POLITECHNIKA ŚLĄSKA

WYDZIAŁ CHEMICZNY

KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII

LABORATORIUM Z CHEMII ORGANICZNEJ

Chromatografia Cienkowarstwowa (TLC)

Prowadzący: mgr inż. Sebastian Budniok

mgr inż. Karolina Leszczyńska

mgr inż. Aurelia Zniszczoł

GLIWICE 2014

1. Wprowadzenie do chromatografii

Chromatografia jest techniką analityczną i preparatywną wykorzystującą różnice

w zachowaniu się składników mieszanin w układzie dwóch faz, w których jedna nie zmienia

swego położenia (faza nieruchoma, stacjonarna), druga zaś porusza się względem

pierwszej w określonym kierunku (faza ruchoma, roztwór rozwijający) prowadząca do

rozdzielenia mieszanin substancji na poszczególne składniki, bądź ich grupy (frakcje).

Ze względu na rodzaj dominującego mechanizmu procesu rozdziału

chromatografie możemy podzielić na:

a) adsorpcyjną - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a nieruchomą ciało stałe

o właściwościach adsorbujących i odpowiednim rozdrobnieniu (np. żel krzemionkowy, tlenek

glinowy, węgiel aktywny itp.). Adsorpcję (nagromadzenie substancji na zewnętrznej

powierzchni ciał stałych) wykorzystuje się do rozdzielenia mieszanin na podstawie różnic

w powinowactwie różnych ciał stałych na powierzchni adsorbenta.

Środki adsorbujące można podzielić na:

niepolarne (węgiel aktywny, niektóre żywice organiczne),

polarne (tlenek glinu, żel krzemionkowy, węglowodany tj. skrobia, cukier, celuloza).

W przypadku polarnego adsorbenta kolejność z jaką składniki mieszaniny pojawiają

się na płytce TLC zależy od ich względnych polarności. Tak więc w przypadku dwóch

składników różniących się polarnością składnik bardziej polarny silniej adsorbuje się na

powierzchni adsorbenta (na płytce TLC znajduje się bliżej linii startu), natomiast składnik

mniej polarny eluowany jest niepolarnym rozpuszczalnikiem (na płytce TLC znajduje się

wyżej od składnika bardziej polarnego).

b) podziałową - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a stacjonarną ciecz zatrzymana na

odpowiednim nośniku (bibuła, ziemia okrzemkowa, kulki szklane itp.). Rozdział jest

wynikiem różnic współczynników podziału.

c) jonowymienną - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a stacjonarną wymieniacz jonowy. Rozdział

zależy od różnic w sile wiązania składników przez wymieniacz.

d) żelową - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a nieruchomą granulowany, jednorodny spęczniały

żel. Rozdział jest powodowany różnicami w zdolnościach dyfundowania do cząsteczek żelu,

a więc różnicami w wielkości cząsteczek składników.

W zależności od rodzaju fazy rozdzielczej i natury substancji w której rozpuszcza

się badaną mieszaninę (eluentu) rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne (Rys. 1):

a) chromatografia gazowa – to analityczna technika chromatograficzna, w której fazą

nośną jest gaz (zazwyczaj hel, argon lub wodór). Chromatografia gazowa jest

najczęściej stosowaną metodą do szybkiej analizy złożonych mieszanin związków

chemicznych oraz oceny czystości tych związków,

b) chromatografia cieczowa – chromatografia, w której eluentem jest ciecz. Istotą

każdej chromatografii cieczowej jest rozdział analizowanej mieszaniny na

poszczególne związki chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu tej mieszaniny

przez stałe lub żelowe złoża. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między

związkami tworzącymi mieszaninę a złożem jedne z nich przechodzą przez złoże

szybciej a inne wolniej. Wyróżniamy tutaj:

chromatografię kolumnową – w której faza rozdzielcza jest

umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie

roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można

wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie

kolumny, oraz

chromatografię planarną – rozdział chromatograficzny jest prowadzony,

gdy faza stacjonarna jest w postaci cienkiej warstwy.

