2009-05-28

1

KORELACJA IN VITRO – IN VIVO

Katarzyna Ciężka

Agnieszka Deręgowska

Maria Drzyzga

Dorota Dynek

Magdalena Hawlicka

Prezentacja wykonana na podstawie

rozdziałów: „In Vitro–In Vivo Correlation”

oraz „IVIVC for Oral Drug Delivery:

Immediate Release and Extended

Release Dosage Forms”

pochodzących z książki: Pharmaceutical

Product Development - In Vitro-In Vivo

Correlation.

2009-05-28

2

Plan prezentacji

Wstęp – czym właściwie jest IVIVC i gdzie się to stosuje?

Kategorie korelacji IVIV – poziomy A, B, C

System klasyfikacji biofarmaceutycznej (BCS)

Proces opracowywania IVIVC poziomu A

Ocena korelacji IVIVC na poziomie A, B i C

Korelacja in vitro-in vivo w przypadku nowoczesnych pozajelitowych postaci leku o przedłużonym uwalnianiu

- Stenty uwalniające lek

- VIADUR®

- Systemy transdermalne

- Liposomy

WSTĘP DO IVIVC

Kluczowym celem rozwoju produktu farmaceutycznego jest zrozumienie jego skuteczności in vivo w oparciu o badania in vitro różnych postaci leku, szczególnie tych o kontrolowanych szybkościach uwalniania substancji leczniczej.

Dobra korelacja in vitro – in vivo (IVIVC) pozwala na uwzględnienie badań nad rozpuszczalnością in vitro w procesie sterowania produkcją oraz na prognozowanie skuteczności działania in vivo bazując na danych laboratoryjnych.

2009-05-28

3

Definicje

IVIVC to matematyczny model predykcyjny

opisujący zależność pomiędzy

właściwościami preparatu badanymi w

warunkach in vitro (szybkość uwalniania lub

ilość uwolnionej substancji leczniczej) a

odpowiedzią biologiczną (stężenie leku we

krwi, ilość wchłoniętej substancji leczniczej).

Wg FDA

Definicje

IVIVC to ustanowienie liczbowej relacji pomiędzy

biologiczną aktywnością a fizykochemicznym

parametrem danej postaci leku.

Parametry biologiczne:

maksymalne stężenie leku (Cmax)

pole powierzchni pod krzywą stężenia w czasie

(AUC)

Parametr fizykochemiczny:

profil rozpuszczalności in vitro

Wg U.S.Ph

2009-05-28

4

Opracowanie IVIVC

Od IVIVC wymaga się, aby uwzględniony był fakt, że

rozpuszczenie lub uwolnienie substancji leczniczej z

danej postaci leku odbywa się w etapach z

uwalnianiem ograniczonej dawki, czyli w sekwencji

kroków prowadzących do wchłonięcia leku.

Dlatego, w niektórych przypadkach, korelacje IVIV

mogą nie być możliwe dla form o natychmiastowym

uwalnianiu, gdzie rozpuszczanie często nie występuje

w krokach o limitowanych dawkach.

Zastosowanie IVIVC

Substytut badań

biorównoważności pozwalający

na:

zwiększenie jakości produktu

zmniejszenie nadzoru organów

stanowiących

proporcjonalne zwiększenie

dawki

niewielkie zmiany w sprzęcie

oraz w procesie produkcyjnym

2009-05-28

5

KATEGORIE KORELACJI IVIV

Poziom A

Poziom B

Poziom C

Rozszerzony poziom C

Poziom A

Korelacja:

typu „punkt po punkcie” pomiędzy wskaźnikiem

wejściowym in vitro (np. stopniem rozpuszczenia) i

wskaźnikiem wejściowym in vivo

zwykle liniowa (nieliniowości też możliwe)

niosąca najwięcej informacji i najbardziej użyteczna w

opracowywaniu leków

wiąże całościowy profil rozpuszczalności in vitro z

profilem stężenia in vivo

pozwala na przewidywanie pełnej zależności stężenie-

czas in vivo na podstawie danych o rozpuszczalności

badanych in vitro.

