Templat tugas akhir S1

1

6

7

ii

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2015SYAFIRA SALSABILA (G84130036)EMA LINDAWATI (G84110010)PENENTUAN PROTEIN METODE LOWRY

PENDAHULUANProtein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Karena protein disusun oleh asam amino yang berbeda secara kimiawinya, maka suatu protein akan terangkai melalui ikatan peptida dan bahkan terkadang dihubungkan oleh ikatan sulfida. Selanjutnya protein bisa mengalami pelipatan-pelipatan membentuk struktur yang bermacam-macam. Adapun struktur protein meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier, dan struktur kuartener. Struktur primermerupakan struktur yang sederhana dengan urutan-urutan asam amino yang tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi percabangan rantai. Struktur primer terbentuk melalui ikatan antara gugus amino dengan gugus karboksil. Ikatan tersebut dinamakan ikatan peptida atau ikatan amida (Berget al. 2006). Struktur ini dapat menentukan urutan suatu asam amino dari suatu polipeptida (Voet & Judith 1995).Struktur sekundermerupakan kombinasi antara struktur primer yang lineardistabilkan oleh ikatan hidrogen antara gugus =CO dan =NH di sepanjang tulang belakang polipeptida. Salah satu contoh struktur sekunder adalah -heliks dan -pleated. Struktur ini memiliki segmen-segmen dalam polipeptidayang terlilit atau terlipat secara berulang (Khopkar 2007). Struktur tersierdari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino. Struktur ini merupakan konformasi tiga dimensi yang mengacu pada hubungan spasial antar struktur sekunder. Struktur ini distabilkan oleh empat macam ikatan, yakni ikatan hidrogen, ikatan ionik, ikatan kovalen, dan ikatan hidrofobik. Dalam struktur ini, ikatan hidrofobik sangat penting bagi protein. Asam amino yang memiliki sifat hidrofobik akan berikatan di bagian dalam protein globuler yang tidak berikatan dengan air, sementara asam amino yang bersifat hodrofilik secara umum akan berada di sisi permukaan luar yang berikatan dengan air di sekelilingnya (Murrayet al 2009). Struktur kuarterneradalah gambaran dari pengaturan sub-unit atau promoter protein dalam ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari sub-unit protein dengan struktur tersier yang akan membentuk protein kompleks yang fungsional. ikatan yang berperan dalam struktur ini adalah ikatan nonkovalen, yakni interaksi elektrostatis, hidrogen, dan hidrofobik. Protein dengan struktur kuarterner sering disebut juga dengan protein multimerik. Jika protein yang tersusun dari dua sub-unit disebut dengan protein dimerik dan jika tersusun dari empat sub-unit disebut dengan protein tetramerik (Lodishet al. 2003).Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat, menghasilkanheteropoly-molybdenum blueakibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dantyrosine-nya. Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein (Lowry et al. 1951). Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Inilah yang menyebabkan penentuan kadar protein metode Lowry dapat dilakukan di dua panjang gelombang spektrofotometer. Warna yang diserap maksimum oleh larutan pada panjang gelombang 500 nm adalah warna hijau kebiruan atau hijau dengan warna komplementernya merah atau ungu-kemerahan (Rahayu 2005). Warna yang terlihat pada larutan adalah tidak berwarna.Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan metode Lowry, yaitu dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar.

METODEBahan dan AlatAlat-alat yang dipakai yaitu tabung reaksi, pipet Mohr, bulb, Spectro UV-VIS Genesys 10 UV, Vortex Vibrifix VFI electronic. Bahan yang digunakan adalah akuades, BSA, protein sampel, reagen C, dan reagen D.

Prosedur PenelitianPembuatan Kurva StandarSebanyak 7 buah tabung reaksi yang bersih dan kering disiapkan dan diberi label 0, 20, 40, 60, 100, 120, 140. Larutan standar 0 g/ml dibuat dari 10 ml akuades. Larutan standar 20 g/ml dibuat dari 0,20 ml BSA yang diencerkan dengan 9,80 ml akuades. Larutan standar 40 g/ml dibuat dari 0,40 ml BSA yang diencerkan dengan 9,60 ml akuades. Larutan standar 60 g/ml dibuat dari 0,60 ml BSA yang diencerkan dengan 9,40 ml akuades. Larutan standar 100 g/ml dibuat dari 1,00 ml BSA yang diencerkan dengan 9,00 ml akuades. Larutan standar 120 g/ml dibuat dari 1,20 ml BSA yang diencerkan dengan 8,80 ml akuades. Larutan standar 140 g/ml dibuat dari 1,40 ml BSA yang diencerkan dengan 8,60 ml akuades. Setiap larutan tersebut dihomogenkan dengan Vortex kemudian dipindahkan sebanyak 1 ml ke dalam masing-masing tabung berlabel sesuai dengan konsentrasinya. Lalu 5 ml reagen C ditambahkan ke dalamnya dan diinkubasi selama 10 menit, ditambahkan 0,5 ml reagen D ke dalamnya dan diinkubasi kembali selama 30 menit. Kemudian nilai absorbansi tiap tabung dibaca pada panjang gelombang 500 nm dan dicatat hasil pembacaannya.Penentuan Konsentrasi Protein SampelSebanyak 3 buah tabung bersih dan kering disiapkan dan diberi label 1, 2, 3. Tabung 1 diisi dengan 1 ml protein sampel, sedangkan tabung 2 dan 3 diisi dengan protein sampel yang diencerkan terlebih dahulu. Sebanyak 5 ml protein sampel diencerkan dengan 5 ml air, dihomogenkan dengan menggunakan Vortex dan dipindahkan ke dalam tabung 2 sebanyak 1 ml. Kemudian sebanyak 2,50 ml protein sampel diencerkan dengan 7,50 ml air, dihomogenkan dengan menggunakan Vortex dan dipindahkan ke dalam tabung 3 sebanyak 1 ml. Disediakan juga tabung berisi 1 ml akuades sebagai blangko. Lalu larutan pada setiap tabung ditambah 5 ml reagen C, diinkubasi selama 10 menit, ditambah 0,50 ml reagen D dan diinkubasi kembali selama 30 menit. Kemudian nilai absorbansi tiap tabung dibaca pada panjang gelombang 500 nm dan dicatat hasil pembacaannya.(3 enter)

HASIL DAN PEMBAHASANTabel 1 Hasil pengukuran absorbansi deret standar protein (BSA) metode Lowry pada panjang gelombang 500 nmNo.Nama sampelKonsentrasi (g/mL)AbsorbansiAbsorbansi terkoreksi

1Standar 1 (blangko)00.0350

2Standar 2200.033-0,002

3Standar 3400.0480,013

4Standar 4600.0520,017

5Standar 51000.0580,023

6Standar 61200.1090,074

7Standar 71400.0660,031

Contoh Perhitungan :Absorbansi terkoreksi = Absorbansi sampel Absorbansi blangko= 0.033 0.035= - 0.002Pengenceran [BSA] g/ml[BSA] stok = 1 g/ml = 1000 g/mlN1 = 1000 g/mlN2 = 20 g/mlV2 = 10 mlV1 x N1=V2 x N2V1=== 0.20 mlJadi, 0.20 ml 1000 g/ml ditera dengan akuades (9.80 ml) sampai total 10.00 ml.

Gambar 1 Hubungan antara konsentrasi protein dalam g/mL dengan absorbansinya pada spektrofotometer UV-VIS Genesys 10 UV dengan panjang gelombang 595 nm.Tabel 2 Hasil pengukuran absorbansi protein sampel metode Bradford pada panjang gelombang 500 nmNo.Nama SampelUlanganAbsorbansiAbsorbansi TerkoreksiRata-rata Absorbansi TerkoreksiKonsentrasi Protein (g/ml)

1Blanko10.050000

20.0500

2Sampel 1(1 ml)10.1010.0510.0625165.5

20.1240.074

3Sampel 2(0.50 ml)10.0640.0140.0195116.0

20.0750.025

4Sampel 3 (0.25 ml)10.0530.0030.00367.0

20.0530.003

Contoh PerhitunganAbsorbansi terkoreksi = Absorbansi sampel Absorbansi blangko= 0.101 0.050= 0.051Rata-rata Absorbansi terkoreksi = = = 0.0625y= a + bx ; x = Konsentrasi protein, y = Rata-rata absorbansi terkoreksiy = 0,0004x - 0,0037Rata-rata A terkoreksi= intersep + slope . Konsentrasi proteinKonsentrasi protein = = = 165.5 g/mlKonsentrasi protein sebenarnya= Konsentrasi protein x Faktor Pengenceran= 165.5 x = 165.5 g/ml

Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru karena menghasilkanheteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik terkatalis Cu, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry dkk 1951). Panjang gelombang 500 nm merupakan panjang gelombang maksimal dimana serapan optimal sehingga absorbansi dapat dibaca pada spektrofotometer UV-VIS (Irwan -).Dalam percobaan ini, dilakukan dua macam perlakuan, yaitu membuat larutan standar dan protein sampel. Dua macam larutan ini sama-sama diberikan reagen C, diinkubasi 10 menit, diberikan reagen D, dan diinkubasi 30 menit. Fungsi perlakuan pertama (larutan standar) adalah untuk membuat kurva standar berdasarkan hasil pembacaan nilai absorbansinya, sedangkan perlakuan kedua (protein sampel) digunakan untuk mengetahui konsentrasi protein sebenarnya dalam campuran. Reagen C merupakan campuran antara reagen A dan reagen B, sementara reagen D merupakan hasil pengenceran reagen Folin-Ciocalteu dalam asam. Fungsi reagen C yaitu untuk membentuk warna kebiruan pada larutan. Reagen D yang mengandung reagen Folin-Ciocalteu merupakan pereaksi kompleks yang berisi fosfomolibdat dan fosfotungstat. Fungsi dari reagen ini adalah membentuk kompleks warna biru yang disebabkan dari reaksi antara tirosin yang ada dalam protein dengan fosfomolibdat dan fosfotungstat (Rohman 2007).Kurva standar dihasilkan dari hubungan antara konsentrasi larutan protein standar dan nilai absorbansi yang dihasilkannya. Persamaan yang didapatkan pada percobaan ini adalah y = 0,0004x - 0,0037 dengan nilai R hanya sebesar 0.6064. Berdasarkan teori, semakin besar konsentrasi larutan uji, maka semakin besar pula nilai absorbansinya (Khopkar 2007). Hasil pengukuran absorbansi deret standar protein metode Lowry pada panjang gelombang 500 nm dapat dilihat di Tabel 1. Nilai absorbansi yang didapatkan tidak selalu berbanding lurus dengan konsentrasi larutan sehingga dapat dikatakan percobaan kurang sesuai dengan teori. Hal ini berpengaruh pada koefisien korelasi (r) yang didapatkan. Nilai regresi standar (r) yang didapatkan cukup kecil, yaitu 0.7787 % berada jauh di luar standar minimal yang besarnya 0.995 %. Nilai ini menunjukkan rendahnya ketepatan percobaan atau adanya penyimpangan selama percobaan yang mungkin disebabkan oleh kesalahan yang berasal dari praktikan. Kesalahan yang mungkin terjadi adalah kesalahan dalam pengenceran protein BSA, biasanya dalam hal volume BSA yang digunakan. Selain itu, praktikan kurang cermat dalam menggunakan kadar reagen C dan kadar reagen D, serta larutan yang terkontaminasi.Hasil pengukuran absorbansi protein sampel metode Lowry pada panjang gelombang 500 nm dapat dilihat di Tabel 2. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai absorbansi semakin meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi protein sampel pada setiap tabung. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa semakin banyak volume protein sampel dalam campuran, jumlah protein yang terlarut akan semakin sedikit, sehingga nilai absorbansinya semakin besar. Tabung 1 berisi 0 ml protein sampel berfungsi sebagai blangko dan memiliki nilai absorbansi terukur 0 dan konsentrasi protein 0 g/ml, tabung 2 berisi Sampel 1 dengan kadar protein 100 % dalam campuran memiliki rata-rata nilai absorbansi terkoreksinya 0.0625 dan konsentrasi protein 165.5 g/ml, tabung 3 berisi Sampel 2 dengan kadar protein 50 % dalam campuran memiliki rata-rata nilai absorbansi terkoreksinya 0.0195 dan konsentrasi protein 116.0 g/ml, tabung 4 berisi Sampel 3 dengan kadar protein 25 % dalam campuran memiliki rata-rata nilai absorbansi terkoreksinya 0.003 dan dan konsentrasi protein 67.0 g/ml. Hasil percobaan sesuai dengan teori bahwa semakin sedikit kadar protein yang terlarut, semakin kecil nilai absorbansinya (Khopkar 2007).

SIMPULAN DAN SARANSimpulanKadar protein dari suatu sampel bisa ditentukan dengan beberapa metode, salah satunya metode Lowry. Metode Lowry menggunakan prinsip spektrofotometri untuk melihat nilai absorbansi dan hubungannya dengan kadar protein heteropoly-molybdenum blue yang dihasilkan. Konsentrasi protein sampel dapat ditentukan setelah membuat kurva standar dari percobaan. Berdasarkan data dan hasil percobaan, dapat disimpulkan bahwa semakin besar konsentrasi protein dalam sampel, semakin tinggi nilai absorbansinya.

SaranSebaiknya alat spektrofotometer disediakan lebih dari satu sehingga praktikan tidak menunggu lama untuk menggunakannya setelah menyiapkan sampel yang akan diukur absorbansinya.

DAFTAR PUSTAKABerg, J.M., J.L. Tymoczko, and L. Stryer. 2006. Biochemistry 5th Ed. New York (USA): W.H. Freeman and CompanyIrwan R. -. Pengaruh penambahan MnCl2 terhadap produksi enzim protease dari Bacillus licheniformis HSA3-1a. Jurnal Ilmiah Biokimia Universitas Hasanudin. (-):-Khopkar S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Pr.Lodish et al. 2003. Molecullar Cell Biology Fifth Edition. New York (USA): WH Freeman&CompanyLowry , Rosenbrough , Farr, Randall. 1951.Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. New York (USA): Kluwer Academic Publishers.Murray RK. et.al. 2009. Harpers Illustrated Biochemistry 28 th ed. New York (USA) : Lange Medical Publications, hlm. 155, 459Rahayu A, Suranto, Purwoko T. 2005. Analisis karbohidrat, protein, dan lemak pada pembuatan kecap lamtoro gung (Leucaena leucocephala) terfermentasi Aspergillus oryzae. Bioteknologi. 2(1): 14-20.Rohman. 2007.Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta (ID): Pustaka PelajarVoet D. & Judith G. Voet. 1995. Biochemistry 2nd edition. New York (USA): John Wiley & Sons, Inc. p. 795-822

Lampiran 1 Rancangan kerja Penentuan Protein Metode Lowry