Chromatografię planarną można jeszcze podzielić na:

chromatografię bibułową (PC) której podstawą działania jest podział

substancji rozdzielanych miedzy fazę nieruchomą, którą stanowi

woda unieruchomiona przez celulozę dzięki jej higroskopijności, oraz

fazę ruchomą rozpuszczalnik organiczny lub mieszaninę

rozpuszczalników, często nawet z wodą, wędrujące po bibule dzięki

siłom kapilarnym. Celuloza stanowiąca nośnik dla fazy stacjonarnej

(wody) ma niewielkie właściwości adsorpcyjne i prawie nie

zniekształca przebiegu rozdzielania opartego na podziale substancji

między wodę a wędrujący rozpuszczalnik. Jeżeli współczynniki

podziału substancji naniesionych na bibułę są różne, to w trakcie

wędrówki po bibule następuje ich rozdzielenie

chromatografię cienkowarstwową (TLC) w której fazę nieruchomą

nanosi się w postaci cienkiej równomiernej warstewki na płytkę

szklaną, arkusz folii aluminiowej czy tworzywa sztucznego.

Rys. 1 Schematyczny podział chromatografii

2. Chromatografia Cienkowarstwowa

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC – z ang. Thin Layer Chromatography) jest

najpopularniejszą metodą szybkiego sprawdzania postępu reakcji chemicznej i czystości

produktu. Może być także wykorzystywana do identyfikacji związków zarówno organicznych

jak i nieorganicznych. Metodę tę stosuje się w analizie mieszanin: poreakcyjnych

i uzyskiwanych z surowców naturalnych, przy potwierdzaniu identyczności składników

produktów handlowych (leki, barwniki, środki konserwujące itp.), a także przy badaniu

obecności wszelkiego rodzaju zanieczyszczeń np. w produktach spożywczych

i w środowisku naturalnym.

W TLC mieszanina substancji jest rozdzielana na poszczególne składniki ze

względu na różnicę w szybkości ich przemieszczania się na podłożu wykonanym

z aktywnego adsorbenta stanowiącego fazę nieruchomą. Poszczególne składniki mieszaniny

z różną siłą wiążą się z polarnym adsorbentem, a następnie wymywane są z niego

rozpuszczalnikiem stanowiącym fazę ruchomą. Im bardziej polarna jest badana substancja,

tym silniej wiąże się z fazą stałą i tym trudniej jest wymywana przez eluent. Im bardziej

polarny jest eluent, tym więcej polarnych centrów aktywnych fazy stałej jest przez niego

blokowane, co zmniejsza „opory” przesuwania się eluowanych substancji.

W chromatografii cienkowarstwowej faza stacjonarna jest naniesiona w postaci

cienkiej warstwy o grubości od 0,1 do 0,25 mm na płytkę szklaną, metalową lub

z tworzywa sztucznego o wymiarach 200×200 mm, 200×50 mm lub 100×50 mm.

Naniesiona warstwa musi być mechanicznie trwała i odporna na ocieranie. Najczęściej do

fazy stacjonarnej dodaje się 0,1 – 10 % tzw. lepiszcza, którym może być gips, skrobia, sole

kwasów poliakrylowych i inne. Ze względu na detekcję substancji warstwy

chromatograficzne zawierają także często trwale zaadsorbowany wskaźnik fluorescencyjny.

W chromatografii cienkowarstwowej, podobnie jak w kolumnowej, do rozdzielania są

wykorzystywane te same mechanizmy oddziaływań międzycząsteczkowych, a więc

adsorpcja, wymiana jonowa, podział, czy warunki układu faz odwróconych. Jednakże

ciągle dominującą rolę (w przeciwieństwie do chromatografii kolumnowej) odgrywa

adsorpcja, a najczęściej stosowanymi adsorbentami są:

Żel krzemionkowy – jest jednym z najbardziej popularnych adsorbentów

stosowanych w chromatografii cienkowarstwowej. Jest on otrzymywany przez

hydrolizę krzemianu sodu, jego kondensację i polimeryzację w trakcie prażenia.

Jego struktura wygląda w przybliżeniu następująco:

O O O O O O O

Si Si Si

OH OH OH

Aktywność żelu krzemionkowego zapewniają grupy Si-OH (silanolowe) obecne na

jego powierzchni. Wytwórcy kontrolują aktywność na etapie prażenia. Żel stosowany

w TLC ma średnicę ziaren w zakresie 5 – 10 mm.