2009-05-28

6

Poziom A

W przypadku zależności liniowej, frakcja rozpuszczona

in vitro i frakcja wchłonięta in vivo powinny się

nakładać, lub zostaną na siebie nałożone poprzez

wprowadzenie współczynnika skalującego (rzadziej

funkcji skalującej).

Aby IVIV korelacja była poprawna, pojedynczy

współczynnik lub funkcja skalująca powinna być

możliwa do zastosowania przy różnych szybkościach

uwalniania substancji leczniczej z tej samej postaci

leku.

Poziom B

Korelacja na poziomie B wykorzystuje metody

momentów statystycznych do porównania

średnich stopni rozpuszczalności in vitro (np.

średni czas rozpuszczania) i średniego

parametru in vivo (np. MRT, średni czas

przebywania leku w organizmie lub średni

czas rozpuszczania in vivo).

2009-05-28

7

Poziom B

Korelacja:

nie jest typu „punkt po punkcie” (dane są wyprowadzane dla jednego zintegrowanego parametru)

nie pozwala na odtworzenie przebiegu zmian stężenia leku we krwi

uważana za niezbyt użyteczną, ponieważ wiele rozmaitych profili in vitro i in vivo może prowadzić do tych samych parametrów sumarycznych

Poziom C

Korelacja:

pojedynczych parametrów

farmakokinetycznych (np. AUC) z

parametrami dostępności farmaceutycznej

(np.t50%)

nie pozwala na obserwację całego przebiegu

krzywej stężenia w czasie

może mieć zastosowanie tylko we wstępnej

fazie projektowania leku

2009-05-28

8

Rozszerzony poziom C

Korelacja:

odnosi kilka parametrów in vivo do

parametrów in vitro powiązanych ze stopniem

uwalniania leku w kilku punktach krzywej

rozpuszczalności.

może być tak samo użyteczna jak korelacja na

poziomie A (jeśli jednak taka korelacja C jest

możliwa, to prawdopodobnie można również

opracować korelację na poziomie A)

SYSTEM KLASYFIKACJI

BIOFARMACEUTYCZNEJ

2009-05-28

9

BCS

System klasyfikacji biofarmaceutycznej (BCS) stanowi podstawę do klasyfikacji leków bazując na ich rozpuszczalności w wodzie oraz przenikalności przez bariery biologiczne.

Jak wspomniano wcześniej, IVIVC jest możliwa kiedy rozpuszczalność następuje w krokach o limitowanej dawce i lek ma wysoką przenikalność.

Substancje grupy I

dobrze rozpuszczalne

dobrze wchłaniane

Postacie leku o

natychmiastowym uwalnianiu

uwalnianie składników

w żołądku

opróżnianie

żołądka

Opróżnianie żołądka stanowi krok ograniczający uwalnianie – proces, który nie

jest brany pod uwagę podczas testowania rozpuszczalności in vitro.

Kiedy rozpuszczalność in vivo jest szybsza w porównaniu z opróżnianiem

żołądka i lek szybko się wchłania rozpuszczalność in vitro nie odzwierciedla

dokładnie wchłaniania, więc IVIVC nie jest przeprowadzana dla substancji

grupy I.

2009-05-28

10

Substancje grupy II

słabo rozpuszczalne

dobrze wchłaniane

Dostępność biologiczna leków jest ograniczona przez

ich słabe rozpuszczanie się, więc szybkość ich

wchłaniania jest zbliżona do szybkości rozpuszczania

się.

Leki z tej grupy wykazują wysoką korelację między

badaniami in vitro i in vivo.

Substancje grupy III

dobrze rozpuszczalne

słabo wchłaniane

Substancja lecznicza uwalnia się szybko, ale jest powoli

wchłaniana.

IVIVC nie jest wiarygodna jeśli rozpuszczalność jest

większa od szybkości wchłaniania w jelitach.

2009-05-28

11

Substancje grupy IV

słabo rozpuszczalne

słabo wchłaniane

Wykazują bardzo słabą korelację między IVIV i muszą

być szczegółowo badane.

