La valutazione del materiale seminale - unite.it · /ml (180-360 x 106/ml) ... La valutazione del materiale seminale. I test di laboratorio sono accurati nella valutazione delle caratteristiche

La valutazione del materiale seminale


Due finalità

1.

Scopo diagnostico

2.

Scopo tecnologico-commerciale


Valutazione del riproduttore

Sviluppo corporeo

Stato di nutrizione e gestione



Corretta conformazione in relazione alla razza ed età

Treno posteriore ed appiombi



Ispezione e palpazione dello scrotoalterazioni di forma

alterazioni di consistenza


Circonferenza scrotale

Alla pubertà

fra 28-30 cm

Carattere ad elevata ereditabilità


Parametro legato a numerosi fattori (età…)

Correlato al peso testicolare

Proporzionale alla quantità

di spz/die

(17M die/g parenchima)



LibidoIstinto alla procreazioneTempo di reazioneConsiderato carattere genetico ereditabileLegato agli ormoni (estrogeni/testosterone)



MontaInterazione con la femminaFiuta genitali esterniSollevamento labro superiore (rif. Flehmen)ErezioneEiaculazione



Tempi di eiaculazioneBovino 3-5 secondiCavallo 1 minuto e oltreSuino diversi minutiCane diversi minutiGatto pochi secondi



MontaImpennataAncoraggio al bacinoPropulsione con spinta eiaculatoriaEiaculazione vaginale (craniale)


Metodo di raccolta del seme

Vagina artificiale

Elettroeiaculazione

Massaggio ghiandole accessorie


Ritmo di raccolta del seme

Addestramento da 15-18 mesi

Fino a 2 anni 1/settimana

Da 2 anni bisettimanale

Massimo a 16 raccolte/mese (con riposo)


Valutazione del materiale seminale

Valutazione macroscopica e chimica

volume (contenitore graduato o peso)coloreodorepH (6.4-6.9)


Valutazione del materiale seminale

Valutazione microscopica

concentrazionemotilitàmorfologiaintegrità

di membrana


Concentrazione

camere contaglobuli

(Burker, Thoma…)

conteggio spz

in ambienti a volume predefinito


Concentrazione

Considerato il gold

standard

Limite legato alla preparazione del campione

Tempo necessario



Camera di Burkern°

x h x dil

x conv

Concentrazione

Spettrofotometro

Contatori elettronici (Coulter

Counter)

CASA


Concentrazione

Bovino: 1.250 x 106/ml (600-2.800 x 106/ml)Cavallo: 240 x 106/ml (180-360 x 106/ml)Cane: numero totale di spermatozoi più

indicativo


Motilità

soggettiva

oggettivaCASASQA


Motilità

Soggettiva

motilità

di massa (0-100%)

qualità

del movimento (da 0 a 5)


Motilità

Oggettiva

Analizzatori computerizzati (CASA)


Motilità

CASA, componenti:

Microscopio a contrasto di fase neg.Telecamera ad alta frequenzaElaboratore


CASA

PRINCIPI GENERALI

Individuazione della testaRiscontro della testa nei successivi fotogrammi (Tracking)Ricostruzione della traiettoriaCalcolo dei parametri numerici


Parametri cinetici degli spermatozoi–Velocità sul percorso medio(VAP)–Velocità lineare (VSL)–Velocità curvilinea (VCL)–Ampiezza del movimento laterale della testa (ALH)–Frequenza di attraversamento della traiettoria (BCF)–Indice di rettilineità (STR)–Linearità (LIN)–Ovalizzazione della testa (ELONG)–Superficie media della testa (SIZE)–Coefficiente di Wobble (WOB)–Danza (DANCE)–Danza media (MeDANCE)

Valori generali

Valori traccia per traccia

Parametri cinetici degli spermatozoi

Sottopopolazioni

Electroejaculated

semen Epididymal

semen

Cluster 1(mean± sd)






% population 12.46 68.26 19.28 14.47 63.72 21.80

VAP (μm/s) 53.56±47.11a 135.34±69.04b 71.09±76.11c 10.51±6.54d 108.58±57.98e 76.33±56.49de

VSL (μm/s) 14.58±13.82a 111.96±65.96b 59.38±71.66c 7.49±5.65d 91.19±55.84e 50.05±53.95f

VCL (μm/s) 132.58±70.42a 202.41±81.97b 110.79±96.28c 24.58±15.96d 192.35±88.34e 158.36±88.4de

ALH (μm) 7.20±3.29a 6.66±2.79b 3.75±2.89c 1.25±0.87d 6.76±2.7b 6.94±3.48b

BCF (Hz) 49.06±14.91a 43.73±12.77b 28.09±24.21c 28.03±25.32d 44.9±14.04e 38.83±22.6f