Typy żelu krzemionkowego oznaczane są często w sposób następujący:

- Żel krzemionkowy G – zawiera 13% gipsu jako czynnika wiążącego

- Żel krzemionkowy H bez środka wiążącego

- Żel krzemionkowy F254 z fluorescentem

- Żel krzemionkowy UV254 z fluorescentem

Jako fluorescent zazwyczaj stosowany jest siarczek cynku.

Żel krzemionkowy ma odczyn lekko kwaśny i może być stosowany do rozdziału

sterydów, aminokwasów, węglowodorów, tłuszczów, alkaloidów itp.

Tlenek glinu – aktywność tlenku glinu związana jest z obecnością zarówno

atomów tlenu jak i glinu. Metoda produkcji polega na kondensacji uwodnionego

wodorotlenku glinu. Może on być produkowany w trzech odmianach

kwasowości powierzchni: formie kwasowej, zasadowej i obojętnej. Zasadowy

tlenek glinu z w/w jest najbardziej popularny. Tlenek glinu jest używany do

rozdziału sterydów, barwników, witamin i alkaloidów.

Celuloza – naturalny polisacharyd zbudowany z cząsteczek glukozy

połączonych wiązaniami β–(1,4)–glikozydowymi. Płytki TLC pokryte są

cząsteczkami celulozy o podobnej wielkości ziaren, co powoduje regularny

przepływ rozpuszczalnika.

Celuloza jest stosowana do rozdziału związków hydrofilowych, rozpuszczalnych

jonów nieorganicznych i kwasów nukleinowych, które mogą zbyt silnie oddziaływać

z tlenkiem glinu lub krzemionką.

Oprócz tych typowych sorbentów w chromatografii cienkowarstwowej stosuje się

także proszek poliamidowy, modyfikowane celulozy o właściwościach

jonowymiennych oraz żele organiczne o właściwościach sit molekularnych np.

Sephadex, BioGel P i inne.

Z nieorganicznych adsorbentów stosowanych w chromatografii

cienkowarstwowej można wymienić szkło sproszkowane, krzemian wapnia,

hydroksyapatyt, siarczan wapnia, tlenek cyrkonu, tlenek tytanu a nawet tlenek

żelaza.

Natomiast fazę ruchomą stanowią zazwyczaj rozpuszczalniki organiczne. Powinny

one być neutralne w odniesieniu do rozdzielanych substancji, wykazywać znaczną lotność

par, co znacznie ułatwia osiągnięcie równowagi ciecz – para, i niską gęstość, co

przyspiesza usunięcie rozpuszczalnika z powierzchni płytki. W celu określenia siły

oddziaływań pomiędzy fazą ruchomą a powierzchnią nośnika wprowadzono parametr siły

rozpuszczalnika e0. Jest to energia adsorpcji na jednostkę powierzchni standardowego

adsorbenta (e0

jest równe zero na tlenku glinu eluowanym pentanem). Generalnie, im

większe wartości e0

tym silniej rozpuszczalnik oddziałuje z powierzchnią adsorbenta

i tym łatwiej cząsteczki związku będą się przemieszczały co prowadzi do większej

wartości Rf (Warto zauważyć, iż im większa polarność eluenta, tym większe e0). Wartości

Rf substancji w każdej fazie ruchomej będą zależne od różnicy w wartości siły

rozpuszczalnika. Parametr mocy rozpuszczalnika, który może być zmierzony daje szereg

elucyjny rozpuszczalników zamieszczony w tabeli poniżej (Tab. 1). Dobór odpowiedniego

układu rozpuszczalników opiera się na zasadzie: podobny rozpuszcza się w podobnym.

Zazwyczaj wykonuje się kilka prób (zmieniając polarność eluentu), dążąc do osiągnięcia

wartości Rf pomiędzy sąsiednimi plamkami przynajmniej 0,1 mm. Przy czym najniższa

z plamek powinna przesunąć się z linii startowej przynajmniej o kilka milimetrów. Często

także korzysta się z danych literaturowych.

