LA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLA DIAGNOSTICA DEI MICOBATTERI Enrico Tortoli

LA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLA DIAGNOSTICA DEI MICOBATTERI

Enrico Tortoli

La diagnostica tradizionale

Esame microscopico test rapido ma scarsamente sensibile

Esame colturale sensibile ma richiede da una a otto settimane problema delle contaminazioni

Identificazione test biochimico-colturali: scarsa specificità, tempi lunghi analisi degli acidi micolici: buona specificità, eseguibili solo

da coltura, messa a punto dei test complessa Antibiogramma

diretto: relativamente rapido ma con alta incidenza di contaminazioni

da ceppo isolato: tempi lunghi

Amplificazione genica, alternativa all’esame microscopico?

Vantaggisensibilità superiore (ma non di molto)specificità di specie (ed eventualmente

anche di genere) Svantaggi

esecuzione complessacosto elevato

Vantaggi molto più rapida se positiva rende superflua l’identificazione eseguibile anche su campioni pesantemente contaminati

Svantaggi non altrettanto sensibile non rileva i micobatteri appartenenti ad altre specie false negatività dovute agli inibitori false positività dovute a contaminazioni costo elevato esecuzione complessa impossibilità di eseguire l’antibiogramma

Amplificazione genica, alternativa all’esame colturale?

I target per l’amplificazionedel M. tuberculosis complex

Geni presenti in copia singola gene codificante per l’antigene da 65-kD (heath shock protein)

• Brisson-Noel et al. Lancet 1989 gene codificante per l’antigene da 126-kD (fusion protein)

• Hermans et al. J.C.M. 1990 gene codificante per lo rRNA 16S

• Boddinghaus et al. J.C.M. 1990 gene codificante per l’antigene di 38-kD (proteina b)

• Miyazaki et al. J.C.M. 1993 gene codificante per la subunità β della RNA polimerasi

• Kim et al. J.C.M. 1999 Sequenze ripetute

IS6110• Eisenach et al. J.I.D. 1990

Amplificazione dei micobatteri,due approcci possibili

in-house kit commerciali

Tecniche in-house

PCR classica 2-tube nested PCR 1-tube nested PCR Reverse transcriptase PCR

Le tecniche utilizzate dai kit commerciali

Polymerase chain reaction rDNA 16S rpoB

Transcriptase mediated amplification rRNA 16S

Strand displacement amplification IS6110

Real-time PCR rDNA 16S

I kit commerciali

Amplicor (Roche) Amplified M. tuberculosis direct test (Gen-Probe) BDProbeTec ET (Becton Dickinson) RealArt M. tuberculosis (Abbott)

Amplicor

PCR del DNA (frammento contenente sequenze genere- e specie-specifiche del gene codificante per il rRNA 16S)

Estrazione, manuale (in prospettiva automatica, col kit AmpliPrep) Amplificazione e rilevamento dell’amplificato automatizzata

(Cobas) Rilevamento dell’amplificato con metodica colorimetrica (avidina-

perossidasi) Prevenzione delle contaminazioni col metodo della

Uracile-N-glicosilasi (AmpErase) Co-amplificazione, non competitiva, di un plasmide avente regioni

di annealing identiche a quelle del bersaglio. La mancata amplificazione del plasmide indica la presenza di inibitori

Riconoscimento degli amplificati mediante sonde M. tuberculosis complex- e plasmide-specifiche

Amplified M. tuberculosis direct test

TMA di un frammento del rRNA 16S contenente sequenze genere- e specie-specifiche

Amplificazione isotermica dovuta all’azione combinata di: transcriptasi inversa (sintesi di DNA dal RNA) RN-asi (separazione degli ibridi RNA-DNA) RNA-polimerasi (sintesi di RNA dal DNA)

Riconoscimento dell’amplificato mediante sonde specie-specifiche

Rilevamento dell’amplificato in chemio-luminescenza (HPA) Esecuzione interamente manuale ma semplice e rapida (non

occorre il termociclatore ma occorre il luminometro)

RealArt

PCR del DNA (frammento specie-specifico, di 163pb, del gene codificante per il rRNA 16S)

Estrazione, manuale (usando kit del commercio) Amplificazione e rilevamento dell’amplificato automatizzata (ABI

Prism sequence detection system) Rilevamento fluorimetrico dell’amplificato in tempo reale. Il

segnale aumenta di intensità man mano che sonde specifiche, marcate con fluorocromo, ibridizzano con l’amplificato

Co-amplificazione di un controllo interno da aggiungere al campione. La mancata amplificazione indica la presenza di inibitori

Costruzione di una curva di taratura con 4 standard per la determinazione del numero di copie di DNA presenti nel campione

Strand displacement amplification (SDA) 1

Nella fase di produzione del target un primer ed un bamper, complementari di sequenze bersaglio molto

vicine, si legano ad un filamento di DNA denaturato, il primer contiene un sito di restrizione

in presenza di DNA-polimerasi primer e bamper si allungano e quest’ultimo spiazza il primer

i filamenti spiazzati si uniscono ad altri primer e bamper dando luogo ad ulteriore allungamento-spiazzamento

bamper

sito di restrizione

5’ 3’target

primer

Strand displacement amplification (SDA) 2

Nella fase di amplificazione esponenziale nei dimeri, il filamento contenente il

sito di restrizione viene tagliato in due frammenti da uno specifico enzima e la porzione a monte si allunga spiazzando quella a valle

il frammento spiazzato funge da stampo per il primer a valle e contemporaneamente si allunga ricreando il sito di restrizione

Un controllo interno, avente sequenza di annealing identica a quella del target, viene co-amplificato solo se non sono presenti inibitori

La tecnica è isotermica

il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA










Amplificazione in house,pro e contro

Costi minimi Sensibilità elevata

Metodiche non standardizzateContaminazioni non infrequentiNecessità di personale specializzatoBrevetto Roche

IDEALE PER LA RICERCA

Kit commerciali, pro e contro

Kit tutto-incluso, con istruzioni Possibile fornitura delle apparecchiature in service Metodiche “robuste” Contaminazioni rare

Omologazione solo per i materiali respiratoriCosti medio-altiSensibilità non eccelsa Rigidità delle metodiche

IDEALE PER LA ROUTINE

Il test di amplificazione non sostituisce esame microscopico e colturale

Da eseguirsi solo su campioni selezionati L’attendibilità del test sui materiali non

respiratori non è dimostrata sufficientemente Non utilizzabile per il monitoraggio della

terapia

Le raccomandazioni dei CDC 1

Le raccomandazioni dei CDC 2

microscopia negativa (3 campioni)microscopia negativa (3 campioni)

amplificazionenegativa

(2 campioni)


(2 campioni)

amplificazionepositiva

(2 campioni)


(2 campioni)

amplificazionidiscordanti

(2 campioni)

amplificazionidiscordanti

(2 campioni)

TBCulterioriindagininon TBC

le raccomandazioni dei CDC 3

microscopia positiva (1, o più campioni)microscopia positiva (1, o più campioni)


(1 campione)


(1 campione)


(2 campioni)


(2 campioni)monitoraggio degli inibitori

monitoraggio degli inibitori

TBC presentipresenti assentiassenti

micobatteriosiripetizione del test

Specificità delle reazioni di amplificazione

Molto buona, attorno al 99% Cause di false positività

contaminazione nella fase pre-analitica o analitica

cross-ibridizzazione con micobatteri non-tubercolari ???