PROCES OPRACOWYWANIA

IVIVC POZIOMU A

2009-05-28

12

1. Prowadzenie badań w odniesieniu do kilku

preparatów, różniących się między sobą

szybkościa uwalniania substancji leczniczej.

Trzy preparaty są zwykle wystarczające: dla

wolnego, średniego i szybkiego uwalniania.

Partie powinny osiągać (lub być bliskie)

oczekiwanym limitom określonym w

specyfikacji in vitro.

2. Dane o rozpuszczalności in vitro są

pozyskiwane za pomocą odpowiedniego testu

rozpuszczalności.

Wymagania:

1. Użycie, co najmniej 12 poszczególnych postaci

leku z każdej partii

2. Czasy pobierania próbek pozwalające na

odpowiednie scharakteryzowanie profilu

rozpuszczalności

3. Współczynnik zmienności mniejszy niż 10%

średniej dla profilu rozpuszczalności

2009-05-28

13

3. Próbki stosowane są do badań

farmakokinetycznych w celu uzyskania danych

o stężeniu leku w warunkach in vivo.

Porównania mogą być dokonywane podczas:

1. jednego krzyżowego badania

farmakokinetycznego

2. równoległych badań

3. różnych badań, które są przeprowadzane jako

część procesu rozwojowego produktu

4. Podczas opracowywania IVIVC może być

konieczne poznanie różnych warunków

rozpuszczania in vivo, w celu zidentyfikowania

zmienności pomiędzy badanymi postaciami

leku.

5. Formuły są dostępne w dwóch grupach:

1. zbiór danych do opracowania IVIVC i estymacji

wewnętrznego błędu predykcji,

2. dane nieużyte do opracowania IVIVC służące

do zademonstrowania predykcji zewnętrznej.

2009-05-28

14

Dobre dopasowanie do IVIVC opisane jest

wzorem:

Prognozowany błąd

%PE

obserwowana

wartość

100

przewidywana

wartość

obserwowana

wartość

6. IVIVC może zostać uznana za poprawną jeśli:

1. rozpatrywanych jest trzy lub więcej różnych stopni

uwalniania

2. średni wewnętrzny błąd jest mniejszy niż 10% dla Cmax

i dla AUC

3. %PE dla poszczególnych preparatów użytych do IVIVC

nie przekracza 15%

7. Konieczność zewnętrznej weryfikacji istnieje jeśli:

1. wewnętrzny błąd predykcji jest większy niż 10%

2. %PE dla poszczególnych postaci leku różniących się

szybkością uwalniania przekracza 15%

2009-05-28

15

Ocena korelacji IVIVC na poziomie A

- wprowadzenie

Procedura oceny korelacji IVIVC na poziomie A jest

dwuetapowa.

W pierwszym etapie sporządza się profile uwalniania substancji leczniczej z postaci leku (in vitro) oraz przeprowadza badania jej dostępności biologicznej (in vivo) z tych samych preparatów.Dane dotyczące dostępności biologicznej (uzyskane podczas badao in vivo) poddaje się dekonwolucji.

I

ETAP

W drugim etapie sporządza się wykres zależności pomiędzy uwolnioną i wchłonięta ilością substancji leczniczej.

II

ETAP

Ocena korelacji IVIVC na poziomie A

- wprowadzenie

Proces dekonwolucji polega na estymacji ilości

uwolnionej lub wchłoniętej po podaniu dawki substancji

leczniczej in vivo, w oparciu o modele matematyczne.

Dekonwolucję danych przeprowadza się metodą

Wagnera-Nelsona, Loo-Riegelmana lub rozwiązując

równanie całkowe (transformacja Laplace’a).

