Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Angka Lempeng Total

LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PRAKTIKUM X

UJI ANGKA LEMPENG TOTAL

Penyusun :

1. Annisa Nilamsari Utami 14/362870/FA/10026 (……)

2. Muhammad Faishal Mahdi 14/362873/FA/10029 (……)

3. Cinantya Talia Paramita 14/362879/FA/10035 (……)

Kelas : A

Golongan / Kelompok : II / 2

Hari, Tanggal Praktikum : Rabu, 20 Mei 2015

Dosen Jaga : Dr. rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si., Apt.

Asisten Jaga : Dita dan Dwi

Asisten Koreksi :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2015

PRAKTIKUM X

UJI ANGKA LEMPENG TOTAL

I. Tujuan

Menetapkan cemaran bakteri yang terdapat dalam sediaan makanan, minuman,

kosmetika, obat atau obat tradisional.

II. Dasar Teori

Pertumbuhan bakteri dengan berbagai cara yang salah satunya yaitu uji angka

lempeng total. Pengukuran dengan platting technique (uji angka lempeng total) merupakan

metode perhitungan jumlah sel tampak (visible) dan didasarkan pada asumsi bahwa bakteri

hidup akan tumbuh, membelah, dan memproduksi satu koloni tunggal. Satuan perhitungan

yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit) dengan cara membuat seri pengenceran

sampel dan menumbuhkan sampel pada media padat. Pengukuran dilakukan pada plate

dengan jumlah koloni berkisar 25-250 atau 30-300 (Pratiwi, 2008).

Uji angka lempeng total (ALT) merupakan metode yang umum digunakan untuk

menghitung adanya bakteri yang terdapat dalam sediaan yang diperiksa. Uji angka lempeng

total dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu teknik cawan tuang (pour plate) dan teknik

sebaran (spread plate). Pada prinsipnya dilakukan pengenceran terhadap sediaan yang

diperiksa kemudian dilakukan penanaman pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri

yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.

Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300. Titik

angka lempeng total dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan

dengan faktor pengenceran. Jumlah angka lempeng total memenuhi aturan Departemen

Kesehatan RI jika kurang dari 106 (Jawetz dkk., 1995).

Prinsip dari metode cawan tuang adalah bila sel ditumbuhkan pada medium, maka

mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung

dan kemudian dihitung tanpa menggunakan mikroskop.

Metode ini merupakan cara yang paling sensitive untuk menentukan jumlah jasad

renik, dengan alasan :

a. Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung.

b. Beberapa jasad renik dihitung sekaligus.

c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk

mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik.

Selain keuntungan-keuntungan di atas, metode hitungan cawan juga mempunyai

kelemahan :

a. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel

yang berdekatan mungkin membentuk koloni.

b. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda

pula.

c. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk

koloni yang kompak, jelas, dan tidak menyebar.

d. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lama agar pertumbuhan koloni

dapat dihitung.

Sementara teknik sebaran dilakukan dengan cara menuangkan media terlebih dahulu

kemudian setelah media memadat baru suspensi sampel dimasukkan pada permukaan agar

dan diratakan dengan spreader glass.

Keuntungan metode spread plate:

a. Sampel yang dibutuhkan hanya sedikit

b. Cocok untuk segala macam bakteri

c. Tidak terpengaruh suhu.

Kerugian metode spread plate:

a. Perlu menggunakan spreader glass

b. Perlu keahlian khusus dalam peralatan sampel agar media tidak rusak (Pratiwi, 2008).

Syarat-syarat metode yang baik adalah :

a. Susunan makanan harus terpenuhi untuk pertumbuhan bakteri, missal sumber nitrogen

dan sumber karbon.

b. Tekanan osmosis harus isotonis

c. Derajat keasaman (pH) relatif netral

d. Temperatur inkubasi sekitar 37°C

e. Sterilitas harus terjaga dengan mengerjakannya secara aseptis.

