augu ģenētikas laboratorijas darbiniekiem, īpaši Tatjanai Sjakstei par palīdzību molekulāro analīžu veikšanā.

Pateicoties Turcijas Zinātnes padomes (TÜBITAK) finansējumam NATO zinātnes atbalsta programmas ietvaros bija iespējams veikt 1. sērijas RAPD analīzes. Esmu pateicīga par sniegto atbalstu kolēģiem Turcijā Yildiz Aka- Kacar, Yeshim Mendi un Selim Cetiner kā arī pārējiem laboratorijas darbiniekiem un studentiem.

INTRODUCTION The preservation of plant genetic resources ex situ requests high

investments. The problem of accession selection become actual: gene banks should escape double accessions and in the same time preserve all present genetic diversity (Hamon et. al., 1995; Swaminathan, 1997). In the different ecological places can be found unique genotypes of the same species.

Maintenance of plant genetic resources in the Baltic states was started in 1993 with following co-operation with the Nordic Gene Bank (NGB) since 1995 (Rashal, 1999). In 1997 the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants was established in the framework of the Nordic–Baltic project (Rashal et. al., 2000). Since 1995 criteria of accessions to be included in the gene bank were developed. Guided by new criteria available accessions were inventorised, evaluated and finally selected for the gene bank collection. An important criteria for accession is homogeneity of the material.

Preservation of accessions of the Latvian origin is prioritised in the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants (Rashal and Weibull, 1997). All four accessible at present cucumber samples were included in the list of preserved accessions.

Old Russian varieties (landraces) were mostly first cucumber introductions in Latvia were. Some local varieties were bred at the beginning of 20th century, for example, 'Krāslavas', 'Tukuma' and 'Grīvas'. Inbreeding and hybridisation were introduced in the cucumber breeding afterwards. Cucumbers in Latvia are grown close to the Northern boundary of cucumber cultivation. Due to this cucumbers of Latvian origin may contain genes of frost tolerance and tolerance to the broad temperature fluctuations. Therefore evaluation of accessible varieties and placing them in a gene bank is an important and immediate task.

In 1994, only 3% of plants of the old Latvian variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' grown from commercially available seeds were morphologically correspondent to the variety. This material was not valuable for placing in the gene bank. Therefore renewing and homogeneisation of variety was started.

The aims of the investigation were following: to split the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' in separate, genetically distinct

lines; •

•

•

to select lines which are most homogeneous and most correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' for the placement in the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants;

to select lines which are the most appropriate for seed production. Several tasks were set up for the reaching the aim: to create inbred-lines

and sib-lines; to evaluate correspondence of lines to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' according to the morphological, phenological and yield parameters; to evaluate homogeneity and linkage of lines by using molecular markers (RAPD).

Investigations were carried out in the Pūre Horticultural Research Station, the Horticultural Department of Cukurova University in Turkey (granted by TÜBITAK) and in the Laboratory of Plant Genetics of the Institute of Biology, University of Latvia.

Novelty of the research Several inbred and sib lines were created from the commercially available

seeds of the old cucumber variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' and placed in the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants; particularities of variation of the phenotypic traits were clarified; existing methods of DNA extraction were modified and adapted for particular equipment and materials; a method of the DNA extraction from cucumber seeds was elaborated; polymorphic praimers yielding the PCR product in the cucumber RAPD analysis were found.

MATERIALS AND METHODS Creating of inbredlines (I)

In 1994, the 1st generation of inbredlines was obtained from the selfing of eight plants most correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'. Parent plants were grown from commercially sold seed material. The main criteria for plant selection for inbreeding were several fruit characteristics, such as skin colour, prickles colour, fruit shape and, finally, fruit development in clusters as a most important trait.

In 1995, seeds of the 1st generation were sown. Plants with traits the most correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' were selfed for creating of the 2nd generation of seeds. In this way eight inbredlines of the 2nd generation (I2) were obtained in 1995: A I2, B I2, C I2, D I2, E I2, F I2, G I2, H I2. Obtained seeds were bulked within line. Inbreeding was not carried out in 1996.