STR (%) 29.05±13.49a 78.47±17.69b 72.64±21.55c 69.87±24.3d 77.60±19.16e 52.35±29.75d

LIN (%) 10.13±4.85a 51.21±21b 43.08±25.03c 38.06±26.3d 43.25±18.12e 27.02±22.63d

AREA (μm2) 61.46±23.14a 61.24±18.03a 79.87±23.07b 77.31±29.68d 63.68±19.4e 86.98± 21.04d

ELONG (%) 4.85±3.8a 6.13±4.42b 2.64±2c 2.24±2.02d 6.05±2.91b 2.41±2.56d

WOB (%) 36.82±12.86a 63.25±17.51b 55.82±20.7c 50.87±22.82d 53.80±14.71e 45.25±17.41d

DANCE (μm2/s) 1118.11±1126.1a 1476.36±1031.3b 622.32±845.0c 39.39±37.61d 1456.00±1044.5b 1304.78±1274.6d

MeDANCE

(%) 0.92±0.93a 0.16±0.1b 0.11±0.09c 0.06±0.07d 0.19±0.12e 0.63±0.96f

Morfologia

Valutazione della forma degli spermatozoi

• colorazione (Diff-Quik, o altre)

• metodo di Hankock


Morfologia

classificazione alla porzione interessata

1. a. della testa2. a. del tratto intermedio3. a. della coda


Morfologia

classificazione in base alla sedea. primariea. secondariea. terziarie


Vitalità

Colorazione classica (eosina/nigrosina)

Colorazioni in fluorescenza

CFDA; SYBR-14

PI; Hoechst

33258;etidio

omodimero;


Ulteriori test

Integrità

dell’acrosoma

(FITC-PSA/PNA)

Potenziale dei mitocondri (Rodamina

123, Mito Tracker, JC-1)

Stato di capacitazione

(CTC, Merocianina

540)

Frammentazione del DNA (acridina orange)


I test di laboratorio sono accurati nella valutazione delle caratteristiche del materiale seminale?

Procedura essenziale per oggettivizzazione e comparazione

Parametri usuali non predittivi della fertilità

Spesso non identificano soggetti subfertili

Mancanza di correlazione fra test classici e recenti rispetto

Fertilizzazione in-vivo

Fertilizzazione in-vitro

Mancanza di correlazione evidenziata in numerose specie


Differenti condizioni ambientali

Microclima epididimaleEiaculazioneAmbiente vaginale/uterinoLegame con regioni della giunzione U.T.CapacitazioneInterazione con zona e oocita


Fattori di variabilità

individuale a livello cellulare

Regolazione del volume cellulare

Legame con l’epitelio oviduttale

Capacità

di fertilizzare (capacitazione)



In condizioni di iperosmosi

o ipoosmosi

Capacità

di perdere o acquisire liquidi

Capacità

acquisita a livello epididimale



Fisiologicamenteeiaculazione (da iperosmosi

a isosmosi)

Tecnologicamentecrioconservazione

shock ipertonico al congelamentoshock ipotonico allo scongelamento



Meccanismo che prevede la perdita di elettroliti

Effetto legato alla fosforilazione/defosforilazione

delle

protein

kinasi

Adattamento del citoscheletro


Test per valutare la regolazione del volume

Hypoosmotic

swelling

test

per valutare la funzionalità

della membrana

ambiente ipotonico determina curvatura/arricciamento degli spz



Hypoosmotic

swelling

test –

limiti

soggettivo

non individua gli spz

che esplodono



Osmotic

challange

Impiego di un contatore elettronico

Volume cellulare determinato come resistenza elettrica al passaggio degli spz

in un capillare



Osmotic

challange

Determina il ∆

volumetrico comeVipertonico

Visotonico


Interazione con l’ovidutto

Spesso deposizione relativamente lontana dall’ovulazione

epitelio sequestra gli spermatozoi

adesione e rilascio controllato

significato di stabilizzazione e aumento sopravvivenza



Spesso deposizione relativamente lontana dall’ovulazione

epitelio sequestra gli spermatozoi

adesione e rilascio controllato

significato di stabilizzazione e aumento sopravvivenza



Individuato il legame carboidrato-recettore

Importante la normale architettura dello spermatozoo

Non ancora sviluppato un test in-vitro


Capacitazione

Cascata di modificazioni metaboliche e strutturali

Rendono lo spermatozoo in grado di fertilizzare

Difficoltà

nello studio in-vivo


Capacitazione

Condizioni ambientali tipiche:

elevata concentrazione di bicarbonato

elevata concentrazione di CO2

influenza di fattori ovulatori


Capacitazione

–

Valutazione

Clortetraciclina

(calcio)

Merocianina

540

Annessina

V


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