Konzervativna rekombinacija DNK specifična za mesto

Konzervativna rekombinacija DNK specifična za mesto

• Rekombinacija između dve definisane sekvence

• Biološka uloga - obezbeđuje dinamičnost molekula DNK

Konzervativna rekombinacija DNK specifična za mesto

• Odigrava se u specifičnoj DNK sekvenci ciljne DNK – zahteva specifično rekombinaciono mesto

• Segment DNK koji se “pomera” sadrži takođe specifičnu kratku sekvencu DNK– rekombinaciono mesto

• Rekombinaze

Rekombinaciono mesto

• Dve simetrične sekvence za prepoznavanje rekombinaza

• Jedna asimetrična sekvenca – CROSSOVER REGION – za “cepanje” i ponovno spajanje DNK

• Nekada kraća i od 20 bp

Rekombinaciono mesto

• Simetrična rekombinaciona mesta

• U zavisnosti od polarnosti, jednog u odnosu na drugi, rekombinaciona mesta mogu biti direktna ili invertovana

Rezultat rekombinacije DNK specifične za mesto je genetički rearanžman

• Tip DNK rearanžmana zavisi kako od rekombinacionog mesta i njegove organizacije tako i od toga da li se rekombinaciona mesta između kojih se odvija ova vrsta rekombinacije nalaze na jednom ili dva molekula DNK.

Genetički rearanžmani rekombinacije DNK specifične za mesto

Insercija

Delecija

Inverzija

Rekombinaze

• Dve familije: Serin-rekombinaze i Tirozin-rekombinaze

• Mehanizam dejstva: Napad OH grupe ak aktivnog centra enzima na fosfoestarsku vezu molekula DNK

• Kovalentna veza između proteina i molekula DNK

• Reakcija ne zahteva dodatnu energiju

Rekombinaze

• Ponovno “spajanje” molekula DNK – napadom OH grupe sa “otcepljenog” kraja molekula DNK na protein-DNK intermedijer – ponovno spajanje DNK i oslobađanje rekombinaze

• KONZERVATIVNA

Serin- rekombinaze

• 4 subjedinice

• Svaka subjedinica seče po jedan lanac molekula DNK

• Sva četiri lanca DNK istovremeno bivaju isečena u jednom koraku reakcije

• “Razmena” prekinutih lanaca

• Ponovno “spajanje” lanaca

Tirozin- rekombinaze • Reakcija iz dva koraka

• Po dva molekula enzima aktivni u jednom koraku reakcije

• “Seku” se i spajaju

DVA PA DVA lanca

• Formiranje

Holidejevih struktura

• “Razmena” lanaca

DNK

Proteini koji pored rekombinaza učestvuju u rekominaciji DNK specifičnoj za mesto

• Sve rekombinacione reakcije kritički zavisne od pravilnog rasporeda rekombinaza na molekulu DNK.

• Neki rekombinacioni događaji zahtevaju i dejstvo pomoćnih proteina, proteini koji menjaju arhitekturu molekula DNK.

• Oni se vezuju za specifične sekvence i savijaju molekul DNK u oblik koji omogućava rekombinaciju.

• Imaju i mogućnost kontrole pravac rekombinacione reakcije (insercija umesto ekscizije segmenta DNK npr.)

Insercija bakteriofaga l

Rekombinaciona mesta

• attP rekombinaciono mesto faga (240bp)

• attB rekombinaciono mesto bakterije (30bp)

• Oba rekombinaciona mesta sadrže dva mesta za vezivanje rekombinaza i crosover region

• attP je duža i sadrži mesta vezivanja za dodatne proteine

Proteini

• Tirozin rekombinaza – integraza (Int)

• Proteini koji menjaju arhitekturu molekula DNK:

- IHF - integracioni faktor domaćina (Integration Host Factor, IHF) koji “savija” molekul DNK za više od 1600

- Xis

- Fis

Insercija bakteriofaga l

• Rekombinacijom DNK specifičnom za mesto korišćenjem rekombinacionih mesta attP i attB

• Rezultat rekombinacije nova hibridna rekombinaciona mesta attL i attR

Ekscizija bakteriofaga l

• Rekombinacijom DNK specifičnom za mesto korišćenjem rekombinacionih mesta attL i attR

• Zahteva nove proteine

• Protein Xis

• Prepoznaje specifične sekvence u novoformiranoj attR – X1 i X2 (takođe prisutne i u attP)

• Savija DNK za više od 1400 i zajedno sa IHF i lINT vrši eksciziju l faga

Protein Xis

• Protein Xis inhibira rekombinaciju između attP i attB

• Dok je protein Xis eksprimiran genom faga ostaje „SLOBODAN“

• Promoviše litički rast

PROGRAMIRANI REARANŽMAN

Salmonella

Flagelarne antigene varijacije kod Salmonella

• Flagela na površini bakterije predstavlja opšti target dejstva imunskog sistema domaćina

• Protein flagellin predstavlja komponentu flagelarnog filamenta koji egzistira u dve alternativne forme: H1 i H2

• Hin rekombinaza (Salmonella Hin recombinase) ima sposobnost inverzije segmenta bakterijskog hromozoma i na taj način obezbeđuje ekspresiju dva alternativna seta gena

• Rekombinaciona reakcija primer programiranog rearanžmana koji “pomaže” bakteriji u “borbi protiv” imunskog sistema domaćina.

Inverzioni segment dužine od 1kb sadrži gen za serin-rekombinazu Hin i promotor

a na svojim krajevima rekombinaciona mesta

Gen flj B kodira flagellin H2 Gen flj A kodira transkripcioni represor za flagellin H1G Gen za H1 na udaljenijoj lokalizaciji

“ON” orijentacija - H2 flagellin i H1 represor se eksprimiraju

“OFF” orijentacija Ćelija na svojoj površini imaju H2 tip flagellina

– ne eksprimira se H2 kao ni represor za H1 Ćelija na svojoj površini imaju H1 tip flagellina

Invertozom

• Pojačivač – stimuliše rekombinaciju (~1000 puta)

• Protein Fis – Faktor za stimulaciju inverzije

• Kompleks pojačivač – protein FIS aktivira katalitički korak rekombinacije

• Koja je biološka uloga kontrole Hin inverzije od strane pojačivača?

Invertozom

• Protein HU

• Blizak strukturni homolog proteina IHF ali se za razliku od njega za molekul DNK vezuje na način nespecifičan od sekvence

• Stabiliše invertozom

Uloga konzervativne rekombinacije DNK specifične za mesto

u održanju kružnih molekula DNK

Kružni molekuli DNK

• Hromozomi mnogih bakterija • Mnogi plazmidi • Neke virusne DNK su kružni • DIMERI ILI MULTIMERICI KRUŽNIH

MOLEKULA DNK KOJI SE STVARAJU TOKOM HOMOLOGNE REKOMBINACIJE “VRAĆAJU SE” U FORMU MONOMERA POMOĆU KONZERVATIVNE REKOMBINACIJE DNK SPECIFIČNE ZA MESTO

Resolvaze

• Rekombinaze - resolvaze

• Nazivaju se “resolvaze” jer razdvajaju dimere ili veće multimere u monomere

• Mnogi kružni molekuli DNK poseduju specifične sekvence za vezivanje resolvaza

Xer rekombinaza

• Vrši monomerizaciju brojnih bakterijskih hromozoma i bakterijskih plazmida

• Tirozin rekombinaza

• Heterotetramer – 2x XerC i 2x XerD

• Rekombinciona mesta za Xer rekombinazu nazivaju se dif mesta

Protein FtsK

• Protein ćelijske deobe • Reguliše aktivnost Xer

rekombinaze • Bez proteina FtsK aktiviraju

se samo dve subjedinice XerC, formira se Holidejeva struktura ali se rekombinacija nikada ne odvija do kraja.

• Reverzni proces čest

Protein FtsK

U prisustvu proteina FtsK

• Subjedinice XerD se prvo aktiviraju pa subjedinice XerC

• Kompletira se rekombinacija DNK specifična za mesto

• Formiraju se hromozomski monomeri.

Protein FtsK

• Protein FtsK je i ATPaza

• Vezuje se za ćelijsku membranu i to na mestima na kojima otpočinje proces binarne deobe bakterijske ćelije

• Reguliše vreme i mesto ćelijske deobe

Protein FtsK

Sledi.... Rekombinacija molekula DNK transpozicijom