2009-05-28

16

Przykład badania oceny korelacji

na poziomie A

Przygotowano preparaty zawierające lek przeciwpadaczkowy charakteryzujące się

różną szybkością uwalniania

• preparat o szybkim uwalnianiu substancji leczniczej (Formulation A)• preparat o pośredniej szybkości uwalniania substancji leczniczej (Formulation B)• preparat o wolnym uwalnianiu substancji leczniczej (Formulation D)

(A) Wykresy zależności stężenia leku we krwi jako funkcja czasu po podaniu 3 preparatów o różnej szybkości uwalniania substancji leczniczej.

(B) Wykresy zależnośd całkowitej ilości uwolnionej substancji w funkcji czasu. Czarnymi symbolami oznaczono zależności otrzymane na podstawie badao in vitro, białymi –zależności otrzymane na podstawie badao in vivo.

(B) Wykresy oznaczone białymi symbolami sporządzone zostały po dekonwolucji danych.

(C) Wykres zależności pomiędzy ilością substancji leczniczej uwolnionej w warunkach in vivo i w warunkach in vitro –w celu sprawdzenia korelacji.

(B) Wyraźnie widad, że całkowite ilości uwolnione w warunkach in vivo i in vitro są porównywalne, natomiast w warunkach in vivo substancja lecznicza uwalnia się wolniej, z pewnym opóźnieniem.

2009-05-28

17

Ocena korelacji IVIVC na poziomie B

Korelacja na poziomie B opiera się o analizę momentów statystycznych. MDT (in vitro) porównuje się z MRT.

Na poziomie B nie jest możliwe porównanie danych uzyskanych in vitro i in vivo punkt po punkcie tak, jak w przypadku korelacji na poziomie A.

MDT (Mean Dissolution Time)

– średni czas rozpadu, średni czas rozpuszczania

In vitro

MRT(Mean Residence Time)

- średni czas przebywania leku w organizmie

MAT(Mean Absorption Time)

- średni czas absorbcji

In vivo

Ocena korelacji IVIVC na poziomie B

(A) Wykres korelacji na poziomie B. Zależnośd średniego czasu przebywania leku w organizmie od średniego czasu rozpadu (in vitro)

2009-05-28

18

Ocena korelacji IVIVC na poziomie C

(B) Wykres korelacji na poziomie C. Zależnośd dostępności biologicznej w czasie Tmax (in vivo) od czasu, w którym uwolniona została połowa dawki substancji leczniczej (in vitro).

Znajomość korelacji in vitro-in vivo pozwala

na ustalenie warunków rozpuszczania postaci

leku o modyfikowanym uwalnianiu.

FDA określa procedury postępowania podczas ustalania warunków

rozpuszczania postaci leku o modyfikowanym uwalnianiu w przypadku:

Korelacji na poziomie A;

Korelacji na poziomie C;

Oraz przy braku korelacji.

Przy stwierdzeniu braku korelacji in vitro-in vivo podczas ustalania

dopuszczalnego odchylenia od ilości uwolnionej substancji powinno się

korzystać z średniego profilu uwalniania. Dopuszczalne odchylenie w

każdym czasie nie powinno przekraczać 20% ( 10%). W przypadku

odchylenia wynoszącego 25% istnieje konieczność potwierdzenia, że

średnie profile rozpuszczania (dla górnej i dolnej granicy odchylenia) są

biorównoważne.

2009-05-28

19

Znajomość korelacji in vitro-in vivo pozwala na

ustalenie warunków rozpuszczania postaci leku o

modyfikowanym uwalnianiu.

W przypadku istnienia korelacji in vitro-in vivo może być

ona wykorzystana do ustalenia parametrów

rozpuszczania badanej postaci leku. Stosując metody

konwolucji przewiduje się stężenie leku w osoczu,

kalkuluje pole powierzchni pod krzywą AUC oraz

stężenie maksymalne Cmax. Następnie sprawdza się,

czy profile uwalniania przy najwyższym i najniższym

stopniu uwalniania substancji (upper and lower release

rate), różnią się od profilu wzorcowego. Dopuszczalne

odchylenie wartości parametrów farmakokinetycznych

Cmax i AUC nie powinno przekraczać 20%.