III. Alat dan Bahan

A. Alat

1. Kotak aseptis

2. Laminar Air Flow (LAF)

3. Tabung reaksi (12 buah)

4. Cawan petri (14 buah)

5. Gelas ukur 10 mL (1 buah)

6. Mikropipet dan blue tip

7. Vortex

B. Bahan

1. Sampel uji, berupa isi dari Calhaid® kapsul

2. Pelarut ASA (Air Suling Agar) 0,05%

3. Media PCA (Plate Count Agar)

IV. Cara Kerja

Ditimbang 1 gram sampel yang akan diperiksa, dicampur dengan 10 mL ASA 0,05%

Di-vortex campuran sampel dan larutan pengencer hingga homogen

Dilakukan pengenceran seri hingga 10-5, direplikasi sebanyak satu kali

Diambil sebanyak 1 mL sampel uji dari masing-masing tabung, dituangkan ke dalam cawan

petri yang telah ditandai untuk tiap konsentrasi dan seri pengenceran

Dicairkan media PCA, ditunggu hingga suhunya sekitar 40°C

Dituang 10 mL media PCA cair ke dalam tiap-tiap cawan petri, dibiarkan memadat

Dibuat kontrol media dan kontrol pelarut

Diinkubasi petri selama 24 jam pada suhu ± 37°C dalam posisi terbalik

Dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada masing-masing cawan petri

V. Hasil Pengamatan

Gambar 1. Sampel uji dengan pengenceran 10-1 setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni pada

seri pengenceran pertama (kiri) adalah 120 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 213.









Gambar 6. Kontrol media (kanan) dan kontrol pelarut (kiri) setelah diinkubasi selama jam. Kedua

kontrol bebas dari koloni bakteri.

Gambar 7. Larutan stok sampel uji (tidak diencerkan) setelah diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni

pada seri pengenceran pertama (kiri) adalah 200 dan pada seri pengenceran kedua (kanan) adalah 277

Pengamatan dilakukan setelah sampel diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu ±

37°C. Data jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing konsentrasi sampel uji

dihimpun dalam tabel berikut ini.

Konsentrasi Seri ke Jumlah koloni Memenuhi syarat perhitungan ALT?

10-1I 120 Ya, karena > 30 dan < 120

II 213 Ya, karena > 30 dan < 120

10-2I 20 Tidak, karena < 30

II 17 Tidak, karena < 30

10-3I 87 Ya, karena > 30 dan < 120






Pada tingkat pengenceran 10-1, kedua cawan petri menghasilkan jumlah koloni

antara 30-300. Untuk mendapatkan nilai ALT-nya, jumlah koloni rata-rata dari kedua

cawan petri dikalikan dengan faktor pengenceran. Perhitungannya adalah sebagai

berikut:

Rata−rata jumlahkoloni=120+2132

=3332

=166,5 koloni

ALT=Jumlah koloni ×

1faktor pengencer

gram sampel=

166,5 ×1

10−1

1=1665 CFU /mL

Berdasarkan data yang terdapat dalam tabel tersebut, sampel uji yang diperiksa

memiliki ALT lebih kecil daripada yang ditetapkan oleh Departemen Kesehatan

Republik Indonesia yaitu 106 CFU/mL, tidak melebihi ambang batas konsumsi.

VI. Pembahasan

Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan cemaran bakteri dalam sampel

yang diuji. Menurut Departemen Kesehatan Republik Indonesia, suatu sediaan dianggap

aman untuk dikonsumsi jika ALT-nya kurang dari 106 CFU/mL (Anonim, 1992).

Sampel yang diuji dalam praktikum kali ini adalah Calhaid® kapsul produksi PT PJT Dr.

Sardjito, mengandung Ekstrak Sonchi Folium sebanyak 385 mg, Ekstrak Curcumae

Rhizoma sebanyak 100 mg dan Saccharum lactis (gula susu) sebanyak 15 mg tiap kapsul.

