Cara-cara pengisolasian mikroba

       Dalam artikel ini kita akan banyak membahas tentang Mempelajari Bagaimana cara-

cara pengisolasian mikroba   yang nantinya bisa kita manfaatkan untuk mengembangbiakan

mikroba itu sendiri Selain itu juga diharapkan dengan adanya artikel ini kita juga

bisa mengetahui dan dapat melakukan teknik-teknik dalam mengisolasi mikroba yang

nantinya bisa bermanfaat dan dapat kita aplikasikan dalam kehidupan sehari-hari

II.          Landasan teori

Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala

laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu

biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat bakteri yang kita butuhkan tersebut tanpa

adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan

istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrient

yang disyaratkan bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang ,menyediakan kondisi

optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar, 1986).

Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, substrat yang berupa

bahan pangan, tanaman, dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri,

khamir, kapang, dan sebagainya. populasi dari mikroba yang ada di lingkungan ini

sangatlah beranekaragam sehingga dalam mengisolasi dierlukan beberapa tahap

penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini

kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk

mengisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap

suatu antibiotic (Ferdiaz, 1992).

Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar

dari lingkungan alamiahnya. Pemisahan mikroorganisme dari lingkungan ini bertujuan

untuk memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri lainnya

dan disebut biakan murni. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis

mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari camouran bermacam-macam mikroba.

Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba

akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya (Nur dan Asnani, 2007).

 

Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan

campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan

metode cawan tuang. Yang didasarkan padda prinsip pengenceran dengan maksud untuk

memperoleh spesies individu. Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari

satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto, 2004).

Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain digunakan

dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi, fisiologi,

dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies (Dwijoseputro, 2005).

Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu antara

lain:

1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi.

2. Tempat hidup atau asal mikrobatersebut.

3. Medium pertumbuhan yang sesuai.

4. Cara menginkubasi mikroba.

5. Cara menginokulasi mikroba.

6. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dan

sesuai dengan yang dimaksud.

7. Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan kultur

murni.

Metode Isolasi mikroba

Menurut hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk memperoleh biakan

murni yaitu:

1.    Metode cawan gores

Metode ini mempunyai dua keuntungan, yanti menghemat bahan dan waktu. metode

cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya

mikroorganisme yang diinginkan.

2.    Metode cawan tuang

Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah

dengan mengencerkan specimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan

(±500C) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam

specimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perku dilakukan

beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu diantara cawan tersebut mengandung

koloni terpisah diatas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan

dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi.

3.    Teknik sebar (spread plate)

Teknik isolasi mikroba dengan cara menyebarkan mikroba pada permukaan media yang

akan digunakan.

4.    Teknik pengenceran (dilution method)

Suatu sampel dari suatu suspense yang berupa campuran bermacam-macam spesies

diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian

diambil kira-kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini

diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan

mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam medium tersebut, akan tetapi

mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini

dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin bahwa koloni tunggal yang kita

peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran

dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.

5.    Teknik micromanipulator

Mengambil satu bakteri dengan mikropipet yang ditempatkan dalam micromanipulator,

kemudian ditempatkan dalam micromanipulator, kemudian dipempatkan dalam medium

encer untuk dibiakkan.

Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua

pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan

suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut

dikenal dengan isolasi mikroba.

Berbagai macam cara dalam mengisolasi mikroba, yaitu:

1.         Isolasi pada agar cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengnecerkan mikroorganisme

sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap

koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu

sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: metode

gores kuadran, dan metode agar cawan tuang. Metode gores kuadran, merupakan metode

yang dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi mikroorganisme, dimana setiap

koloni berasal dari satu sel. Metode agar tuang berbeda dengan metode gores kuadran,

cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (500C) yang

kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang

terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan/di dalam cawan.

2.         Isolasi pada medium cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada

agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga

perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi

pegenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

3.         Isolasi sel tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran

besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel

mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel

tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun

micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.

