LaporanPraktikumBiokimia

NamaPercobaan :IP – Isolasi Protein dari Susu

Hari/ TanggalPercobaan : Kamis / 13 September 2012 / 13.00 – 15.00

Kelompok : C

Golongan : S

NamaMahasiswa / NRP : - Raymond Harris Mustafa (2443011185)

- PetronelaStefania Rondo (2443011173)

- IraniusAgung Astra Amijaya (2443011190)

- Gratia Sintia (2443011172)

- AniRombeSarungngu (2443011177)

I. Tujuan Percobaan

Mengisolasi kasein dari susu berdasarkan titik isoelektriknya.

II. Dasar Teori

Kasein merupakan sebuah fosfoprotein. Kasein tidak dapat larut pada titik

isoelektriknya, pH 4.6, namun karena pH susu mendekati 7.0, tidak diragukan lagi

bahwa kasein akan berada sebagai sebuah garam, yakni kalsium kaseinat. Pada

asidifikasi (pengasaman), kasein akan mengendap:

Ca−kasein+2 HCl → Kasein+CaC l2

Pada pengasaman susu, reaksi yang sama akan terjadi. Rennin juga akan

mengendapkan kasein. Bagaimianapun juga, hal ini tidak sepenuhnya benar, karena

pencernaan parsial juga ikut ambil bagian dalam reaksi tersebut, dimana beberapa

fragmen dari protein akan memisah. Hal ini berbeda dengan pengendapan dengan

menggunakan asam yang hasil endapannya mengandung kalsium. Faktanya, pada

ketiadaan kalsium, pengendapan tidak akan terjadi seperti ini:

Ca−kaseinat Rennin→

Ca−parakaseinat+ peptida

namun:

Kasein Rennin→

Parakasein+ peptida

Parakasein akan tetap berada dalam larutan hingga ion Ca2+ ditambahkan:

Parakasein+C a2+¿→ Ca−parakaseinat ¿

Hal ini dapat ditunjukkan dengan menambahkan sejumlah asam oksalat ke

dalam susu, dan akan melalui penyaringan, susu tanpa kalsium. Rennin, jika

ditambahkan ke dalam susu tanpa kalsium itu, tidak akan menggumpalkan kasein

dalam susu tersebut, dibandingkan dengan rennin yang akan menggumpalkan susu

biasa dalam beberapa menit. Penambahan berikutnya, garam kalsium yang dapat

larut, dalam jumlah berlebih, akan membawa gumpalan turun ke dasar wadah. Bila

rennin ditambahkan ke dalam susu yang dididihkan, tidak akan ada gumpalan, sebab

pemanasan telah menyebabkan kalsium menjadi terendapkan sebagai Ca3(PO4)2. Susu

yang digumpalkan atau “junket” sering digunakan dalam makanan Amerika. Pada

kondisi yang sesuai, enzim proteolitik lain akan menyebabkan susu menggumpal

dengan cara ini, namun rennin, enzim yang berada dalam perut keempat pada sapi

muda, sangat efektif dan sangat jelas efeknya terbatas pada pencernaan ini. (Kleiner

and Orten, 1966)

III. Alat dan Bahan

Alat:

Gelas kimia

Termometer

pH meter

Penyaring Buchner

Neraca analitis

Gelas arloji

Bahan:

Susu cair

Buffer Na-Asetat (0.2 mol/L, pH 4.6)

Etanol 95%

Eter

Muslin (kain saring)

Kertas saring

IV. Cara Kerja

Tempatkan 100 mL susu dalam gelas kimia 500 mL, dan buffer Na-Asetat dalam gelas kimia 500 mL.

Panaskan susu dan buffer Na-Asetat sampai 40° C

Tambahkan buffer ke dalam susu secara perlahan dengan pengadukan, sampai pH akhir campuran mencapai sekitar 4.8 (ukur dengan pH meter)

Dinginkan suspensi sampai suhu ruang kemudian dinginkan lagi selama 5 menit sebelum disaring dengan muslin.

Cuci endapan yang diperoleh beberapa kali dengan sejumlah kecil air, kemudian suspensikan dalam sekitar 30 mL etanol.

Saring suspensi dengan penyaring Buchner dan cucilah kembali dengan campuran etanol-eter (1:1) secukupnya.

Cucilah endapan pada kertas saring dengan 50 mL eter dan hisap kering dengan penyaring Buchner.

Pindahkan serbuk kasein yang diperoleh ke gelas arloji, ratakan untuk menguapkan eter.

Timbang serbuk kasein kering yang telah bebas eter.

V. Hasil Pengamatan

VI. Pengolahan Data

Persentase Hasil=(Bobot KaseinVolume Susu ) x100 %

¿( 4.667100 ) x100 %

¿4.667 %

Nilai Teoritis:

Rentang kadar kasein dalam susu: 2.1% - 6.4%

Serbuk Kasein Kering

Massa: 4,667 gr

Susu setelah kaseinnya diendapkan

VII. Pembahasan

PembahasanHasilPercobaanDikaitkandenganTeoridanTujuanPraktikum

Persentase kadar kasein dalam susu yang kami peroleh dari percobaan (4.667

gr) sesuai dengan rentang kadar kasein yang kami peroleh dari literatur, yakni 2.1% -

6.4%. Namun, kadar kasein yang kami peroleh dapat merupakan jumlah yang bukan

kadar yang sebenarnya. Hal ini dapat disebabkan karena beberapa hal, di antaranya:

a. Adanya kasein yang tertinggal di dalam susu, kertas saring, dan kain saring.

b. Serbuk kasein kering yang telah kami timbang masih mengandung air.

Jawaban dari Bahan Diskusi / Pembahasan

1. Apa yang dimaksud dengan titik isoelektrik?

Jawab: titik isoelektrik merupakan pH di mana muatan pada asam amino

saling seimbang satu sama lain (antara muatan positif dan negatifnya), dan

merupakan pH di mana asam amino memiliki kelarutan terkecil.(Kleiner and Orten,

1966)

2. Carilah dan jelaskan beberapa metode isolasi protein yang lain.

Jawab:

a. Metode Salting Out

Prinsip: Solubilitas protein

dalamsebuahlarutandipengaruhiolehkonsentrasigaram yang ada di

dalamlarutantersebut. Efekinimuncul karena adanyainteraksiantara ion-ion

garamdengangugusbermuatanpada

protein.Adisigaramkedalamlarutanbisamenyebabkanduahal yang

berbeda.Padabeberapalarutandengan protein yang

tidakdapatatausulituntuklarutdalamakuades,

adisigaramdalamjumlahkecilbisamenyebabkan protein

tersebutlarut.Fenomenainidisebutsalting in.Apabilaadisigaramdilanjutkan,

akanterdapatsuatutitikdimanaadisilebihlanjutdarigaramtidakakanmenambahsolubilitas

protein, malahakanmenyebabkanpresipitasidari protein. Fenomenainidisebutsalting

out. (Srivastava, 2009)

b. MetodeKromatografi

Prinsip: Kromatografimerupakansalahsatucara yang

seringdigunakanuntukmemisahkan / mengisolasimolekul-molekulbiologiseperti

protein. IstilahinidiciptakanTswett (1906) daribahasaYunanichroma yang

berartiwarna.Iamemisahkanklorofildaripigmen-pigmen lain

dalamtanamandenganmenggunakantabung (kolom) yang

diisipadatdengankalsiumkarbonatsebagaiadsorben.

Ekstraktanamandimasukkankedalamkolomdanbiladialirkanpelarutorganik yang

sesuai, pigmen-pigmendalamekstrakbergerakturundarikolomdengankecepatan yang

berbeda-bedadanmasing-masingterpisahmembentukcincinatau pita

berwarna.Kemudianditemukanbahwacarainijugadapatjugadigunakanuntukmemisahka

nmolekul yang tidakberwarna.

Padapemisahanmolekuldenganteknikkromatografi, molekul-molekul yang

akandipisahkanterdistribusiantaraduafasazat, yaitufasastasioner yang

tidakbergerakdanfasamobil yang bergerak. Fasastasioner data

berupazatpadatataucairan, sedangkanfasamobilmungkinsuatucairanatau

gas.Fasamobildisebutjugaeluendan proses

pergerakansuatumolekulsepanjangfasastasioner yang

disebabkanoleheluendisebutelusi.

Hasilpemisahandenganteknikkromatografidisebutkromatogram.(Murray, 2006)

KromatografiKolom

Kromatografikolommerupakanteknikpemisahanmolekul-

molekuldaricampurannyadenganmelewatkanlarutan yang mengandungmolekul-

molekul yang akandipisahkantersebutmelaluikolom yang

berisimatrikspadatsebagaifasastasioner. Sifatmatriksdapatdibuatsedemikianrupa,

sehinggamemungkinkanpemisahanselektifmolekul-molekultersebut.Sifatiniantara

lain: kelarutan, ukuran, ataumuatanmolekul.

Padakromatografikolom yang klasik,

umumnyadigunakantabunggelasberdiameter 1 cm ataulebih, denganpanjangsekitar 10

– 30 cm. Adsorbenberupapartikel-

partikelmikroskopisdipadatkanpadakolommembentukfasastasioner.

Lajualiraneluendiaturdengankeran (pengaturaliran), biasanyasekitar 1 mL/menit.

Sampel, yang berupalarutan yang mengandungcampuranmolekul-molekul,

dituangkedalamkolomdanmolekul-molekuldipisahdenganmengalirkaneluen yang

sesuai.Elusiberlangsungsampaimolekul-molekulkeluarsatu-persatudarikolom.Fraksi-

fraksiyang terdiridaribeberapa mLeluen yang

keluardarikolomditampungdalamtabung-tabungsecara manual

ataumenggunakankolektorotomatis.Deteksifraksi yang mengandungmolekul-

molekulitudilakukandengancaramembandingkanvolume retensi (VR)

denganwakturetensi (tR) molekul-molekultersebutdenganstandar yang

telahdiketahui. Volume retensi adalah volume eluen yang

diperlukanuntukmengelusisuatumolekulpadakadarmaksimumnya,

sedangkanwakturetensimenyatakanwaktu yang

diperlukanuntukmengelusimolekulpadakadarmaksimumnya.

Selanjutnyapenetapankuantitatifmolekul-molekuldapatdilakukandengnacaratitrasi,

spektofotometriatasmetodaanalisis lain.(Murray, 2006)

Kromatografi Gel Penyaring

Padateknikini, protein/molekul lain

dipisahkandaricampurannyaberdasarkanperbedaanberatatauukuranmolekul. Cara

inidisebutjugamolecular sieve chromatographyatausize exclusion

chromatographykarenabutiransintetisdengandiameterdanukuranpori-poritertentu

yang dipadatkanpadakolombekerjasebagaipenyaringmolekuler.

Bilalarutan yang mengandungcampuran protein dilewatkanpadakolom,

molekul yang lebihkecildapatmasukkepori-

porisehinggarelatiftertahandanlebihlambatkeluardarikolom, sedangkanmolekul yang

lebihbesardaripori-poriteruslewat di

selabutiranpenyaringsehinggalebihcepatkeluardarikolom.Penyaringmolekuler yang

biasadigunakanadalah gel dekstranataupoliakrilamid yang

tersusundaributiranmikroskopis.

Dalampercobaanini, digunakanbutiran-butiranmikroskopisdekstran,

suatubentukpolimerdariglukosa, denganukuranterterntu yang seragam,

sebagaifasastasionerataumatrikspemisah.Dekstran yang

menyusunbutiranmikroskopistersebutteranyamsedemikianrupa,

sehinggamempunyaimataanyamandenganukuranterterntu pula.Partikel yang

larutdalamfasamobildandenganukuranlebihkecildarimataanyamantersebutakanterpera

ngkaplagidalambutiran yang lain, demikianseterusnya. Sebaliknya,

m

olekuldenganukuranlebihbesardarimataanyamantidakterperangkapdanmengalirdalam

cairan di antarapartikel-partikeltersebut.Akibatnya,

molekuldenganukuranlebihbesardarimataanyamantersebutmenempuhjalan yang

lebihpendekdankeluarlebihdahuludarikolompemisah. (Murray, 2006)

c. MetodeElektroforesis

Prinsip: Protein adalah heterobiopolimer yang terdiri dari asam amino melalui

ikatan peptida. Protein-protein ini dibedakan berdasarkan muatan elektronnya yang

berikatan secara ionik atau kovalen. Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan

protein memiliki muatan listrik yang berbeda-beda. Selain itu, dapat juga dibedakan

berdasarkan berat molekulnya.

Pada teknik pemisahan protein dengan metode elektroforesis, protein serum

dipisahkan berdasarkan muatan listriknya. Apabila larutan protein diletakkan dalam

suatu medan listrik, tiap protein akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari

muatan yang dikandung protein tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan

bergerak ke anode yang adalah kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak

bermuatan tidak akan bergerak. (Wade, 2006)

VIII. Kesimpulan

Pada percobaan praktikum ini, kasein menunjukan kelarutan terkecilnya pada

pH 4.8, yang merupakan titik isoelektriknya. Titik isoelektrik yang dimiliki kasein ini

dapat dipergunakan sebagai prinsip untuk mengisolasi kasein, yakni dengan

menurunkan pH larutan yang mengandung kasein menjadi 4.8, sehingga melalui

penyaringan, endapan kasein akan didapat.

Surabaya, 18 September 2012

Praktikan,

Raymond Harris Mustafa

IX. Daftar Pustaka

BukuPetunjukPraktikumBiokimia. 2012.

FakultasFarmasiUniversitasKatolikWidya Mandala Surabaya.

Ghosal S, Srivastava AK.Fundamentals of Bioanalytical Techniques and

Instrumentation. New Delhi: PHI Learning Private; 2009

Kleiner and Orten: Biochemistry 7th edition. Saint Louis. 1966. The C. V.

Mosby Company.

Murray, Robert K. Granner, Daryl K. Rodwell, Victor W. Biokimia.

Harper.27th ed. Jakarta.PenerbitBukuKedokteran EGC: 2006.

L. G. Wade, Jr. Organic Chemistry, 6th ed. New Jersey : Pearson, 2006