Tab 1. Szereg elucyjny (eluotropowy) rozpuszczalników

Rozpuszczalnik e0 (Al2O3)

Graniczna przepuszczalność w UV [nm]

Temperatura wrzenia

[oC]

Pentan 0,001 210 36,0

Heptan 0,01 210 98,4

Cykloheksan 0,04 210 81,0

Disiarczek węgla 0,15 380 45,0

Czterochlorek węgla 0,18 265 76,7

Eter diizopropylowy 0,28 220 69,0

Toluen 0,29 285 110,6

Chlorobenzen 0,30 280 132

Benzen 0,32 280 80,1

Eter dietylowy 0,38 220 34,6

Chloroform 0,40 245 61,2

Dichlorometan 0,42 245 41,0

Tetrahydrofuran 0,45 220 65,0

1,2-Dichloroetan 0,49 230 84,0

Aceton 0,56 330 56,2

1,4-Dioksan 0,56 220 104,0

Octan etylu 0,58 260 77,1

Octan metylu 0,60 260 57,0

Dimetylosulfotlenek 0,62 270 190,0

Nitrometan 0,64 3809 100,8

Acetonitryl 0,65 210 80,1

Pirydyna 0,71 305 115,5

Izopropanol 0,82 210 82,4

Etanol 0,88 210 78,5

Metanol 0,95 210 65,0

Glikol etylenowy 1,11 210 198,0

Kwas octowy Bardzo duży 251 118,5

W wielkim uproszczeniu zjawiska zachodzące w komorze chromatograficznej można

przedstawić następująco: faza ruchoma dzięki siłom kapilarnym migruje wzdłuż warstwy

sorbentu (fazy stacjonarnej) i w zależności od energii oddziaływań substancji z fazami

wykazują one różny stopień retencji, tzn. mają różną drogę migracji i znajdują się w różnych

miejscach warstwy.

Rys. 2 Schematyczny obraz procesów zachodzących w czasie rozwijania chromatogramu na

płytce chromatograficznej

Najbardziej powszechnym sposobem rozwijania płytek chromatograficznych jest sposób

liniowy, który w najprostszej postaci wymaga tylko kontaktu jednego końca płytki (warstwy

chromatograficznej) z rozpuszczalnikiem. Płytkę chromatograficzną ustawia się

w pozycji pionowej bądź pod kątem w kilku mililitrach rozpuszczalnika w odpowiednim

pojemniku zwanym komorą chromatograficzną Rozwijanie liniowe może być jednokierunkowe

lub dwukierunkowe. Płytkę można rozwijać pojedynczo lub wielokrotnie.

W rozwijaniu jednokierunkowym faza ruchoma przesuwa się w jednym kierunku zaś rozwijanie

dwukierunkowe polega na tym, że po pierwszym rozwinięciu płytkę suszy się

w celu usunięcia rozpuszczalnika a następnie zanurza w tym samym rozpuszczalniku lub

innym, ale obróconą o 90 stopni. Przy wielokrotnym rozwijaniu płytkę po każdej analizie

suszy się i ponownie rozwija stosując taką samą fazę ruchomą lub inną. Efektem tego

sposobu rozwijania jest zwężenie pasma stężeniowego substancji i związane z tym zwiększenie

sprawności układu jak również zwiększenie czułości metody.

Po rozwinięciu płytki chromatograficznej i wysuszeniu wizualizacje „plamek” na

warstwie chromatograficznej można dokonać m.in. metodami fizycznymi, chemicznymi lub

biologicznymi.

Do metod fizycznych zaliczamy fotometrie absorpcyjną, fluorescencje, fosforescencje

(w przypadku substancji znakowanych izotopami promieniotwórczymi) oraz metody

radiometryczne. Metody te nie powodują uszkodzenia próbki co ma istotne znaczenie jeśli

stosuje się chromatografie cienkowarstwową do celów preparatywnych.

