Kloning av möjlig promotorsekvens uppströms kloritdismutas i Ideonella dechloratans.

Cloning of a possible promoter sequence upstream of chlorite dismutase in

Ideonella dechloratans.

Lisa Ljungberg

Faculty of Technology and Science

Biovetenkapligt program, Biokemi

Kandidatuppsats i Kemi 15hp

Maria Rova

Jörgen Samuelsson

26 mars, 2014

1

Lisa Ljungberg

2

2

Sammanfattning

Perklorat och klorater finns naturligt i atmosfären, varifrån det sedimenterar ner i grundvatten

och jord. Utsläpp av klorat och perklorat ifrån jordbruket och pappersbruk leder också till

ökade halter i vår miljö. Dessa föroreningarna kan renas med bakterier vilka kan reducera

perklorat och klorat till syrgas och kloridjoner. Denna reduktion fungerar dock bäst i en

anaerob, syrefri miljö. Med en utökad kunskap om generna, vilka är ansvariga för regleringen

och uttrycket av reducerande enzymer kan man modifiera dessa att fungera lika bra i en

aerob, syrerik miljö. Ett av dessa enzymer är kloritdismutas. Uppströms genen för

kloritdismutas i bakterien Ideonella dechloratans finns en möjlig promotorsekvens. Syftet

med detta arbete var att korta ner denna DNA-sekvens för att komma närmare inpå möjliga

reglerande sekvenser och inbindningssäte för RNA-polymeras. Därefter kontrollera om

sekvensen var en aktiv promotor. Den möjliga promotor region kortades ner och

amplifierades med PCR. Sedan ligerades den in i plasmiden pRU1103, som bär på en reporter

gen. Konstruktionen klonades i Escherichia coli och visade sig kunna bilda produkten av

reportergenen. Detta tyder på att sekvensen innehöll en fungerande promotor.

Lisa Ljungberg

3

3

Abstract

Perchlorate and chlorate are naturally occurring in the atmosphere, from here it sediments

into groundwater and soil. The pollution is increased by discharges of perchlorate and

chlorate from agriculture and paper mills. Bacteria capable of reducing perchlorate and

chlorate to chloride and oxygen can be used to get rid of these contaminants. However an

anaerobic environment needs to be sustained in order for this reaction to be used. For this

reduction to work in an aerobic environment as well, a greater knowledge of the reducing

enzymes, regulating factors and their corresponding genes is needed. One of these enzymes is

called chlorite dismutase. The upstream region of this gene in Ideonella dechloratans bacteria

is likely to contain a promoter sequence. The purpose of this work was to shorten this DNA

sequence to get closer to the potential regulatory sequences and binding-site for RNA

polymerase. Subsequently control if the sequence was active as an promoter. The potential

promoter region was shortened and amplified by PCR. It was then ligated into the plasmid

pRU1103which is carrying a reporter gene. Cloning of the construction into Escherichia coli

resulted in a production of the reporter gene product. This indicates that the sequence

contained a working promoter.

Lisa Ljungberg

4

4

Innehållsförteckning

SAMMANFATTNING ........................................................................................................................... 2

ABSTRACT ............................................................................................................................................ 3

FÖRKORTNINGAR .............................................................................................................................. 4

1. INLEDNING....................................................................................................................................... 6

2. MATERIAL OCH METODER ........................................................................................................ 10

2. 1 PRIMERDESIGN ............................................................................................................................................ 10 2. 2 PLASMIDPREPARATION .................................................................................................................................. 11 2. 3 RESTRIKTIONSKLYVNING ................................................................................................................................ 11 2. 4 RENING AV KLUVEN PLASMID .......................................................................................................................... 11 2. 5 PCR .......................................................................................................................................................... 12 2. 6 LIGERING .................................................................................................................................................... 13 2. 7 ELEKTROKOMPETENTA CELLER ......................................................................................................................... 13 2. 8 TRANSFORMATION OCH ELEKTROPORERING ........................................................................................................ 13

3. RESULTAT OCH DISKUSSION .................................................................................................... 14

3.1 PRIMERDESIGN ............................................................................................................................................. 14 3. 2 PLASMIDPREPARATION .................................................................................................................................. 15 3. 3 RESTRIKTIONSKLYVNING ................................................................................................................................ 15 3. 4 RENING AV KLUVEN PLASMID .......................................................................................................................... 18 3. 5 PCR OCH TRANSFORMATION .......................................................................................................................... 19

SAMMANFATTANDE SLUTSATS ................................................................................................... 24

REFERENSER ..................................................................................................................................... 25

APPENDIX I ........................................................................................................................................ 27

APPENDIX II ....................................................................................................................................... 28

APPENDIX III ...................................................................................................................................... 29

Lisa Ljungberg

5

5

Förkortningar

PCR - Polymerase chain reaction

MCS - Multiple cloning site

X-gal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

Ö. N – Över natt

PRB - Perklorat reducerande bakterier

CRB - Klorat reducerande bakterier

FNR - Fumarat och nitrat reduktas

bp - baspar

cfu - colony-forming unit

Lisa Ljungberg

6

6

1. Inledning

Perklorat och klorat är kemiskt stabila i vattenmiljöer och extremt lösliga. Perkloraters stora

spridning på jorden kan tyda på en naturlig källa, detta har likaså hittats i grundvatten och

ökenmark [1]. Möjligen genereras perklorat och klorat i atmosfären, sedan lagras det i jord

och grundvatten. Det faktum att många bakterier har kapaciteten att metabolisera klorater och

leva i en kloratrik miljö kan förklaras av att en naturlig källa finns [2]. Klorat och perklorat är

starka oxidationsmedel och kan därför ha en mycket negativ inverkan på biologiska system.

Perklorat och klorat är farligt för både djur och växter, exempelvis kan perklorat påverka

upptaget av jod i sköldkörteln (tyreoidea), jod är essentiellt för att bilda sköldkörtelhormoner.