In 1997, inbreeding was realised for the four lines most yielding and typical to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' according to the trial results of 1995. They were C I2, D I2, G I2, H I2. From the all plants (320) only eight were found as phenotypically matching to the variety: two from the line D I2, one from the line G I2 and five from the H I2 line. Therefore seeds of I3 generation were obtained from three inbred-lines of I2 generation. In total eight sub-lines were derived. The designation system was changed:

I3 generation Parent line 1 I3 D I22 I3 D I23 I3 G I24 I3 H I25 I3 H I26 I3 H I27 I3 H I28 I3 H I2

Seeds of I4 generation were obtained in 1998 from the plants of I3 generation grown in the open field for the phenological, morphological and yield evaluation. In 1998 seed collection from the separate plants (sublines) was started.

In 1999, seeds of sublines of I5 generation were obtained in an unheated greenhouse. Plants were selected for the selfing according to the same principles as for previous generations i.e. maximal correspondence to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'. In total, 44 sublines were derived.

In 2000, I6 seed production was carried out also in the unheated greenhouse. Sublines of I5 generation morphologically the most correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' were used for seed production of I6 generation. 127 sublines of I6 inbred generation were obtained carrying on the same principles of selfing.

Creating of sib-lines (S)

Sibling was started in 1997. Seeds collected from the plants of uncontrolled pollination in 1996 were sown in 1997 in open field conditions. Sib matting was done for plants most correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'. According to the results of morphological evaluation, 10 plants were selected for the sibling from 800 plants.

Plants from seeds of the selected plants of previous year, were grown in the open field conditions in 1998. Among each line plants morphologically most correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' again were selected. Pollination among of the selected plants was done by using butter cloth isolators. The difference between inbreeding and sibling was in the pollination system: sib-lines (S) were obtained by pollination of the typical plants inside of separate family but inbred-lines (I) were obtained just by selfing of typical plants.

Seeds obtained by sibling of typical plants were bulked within the sib-line. In 1999, 11z subline was selected out from 11 S2, and sib-line 21 S2 was divided in three sublines: 21(3)z, 21(3)t and 21(3)IV. Altogether nine sib-lines were selected for more detailed investigation in 2000.

Evaluation of phenological, morphological and yield parameters

Phenological phases were fixed during the time of vegetation: the number of days from the sowing till germination, the number of leaves at the planting day, the number of days till on 10% and 75% of plants male and female flowers were open, as well as beginning and duration of harvesting.

Morphological parameters (plant branching, flowering type, fruit development in clusters, fruit shape, cross section of fruits and size of ovary, fruit colour, drawing, density and size of warts, colour and type of prickles) were scored by four point scale. For the particular trait plant was recorded by score 3 if its expression was correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' completely. If the trait was not fully correspondent to the variety DZK it received score 2, less

correspondent traits were evaluated by score 1 point but untypical expression of trait was scored as 0 (Table 1).

Table 1 Score of the morphological traits

Score Trait

0 1 2 3 Plant

branching bush-

shaped main vine

0.5 – 0.7 m length

main vine 0.7 – 1.15 m

length

main vine

above 1.15 m

Frui t development

in c lusters

1 f ru i t per node

2 f ru i ts per node

3 f ru i ts per node

4 and more fru i ts

per node Skin

drawing white

mott l ing across a l l

f ru i t

s t r ipes and mott l ing

across a l l f ru i t

weak s tr ipes and mott l ing

marked s t r ipes in 1 /3 - 1 /2 of f ru i t

Frui t colour

l ight green, glossy

l ight green green dark green

Frui t vest i ture

smooth fru i t

hairs only hairs and pr ickles

pr ickles only

Pr ickles colour

b lack brown yel low white

Warts on skin

smal l , dense

absent rough, scarce

rough, mid

dense The first two generations of inbred lines were evaluated for morphological

traits from the bulked sample of each line. Starting with the I3 generation each plant was scored separately for flowering type, branching, fruit colour, prickles colour, fruit development in clusters and for general correspondence to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'. Therefore evaluation of genotype homogeneity became possible. Fruit shape, shape of cross section, ovary diameter, fruit drawing and taste were evaluated in a bulked sample of 5 plants per each genotype.