Do wizualizacji plamek można także wykorzystać metody chemiczne. Wówczas

rozdzielane substancje przeprowadza się w substancje barwne stosując do tego celu reagenty

chemiczne, które ulegają reakcji z wybranymi grupami funkcyjnymi. Stosunkowo często

stosowanym wywoływaczem jest stężony kwas siarkowy. Proces wywoływania polega na

spalaniu substancji organicznych i pojawianiu się ciemnych plam na warstwie

chromatograficznej. Inne popularne wywoływacze zostały zamieszczone w tabeli 4.

Natomiast biologiczne metody wywoływania chromatogramów mają zastosowanie

w badaniach substancji czynnych, występujących w żywych ustrojach, np. enzymów,

koenzymów, aktywatorów i inhibitorów enzymatycznych. Na przykład w badaniach przemian

enzymatycznych nanosi się badany materiał na bibułę i rozpyla roztwór preparatu

enzymatycznego. Inkubację przeprowadza się w termostacie w temp. 37-38°C, a po jej

zakończeniu, rozwinięciu chromatogramu i wywołaniu właściwym testem, identyfikuje się

produkty reakcji enzymatycznej.

Tabela 4. Roztwory stosowane do wizualizacji substancji na płytkach TLC

Związek chemiczny Układ wywołujący

Aldehydy alifatyczne Chlorowodorek hydrazonu 3-metylo-2-benzotiazolinonu

Alkaloidy Heksachloroplatynian potasu, ninhydryna

Antybiotyki Ninhydryna

Aminokwasy Ninhydryna

Węglowodany Roztwór kwasu siarkowego w metanolu

Lipidy Chlorek antymonu(III), błękit tymolowy, ninhydryna, rodamina B

Kwasy karboksylowe Zieleń bromokrezolowa

Fenole Chloranil, kwas fosfomolibdenowy

Terpeny Kwas fosfomolibdenowy

Wykonanie analizy TLC

Badane substancje (10-20 mg) rozpuszcza się w niewielkiej ilości rozpuszczalnika ok.

0.5 ml. Substancja powinna być dobrze rozpuszczalna w zastosowanym rozpuszczalniku,

najczęściej stosuje się roztwory w metanolu, acetonie, chloroformie. W przypadku substancji

bardzo polarnych np. aminokwasy do roztworu można dodać 1 kroplę wody. Przygotowuje

się płytkę chromatograficzną o wymiarach zależnych od ilości substancji jakie zamierza się

nałożyć na płytkę. Na przygotowanej płytce zaznacza się przy użyciu zwykłego ołówka

punkty, na które następnie nanosi się roztwory substancji badanych, przy pomocy szklanej

kapilary, w odległości ok. 0.5 cm od bocznej krawędzi płytki oraz ok. 0.5 cm od dolnej

krawędzi. Roztwór nanosi się lekko dotykając powierzchni płytki końcem kapilary(czynność

można powtórzyć kilkakrotnie). Dobrze naniesiona substancja tworzy na płytce tzw.

„plamkę” o średnicy ok. 2 mm. Po nałożeniu wszystkich substancji płytkę suszy się,

a następnie ostrożnie zanurza się dolną krawędzią w roztworze rozwijającym, znajdującym

się w komorze chromatograficznej, tak by nie zanurzyć plamek. Komora powinna być

umieszczona pod sprawnie działającym wyciągiem. Rolę komory chromatograficznej

z powodzeniem spełnia zwykły słoik przykryty szkiełkiem zegarkowym. Dla lepszego

nasycenia komory parami rozpuszczalnika, ścianę boczną komory wyściela się paskiem

z bibuły. Czoło rozpuszczalnika powoli przemieszcza się po płytce, aż do osiągnięcia linii

końcowej tj. ok. 5 mm od górnej krawędzi płytki. Wówczas płytkę ostrożnie wyjmujemy

z komory. Rozpuszczalnik pozostały na płytce usuwa się za pomocą zwykłej suszarki do

włosów. W przypadku związków absorbujących w UV, wizualizację plamek dokonuje się

przez włożenie płytki do komory lampy UV, pod warunkiem, że adsorbent znajdujący się na

płytce zawiera dodatek fluorescenta. Wtedy na żółto zabarwionej w świetle UV płytce

substancje widać jako ciemne plamki. Inna metoda wizualizacji plamek polega na

umieszczeniu płytki w komorze jodowej lub krótkotrwałym zanurzeniu w naczyniu

z odpowiednim roztworem wywołującym a następnie wygrzaniu płytki w podwyższonej

temperaturze (zazwyczaj nie wyższej niż 120 oC). Wraz z przesuwaniem się rozpuszczalnika

przemieściły się nałożone substancje. Szybkość ich przemieszczania jest ich cechą

indywidualną i zależy od ich powinowactwa do podłoża płytki (adsorbcja) i wymywania