III.          Alat dan bahan

Alat:

Jarum inokulasi

Pembakar Bunsen/spritus

Orbital shaker

Tabung reaksi

Cawan petri

Incubator

Pemanas air

Pipet volume 1 mL

Spreader

Bahan:

Media NB steril

Biakan bakteri

Media nutrient agar miring

Media NA steril

Kapas

Cara kerja dalam praktek mengisolasi mikroba

a.         Isolasi ke media cair

1.       Memegang jarum inokulasi dan tabung berisi biakan bakteri

2.       Memanaskan jarum inokulasi

3.       Memasukkan jarum inokulasi ke dalam tabung bakteri

4.       Jarum diangkat, memanaskan mulut tabung dekat api

5.       Tabung ditutup dengan kapas

6.       Mengambil media NB dengan tangan kiri dan buka

7.       Memanaskan mulut labu media

8.       Memasukkan ujung jarum inokulasi

9.       Mengangkat jarum

10.   Memanaskan mulut labu dan menutupnya

11.   Kultur diinkubasi pada temperature tertentu sambil digoyang dalam orbital shaker.

b.        Isolasi ke media padat

b1.   Agar miring

1.       Secara steril gesekkan jarum inokulasi ke biakan bakteri di atas permukaan agar

miring ke dalam tabung reaksi pertama dengan cara zigzag.

2.       Tabung kedua merupakan tabung control.

3.       Kedua tabung diinkubasi pada temperature 370C selama 48 jam.

4.       Baakteri berkembang biak dan berkoloni.

b2.   Agar dalam cawan petri

1.       Memanaskan tabung-tabung berisi agar dalam pemanas 1000C hingga agarnya

mencair.

2.       Membuka bungkusan cawan petri dan tempatkkan di atas meja.

3.       Mengambil satu tabung berisi media agar, dan dinginkan sampai suhunya ± 550C.

4.       Membuka tutup tabung dlam keadaan miring dan panaskan mulut tabung dalam

nyala api.

5.       Membuka tutup cawan petri dan masukkan agar dalam cawan.

6.       Memaskan mulut cawan petri.

7.       Menutup cawan petri.

8.       Mendiamkannya hingga media agar beku.

b2.1.Isolasi dengan teknik geser

1.    Memijarkan jarum inokulasi

2.    Membasahi jarum inokulasi dengan suspense bakteri

3.    Menggeser bagian jarum yang telah dibasahkan pada permukaan media agar dalam

cawan petri dengan membuat sejumlah garis lurus yang sejajar.

4.    Memutar cawan 900C.

5.    Menggeser jarum dimulai dari ujung garis geseran terakhir dan geserkan kembali

membentuk garis lurus sejajar.

6.    Memutar kembali berlawanan arah jarum jam, ulangi 1 atau 2x.

7.    Menutup cawan petri dan membakar mulutnya.

8.    Menyimpannya pada temperature inkubasi yang ditentukan.

b2.2. Isolasi menggunakan teknik tuang/pour plate dengan pengenceran sampel.

1.    Memberi label pada 3 tabung akuades steril masing-masing 10-1, 10-2, dan 10-3.

2.    Memberi label pada cawan petri masing-masing 10-1, 10-2, dan 10-3.

3.    Memanaskan media NA beku hingga mencair.

4.    Mendingikannya sampai kira-kira 550C.

5.    Mengambil 1 mL suspense bakteri lalu masukkan dalam tabung akuades 10-1.

6.    Mengambil 1 mL dari tabung 10-1 dan masukkan dalam tabung 10-2.

7.    Mengambil 1 mL dari tabung 10-2 dan masukkan dalam tabung 10-3.

8.    Mengambil 1 mL sampel dan masukkan dalam cawan petri.

9.    Memasukkan media NA yang temperaturnya ±550C dan tunggu hingga mengeras.

10. Memasukkannya dalam incubator dalam posisi terbalik.

11. Mengamati koloni yang timbul.

b2.3. Isolasi dengan teknik sebar

1.       Mengambil 1 Ml suspense bakteri.

2.       Memasukkannya dalam cawan petri berisi media NA.

3.       Memanaskan spreader.

4.       Menunggu hingga agak dingin.

5.       Meratakan suspense bakteri diatas permukaan media agar dengan spreader.

Menginkubasi kultur pada temperature yang sesuai.

V.          Analisis dan pembahasan

Ada beberapa metode dalam mengisolasi mikroba bakteri (mikroorganisme)yaitu dengan

menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran dan agar

miring. Metode-metode ini berdasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan

organisme sedemikian rupa sehingga tiap individu spesies dapat dipisahkan dengan

lainnya. Prkatikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik-teknik di dalam pengisolasian

mikroba beserta pemurniannya.

Pengenceran ini bertujuan untuk mempermudah dalam perhitungan jumlah koloni mikroba

yang utmbuh, baik warna maupun karakteristik lainnya. Dari hasil praktiukum dapat

diketahui bahwa bentuk, tepian, warna dan wlwvasi dari bakteri. Untuk bakteri, bentuknya

ada yang bundar, rizoid, tidak beraturan dan menyebar dengan yang tepian siliat, berlekuk,

bercabang, berombak, dan licin. Warna yang dapat dilihat dari koloni bakteri pada sampel

ini adalah semua berwarna putih susu dan elevasi pada semua sampel ini datar da nada

pula yang cembung.