Yield recording was done during the all period of fruit production. Number of fruits and weight were fixed.

Analyse of molecular markers (RAPD) Molecular analyses was performed in two series: 1st series – DNA was extracted from the green leaves of four to six plants of

the same genotype in bulked sample. Seven inbred (I5) and nine sib-lines (S3) were analysed.

2nd series – DNA was extracted from the four to six separate seeds of the same line. Hereafter DNA of each seed was analysed separately. Plants of seven inbred (I6) and seven sib-lines (S4) were analysed.

DNA extraction was adopted for both of series of analyses. The 1st series was performed in the Laboratory of Biotechnology, Horticultural Department of the Cukurova University, Turkey, the 2nd – in the Laboratory of Plant Genetics of the Institute of Biology, University of Latvia.

DNA extraction from the green leaves (the 1st series of analyses) The 2nd and 3rd leaves were bulked from the three - four plants of each line.

To compare results a distinct variety 'Grīvas' was included in the analysis. Weight of leave sample was 2-3 g. DNA extraction was done according to Dellaporta et. al, 1983.

DNA extraction from the seeds (the 2nd series) DNA was isolated from seed primordia separate from six plants per

genotype according to Roder et.al., 1998 with some modifications. PCR components in both of series of the RAPD analysis are summarised in

Table 2. Segregation of PCR products was done in 2% (in the 1st series) and in 1 % (in the 2nd series) agarose gel by electroforesis. DNA visualised by ethidium bromide.

Mathematical analysis of results

Percentage of plants with particular score was calculated in each generation for each line. Also the average score of traits was analysed for each genotype during the last three generations (Table 3). Average score and yield parameters were evaluated by ANOVA and differences between lines were compared according to the Stjudent criteria.

Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYS) was used to perform the similarity coefficient and dendrogram tree by hierarchical cluster analysis.

Mathematical analyses performed by EXCEL and STATICTICA software.

Molecular data analysis Fingerprintings were fixed digitally in a computer or by photography.

Bands on RAPD gels were scored as present (1) or absent (0) for all primers and genotypes studied. DNA fragments of the similar length (the same band) were described as the same loci. NTSYS and EXCEL software were used to perform the similarity coefficient and dendrogramm tree by the hierarchical cluster analysis.

Coefficient of similarity was calculated according to Nei and Li, 1979. Matrix obtained from this calculation was used for dendrogramm generation.

Heterogeneity index was calculated for the evaluation of primers and lines heterogeneity level.

Multidimensional analysis was done for data of both morphological and molecular investigations. Dendrogramm for morphological traits was generated on the base of score of lines for all evaluated traits. In all cases multidimensional grouping was performed according to the UPGMA method (unweighted pair-group method of arithmetic average).

RESULTS

Evaluation of lines in the field conditions

For phenological phases between all lines significant difference had not been stated during the investigation. Apparently meteorological conditions of the year and genotype-environment interactions had the significant influence on the expression of phenological parameters. The same influence of meteorological conditions was observed for yield parameters.

Morphological traits of plant Variability of morphological traits differs between genotypes and also

between generations. Average score of traits and statistically significant distances are shown in the Table 3.

Branching, plant length and flowering type of plants are the traits which lines were homogeneous already at the very beginning of the experiment. Flowering type for all of the lines in all generations was constant: predominantly male flowering. Probably, plants were homozygous for this trait because male flowering is determined by recessive alele a. Plant branching and length also were not variable between and within genotypes. This trait is determined by dominant alele T. Apparently presence of this alele determines such the trait. Consequently, even heterozygous lines are phenotypically homogeneous and typical to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'.

The fruit development in clusters was the most changeable trait between the generations. Moreover it was one of the most important trait for selection of particular plant for inbreeding and sibling. Therefore significant improvement of the fruit development in clusters was reached. The trait is very typical for the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' but at the beginning of homogeneisation the variety was the most destroyed according this trait. Rapid increasing of the amount of plants with clustered fruits was observed in I3 and I4 generations for inbredlines as well as in S2 and S3 generations for sib-lines. The highest score of clustered fruits in the last three generations was observed for 2nd inbredline. Also 3 I4 inbredline had notable high proportion of clustered fruits. High variation of fruit development in clusters was observed between plants inside of inbredlines, as well as between

inbredlines within one generation and between the generations. Different results were for sib-lines. Significant differences between sib-lines were observed only in two last generations. But ANOVA analysis did not showed significant differences between sib-lines during last three generations. It is known from the literature that fruit development in clusters is determined by the dominant alele Mp-2 but there are several modifiers. We can presume that during long-term inbreeding plants with homozygous recessive aleles, which determine single fruit per node, were eliminated. Also it is possible that the influence of modifiers was eliminated.

Fruit morphological traits Fruit morphological traits were evaluated during stage of marketable size.

Some differences between and within lines were registered for fruit morphology. Variability of some fruit morphological traits was stated also within generations.

Fruit length and diameter as well as shape index had variability with light tendency to diminish fruit length with every generation. Fruits of all the lines incorporated in the characteristic diapason of the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'.

The shape of fruit cross-section had significant differences between lines. Apparently some lines were heterozygous for this trait and during homogeneisation lines were segregated in the several genotypes.

Prickle colour was registered for the every plant in the line in the last three generations. White coloured prickles are typical for the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' and they are determined by a recessive alele. There was quite high variability for this trait within and among lines and between generations. Tendency to the prevalence of the black prickles in latest generations inbredlines was found. Since white prickles are determined by the recessive allele in homozygous plants this alele should be expressed phenotypically but it was not observed. This indicate that inheritance of black prickles is more complicate – probably this trait is controlled by several loci or uncontrolled pollination was occured. In sib-lines the same tendency was stated – the amount of black prickled fruits was higher.

Size of warts and its density also is characteristic trait for cucumber varieties. Common tendency for the all lines was stated in the investigations: for some lines the amount of plants with typical warts decreased with every generation or remained on the same level. For great majority of inbredlines size of warts and its density did not changed during inbreeding. Unsignificant tendency to increase the amount of typical to variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' plants was stated for sib-lines. In general, segregation of untypical plants in the lines was detected during of inbreeding. Probably, recessive aleles s, s-2 and s-3, which determine small and dense warts, had become homozygous.

Lines evaluation for the general correspondence to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' was done for every plant during the last three generations. This is the most subjective parameter in the line evaluation. Nevertheless this criteria was included in the evaluation of lines. Evaluation was done by three point system, as for the all traits. Common tendencies were stated for the lines during

homogeneisation: the percentage of plants scored by 3 was increased with every generation. Different results were for few inbredlines, which had low score of the complex correspondence to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'. For sib-lines the amount of typical plants was increased with every generation too.

Yield parameters were not significantly different for the most of all genotypes. Environment factors had an important influence to the yield in all generations.

As a result of all field investigations of genotypes is conclusion that the most homogeneous in the I5 generation were the 2nd and the 3rd inbred-lines, as well as the 20th and the 21st sib-lines of S3 generation. Homogeneity of lines in the last three generations was different for some parameters, because the phenotypic expression of traits is influenced by genotype of variety parental plants and environment-genotype interactions. It means that objective evaluation of genotypes according only phenotypic traits is impossible. Therefore more precise methods not so influenced by environmental factors should be used for more proper evaluation of genotypes. Molecular markers are the most appropriate for reaching the aim.

Lines evaluation by using molecular markers

Evaluation of allelic polymorphism In total 26 primers among 53 tested were polymorphic (Table 4). One

primer was monomorphic (OPAC - 09), the rest 26 primers had no amplification. One of the primers (OPAK - 05) had amplification only in the 1st series of the RAPD analysis.

The level of loci polymorphism for the amplified primers varied among 50-100 %. The length of amplification products was between 250 and 3000 bp (base pairs), which is similar to the mentioned in publications for cucumbers.

In total, allelic polymorphism varied between praimers. In the most cases the percentage of monomorphic alleles was higher than polymorphic but in some cases – equal.

Larger amount of different length fragments was obtained in the analysis of DNA from separate leaves. Probably, it is caused by following factors: specificity of the RAPD analysis – it has low repeatativeness; the differences in the conditions of PCR reaction; different methods of DNA extraction; different thermocyclers et c. Important can be a fact that in the 2nd series of analysis DNA was extracted from seeds but in the 1st – from green leaves. In the 2nd series was analysed DNA from the separate plants also and therefore the proportion of each plant DNA in the reaction solution was higher. Therefore the amount of amplification products of the particular length was higher and more observable on the gel. Different generations of genotypes analysed in both series also could cause the differences in the results.

Evaluation of lines homogeneity Coefficients of similarity from the molecular analysis data of bulked

samples are shown in Table 5. The highest coefficients reflect most close

genotypes but the lowest –more distinct. Coefficient of similarity varied between 0.66 and 0.91. In average, the coefficients of similarity in bulked sample DNA were found higher than in DNA analysis of each plant. It can be caused by the fact, that in the 2nd series the next generation plants were analysed and lines became more genetically distinct.

Homogeneity of genotypes was evaluated in the 2nd series of the RAPD analysis. Coefficient of similarity was calculated according to the results of the RAPD analysis and used for homogeneity evaluation. The most homogeneous were 8 I6 (average coefficient of similarity within line 0.83) and 1 I6 (average in line 0.7) (Table 6).

The most homogeneous sib-line was 11 S4 (coefficient of similarity between plants within line varied between 0.57 to 0.86).

Lines 8 I6 and 11 S4 were the most homogeneous according to the results of molecular analysis.

Multidimensional analysis of genotypes

Genetic relations of selected lines are visible in the dendrogramm generated from the scores of morphological parameters (Fig. 2). All the sib-lines are grouped in the mid part of dendrogramm. This placement of lines represents the point of close related matting: inbreeding segregates the population in different genotypes more strictly than sibbling. Such position of lines prove that line evaluation by using morphological parameters is correct enough. Nevertheless environment and genotype interactions could cause some disadvantages in line evaluation by phenotypical parameters. For more proper comparison of line relativeness, clustering was done for results obtained from the molecular analysis (coefficient of similarity). Common tendencies are clear visible in both of dendrogramms obtained from morphological data and generated from results of molecular analysis in the bulked sample of DNA (Fig. 3). It is clear visible, that inbred-lines are grouped in the side clusters but sib-lines are grouped mostly in the mid part of the dendrogramm.

Results of molecular analysis confirm the tendency of more rapid homogeneisation of lines by using inbreeding. Differences between dendrogramms generated from morphological and molecular data are caused mainly by environment and genotype interaction. Probably, extended amount of evaluated morphological traits would diminish difference between dendrogramms generated from morphological and molecular data. Moreover, differences between dendrogramms can be caused by sensitivity of the RAPD method, heterogeneity of genotypes. It can be also that amplificed DNA fragments do not determine traits evaluated in the field investigations. Nevertheless, obtained results proves significant role of molecular and morphological markers in the investigations of plant homogeneity and genetic linkage.

Accessions for the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants Inbred-lines 2 I6, 3 I6 and 8 I6 and sib-lines 20 S4 and 21(3)z S4 were

selected for the conservation in the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants. These lines were recognised as most homogeneous according both morphological and molecular analysis and also had sufficient yielding parameters. All mentioned lines as well are recommended for seed production of the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'.

CONCLUSIONS 1. Seven inbredlines of 127 generated in total and eight sib-lines of 21

were selected for further phenotypical and molecular investigations. Selected genotypes were on different level of homozygosity and conformity to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'.

2. At the beginning of the investigation several traits were correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru': phenological phases, plant length and branching, and flowering type. These traits were maintained during the homogeneisation of the variety. It indicates to homozygosity of the initial material for these traits.

3. Most heterogeneous and less correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' was the fruit development in clusters. Dramatic improving was reached for this trait during the homogeneisation of the variety.

4. Wart colour was changed quite remarkable during the process of homogeneisation of the variety. During the investigation untypical for the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' fruits (black-prickled) appeared. Possible explanations of such result are following: a) inheritance of black spines is more complicate than monogenic; b) uncontrolled pollination was occured. Probably, impact of suppressors on the dominant alele B is occured.

5. Significant influence of environment conditions was observed on phenological phases, yield, fruit length and diameter, as well as on skin drawing.

6. 26 polymorphic praimers were selected of 53 primers tested in total for performing of the RAPD analysis in the investigated cucumber material. Selected primers generated qualitative amplification products with high polymorphism. One primer (OPAC-09) from 12 selected from the literature did not yield amplification product in the 1st series of the analysis.

7. A method of DNA extraction from cucumber seeds was elaborated. DNA extracted from one seed is of sufficient quality and quantity to perform the analysis of each seed genotype. The method is less

laborious, cheaper and time saving in comparison with the traditional DNA extraction from green leaves.

8. Results of both RAPD series were not identical – common as well as different loci were amplified in both series. In the RAPD analysis of bulked DNA samples more loci were produced in comparison with analysis of DNA extracted from each plant.

9. Repetitiveness of RAPD analysis between both series was quite high: seven primers from nine used in both series yielded more than 65 % of common loci for both 1st and 2nd series.

10. Coefficients of similarity calculated from the results of 1st series were between 0.66 and 0.91, but from 2nd series – between 0.06 and 0.94. It proves that inbreeding and sibling resulted in splitting of the initial material of variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' to diverse genotypes. Some of lines were very homogeneous what was confirmed by high coefficients of similarity between plants within the same genotype.

11. According to the phenotypic evaluation, most correspondent to the variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' and homogeneous were two inbredlines: 2I5 and 3I5. From sib-lines most typical were 20S3 and 21(3)zS3. Additionaly 2I5, 20S3 and 21(3)zS3 were quite homogeneous also according to the molecular analysis.

12. According to the results of 2nd RAPD series the most homogeneous genotype was inbredline 8I5.

13. Three inbredlines as well as two sib-lines were placed in the Latvian Gene Bank of Cultivated Plants: 2 I5 ,3 I5, 8 I5, 20 S3 and 21(3)z S3. All these genotypes are recommended also for seed production.

ACKNOWLEDGEMENTS I am very thankful to my husband Janis for professional and moral support

during the Thesis writing, as well as to my children Robert and Elza for their patientness.

I wish to thank my colleagues in Pūre Horticultural Research Station for their support and assistance. Especially I am thankful to Larisa Bite for assistance in the first steps of investigation. As well as I am thankful to all staff of Plant genetic Laboratory of Latvia University, especially to Tatjana Sjakste for assistance in the performing of molecular analysis.

I am thankful to the Scientific Board of Turkey (TÜBITAK) for the granting of 1st series of RAPD analyses. Also my greatest acknowledgement to colleagues in Turkey: Yildiz Aka- Kacar, Yeshim Mendi and Selim Cetiner, as well as other staff and students.

Zinātnisko publikāciju saraksts / Scientific publications 1. L. Lepse. Methods of renewing and improving of cucumber variety

`Dindoņa Zaļie Ķekaru` // Scientific works of Lithuanian Institute of Horticulture and Lithuanian University of Agriculture.- Nr. 17(2) (1998), p. 60-66.

2. L. Lepse, I. Rashal, M. Baumane. Cucumber genetic resources of Latvian

origin // Acta Horticulturae.- 510 (2000), p. 257-262. 3. L.Lepse. Inbredizācijas un ģimeņu atlases efektivitātes salīdzinājums gurķu

populācijas homogenizēšanā, izmantojot morfoloģiskos un molekulāros (RAPD) marķierus // Zinātne, Latvija, Eiropa: Starptautiskās Zinātniskās konferences referāti, 2000. gada 22. - 24. maijs, Jelgavā, 91.-98. lpp.

4. L. Lepse, M. Baumane, I. Rashal. Restoring morphological characteristics of

the Latvian cucumber variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru' // Acta Biol. Univ. Daugavp.- 1 (2), (2001), p.73-76.

5. L. Lepse, T. Sjakste, I. Rashal. RAPD analyses in some lines of cucumber

variety 'Dindona Zalie Kekaru' // Scientific works of Lithuanian Institute of Horticulture and Lithuanian University of Agriculture.- 20 (3), (2001), p.364-369.

Referāti un ziņojumi zinātniskās konferencēs / Presentations in scientific conferences

1. LLMZA un LLU Lauksaimniecības fakultātes zinātniskā konference,

Jelgava, 1997. Mutisks referāts: L. Lepse, L. Bite. Gurķu selekcijas problēmas un to risinājums Latvijā.

2. 2. Nordic Baltic in situ simposium, 1998 Vilnius, Lithuania. Stenda referāts: L. Lepse. Genetic diversity of vegetables of Latvian origin in Latvia from 1930 to 1997.

3. International conference on vegetable breeding, 1998 Babtai, Lithuania. Mutisks referāts: Methods of renewing and improwing of cucumber variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'.

4. 1st International meeting of young scientists in horticulture, 1998 Lednice, Check Republic. Stenda referāts: Lepse L. Historical developement and achievements in cucumber growing, breeding and introduction in Latvia.

5. Proceedings of the VIII Scientific Horticulture Plant Breeding Symposium "Horticulture Plant Breeding to start with XXI Century"

1999 Lublin, Poland. Stenda referāts: Liga Lepse. Evaluation of cucumber and onion genetic material of Latvian origin.

6. LLMZA un LLU Lauksaimniecības fakultātes zinātniskajā konferencē Jelgavā, 1999. gadā. Mutisks referāts: L. Lepse, M. Baumane, Ī. Rašals. Dārzeņu ģenētisko resursu saglabāšanas problēmas un to risinājumi.

7. 2nd International conference of PhD students University of Miskolc, Hungary, 1999. Mutisks referāts: L. Lepse, M. Baumane, I. Rashal. Evaluation of vegetable genetic resources of the Latvian origin.

8. VII EUCARPIA meeting on Cucurbit Genetics & Breeding, Israel, 2000. Mutisks referāts: L. Lepse, M. Baumane, I. Rashal. Cucumber genetic resources of Latvian origin.

9. Doktorantu Zinātniskā konference "Latvija, Zinātne, Eiropa" Jelgavā, 2000. Mutisks referāts: L. Lepse. Inbredizācijas un ģimeņu atlases efektivitātes salīdzinājums gurķu populācijas homogenizēšanā, izmantojot morfoloģiskos un molekulāros (RAPD) marķierus.

10. International workshop on molecular biology and biotechnology in agriculturally important organisms, Lithuania, Kaunas, 2000. Mutisks referāts: L. Lepse, I. Rashal. Detection of genetic variability by RAPD markers in cucumber.

11. International conference "Research and conservation of biological diversity in Baltic Region" Daugavpils, Latvia, 2001. Mutisks referāts: L. Lepse, T. Sjakste. I. Rashal. Evaluation of genetic resources of cucumber (Cucumis sativus) by using morphological and molecular (RAPD) markers.

12. EUCARPIA section genetic resources "Broad Variation and Prescise Characterisation – Limitation for the Future", Poznan, Poland, 2001. Stenda referāts: L. Lepse, I. Rashal. Collection and evaluation of vegetable genetic resources of Latvian origin.

13. International scientific conference "Genetic Variability and Control Problems in Breeding of Horticultural Plants", Lithuanuia, Babtai, 2001. Stenda referārts: L. Lepse, T. Sjakste, I. Rashal. RAPD analyses in some lines of cucumber variety 'Dindona Zalie Kekaru'.

14. International symposium "Molecular Mechanism of Genetic Processes and Biotechnology" Moscow, 2001. Stenda referāts: L. Lepse, T. Sjakste, I. Rashal. Evaluation of genetic diversity in cucumber by using morphological and molecular markers.

15. The 3rd Genetical Congress of Baltic States, Vilnius, Lithuania, 2002. Stenda referāts: L. Lepse, I. Rashal. Homogeneisation of the old cucumber variety 'Dindoņa Zaļie Ķekaru'.