(desorpcja). W wyniku różnej szybkości migracji poszczególnych substancji w danych

warunkach, na płytce chromatograficznej powstaje seria plamek w różnej odległości od linii

startowej. Położenie plamek zaznacza się przez lekkie obrysowanie ich krawędzi ołówkiem

bezpośrednio po wywołaniu. Następnie obliczamy tzw. współczynnik Rf (współczynnik

retencji). Mierzy się odległość środka plamki od linii startowej (w mm) i dzieli przez dystans

pomiędzy linią startową i końcową też w mm. Pomiaru i obliczenia Rf dokonuje się dla każdej

plamki. Na rys.2 przedstawiono sposób pomiaru Rf.

a

Rf = b

a'

; Rf ' = b

; Rf '' = a''

b

b a

a' a''

x x x

Rys. 2. Sposób pomiaru i obliczania Rf.

Odmianą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) jest preparatywna chromatografia

cienkowarstwowa (PTLC) którą stosuje się w celu izolacji znacznie większych ilości

substancji, które następnie mogłyby być stosowane dla celów preparatywnych. Jest to

możliwe gdyż stosuje się płytki o znacznie większych wymiarach niż analityczne. Najczęściej

stosowane są płytki wymiarach 20x20 cm i grubości warstwy 1,0-2,0 mm. Postępowanie

w przypadku stosowania preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej jest podobne jak

w przypadku stosowania konwencjonalnej czy wysokosprawnej warstwy. Na warstwę

chromatograficzną nakłada się rozdzielaną mieszaninę substancji w formie paska lub plamek

obok siebie. Ilość nakładanej substancji zależy od grubości warstwy żelu oraz od trudności

rozdzielczych w danym układzie. Po rozwinięciu płytki w komorze zawierającej układ

rozwijający i po wysuszeniu płytkę wywołuje się stosując metody nieinwazyjne jak np.

wizualizację za pomocą lampy UV.

3. Wykonanie ćwiczenia

Ćwiczenie składa się z trzech części:

I. Wpływ polarności fazy ruchomej na Rf

Z dużej płytki należy wyciąć trzy paski o długości 8 cm i szerokości 1,5 cm. Ołówkiem

nanosi się, na każdym z nich, w odległości ok. 10 mm od dolnej krawędzi płytki,

punkt startowy. Za pomocą kapilary nanosi się na każdą płytkę kilka mikrolitrów

roztworu aminy aromatycznej a następnie, po wysuszeniu, ostrożnie zanurza się dolną

krawędź płytki w roztworze rozwijającym. Pierwszą z płytek rozwija się w układzie:

heksan:octan etylu (1:1) (roztwór A), drugą: metanol:chloroform (1:4) (roztwór B),

trzecią: metanol:chloroform:r-r amoniaku (1:1:0.03) (roztwór C). Gdy czoło

rozpuszczalnika osiągnie poziom ok. 5 mm od górnej krawędzi, płytkę należy wyjąć

z komory, odrysować czoło fali i po wysuszeniu umieścić w komorze jodowej. Po

wybarwieniu plamki należy zakreślić ołówkiem a następnie obliczyć Rf.

II. Analiza jakościowa - reakcje barwne związków organicznych

Przed tym ćwiczeniem każdy otrzymuje indywidualną próbkę do analizy, zawierającą jedną

z substancji: aminokwas, amina aromatyczna, monosacharyd.

Przygotować dwie płytki o wymiarach 2 cm x 1,5 cm.