Koloni=koloni yang telah ditentukan pada masing=masing medium kemudian

diidentifikasi morfologinya yaitu bentuk luar, warna, struktur dalam koloni, tepi koloni,

elevasi. Pada masing-masing media sendiri terdapat keanekaragaman dalam morfologi

tersebut. Koloni bakteri dapat dengan mudah dibedakan dari koloni lainnya dengan adnya

penampakan umum berupa lender dan agak mengkilap. Bakteri adalah salah satu contoh

mikroorganisme yang penting dan memiliki bentuk yang beragam. Pada umumnya bakteri

berhubungan dengan makanan. Adanya bakteri dalam bahan pangan dapat mengakibatkan

pembusukan yang tidak diinginkan atau menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui

makanan atau dapat melangsungkan fermentasi yang menguntungkan.

Kontaminasi dalam praktikum isolasi dan pemurnian mikroba dapat mungkin terjadi jika

kondisi dari alat, bahan maupun prkatikan tidak steril. Oleh karena itu dalam setiap

prosedur kerja, baik saat pengenceran ataupun saat menyebar mikroba ke dalam medium

perlu kehati-hatian agar tidak terjadi kontaminasi yang dapat merusak hasil percobaan.

Setiap pada prkatikum kali ini, semua cawan biakan bahkan cawan control pun

terkontaminasi hal ini dibuktikan pada cawan control terdapat koloni-koloni bakteri.

Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup merupakan suatu hal yang

penting untuk diketahui. Pengetahuan tentang faktor-faktor yang mempengaruhi

pertumbuhan mikroba sangat penting didalam mengendalikan mikroba.  Berikut ini faktor-

faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam

mengendalikan mikroba.   

Faktor-faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba:

a.                   Suplai nutrisi

Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber

energy dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah: karbon, nitrogen,

hydrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi, dan seju,lah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau

kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga

pada kahirnya dapat menyebabkan kematian. Kondisi tidak bersih dan higienis pada

lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba

sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu

prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih dan higienis adalah meminimalisir sumber

nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali.

b.                  Suhu atau temperature

Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam mempengaruhi pertumbuhan

mikroorganisme. Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang berlawanan:

1.         Apabila suhunaik maka kecepatan metabolism naik dan pertumbuhan dipercepat.

Sebaliknya apabila suhu turun, maka kecepatan metabolism akan menurun dan

pertumbuhan diperlambat.

2.         Apabila suhu naik atau turun secara drastic, tingkat pertumbuhan akan terhenti,

komponen sel menjadi tidak aktif dan rusak sehingga sel-sel menjadi mati.

Berdasarkan hal diatas, maka suhu yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme

digolongkan menjadi tiga, yaitu:

1.         Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka pertumbuhan

terhenti.

2.         Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling cepat dan

optimum disebut juga suhu inkubasi.

3.         Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada di atasnya maka pertumbuhannya

tidak terjadi.

c.       Keasaman atau kebasaan (pH)

Setiap organisme memiliki pH masing-masing dan memiliki pH optimum yang berbeda-

beda. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 8 dan nilai pH di luar

kisaran 2 sampai 10 biasanya bersifat merusak.

d.      Ketersediaan oksigen

Mikroorganisme memeilki karakteristik sendiri-sendiri di dalam kebutuhannya akan

oksigen. Faktor-faktor yang memungkinkan terjadinya kontaminasi medium adalah:

1.                   Sterilisasi medium yang kurang sempurna.

2.                   Medium memenuhi semua kebutuhan nutrient.

3.                   Proses prkatikum yang tidak aseptis.

4.                   Lingkungan laboratorium yang kurang steril.

VI.          Kesimpulan

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari

lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni. Cara-cara pengisolasian mikroba dengan

cara isolasi ke media padat dan isolasi ke media cair. Teknik-teknik isolasi ke media padat

dengan cara agar miring, teknik sebar, teknik tuang, dan teknik gores.

VII.          Daftar pustaka

Bukle, KA., 1987, Ilmu pangan, Universitas Jakarta: Jakarta.

Dwijoseputro, D., 1989, Dasar-dasar Mikrobiologi, Djambatan: Malang.

Pelzcar dan Chan, 1986, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI Pres: Jakarta.

Sumantri, Debby M, dkk., 2009, Diktat Penuntun Prkatikum Mikrobiologi Pangan,

Universitas Pajajaran, bandung.Fardiaz, S., 1992, Mikrobiologi Pangan 1, Gramedia

Pustaka utama, Jakarta.