Przykład: ustalanie stopnia uwalniania

pseudoefedryny z systemu OROS

Dowiedziono, że istnieje korelacja na poziomie

A (1:1) pomiędzy stopniem uwalniania

pseudoefedryny in vitro i in vivo;

Zaprojektowano postacie leku tak, aby z jednej

substancja lecznicza uwalniała się szybciej (90%

w ciągu 14h), z drugiej wolniej (65% w ciągu

14h).

2009-05-28

20

Przykład: ustalanie stopnia uwalniania pseudoefedryny z systemu

OROS

(A) Profil uwalniania in vitro serii badanej z uwzględnieniem proponowanych parametrów uwalniania in vitro.

(B) Przewidziane i zaobserwowane stężenia pseudoefedryny in vivo.

Korelacja in vitro-in vivo w przypadku

nowoczesnych pozajelitowych postaci leku o

przedłużonym uwalnianiu

W celu badania nowoczesnych postaci leku niezbędne jest poszerzenie wiedzy na temat korelacji in vitro-in vivo ponieważ:

Substancja lecznicza z omawianych postaci leku uwalniana jest przez okres kilku dni lub miesięcy, natomiast badania uwalniania in vitro zaprojektowane są tak, aby proces uwalniania trwał do kilku godzin;

Do tej pory nie zaprojektowano środowiska in vitro, które odzwierciadlałoby warunki in vivo.

Dostępna wiedza na temat doustnych postaci leku może być zastosowana w celu określenia korelacji IVIVC dla postaci leków takich jak: stenty uwalniające lek, liposomy czy plastry transdermalne, natomiast znane procedury wymagają wielu modyfikacji.

2009-05-28

21

Stenty uwalniające lek

Stenty uwalniające lek (Drug-Eluting Stents) są to małe cylindryczne

rusztowania, które po umieszczeniu wewnątrz naczynia krwionośnego

utrzymują drożność i zapobiegają zamknięciu jego światła. Co więcej,

stenty są zaprojektowane tak, aby miejscowo uwalniały leki

przeciwzapalne i przeciwnowotworowe w celu zahamowania

infiltrancji leukocytów i proliferacji komórek mięśni gładkich.

Problem w zastosowaniu klasycznych korelacji in vitro-in vivo stanowi fakt, że w przypadku omawianej postaci lek jest uwalniany miejscowo.

VIADUR®

Implanty, takie jak np. VIADUR® zaprojektowane są, aby uwalniać substancję leczniczą w sposób ciągły utrzymując stałe stężenie leku we krwi. Preparat VIADUR zawiera octan leuproreliny i jest stosowany w paliatywnym leczeniu zaawansowanej postaci raka prostaty.

Przeprowadzono badania in vivo na szczurach rasy Fisher, którym wszczepiono implanty z octanem leuproreliny. Następnie, po upływie 3, 6, 9 i 12 miesięcy usunięto implanty i przy pomocy metody z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie odwróconych faz zmierzono pozostałą w implancie ilość leku.

Badania in vitro przeprowadzono umieszczając implanty w probówkach zawierających PBS z 2% dodatkiem azydku sodu jako środka konserwującego. Podczas badania probówki znajdowały się w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni.

2009-05-28

22

VIADUR®

Porównując wyniki badania wykazano, że pomiędzy uwalnianiem leku in vitro i in vivo z implantu zawierającego octan leuproreliny istnieje liniowa korelacja.

Systemy transdermalne

W przypadku leków transdermalnych zakłada

się, że kształt krzywej uwalniania in vitro jest

identyczny z kształtem krzywej uwalniania in

vivo.

Różnice dotyczą całkowitej ilości

uwolnionego leku.