Na pierwszą nanosimy próbkę aminokwasu oraz otrzymaną próbkę a na drugą monosacharyd

oraz otrzymaną próbkę. Płytkę pierwszą wywołuje się przez spryskanie roztworem

ninhydryny a następnie wygrzewanie w podwyższonej temperaturze. Aminokwasy

wybarwiają się na kolor czerwony do fioletowego. Płytkę z naniesionym monosacharydem

wybarwia się przez spryskanie roztworem kwasu siarkowego i wygrzanie w podwyższonej

temperaturze. Monosacharydy wybarwiają się na kolor od zielonego do czarnego.

Porównać reakcje barwne wzorców z próbką.

Uwaga: wygrzewanie należy przeprowadzić ostrożnie, zbyt gwałtowne ogrzanie może

doprowadzić do ściemnienia całej powierzchni płytki, co uniemożliwi obserwację plamek.

III. Analiza jakościowa – właściwa analiza TLC

Na płytce o wymiarach 4 x 3 cm zaznaczamy cztery punkty startowe w odległości ok. 0,5 cm

jeden od drugiego. Na zaznaczone punkty nanosimy roztwory wzorcowe w kolejności:

aminokwas, monosacharyd, amina aromatyczna oraz roztwór próbki badanej. Płytkę

umieszczamy w komorze zawierającej roztwór B metanol:chloroform (1:4). Po

rozwinięciu, wywołujemy osuszoną płytkę w jodzie. Obrysowujemy powstałe plamki.

Obliczamy Rf. Następnie desublimujemy jod z powierzchni płytki poprzez wygrzanie

strumieniem ciepłego powietrza. Płytkę spryskujemy roztworem ninhydryny, wygrzewamy

i obrysowujemy powstałe plamki. Postępujemy analogicznie z roztworem kwasu siarkowego.

Wizualizację dokonujemy również w komorze lampy UV.

Na podstawie względnego położenia plamek i ćwiczenia II należy określić prawdopodobną

przynależność związku nieznanego do jednej z trzech klas: aminokwasy, aminy

aromatyczne, monosacharydy.

Zaliczenie ćwiczenia

Zaliczenie ćwiczenia następuje po poprawnym wykonaniu wszystkich trzech składowych

elementów analizy TLC, na podstawie opracowanego sprawozdania (wnioski!!!), oraz

pozytywnym napisaniu kolokwium zaliczeniowego.

UWAGA!!!!

Na ćwiczenia każdy student powinien przynieść: okulary, fartuch (zakładamy PRZED wejściem

do laboratorium), rękawiczki np. nitrylowe, ołówek, linijkę, nożyczki, taśmę klejącą oraz zeszyt

laboratoryjny. Dodatkowo na grupę – mydło, płyn do mycia naczyń i ścierkę. Jest to warunkiem

przystąpienia do zajęć!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

W miarę możliwości uprasza się studentów pierwszych 3 grup odbywających laboratorium TLC

o przyniesienie kompletnych słoiczków o poj. 500 ml.

LITERATURA

1. Chromatografia cieczowa – praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego,

CEEAM, Gdańsk 2004

2. Z. Witkiewicz – Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995

3. Berthillier - Chromatografia i jej zastosowanie - PWN, 1975.

4. Opieńska-Blauth, H. Kraczkowski, H. Brzuszkiewicz - Zarys chromatografii cienkowarstwowej - PWRiL, 1971, 1976.

5. Irena Baranowska - Wybrane działy analizy instrumentalnej

SPRAWOZDANIE (drukowane dwustronnie)

Temat: Chromatografia Cienkowarstwowa (TLC)

Prowadzący: mgr inż. Karolina Leszczyńska

Data wykonania ćwiczenia:

Sprawozdanie oddane, ocena:

Imię, Nazwisko oraz numer grupy: CZĘŚĆ I – Wpływ polarności fazy ruchomej na wartość Rf (przebieg, obserwacje, wnioski)

Cel ćwiczenia:

Przebieg:

Wnioski:

CZĘŚĆ II – Analiza jakościowa-reakcje barwne (przebieg, obserwacje, wnioski)

Cel ćwiczenia:

Przebieg:

Wnioski:

CZĘŚĆ III – Analiza jakościowa – właściwa analiza TLC (przebieg, obserwacje, wnioski)

Cel ćwiczenia:

Przebieg:

Wnioski: