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LA DIAGNOSI DEI
LINFOMI MALIGNI ATTRAVERSO
TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
Dott.ssa Cristina Colarossi
Anatomia Patologica
Istituto Oncologico del Mediterraneo
Catania
Linfomi
• I Linfomi sono malattie monoclonali neoplastiche
caratterizzate dalla proliferazione di linfociti B o T negli
organi linfoidi.
• Causano un sovvertimento strutturale del linfonodo
• Nella maggioranza dei casi la diagnosi si basa su aspetti• Nella maggioranza dei casi la diagnosi si basa su aspetti
morfologici ed immunofenotipici
• Nel 5-15% dei casi sono necessarie analisi molecolari per
conferma diagnostica
ANATOMIA DEGLI ORGANI LINFOIDI
Classificazione dei linfomi
A CELLULE B
• Immature
• Mature
• CLL/SLL
• A CELLULE T/NK
• Immature
• Mature
• NOS
• Angioimmunoblastico• Folliculare
• Marginale
• Diffuso a grandi cellule
• Mantellare
• Burkitt
• Mieloma plasmacellulare
• Angioimmunoblastico
• Micosi fungoide/Sézary
• Anaplastico a grandi cellule
• LINFOMA DI HODGKIN
Clonalità dei linfomi
• L’analisi della clonalità delle cellule linfoidi attraverso
l’amplificazione, mediante PCR, delle regioni VDJ dei geni
delle immunoglobuline (IG) e del recettore dei linfociti T
(TCR) permette di distinguere processi reattivi (policlonali)
dalle neoplasie (monoclonali)dalle neoplasie (monoclonali)
• I segmenti genici V (Variable) sono collocati
all'estremità 5' di ciascun locus delle Ig. Sono lunghi
mediamente 300 bp.
• I segmenti genici D (Diversity) sono collocati oltre i
segmenti V e sono presenti solo nel locus per le catene
pesanti delle Ig
LOCI DELLE IMMUNOGLOBULINE
pesanti delle Ig
• I segmenti genici J (Joining) sono collocati a valle dei
segmenti D. Ciascun segmento J è lungo 30-50 bp.
• I segmenti genici C (Constant) codificano per la
regione costante delle catene pesanti e delle catene
leggere Ig
Loci delle catene delle immunoglobuline
TCR
• I loci codificanti per le quattro catene del TCR (α, β, γ, δ)
sono collocati
• sul cromosoma 7
• sul cromosoma 14• sul cromosoma 14
• Nei loci per i geni del TCR la struttura è simile a quella dei
loci genici per le Ig, si riscontrano ancora una volta
segmenti V, D, J e C.
• Le catene α e γ non possiedono segmenti D
Loci del TCR
Riarrangiamenti genici
• I geni delle immunoglobuline e del TCR contengono molti
segmenti VDJ che vengono riarrangiati durante lo
sviluppo iniziale dei linfociti
• Il processo di riarrangiamento affianca casualente un
segmento V, uno D, ed uno J in modo da creare le regionisegmento V, uno D, ed uno J in modo da creare le regioni
variabili di geni ricombinati che possono essere trascritti
in mRNA e codificare per i recettori dell’antigene.
Fasi del Riarrangiamento
• I riarrangiamenti sono mediati da un complesso
enzimatico nel quale le proteine RAG1 e RAG2
agiscono tagliando a livello di speciali sequenze
segnale (regioni RSS)
• Dopo il taglio inserzioni o delezioni di nucleotidi
aumentano la diversificazione
• L’ultima tappa è l’avvicinamento dei segmenti
genici
Clonalità dei linfomi
• Clonalità linfomi B
• Valutazione molecolare delriarrangiamento del geneIgH:(catena pesante delleimmunoglobuline)
• Clonalità linfomi T
• Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene gamma del recettore dei linfociti T (TCR gamma)immunoglobuline)
• Valutazione molecolare delriarrangiamento del geneIgK: (catena leggera delleimmunoglobuline)
linfociti T (TCR gamma)
• Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene beta del recettore delle cellule T (TCR beta).
BIOMED 2
• Uno studio coordinato dal gruppo BIOMED 2 (ora
chiamato euroclonality consortium) ha standardizzato i
protocolli con multipli set di primers (Van Dongen,
Leukemia, 2003)
• Numerosi lavori scientifici nel decennio successivo hanno• Numerosi lavori scientifici nel decennio successivo hanno
confermato la sensibilità, specificità e riproducibilità dei
test
• Tali protocolli possono essere applicati allo studio di
campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina,
agoaspirati e biopsie osteomidollari decalcificate
Limiti degli studi molecolari• Sensibilità limitata in caso di un normale background
policlonale, (es Linfoma B T cell rich) con percentuale di
linfociti clonali < 10%
• Clonale non è sempre sinonimo di malignità (processi
linfoproliferativi EBV correlati o proliferazioni cutanee
benigne a fenotipo T)benigne a fenotipo T)
• I riarrangiamenti di Ig e TCR non sono esclusivi di
una linea cellulare: riarrangiamenti di TCR possono
riscontrarsi in neoplasie immature a fenotipo B o alcune
leucemie mieloidi acute.
Valutazione qualità del DNA
• Il DNA estratto da tessuti FFPE è di qualità subottimale e
potrebbe contenere inibitori della PCR
• E’ essenziale valutare l’integrità e l’amplificabilità del DNA
• Il protocollo BIOMED 2 ha standardizzato una multiplex
PCR contenente i primers di geni housekeeping di 100,PCR contenente i primers di geni housekeeping di 100,
200, 300 e 600 paia di basi
• Per l’analisi di IGH/TCR la PCR di controllo dovrebbe
amplificare prodotti di almeno 300 bp
Analisi qualitativa DNA
AF4
PLZF
RAG1
TBXAS
La presenza delle 4 bande indica che il DNA genomico
è integro. La qualità del campione è idonea per
effettuare amplificazioni, mediante PCR, anche di
frammenti di grosse dimensioni
Clonalità IGH
• Tre set di primers amplificano 3 regioni nella regione
variabile e la regione J
• Due set di primers amplificano la regione D e J
• L’analisi dei prodotti di PCR può essere condotta con
metodica:metodica:
• Heteroduplex: i prodotti di PCR vengono denaturati a
95°, rinaturati a 4°e poi corsi su gel di poliacrilamide al 6%
• Gene scanning: i primers devono essere marcati con
fluorocromo per analizzare i prodotti di PCR con metodi
automatizzati (es sequenziatore 3500)
Clonalità IGH
Analisi dei prodotti di PCR
Analisi riarrangiamento del gene IGH
Ipermutazione somatica (Maturazione
dell’affinità• Negli organi linfoidi periferici i linfociti B maturi
(centrociti o cellule del centro germinale)
subiscono un’ulteriore diversificazione nel sito di
riconoscimento antigenico tramite il processo di
ipermutazione somatica.ipermutazione somatica.
• Dopo l’incontro con l’antigene e la stimolazione del
linfocita B da parte di un linfocita T helper, si
generano delle mutazioni puntiformi nelle regioni
geniche codificanti per i domini variabili di IGH.
Leucemia Linfatica Cronica
• In circa il 50% dei casi la cellula neoplastica origina in una
fase di maturazione linfocitaria antigene indipendente
(pre-centro germinativo nel linfonodo). Non sono
presenti mutazioni somatiche del gene IgVH
• Nel restante 50% dei casi circa la cellula neoplastica
origina in fase maturativa Ag dipendente, post centro
germinativo. Sono presenti mutazioni somatiche del
gene IgVH
Stato mutazionale di IGVH nella LLC
• M-CLL (mutata): a buona prognosi;
• U-CLL (non mutata) a prognosi infausta
• Cut-off: 98% di identità con la sequenza germline• Cut-off: 98% di identità con la sequenza germline
• Linee guida per l’analisi molecolare (EuropeanResearch Initiative on CLL, ERIC reccomendation)
• Lo stato mutazionale puo’essere determinato in qualsiasi momento.
IGH Hypermutation
Traslocazioni e riarrangiamenti nei linfomi
Riarrangiamenti
B-cell Linfoma/Leuk Catene pesanti Ig
T-cell Linfoma/Leuk T-cell receptor
Patologia Traslocazione Geni coinvolti
Linfoma follicolare t(14;18) BCL2-IgH
Linfoma mantellare t(11;14) BCL1-IgH
Linfoma di Burkitt t(8;14) MYC-IgH
Linfoma anaplastico t(2;5) ALK-NPM
BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21)
• Presente nel 90% dei FL e nel 20% dei DLBCL
• Giustappone il gene che codifica per l’elemento J delle
catene pesanti delle immunoglobuline, (14q32), al gene
Bcl-2 (18q21)
• Pone BCL2 sotto il diretto controllo trascrizionale di• Pone BCL2 sotto il diretto controllo trascrizionale di
enhancers del locus IGH e successiva alterazione
dell’espressione della proteina
• La valutazione della traslocazione è di ausilio diagnostico
per distinguere il linfoma da iperplasia linfoide benigna
• Monitorare la recidiva neoplastica e la malattia minima
residua.
BCL2/JH
• Maior Breakpoint Region (MBR): 70% delle rotture del
gene bcl2 al livello del terzo esone
• Minor cluster region (mcr) :I rimanenti punti di rottura
sono situati 20 kb a valle del terzo esone.
• Analisi cariotipica
• FISH
• Southern blotting
• PCR
Traslocazione t(14;18) BCl2/JH
Dimensione ampliconi di controllo
CT (+): 250 bp
CT (-): --- bp
FOLLOW UPLa malattia minima residua
• La presenza di un basso numero di celluleneoplastiche dopo terapia viene definito comemalattia minima residua (MRD)
• Metodiche di RT PCR consentono di evidenziare• Metodiche di RT PCR consentono di evidenziarela presenza di numerose traslocazioni conmaggiore precisione e sensibilità (1x105) rispettoalla citogenetica convenzionale (1x102)
• RT-PCR è pertanto il metodo di scelta permonitorare la risposta al trattamento el’eradicazione completa di cellule neoplastichedurante il corso della malattia
NEXT GENERATION SEQUENCING
NGS
NGS
• Le due tipologie di piattaforme NGS più diffuse
permettono il sequenziamento parallelo massivo
di molecole di DNA amplificate in modo clonale.
• Nelle tecnologie NGS, il sequenziamento viene• Nelle tecnologie NGS, il sequenziamento viene
effettuato mediante cicli ripetuti di estensioni
nucleotidiche ad opera di una DNA-polimerasi.
• La procedura è parallela e massiva, e consente
di sequenziare da centinaia di Mb fino a Gb di
DNA in un’unica seduta analitica.