Principali fattori che influenzano positivamente la specificitàautomazioneinattivazione degli ampliconi prodotti in

precedenti amplificazioni (UNG)

Dati della letteratura estremamente variabili 90-100% nei campioni microscopico-positivi40-80% nei campioni microscopico-negativi valori più bassi nei campioni extrapolmonari

Principali cause di sovrastima della variabilitàscelta di un gold standard improprioselezione dei campioni

Sensibilità delle reazioni di amplificazione

Cause di false-negatività

Presenza di inibitori Estrazione subottimale dell’ac. nucleico Distribuzione non omogenea dei bacilli

all’interno del campione Campione non idoneo

La coltura rimane ancora il test di riferimento per la diagnosi microbiologica della tubercolosi, i test genetici sono utili complementi ma sono lontani i tempi in cui potranno sostituirla

I risultati dei test genetici devono essere sempre interpretati alla luce dei dati clinici e dei risultati della microbiologia tradizionale

Amplificazione genica, alternativa all’esame colturale?

Enorme risparmio di tempo Specificità pressoché assoluta

Disponibili per un numero limitato di specieCostoComplessità di esecuzione

DNA-probe, alternativa all’identificazione?

I DNA-probe commerciali

AccuProbe (GenProbe) INNO LiPA Mycobacterium (Innogenetic) GenoType Mycobacteria (Hain)

AccuProbe

Bersaglio: rRNA 16S Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente sulle

colonie Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA) Specificità:

M. tuberculosis complex MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente M. kansasii M. gordonae

Limiti: test a cascata non disponibili per specie comuni in Europa ma rare negli USA

Solid-phase reverse hybridization

INNO LiPA Mycobacterium

Bersaglio: regione spaziatrice fra i geni codificanti per lo RNA 16S e 23S Reazione: ibridizzazione inversa, con 21 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante

PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità:

Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii (differenziazione dei tipi I, II, III-IV-V-M. gastri) M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare (2 tipi) MAC M. scrofulaceum M. fortuitum M. marinum-M. ulcerans M. genavense M. haemophilum M. chelonae (differenziazione dei tipi I, III, II-IV) M. smegmatis M. malmoense M. celatum M. simiae

Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) alcune reattività crociate con specie rare

GenoType MycobacteriaGenoType Mycobacteria Bersaglio: gene codificante per lo rRNA 23S Reazione: ibridizzazione inversa, con varie sonde immobilizzate su due strisce di cellulosa, del bersaglio

amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità

Gram + ad alto contenuto di GC Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare M. scrofulaceum-M. paraffinicum M. malmoense-M. haemophilum-M. palustre-M. nebraskense M. peregrinum-M. septicum-M. alvei M. chelonae-M. immunogenum M. fortuitum 1 M. fortuitum 2-M. mageritense M. abscessus-M. immunogenum M. interjectum M. marinum-M. ulcerans

Gram + ad alto contenuto di GC Mycobacterium genere M. simiae M. mucogenicum M. celatum I, III M. phlei M. szulgai-M. intermedium M. goodii M. haemophilum-M. nebraskense M. ulcerans M. gastri M. lentiflavum M. heckeshornense M. shimoidei M. genavense M. smegmatis M. kansasii M. asiaticum

Limiti:• esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione)• numerose identificazioni non univoche• incorretta identificazione dei MAC non-M. avium, non-M. intracellulare• alcune reattività crociate con specie rare

GenoType Mycobacteria MTBC Bersagli:

gene codificante per lo rRNA 23S gene girB regione RD1

Reazione: ibridizzazione inversa, con 9 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati)

Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità:

M. tuberculosis complex M. tuberculosis M. africanum tipo I M. microti M. bovis M. bovis BCG M. caprae

Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) mancato riconoscimento di M. africanum tipo II, di M. canettii e di M. pinnipedii

Le tecnologie basate sull’impiego di sonde sono attualmente in grado di sostituire i test fenotipici per l’identificazione dei micobatteri più comuni

Per le specie più rare il test di riferimento è rappresentato dal sequenziamento

DNA-probe, alternativa all’identificazione?

Il sequenziamento genico

E’ la tecnica di riferimento per l’identificazione Possibili bersagli

16S rRNA o rDNA23S rDNAspacer fra i geni codificanti per rRNA 16S e 23Sgene codificante per le heat shock proteinsgene codificante per la superossido dismutasi

Tecnologia microarray-microchip

Microarray: sistema multi-sonda miniaturizzato (controllato, o meno, elettronicamente)

Identificazione in vari passaggi di numerosi ceppi (amplicon down)

Identificazione di un solo ceppo con un solo passaggio (capture down)

Amplicon down

I prodotti di PCR di vari micobatteri da identificare sono legati a differenti elettrodi di un micro-array

Una o più sonde (marcate diversamente) sono aggiunte in sequenza

A ciascun passaggio, il monitoraggio degli elettrodi che presentano ibridizzazione permette, in base alla specificità della sonda usata, l’identificazione del corrispondente amplicone

Capture down

Varie sonde con diversa specificità sono legate ai singoli elettrodi di un micro-array

Identificazione in base alla specificità della sonda legata all’elettrodo su cui si è avuta l’ibridizzazione

Aggiunta del prodotto di PCR di un ceppo da identificare

Rivelazione dell’amplificazione con l’aggiunta di un reporter (sonda marcata) che riconosca un tratto non specie-specifico della regione amplificata

Epidemiologia molecolare

Ricerca di marcatori, all’interno del genoma del microorganismo, dotati di specificità di ceppo

Permette di ricostruire i flussi epidemici Permette di raggruppare i ceppi in grandi “famiglie” che

riflettono il cammino dell’evoluzione Permette il riconoscimento delle infezioni miste Permette di differenziare le recidive dalle reinfezioni Individua le contaminazioni di laboratorio

IS6110

IS6110

Lunghezza 1361 pb; numero di copie 5-20; posizione variabile

Fingerprinting in base al IS6110








Alcuni pattern RFLP

RFLP: Toscana, anni 2002

Ceppi raccolti: 245 Pattern RFLP: 215 Cluster

di 2 ceppi: 19 di 3 ceppi: 3 di 4 ceppi: 1

Nessun focolaio epidemico Tre contaminazioni di laboratorio

Il locus DR (direct repeat)

Da 9 a 50 sequenze ripetute di 36 bp (DR) inframmezzate da sequenze non ripetute di 35-41 bp (spaziatori)

DRDR DR DR DR DR DR1

1

2

2

4

4

5

5

6

6

H37Rv3

3

1 5 10 15 20 25 30 35 40

1

1

2

2

4

4

5

5

6

6

DR DR DR DR DR DR BCG

spaziatore

DR

Il locus DR

Spoligotyping

5 10 15 20 25 30 35 40

BCG

H37Rv

X

I ceppi Beijing

I vari spolygotipi possono essere raggruppati (in base alle somiglianze) in famiglie

I ceppi della famiglia Beijing hanno soltanto gli spaziatori 35-43 Presenti originariamente in Cina, vengono oggi isolati, con frequenza

crescente, in quasi tutti i paesi del mondo Fra le caratteristiche principali:

spiccata virulenza frequente sviluppo di resistenze multiple

H37Rv

Beijing

5 10 15 20 25 30 35 40

I ceppi Beijing isolati nel 2002

1 5 10 15 20 25 30 35 40

804

836

763

952

669

884

974

I ceppi Beijing toscani

Cina

Italia

altri

2002: 7 ceppi, pari al 3% 2003: 16 ceppi, pari al 6%

Altre famiglie

I ceppi isolati in Toscana includono rappresentanti di molte delle famiglie a larga diffusione mondiale

Non mancano ceppi (specialmente fra gli extra-comunitari) appartenenti a famiglie a diffusione più limitata

E’ stata denominata “Tuscany” una famiglia mai segnalata in precedenza, rappresentata da 8 ceppi isolati da pazienti italiani

RFLP e spoligotyping

RFLP: interessa l’intero cromosoma alto potere discriminante impossibile l’impiego dell’amplificazione

Spoligotyping: interessa una porzione limitata de genoma ceppi diversi possono avere identico spoligotipo possibilità di ricorso all’amplificazione

Possibile compromesso: esecuzione dello spoligotyping su tutti i ceppi e approfondimento mediante RFLP su quelli risultati identici o “interessanti”

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