Metode yang digunakan untuk menentukan AKK-nya adalah pour plate, yaitu teknik

menumbuhkan bakteri dengan menambahkan suspensi bakteri dalam media kemudian

dipadatkan (Leboffe & Pierce, 2010).

Percobaan dilakukan secara aseptis; tahap pengenceran sampel uji dilakukan di dalam

kotak aseptis dan proses pencampuran sampel uji dengan media serta pembuatan kontrol

dilakukan dalam LAF (Laminar Air Flow), alat yang memiliki pola pengaturan dan

penyaring aliran udara untuk menciptakan area yang bebas mikroba; serta dilengkapi lampu

UV yang berfungsi sebagai germisida, dinyalakan selama 15-20 menit beberapa jam

sebelum digunakan, sehingga cocok untuk pekerjaan aseptis yang membutuhkan kondisi

steril (Nair, 2005). Digunakan kotak aseptis pada tahap pengenceran sampel karena saat

praktikum dilaksanakan LAF yang tersedia tengah digunakan oleh kelompok yang

mengerjakan percobaaan lain. Tangan praktikan serta peralatan yang digunakan disemprot

terlebih dahulu dengan alkohol sebelum masuk ke dalam kotak aseptis dan LAF, tujuannya

adalah mensterilkan segala hal yang masuk ke dalam kedua alat tersebut dari cemaran

mikroba untuk menghindari kontaminasi.

Langkah pertama adalah menimbang 1 gram sampel yang akan diuji, yaitu isi dari kapsul

Calhaid®, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 10 mL larutan pengencer

ASA (Air Suling Agar 0,05%) dan di-vortex agar kedua bahan tersebut tercampur secara

homogen. Digunakan ASA 0,05% karena zat ini memiliki pH dan tekanan osmotik yang

sesuai dengan kondisi pertumbuhan bakteri. Campuran ini menjadi larutan stok.

Langkah selanjutnya adalah pengenceran seri yang bertujuan untuk memperkecil populasi

mikroba juga mempersempit area uji sehingga koloni bakteri yang dihasilkan tidak

bertumpuk dan mudah untuk diamati. Diambil 1 mL campuran dari tabung larutan stok, lalu

dipindahkan ke dalam tabung pertama sehingga konsentrasinya menjadi 10-1; selanjutnya

diambil 1 mL campuran dalam tabung reaksi pertama, lalu dipindahkan ke dalam tabung

kedua sehingga konsentrasinya menjadi 10-2; demikian seterusnya hingga diperoleh sampel

uji dengan konsentrasi 10-5. Prosedur ini direplikasi sebanyak satu kali sebagai pembanding.

Kemudian dari setiap tabung diambil 1 mL campuran dan dimasukkan ke dalam cawan

petri.

Berikutnya dipanaskan media PCA (Plate Count Agar) yang berfungsi sebagai media

pertumbuhan bakteri hingga mencair. Media ini mengandung 5 g Tryptone, 2,5 g yeast

extract, 1 g dekstrosa (glukosa) dan 15 g agar per liter (Harley & Prescott, 2001). Sebelum

ditambahkan dengan sampel yang berada dalam cawan petri, media yang telah mencair

tersebut didiamkan terlebih dahulu hingga suhunya mencapai ± 40°C. Apabila terlalu panas

bakteri dapat mati sedangkan apabila terlalu dingin media akan memadat kembali.

Media cair PCA yang telah mencapai suhu ± 40°C kemudian dituangkan ke dalam cawan

petri yang telah berisi sampel uji; setiap cawan petri diisi dengan 10 mL media cair PCA.

Selain itu dibuat kontrol media dengan menuangkan 10 mL media cair PCA pada cawan

petri tanpa penambahan apapun serta kontrol pelarut dengan meneteskan 1 mL pelarut ASA

lalu ditambahkan 10 mL media cair PCA. Fungsi kedua kontrol ini adalah mengetahui

apakah media dan pelarut yang digunakan telah terkontaminasi oleh bakteri atau tidak.

Selanjutnya cawan petri digoyangkan agar media merata dan homogen dengan sampel.

Setelah itu cawan petri ditutup dan direkatkan dengan selotip untuk menghindari masuknya

kontaminan. Seluruh cawan petri kemudian diinkubasi pada suhu ± 37°C selama 24 jam;

suhu tersebut merupakan suhu optimum pertumbuhan bakteri dan rentang waktu 24 jam

diasumsikan cukup untuk perkembangbiakan bakteri, namun fungi tidak dapat tumbuh

optimal pada suhu tersebut sehingga penambahan bahan antifungi tidak diperlukan. Saat

inkubasi cawan petri diletakkan dalam kondisi terbalik agar air atau uap air yang terbentuk

akan menempel pada tutup cawan petri alih-alih di permukaan media; sebab permukaan

media yang terbasahi air akan mengganggu pertumbuhan koloni bakteri.

Berdasarkan hasil pengamatan, koloni tumbuh pada semua cawan petri yang berisi

sampel uji kecuali pada seri pengenceran kedua dengan konsentrasi 10-4 dan 10-5; sedangkan

kedua kontrol bersih dari pertumbuhan bakteri yang menunjukkan bahwa media dan pelarut

yang digunakan bebas dari kontaminan. Karena hanya sampel dengan konsentrasi

konsentrasi 10-1 yang kedua seri pengencerannya memiliki jumlah koloni dalam kisaran 30-

300, maka ALT ditentukan dengan merata-ratakan jumlah koloni dari kedua cawan petri

pada tingkat pengenceran tersebut lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Diperoleh

nilai ALT sebesar 1665 CFU/mL, yang masih dibawah ambang batas aman konsumsi yang

telah ditetapkan oleh Departemen Kesehatan Republik Indonesia yaitu 106 CFU/mL

sehingga dapat disimpulkan bahwa sediaan ini aman untuk dikonsumsi.

VII. Kesimpulan

1. Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui apakah sampel yang diuji tercemar bakteri

lebih dari ambang batas konsumsi yang telah ditetapkan oleh Departemen/Kementerian

Kesehatan Republik Indonesia yaitu 106 CFU/mL.

2. Angka Lempeng Total (ALT) dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri dikalikan faktor

pengenceran per bobot sampel dalam gram.

3. Metode penentuan ALT yang diaplikasikan dalam praktikum ini adalah metode pour

plate (teknik cawan tuang)

4. Sampel yang diuji memiliki nilai ALT sebesar 1665 CFU/mL, kurang dari 106 CFU/mL

sehingga sampel tersebut, yaitu Calhaid® kapsul aman untuk dikonsumsi.

VIII. Daftar Pustaka

Anonim, 1992, Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi, Pusat Pemeriksaan

Obat dan Makanan Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Harley, J.P. & Prescott, L.M., 2001, Laboratory Exercise in Microbiology, 5th ed.,

McGraw-Hill, New York.

Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., Brooks, G.F., Butel, J.S. & Ornston, L.N.,

1995, Mikrobiologi Kedokteran, edisi keduapuluh, diterjemahkan oleh Nugroho &

R.F. Maulany, EGC, Jakarta.

Leboffe, M.J. & Pierce, B.E., 2010, Microbiology: Laboratory Theory & Application, 3rd

ed., Morton Publishing, Colorado.

Nair, J., 2005, Comprehensive Biotechnology Class XII, Firewall Media, New Delhi.

Pratiwi, S.T., 2008, Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta.

Yogyakarta, 26 Mei 2015

Praktikan,

1. Annisa Nilamsari Utami (10026) (………)

2. Muhammad Faishal Mahdi (10029) (………)

3. Cinantya Talia Paramita (10035) (………)

Documents

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Angka Lempeng Total