2009-05-28

23

Dla płynnego zbiornika leku w systemie transdermalnym uwalnianie leku opisuje I prawo dyfuzji Fick`a:

Gdzie:

dQ/dt – ilość substancji leczniczej uwolnionej w czasie

A – powierzchnia błony (cm2)

Dm – współczynnik dyfuzji leku w membranie (cm2/h)

Km – współczynnik podziału między membranę a podłoże

Hm – grubość błony systemu (cm)

C – stężenie leku w podłożu (mg/cm3)

Stopień absorpcji skóry wynosi:

Gdzie:

ks – współczynnik podziału między stratum corneum a skórę

właściwą

Vs – objętość skóry

Hs – grubość skóry

Ds – współczynnik dyfuzji przez skórę

2009-05-28

24

W pewnym doświadczeniu użyto danych,

dotyczących stopnia uwalniania fentanylu

in vitro dla podania dożylnego, w celu

zademonstrowania korelacji in vitro-in vivo z

podaniem transdermalnym.

Dla ustalenia odpowiedniego modelu przygotowano następujące założenia:

kształt krzywej uwalniania in vitro był zbliżony do tego, który przedstawia krzywa uwalniania in vivo (całkowita ilość uwolnionego leku mogła się różnić)

przezskórna absorpcja była zaliczana do procesów 1-ego rzędu

wyjaśniono wpływ promotorów sorpcji na absorpcję

2009-05-28

25

Jako wynik uzyskano dobrą korelację

pomiędzy przewidywanym i obserwowanym

stężeniem fentanylu w surowicy po podaniu

dożylnym i w systemie transdermalnym.

Ciekawostka

2009-05-28

26

Liposomy

Liposomy zbudowane są z podwójnej

amfipatycznej błony molekularnej

ograniczającej środowisko wodne. Lek

zostaje zamknięty w środku (wewnątrz

środowiska wodnego) lub we wnętrzu błony.

Liposomy wykazują dłuższe uwalnianie leku

w organizmie na stałym poziomie.

Liposomy mogą in vivo wchodzić w interakcje

z lipoproteinami i białkami występującymi we

krwi.

Trudnością w ich przewidzeniu jest fakt, iż

często zdarzają się przypadki, w których

liposom in vivo zachowuje się odmiennie niż

w warunkach in vitro.

2009-05-28

27

Metoda określająca zachowanie się liposomu w

warunkach fizjologicznych jest ważna dla:

Oceny jakości liposomu

Zapewnienia prawidłowych procesów kontroli

Zapewnienia uwalniania charakterystycznego dla

tego produktu

Oceny zmian chemicznych, produkcyjnych

Kontroli zmian w badaniach in vivo.

Metoda ta jednak spotkała się z różnymi

efektami w praktyce

Potencjalne powody braku korelacji mogą

mieć związek z rozległością błon lipidowych i

lipidów in vivo, do których uwolniony lek

może się wiązać.

2009-05-28

28

WYKORZYSTANIE FARMAKODYNAMIKI W

ROZWOJU KORELACJI IN VIVO-IN VITRO

Do pomiaru dostępności biologicznej, oprócz pomiaru stężenia leku w płynach ustrojowych, służy także odpowiedź farmakologiczna ustroju na lek. Dostarcza ona danych o takim samym znaczeniu, jak te uzyskane z pomiarów stężenia leku we krwi lub w moczu.

Założenia potrzebne dla wykorzystania odpowiedzi farmakologicznej:

Wartością limitującą etapy procesu jest dostępność biologiczna

Interakcje receptor – lek i transdukcja sygnału są szybkie.

Wszystkie procesy są odwracalne tzn. usunięcie leku ze środowiska skutkuje cofnięciem odpowiedzi farmakologicznej

Kinetyka leku jest liniowa

Metody wykorzystujące odpowiedź farmakologiczną mogą zostać wykorzystane tam, gdzie nie ma możliwości oznaczenia stężenia leku.

2009-05-28

29

WNIOSKI OGÓLNE

Dobrą korelację IVIV otrzymuje się dla

transdermalnych systemów terapeutycznych i

innych postaci o przedłużonym oraz

kontrolowanym uwalnianiu.

Dobrą korelację wykazują również substancje

lecznicze słabo rozpuszczalne w wodzie, ale

dobrze przenikające przez membrany

biologiczne (grupa II w klasyfikacji BCS),

niezależnie od postaci, w jakiej są podane.