Perklorat binder till natrium-jod symportern och inhiberar på så vis upptaget av jod till

sköldkörteln. Detta kan leda till sköldkörtelhormonbrist, hypotyreos [3]. Då

sköldkörtelhormoner styr metabolismen kan en felfunktion leda till defekter i tidig utveckling

hos barn och foster [4]. Växter som utsatts för klorater fick en förändring i tillväxten,

speciellt hos brunalger. Antalet alger minskade kraftigt och i några miljöer slutade algerna att

växa [2,5,6]. Klorat verkar dock vara mer toxiskt för brunalgerna jämfört med många andra

marina växter som saknar enzymet nitratreduktas. Detta kan bero på kloratets strukturella

likhet med nitrat och att det nitratreducerande enzymet nitratreduktas reducerar klorat till dess

toxiska form klorit i brunalgerna[2,7]. Trots att det finns belägg för en naturlig källa kan

klorater i vatten och jord bäst förklaras genom mänsklig påverkan. Klorater har producerats

industriellt under många år, då dessa har använts inom jordbruket som ett ogräs- eller

avlövningsmedel. Klorat bildas också som en oönskad biprodukt vid vattendesinfektion och

ifrån cellulosablekning av pappersmassa. Trots detta finns för närvarande inga regleringar av

klorathalt i drickvatten [8]. Kloraters höga löslighet och mobilitet leder till att de traditionella

teknikerna för behandling av avloppsvatten inte är effektiva nog. Biologisk rening har ansetts

vara den bästa lösningen då det betraktas vara effektivt och ekonomiskt gynnsamt [1].

Denna biologiska rening tar hjälp av mikrobiell nedbrytning av perklorat eller klorat genom

bakteriers respiration. Reduktion av klorat (ClO3-) och perklorat (ClO4

-) till kloritjoner (ClO2

-

) är en tvåstegsreaktion där perklorat först reduceras till klorat vilket i sin tur reduceras till

klorit. Klorit sönderdelas därefter till kloridjoner och syrgas (O2). Syret kan sedan användas

som respiratorisk elektronacceptor [9].

Lisa Ljungberg

7

7

→

→

→

Nedbrytningen av perklorat och klorat sker med tre olika enzymer, perkloratreduktas,

kloratreduktas och kloritdismutas. Den ena gruppen bakterier är kapabla att reducera

perklorat eller klorat i elektrontransportkedjan för cellandningen. Dessa benämns

perkloratreducerande bakterier (PRB). Den andra gruppen kallas kloratreducerande bakterier

(CRB) och dessa bakterier har enzymet kloratreduktas. Detta gör att de kan reducera klorat

men inte perklorat [10]. Gemensamt för de båda är kloritdismutas, vilket gör detta till ett

protein av intresse. För att en klorat- och perkloratreducerande reaktionsväg ska utnyttjas

krävs idag en anaerob miljö. Med en ökad kunskap om hur perklorat- och kloratreduktionen

regleras kan möjliga regulatorer manipuleras. På så vis kan bakterierna eventuellt utnyttja

denna reaktionsväg även under aeroba förhållanden. Detta skulle leda till minskade kostnader

och en ökad effektivitet [9].

Ideonella dechloratans är en gramnegativ och stavformad bakterie. Den kan inte bryta ner

perklorat men den är däremot en CRB och har förmågan att använda klorat som

elektronacceptor i andningskedjan vid frånvaro av syre. Bakterien är fakultativt anaerob. Om

syre finns tillgängligt används detta som elektronacceptor men vid syrebrist kan en alternativ

källa utnyttjas som klorat eller nitrat. Dock förlorar I. dechloratans förmågan att använda

nitrat i elektrontransportkedjan efter ett par subkultiveringar anaerobt på klorat [11]. Det har

isolerats omkring 50 arter som tillsammans med Ideonella dechloratans kan reducera

perklorat eller klorat. Reduktionen sker i periplasman, utrymmet mellan yttermembran och

cellmembran. Det är också här de två kloratnedbrytande enzymerna finns. Kloratreduktas

består av tre subenheter vilka kodas av generna clr A, clr B, clr C. Till subenheterna finns

även av ett specifikt chaperon som kodas av genen clr D. Kloritdismutas kodas enbart av

genen cld. Uppströms om clr A genen i Ideonella dechloratans ligger en möjlig promotor

sekvens (Figur 1). Promotor sekvenser är specifika sekvenser i DNA-molekylen till vilka

RNA-polymeras binder in. På så sätt leds transkriptionen av DNA till intilliggande

gensekvenser. I Escherichia coli binder RNA-polymeraset till en region ungefär 70 baspar

innan transkriptionsstart till 30 baspar efter. De baspar i DNA molekylen som korresponderar

till de första basparen i RNA molekylen får positiva nummer, medans de som kommer innan

RNA start sätet får negativa nummer. Promotorn sträcker sig alltså mellan -70 och +30.

Genom analys och jämförelse av promotor regioner i vanliga bakteriestammar har man sett

Lisa Ljungberg

8

8

likheter i två korta sekvenser i positionerna -10 och -35. Konsensus sekvensen vid -10 är (5’)

TATAAT (3’) och vid -35 (5’) TTGACA (3’).

Transkriptionen av en gen regleras noggrant i cellen för att endast bilda proteiner i nödvändig

mängd. Dessa regleringar sker främst vid RNA-polymeras inbindning och transkriptions

initiering, för att spara energi. Proteiner kan binda till regioner både nära och långt ifrån

promotorn och på så sätt påverka genuttrycket. Ett repressor protein hindrar RNA-

polymerasets rörelse igenom eller inbindning till promotorn genom blockering. Repressorn

binder till specifika platser i DNA molekylen, så kallad operator. Operatorn sitter generellt

nära promotorn. Andra transkriptionsfaktorer kan öka affiniteten eller specificiteten för RNA-

polymeraset. En aktivator är ett protein som ökar affiniteten till RNA-polymeraset och därför

också ökar transkriptionen av en eller flera gener [12]. Det är visat att transkriptionen av cld

ökar under anaeroba förhållanden [13], detta kan vara en effekt av transkriptions reglerande

sekvenser.

Escherichia coli har flera sensormekanismer som ger svar på syretillgångar och närvaro av

olika elektronacceptor. Dessa regleringar samordnas av en grupp globala regulatorer vilka

inkluderar FNR-proteinet (fumarat och nitrat reduktas) och två-komponent arcAB systemet.

ArcA, en transkiptionell regulator och arcB, ett sensorkinas. ArcA fosforyleras av arcB vid

anaeroba förhållanden. Det aktiverade arcA reglerar uttrycket av ett flertal operon,

genkluster, involverade i respiratoriska och fermentativa metabolismer [14,15]. I sekvensen

uppströms om cld finns en möjlig arcA bindande sekvens (Figur 1) och även en FNR-

liknande sekvens (figur 1). FNR-proteinet hos E.coli är en syrekänslig regulator och aktivator

som krävs för att kunna byta ifrån aerob till anaerob metabolism. FNR proteinet binder till

den återkommande palindrom liknande sekvensen TTGA(T/C)NNNN(A/G)TCAA vilken

ofta är centrerad vid -40 [15]. FNR kontrollerar alltså transkriptionen genom att binda till

promotorer under anaeroba förhållanden. FNR homologer har identifierats i många andra

bakterier, där dess roll också verkar vara reglering av genuttryck som svar på syre

förhållanden [16,17].

Lisa Ljungberg

9

9

5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTCCCCGAGGGTCATGTTTGTTGAGAAGTCAATTTCC

ACTGGAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCAAA

CACATAAAAAAGGAGAAATGCGAAGATTCGTGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACC AAGCCGCCCA

GC 3'

Experimentell Transkriptionsstart Möjlig FNR-Box Möjliga -10 och -35 sekvenser Möjlig arcA bindande sekvens

I Ideonella dechloratans har även en ArsR-gen hittats i genklustret för kloratmetabolism.

Möjligen kan denna gen vara involverad i den ökade transkriptionen av cld eller clrA under

anaeroba förhållanden [13]. Sekvensen i Ideonella dechloratans (understruket i figur 1) har

likheter med DNA-inbindningssätet för ArsR-regulatorn Rv2034, i Mycobacterium

tuberculosis. Rv2034 visades här reglera uttrycket av dosR genen, vilken ger hypoxi, istället

för att agera som metallsensor, vilket ArsR främst är förknippat med [18,19]. Dessa

sekvenser kan ha en koppling till kloratmetabolismen i anaeroba förhållanden hos Ideonella

dechloratans.

Ovanstående sekvens, Figur 1, har tidigare klonats i Escherichia coli. Under dessa försök

klonades sekvensen i plasmiden pQlacZ [20]. PQlacZ är en så kallad broad-host-range

plasmid vilket betyder att den kan användas i många olika bakterier, den begränsas främst av

sin stora storlek, 17.1 kbp. PQlacZ är en reporterplasmid och bär på reportergenen lacZ, Med

hjälp av denna reportergen har man visat att sekvensen uppströms cld innehåller en promotor.

LacZ uttrycker β-galactosidase, transkriptionen av denna gen startar om en uppströms

promotorsekvens sätts in.

Genom att korta ner sekvensen med promotorn kan man få en tydligare bild av denna och

dess innehåll. Plasmiden pRU1103 (figur 2) är en betydligt mindre plasmid, 7990 bp lång,

med 17 klyvningssäten för olika restriktionsenzym. Den ingår i en serie promotor probe

vektorer, avsedda för att undersöka närvaron av promotor regioner i gramnegativa bakterier

[22]. En gen för lacZ finns även i pRU1103, tillsammans med en gen för gentamicin

resistens. Antibiotika resistensen kan utnyttjas vid detektion av transformanter. pRU1103 har

en komplett lacZ gen som endast saknar dess promotor och reglerande sekvenser. Om en

Figur 1 Sekvens uppströms cld i Ideonella dechloratans. Understruket i figuren ses möjlig ArsR bindande sekvens

Lisa Ljungberg

10

10

promotor sekvens sätts in framför lacZ genen kommer de bakterier som tagit upp plasmiden

med insert att uttrycka β-galactosidase, precis som hos pQlacZ. Tillför man sedan x-gal, en

laktos analog, hydrolyseras denna av β-galaktosidas och bildar färglös galaktos och blåfärgad

4-chloro-3-brom-indigo [23]. Den blåa färgen ses som blåa kolonier på agar platta.

Figur 2 Restriktionssäten, ORF's och gener hos PRU1103. Bilden kommer Ifrån Addgene, www.addgene.org/14467/

Syftet med detta examensarbete var att skala ner sekvensen uppströms om cld och samtidigt

behålla de sekvenser identifierade som möjliga promotor och reglerande sekvenser. Därefter

undersöka om den nedkortade sekvensen fortfarande fungerade som promotor i Escherichia

coli [20].

2. Material och metoder

2. 1 Primerdesign

Design av primerpar gjordes med Primer-BLAST ifrån NCBI. De resulterande fem primer

paren analyserades med avseende på dess benägenhet att bilda hairpin struktur, self-dimer

och hetero-dimer. Analysen gjordes med OlgioAnalyser 3.1 ifrån Integrated DNA

Lisa Ljungberg

11

11

Technologies®. Till uppströms primern adderades ett restriktionssäte för restriktionsenzymet

PstI och i nedströms primers adderades ett säte för HindIII.

2. 2 Plasmidpreparation

Renodling gjordes av E.coli XL1-Blue innehållande plasmiden pRU1103. Kolonierna

odlades på LB-agar platta (Appendix I) under 16h, 37°C och med en tillsats av 10µg/ml

gentamicin. Mer än tolv stycken kolonier plockades till varsin Ö. N kultur och utav dessa

gjordes plasmid preparationer med E.Z.N.A®, Plasmid Mini Kit I, från Omega Bio-Tek

enligt Plasmid mini Kit I spin Protocol med en elueringsvolym på 40-100µl. Plasmid

koncentrationen och renheten mättes med Infinite® 200 PRO NanoQuant vid 280nm samt

260nm. Kvoten av A260/A280 visar förhållandet mellan DNA och proteiner och ger ett mått på

provets renhet, vid ett värde över 1,8 anses provet vara rent.

2. 3 Restriktionsklyvning

För att kunna ligera in rätt sekvens behövde plasmiden, pRU1103, först klyvas med rätt

restriktionsenzymer, vilka matchar de säten som amplifierats i PCR'en. 5,3µg plasmid

(pRU1103) klyvs med restriktionsenzymer HindIII (8u/µg) ifrån Thermo Scientific och PstI

(8u/µg) ifrån New England Biolabs. Klyvningen utfördes med Buffer R (1x), enligt

rekommendationer ifrån Thermo Scientific DoubleDigest tool. Klyvningen, med en total

volym på 100µl, inkuberades under 60 minuter i 37 °C vattenbad. De båda

restriktionsenzyms sätena sitter i multipelt kloninssite (MCS) vilket resulterade i att ett 85 bp

långt fragment klyvdes bort, se figur 2. En inkubering i 80 °C under 20 minuter gjordes

avslutningsvis för att inaktivera HindIII och PstI innan gelrening. Vid kontroller av okluven

och kluven plasmid användes DNA stegen lambda Eco1301 (styI) 16, ifrån Fermentas, se

Appendix III.

2. 4 Rening av kluven plasmid

Resultatet ifrån restriktionsklyvningen fördes över till en 0,8% agaros gel med 1µl 6x loading

dye per brunn i gelen. Alla gelelektroforeser utfördes med 1x TEA-Buffer (Appendix I).

Provet kördes på gelen under 75V i 90 minuter. Till gelen sattes även kontrollklyvningar av

enbart HindIII respektive PstI för att kontrollera att dessa var aktiva och gav en korrekt

klyvning av plasmiden, pRU1103. Bandet med DNA ifrån gelen renades därefter med

QIAEX II Gel Extraction Kit, enligt medföljande protokoll för rening ur agarose gel.

Lisa Ljungberg

12

12

2. 5 PCR

PCR (tabell 2, 3 och 4) av genomiskt DNA användes för att amplifiera sekvensen av intresse,

figur 1. Alla PCR reaktioner utfördes med KAPA2G Fast HotStart ReadyMix, enligt

medföljande anvisningar för maximal yield reaction. Ungefär 30 ng genomiskt Ideonella

dechloratans DNA användes till varje reaktion. Alla kontroller av PCR produkter gjordes på

3-4% agarose gel med DNA stegen O'Gene ruler™, low range DNA ladder, Ready-to-use

(0,1µg/µl) ifrån Fermentas (Se AppendixIII).

Tabell 1 Temperaturer och tider för de olika stegen och cyklerna i PCR 1 (touchdown).

Steg Temperatur Tid Cykler

Initial denaturation 95 °C 3 min 1

Denaturation 95 °C 15 sek

Annealing 1* 65-55 °C 15 sek 35

Annealing 2 55 °C 15 sek

Final extension 72 °C 1 min 1

* Annealingtemperaturen sänktes, -1 °C/Cykel, under 10

cykler.

En annealingtemperatur på 55 °C användes till de sista 25 cyklerna.

Tabell 2 Temperaturer och tider för de olika stegen och cyklerna i PCR 2.

Steg Temperatur Tid Cykler

Initial denaturation 95 °C 3 min 1

Denaturation 95 °C 15 sek

Annealing 63 °C 15 sek 35

Final extension 72 °C 1 min 1

Tabell 3 Tempereturer och tider för de olika cyklerna i PCR 3.

Steg Temperatur Tid Cykler

Initial denaturation 95 °C 3 min 1

Denaturation 95 °C 15 sek

Annealing 56 °C 15 sek 35

Final extension 72 °C 1 min 1

PCR produkten renades ifrån salter och Taq-polymeras med GeneJet PCR Purification Kit

(Thermo Scientific). Den framrenade PCR produkten kontrollklyvdes med

Lisa Ljungberg

13

13

restriktionsenzymerna HindIII (Thermo Scientific) och PstI (New england Biolabs) enligt

återförsäljares rekommendationer och tidigare klyvning av pRU1103.

2. 6 Ligering

Genom en ligering kunde den amplifierade PCR produkten föras in i pRU1103. Ligeringen

gjordes med T4 Ligase och 10x T4 ligase buffer ifrån Thermo Scientific. Återförsäljarens

protokoll följdes för sticky-end ligation. 1µg plasmid ligerades med 28ng insert-DNA för 2:1

förhållande och med 14ng insert-DNA för 1:1 förhållande. Ligeringen inaktiveras i 65 °C

under 10 minuter. En volym på 60µl ligerat DNA erhölls och denna fälldes ut med etanol (se

Appendix II). Resulterande DNA löstes i TE-Buffer.

2. 7 Elektrokompetenta celler

XL1-Blue, E. coli, gjordes elektrokompetenta för att kunna ta upp plasmid genom

elektroporering. Alla tillsatser och centrifugeringar under framställningen av

elektrokompetenta celler gjordes på is eller i 4 °C. Först odlades en kultur av XL1-blue under

natt (250 ml LB-medium, se Appendix I). Cellerna odlades kommande dag till ett OD på

0,62. Efter att cellerna fått kylas på is under ca 15 minuter centrifugerades de i 15 minuter,

4500 rpm i rotor SLA-3000 (Sorvall™). Pelleten som bildades resuspenderades i ungefär

100ml iskallt vatten. Provet centrifugerades som innan och resuspenderades med ytterligare

40ml iskallt vatten. Efter ännu en centrifugering, som ovan, resuspenderades cellerna i 5ml

10% glycerol två gånger. Sista gången resuspenderades de i 500µl 10% glycerol. Cellerna

överfördes i 40µl portioner till eppendorfrör.

2. 8 Transformation och elektroporering

Transformation med XL1-Blue Competent Cells ifrån STRATAGENE utfördes, enligt

medföljande protokoll med pRU1103 innehållande insert ifrån PCR 3 (tabell 3).

Elektroporeringen gjordes med Gene Pulser II®

ifrån Bio-Rad. Fältstyrkan sattes till 2,5

kV/cm, resistensen till 200 Ω och kapacitansen till 25 μF. I kyvetten (Bio-rad) var avståndet

mellan elektroderna 0,2 cm. 40µl kompetenta celler pulsades en gång tillsammans ~40 ng

plasmid. En tidskonstans på 5,01 erhölls. Direkt efter pulsen var skickad tillsattes 1ml SOC-

medium (Appendix I). Cellerna inkuberades därefter i 5ml SOC-medium, 37°C under 1h. En

positiv kontroll av pUC18 gjordes under samma kriterier. Även otransformerade celler

odlades upp i 5 ml SOC-medium för att beräkna mängden celler vilka överlevt

elektroporeringen. Efter inkubering spreds de elektroporerade, transformerade, cellerna ut på

Lisa Ljungberg

14

14

LB-agar plattor innehållande gentamicin (10µg/ml) för pRU1103 och ampicilin (100µg/ml)

för pUC18. De otransformerade, elektrokompetenta cellerna spreds ut på LB-agar plattor utan

antibiotika. På plattorna med XL-1 Blue och pRU1103 sattes även X-gal (20mg/ml) för att

kontrollera vilka kloner som tagit upp plasmid innehållande insert genom blå/vit screening.

3. Resultat och diskussion

3.1 Primerdesign

De primer par som användes vid PCR såg ut enligt följande:

Upstream: 5'GCC TGC AGC AAG CGG AAA GTG CAC GAA T 3'

Den maximala frigjorda energin, ΔGmax värdet, för hairpin och själv-dimer bildning var

följande:

Hairpin ΔGmax: -1.93 kcal/mol

Self-dimer ΔGmax: -10.24 kcal/mol

Downstream: 5' GGC AAG CTT CTG GAA CGG CAT AGA GCC AA 3'

Hairpin ΔGmax: -3.02 kcal/mol

Self-dimer ΔGmax: -10.23 kcal/mol

ΔGmax värdet för hetero-dimer bildning mellan de båda primrarna var: -6.68 kcal/mol

5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTCCCCGAGGGTCATGTTTGTTGAGAAGTCAATTTCCACTGGAA

CGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCAAACACATAAAAAAGGA

GAAATGCGAAGATTCGTGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACC AAGCCGCCCA GC 3'

Experimentell Transkriptionsstart Möjlig FNR-Box Möjliga -10 och -35 sekvenser Möjlig arcA bindande sekvens

Figur 3 Sekvens uppströms cld med primer sekvenser markerade i rött. Understruket ses möjlig ArsR bindande sekvens.

Rödmarkerat ses inbindningssäten för uppströms och nedströms primer.

Rödmarkerat i figur 3 är sekvenserna vid vilka primer paren kommer binda in. Den nya

sekvensen ses i figuren nedan (figur 4). Detta är den avskalade sekvensen vilken klonades i

plasmiden pRU1103 i E. coli:

Lisa Ljungberg

15

15

(5’)CTGGAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCAA

ACACATAAAAAAGGAGAAATGCGAAGATTCGTGCACTTTCCGCTTG (3’)

Experimentell Transkriptionsstart Möjlig FNR-Box Möjliga -10 och -35 sekvenser Möjlig arcA bindande sekvens

Figur 4 Den förkortade sekvensen som klonas i pRU1103. Understruket i figur ses möjligt ArsR bindande sekvens.

3. 2 Plasmidpreparation

Plasmiden pRU1103 preparerades fram i olika fraktioner, dessa poolades samman till en

slutvolym på 390 µl. Koncentrationen mättes till 63,35ng/µl, alltså en totalmängd på ~24µg

DNA. Provets renhet mättes till 2,04 (A260/280) vilket anses som rent (se tabell 3).

Tabell 4 Absorbansmätning vid 260 och 280nm för koncentrations- och renhetsbestämning av pRU1103.

Medelvärde av pRU1103 absorbans

260nm (A) 280nm (A) Konc (ng/µl) Ratio Volym (µl)

0,06335 0,0308 63,35 2,04 390

3. 3 Restriktionsklyvning

För att kontrollera att restriktionsenzymerna PstI och HindIII var aktiva och resulterade i en

klyvning av plasmiden gjordes kontrollklyvningar i samma buffer som användes till

dubbelklyvningar (5).

Lisa Ljungberg

16

16

Figur 5 Ifrån vänster till höger: 1: Stege, Lambda Eco1301 . 3: Oklyvd plasmid, pRU1103 5: pRu1103 klyvd med HindIII. 7:

pRU1103 klyvd med PstI. Resten av brunnarna är blanka

I brunn nummer 3, i figur 5, ses två band för den okluvna plasmiden. Ett band i toppen av

stegen, vid 19000 bp och ett strax under vid ungefär 7700 bp. Två band uppkommer eftersom

plasmiden finns i cirkulärt ( relaxerat) och supercoilat tillstånd. Plasmid i cirkulärt tillstånd

rör sig långsammare på gelen. I brunn nummer 7, i samma figur, ses ett band vid ungefär

8000 bp för pRU1103 kluven med PstI. Plasmiden ser ut att ha kluvits fullständigt av PstI

eftersom endast ett band ses i gelen vid önskad storlek, 7990 bp, med klyvd plasmid i linjär

form. Om två band uppkommit även här hade plasmiden fortfarande varit okluven. I brunn

nummer 3, i figur 5, syns inget band. Detta beror troligen på att en för liten mängd DNA

användes till klyvningen med HindIII. Hind III klyvningen kontrollerades därför ytterligare

en gång (figur 6). Den oklyvda plasmiden i cirkulärt tillstånd kunde förväntas röra sig enligt

en dubbel så stor storlek. Det är därför troligt att detta är vad som ses på gelen i brunn 3

(figur 5).

Lisa Ljungberg

17

17

Figur 6 I brunn 3 ses ett svagt band av pRU1103 klyvd med HindIII. I brunn 7 finns DNA-stege lambda Eco1301.

I brunn nummer 3, i figur 6, ses ett svagt band vid 8000 bp för pRU1103 kluven med HindIII.

Plasmiden ser ut att ha kluvits korrekt då endast ett band ses och det har den förväntade

storleken på ca 8000 bp.

Figur 7. I brunn 1 ses DNA-stege lambda Eco1301. I brunn 2 ses oklyvd pRu1103. I brunn 4-7 ses pRU1103 klyvd med PstI och

HindIII. I brunn 8 ses DNA.stege Lambda Eco1301.

Lisa Ljungberg

18

18

I figur 7 ses i brunn nummer 4 till 7 pRU1103 kluven med både HindIII och PstI. Ett band ses

i respektive brunn vid lite mindre än 8000bp. Dubbelklyvningen ser korrekt ut eftersom ett

band ses i brunnarna 4, 5, 6 och 7 och dem har den förväntade storleken på ca 7990 bp.

I Brunn 2 ses ett band större än 19329 bp med okluven pRU1103. Bandet med okluven

pRU1103 ligger över den förväntade storleken, på 7990 bp, eftersom den troligtvis befinner

sig i relaxerad form och därför rör sig långsammare på gelen. Ifrån denna gel renades den

dubbelklyvda plasmiden.

3. 4 Rening av kluven plasmid

Tabell 5 Absorbansmätning vid 260 och 280nm för koncentrations- och renhetsbestämning av pRU1103 efter gelrening.

Medelvärde av renad pRU1103

260nm (A) 280nm (A) Konc (ng/µl) Ratio Volym (µl)

0,0195 0,0104 19,4 1,87 90

Efter gelreningen poolades produkterna samman till en totalvolym på 90µl som

koncentrationsbestäms till 19ng/µl (tabell 4). Detta ger en sammanlagd DNA mängd på 1,7µg

DNA. Ett utbyte på 30 % erhölls ifrån gelreningen. Renheten mättes till 1,87 (tabell 4), vilket

antyder att provet bör vara rent ifrån andra ämnen som proteiner och acetat. Reningen av

gelen fick optimeras ett par gånger då utbytet blev mycket lågt vid de första försöken. Den

största skillnaden mellan körningarna var i lufttorkningssteget. Pelleten fick torka under 15

minuter och resuspenderingen gjordes direkt då den vita färgen började träda fram. Pelleten

blev lätt över- eller under-torkad. Detta resulterade antingen i att etanol fanns kvar och störde

eller att pelleten blev för svår att resuspendera. Utbytet jämfördes med tidigare

dokumenterade gelreningar ifrån samma kit där det maximala utbytet också visade sig vara

30 %.

Lisa Ljungberg

19

19

3. 5 PCR och transformation

Figur 8 PCR 2, annealingtemperatur = 63° C. I brunn 2: "Prov 1". Brunn 5: "Prov 2". Brunn 6: Endast templat DNA (I.

dechloratans). Brunn 7: Negativ kontroll, utan templat. Brunn 8: DNA-stege O’Gene ruler, low range DNA ladder.

Under de första körningarna av PCR används en annealing-(hybridisering) temperatur på 63°

C (figur 8). I figur 8, brunnarna 2, 4 och 6 ses inga band. Ytterligare en reaktion gjordes,

denna gång med en annealingtemperatur på 56° C (figur 9). I brunn 3, figur 19, ses ett band

strax under 150bp för PCR produkten. I samma figur, brunn 4, ses ett band strax under 150

bp för den negativa kontrollen. I brunn 5 ses inget band för den positiva kontrollen. PCR

produkten, i brunn 3, ligger i samma storlek som den väntade produkten på 127 bp. I brunnen

med den negativa kontrollen, brunn 4, antogs det vara en kontaminering av genomiskt I.

dechloratans DNA. Detta eftersom ett band med ungefär önskad produktstorlek, 126 bp,

uppkom även här.

Figur 9 PCR 3, annealingtemperatur = 56° C. I brunn 1 och 8 ses DNA-stege, O’gene ruler, low range DNA- ladder. I bunn 3:

"Prov". Brunn 4: Negativ kontroll utan templat. Brunn 5: Endast templat DNA (I. dechloratans).

Lisa Ljungberg

20

20

Figur 10 Kolonier spädda med 100µl vatten ifrån koloni PCR. Brunn 1: Stege, O’Gene ruler low range DNA-ladder. Brunn 2-11

kolonier 1-10 ifrån transformation av pRU1103 med insert ifrån PCR 3. Brunn 15: Negativ kontroll.

I figur 10 ses PCR av kolonier ifrån transformation av XL1-blue superkompetenta celler med

pRU1103 innehållandes produkt ifrån PCR 3 (figur 9). I brunn nummer 5, 6, 8 och 11 ses

tydliga band vid lite under 150 bp. I Brunn 9, samma figur, ses ett svagt band vid lite under

150 bp. I brunn nummer 15 ses också ett band vid lite under 150 bp. I brunnarna 5, 6, 8 och

11 ser det önskade insertet ut att finnas då banden ligger vid önskad storlek, ungefär 126 bp. I

den negativa kontrollen, brunn 15, ses också ett tydligt band vid ungefär 126 bp. Under tiden

av koloni PCR’en kontrollerades allt material använt vid PCR för kontamineringar. Olika

koncentrationer detta materialet kördes ut på agarose geler, inga band uppkom och någon

kontaminering hittades inte. Produkten ifrån PCR reaktionerna bör vara resultatet av en

primer-dimer. För att komma runt detta problem användes en touchdown PCR, där

annealingtemperaturen fick gå ifrån 65-55° C (figur 11). Denna varierande

annealingtemperatur ger de båda primrarna en chans att binda in vid sin optimala

hybridiseringstemperatur. Temperaturintervallet valdes efter rekommendationer ifrån tidigare

användare av metoden. Detta intervall var också baserat på det faktum att ingen produkt

bildades vid en annealingtemperatur på 63 °C. Mycket produkt bildades däremot vid 56 °C,

den optimala temperaturen ansågs därför finnas någonstans emellan de båda

annealingtemperaturerna.

Lisa Ljungberg

21

21

Figur 11 PCR 1, Touchdown. I brunn 1: stege, O’gene ruler low range DNA-ladder. Brunn 2: prov ifrån PCR 1. Brunn 3: Negativ

kontroll.

I figur 11 ses resultatet ifrån PCR 1, av touchdown modell, av genomiskt I. dechloratans

DNA. I brunn 2, ett band vid ungefär 126 bp. I brunn, negativa kontroll, 3 ses inget band.

Produkten i brunn 2 ser ut att vara den rätta eftersom den negativa kontrollen nu är blank och

bandet ligger vid storleken för den önskade produkten, 126 bp.

Figur 12 LB- platta med XL1-blue transformerad med pRU1103 innehållandes insert ifrån PCR 1 (touchdown).

Materialen ifrån touchdown PCR'en (figur 11) ligerades in i pRU1103. Sedan

transformerades E. coli, XL1-Blue, genom elektroporering och kolonier odlades upp på x-gal.

En av Ö. N kulturerna ses i figur 12, med många blåfärgade, men små, kolonier. Blåfärgade

kolonier uppkom i alla Ö. N kulturer. Ifrån en spädning av transformanter med en

Lisa Ljungberg

22

22

spädningsfaktor på 1:70 000 växte 60 kolonier på plattan. Detta gav 1,67*108

transformanter/µg DNA och 4,20*106 cfu/ml. De elektrokompetenta cellerna, vilka ej hade

elektroporerats, späddes med en spädningsfaktor på 1:1 000 000 och gav 11 kolonier,

1,10*107 cfu/ ml. Vid processen då cellerna gjordes elektrokompetenta överlevde endast 2%

(cellerna innan de gjorde elektrokompetenta hade 6,00*108 cfu/ml). Efter elektroporeringen

och uppodling på antibiotika hade 38 % av cellerna överlevt.

Figur 13 pRU1103 med långt insert (promotor) odlad på X-gal

Figur 14 - pRU1103 utan insert odlad på X-gal

I figurerna ovan (figur 13 och 14) ses pRU1103 med det långa insertet (figur 1) och pRU1103

utan insert odlade på LB-agar plattor med X-gal. I figur 13 ses blåfärgade kolonier. I figur 14

är kolonierna färglösa. De blåa kolonierna har producerat β-galactosidase och kan därför

bryta ner X-gal till den blåfärgade produkten. Det långa insertet innehåller alltså en promotor

sekvens. Det nedkortade sekvensen uppströms cld, i figur 12, innehåller troligtvis också en

fungerande promotor eftersom kolonierna blivit blåfärgade även här.

Lisa Ljungberg

23

23

Figur 15 PCR av kolonier ifrån transformation av XL1-blue med pRU1103 (+ insert ifrån PCR 1 (touchdown)) I brunn 1 och 9:

Stege, O'Generuler Low rangen DNA -ladder. Brunn 2, 4, 6, 10 och 12: Kolonier 1-5 spädda i 100 µl H2O. Brunn 3, 5, 7 och 11:

Kolonier 1-4 spädda i 1000µl H2O. Brunn 8: Negativ kontroll, utan templat DNA.

I figur 15 ses resultatet ifrån PCR på kolonier ifrån transformationen av XL1-Blue med

pRU1103 innehållandes det korta insertet ifrån PCR 1 (touchdown). I brunnarna 2, 4, 6, 10

och 12 ses kolonierna 1-5, spädda i 100 µl vatten, Här finns ett band vid ungefär 126 bp. I

brunnarna 3, 5, 7 och 11 ses kolonier 1-4 spädda i 1000µl vatten. Här finns ett band vid 126

bp i alla brunnar utom nummer 10. I brunn nummer 8 finns den negativa kontroller, här ses

inget band. I alla kolonier ser insertet ut att finnas då banden ligger vid storleken för

produkten, 126 bp. Detta visar att transformationen har fungerat och att pRU1103 har tagit

upp det önskade fragmentet. Att det finns en band i brunn 11 men inte i brunn 10 kan bero på

att cellerna ifrån koloni 4 spädda i 100µl inte lyserats på grund av att LB funnits kvar och

inhiberat. De kloner som odlats upp på plattor är väldigt små, tillväxten ser ut av avstanna

efter att de börjat växa på LB-plattan. Samma resultat sågs i alla kloner ifrån

transformationen. En möjlighet är att en stor produktion av β-galaktosidas verkar toxiskt för

cellen, eller att det finns inhiberande regioner vilka tagits bort i och med förkortningen.

Lisa Ljungberg

24

24

Sammanfattande slutsats

Att kolonierna ifrån elektroporeringen blivit blåfärgade tyder på att en fungerande promotor

finns. Plasmiden pRU1103 har alltså tagit upp ett insert innehållandes en promotorsekvens.

Till denna promotorsekvens i plasmiden kan RNA-polymeras binda in och börja transkription

av den efterföljande lacZ genen vilket till att cellerna producerar β- Galaktosidas och färgar

kolonierna blå i närvaro av x-gal. De designade primerparen har därmed fungerat och

amplifierat det önskade området.

Genom att PCR-reaktionen gjord på de transformerade klonerna ger en produkt av förväntad

längd är det troligt att önskad sekvens har tagits upp. Ett nästa steg vore att jämföra promotor

aktiviteten i det korta insertet med det tidigare klonade, långa, insertet. Promotor aktiviteten

kan mätas och jämföras med avseende på enzymaktivitet i en β- Galaktosidas-assay.

Ytterligare ett steg vore att klona den nya, kortare, promotor sekvensek i Ideonella

dechloratans. Om framtida studier på klonerna ska vara möjligt behövs dock kolonier som

växer bättre. Ett försök vore att odla dem på SOC-medium istället för LB-medium, då de får

tillgång till mer mineraler och glukos.

Lisa Ljungberg

25

25

Referenser

1. Ahn S. C, Hubbard B, Cha D, Kim B. J : Simultaneous removal of perchlorate and

energetic compounds in munitions wastewater by zero-valent iron and perchlorate-respiring

bacteria. Journal of Environmental Science and Health, Part A 2014;49:575-583.

2. Schwarz AO, Urrutia H, Vidal JM, Perez N: Chlorate reduction capacity and

characterisation of chlorate reducing bacteria communities in sediments of the rio cruces

wetland in southern chile. WATER RESEARCH 2012;46:3283-3292.

3. Wolff J: Perchlorate and the thyroid gland. Pharmacol Rev 1998;50:89-105.

4. Health implications of perchlorate ingestion. The National Academies Press, 2005.

5. Li H, Zhang X, Lin C, Wu Q: Toxic effects of chlorate on three plant species inoculated

with arbuscular mycorrhizal fungi. Ecotoxicology and Environmental Safety 2008;71:700-

705.

6. Palma AT, Henríquez LA, Alvarez X, Fariña JM, Schwarz A, Lu Q: Do subtoxic levels of

chlorate influence the desiccation tolerance of egeria densa? Environmental Toxicology and

Chemistry 2013;32:417-422.

7. DJ: Chlorate toxicity in aspergillus nidulans. Studies of mutants altered in nitrate

assimilation. Molecular & General Genetics: MGG 1976;146:147-159.

8. WSH: Chlorite and chlorate in drinking water. Background document for development of

who guidelines for drinking-water quality. World Health Organization, Water Sanitation and

Health, 2005.

9. Nilsson T, Rova M, Smedja Bäcklund A: Microbial metabolism of oxochlorates: A

bioenergetic perspective. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics

2013;1827:189-197.

10. Mehboob F, Wolterink AFM, Vermeulen AJ, Jiang B, Stams AJM, Kengen SWM,

Hagedoorn PL: Purification and characterization of a chlorite dismutase from pseudomonas

chloritidismutans. FEMS Microbiology Letters 2009;293:115-121.

11. Malmqvist Å, Welander T, Moore E, Ternström A, Molin G, Stenström I-M: Ideonella

dechloratans gen.Nov., sp.Nov., a new bacterium capable of growing anaerobically with

chlorate as an electron acceptor. Systematic and Applied Microbiology 1994;17:58-64.

12. Nelson DL, Cox MM, Lehninger AL: Lehninger principles of biochemistry / david l.

Nelson, michael m. Cox. New York : W. H. Freeman ; Basingstoke : Palgrave [distributor],

cop. 2008

5th ed., 2008.

13. Hellberg Lindqvist M, Johansson N, Nilsson T, Rova M: Expression of chlorite dismutase

and chlorate reductase in the prescence of oxygen and/or chlorate as the terminal electron

Lisa Ljungberg

26

26

acceptor in ideonella dechloratans. Applied and Environmental Microbiology 2012;78:4380-

4385.

14. Bell A, Busby S: Location and orientation of an activating region in the escherichia coli

transcription factor, fnr. Molecular Microbiology 1994;11:383-390.

15. Lynch AS, Lin ECC: Transcriptional control mediated by the arca two-component

response regulator protein of escherichia coli: Characterization of dna binding at target

promoters. Journal of Bacteriology 1996;178:6238-6249.

16. Joshi M, Dikshit KL: Oxygen dependent regulation of vitreoscilla globin gene: Evidence

for positive regulation by fnr. Biochemical And Biophysical Research Communications

1994;202:535-542.

17. Vasilieva SV, Strel'tsova DA, Moshkovskaya EY, Vanin AF, Mikoyan VD, Sanina NA,

Aldoshin SM: Reversible no-catalyzed destruction of the fe-s cluster of the fnr[4fe-4s]

transcription factor: A way to regulate the aidb gene activity in escherichia coli cells cultured

under anaerobic conditions. Doklady Biochemistry & Biophysics 2010;435:283-286.

18. Gao Ch, Yang M, He ZG: Characterization of a novel arsr-like regulator encoded by

rv2034 in mycobacterium tuberculosis. PLoS ONE 2012;7.

19. Park H-D, Guinn KM, Harrell MI, Liao R, Voskuil MI, Tompa M, Schoolnik GK,

Sherman DR: Rv3133c/dosr is a transcription factor that mediates the hypoxic response

ofmycobacterium tuberculosis. Molecular Microbiology 2003;48:833.

20. Ölund D: Konstruktion av reporterplasmider innehållande möjliga promotorregioner för

kloratreduktas respektive kloritdismutas från Ideonella dechloratans, 2012, pp 26.

21. Miller JH: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.

22. Karunakaran R, Mauchline TH, Hosie AH, Poole PS: A family of promoter probe vectors

incorporating autofluorescent and chromogenic reporter proteins for studying gene

expression in gram-negative bacteria. Microbiology 2005;151:3249-3256.

23. Horwitz JP, Chua J, Curby RJ, Tomson AJ, Da Rooge MA, Fisher BE, Mauricio J,

Klundt I: Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity. I. Some substituted

3-indolyl-β-d-glycopyranosides1a. Journal of Medicinal Chemistry 1964;7:574-575.

Lisa Ljungberg

27

27

Appendix I

Soc-Medium:

0,5% Jästextrakt

2% Tryptone

10mM NaCl

2.5mM KCl

10mM MgCl2

10mM MgSO4

20 mM Glukos

1 x TEA Buffer:

1mM EDTA

20mM Ättiksyra

40mM Trizma Base

LB-Medium, 1 liter

10g NaCl

5g Jästextrakt

10g Tryptone

fylls till 1 liter med H2O

Lisa Ljungberg

28

28

Appendix II

Etanol fällning:

Uppskatta provets volym

Tillsätt 1/10 volymer natriumacetat, pH 5,2 till en slutkoncentration på 0,3M

(Förutsatt att DNA't finns i enbart TE-buffer. Om inte beräkna med avseende på

saltkoncentrationen)

Blanda väl

Tillsätt 2 till 2.5 volymer iskall 99,9% Etanol

Blanda väl

Inkubera på is > 20 minuter

Centrifugeras på14,5 x g, 10-15 minuter

Häll av supernatant

Tillsätt 1ml 70% Etanol, centrifugeras snabbt och ta sedan bort supernatant

Lufttorka pellet

Resuspendera i önskad mängd TE-buffer

Lisa Ljungberg

29

29

Appendix III

Figur 16 DNA stege, O'gene Ruler. Bild ifrån ThermoScientific.

Figur 17 DNA stege Lambda Eco1301. Bilden är en skärmdump ifrån tillverkarens (Fermentas) meföljande protokoll.