Klinički zavod za kemiju KBC Sestre milosrdnice...•DNA profiling (DNA fingerprinting) individualni jedinstveni DNA profil •razdvajanje dugačkih fragmenata (PR, RFLP, STR i VNTR

Klinički zavod za kemijuKBC Sestre milosrdnice

Tečaj HKMBAnalitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: elektroforetske i kromatografske separacije

Farmaceutsko biokemijski fakultet, A. Kovačića 1, Velika predavaonica, 10.3.2018.

Odvajanje nukleinskih kiselina - CF u gradijentu • na osnovu razlike u brzini sedimentacije • dugotrajno, velike količine uzorka• teška oprema

ALTERNATIVA elektroforeza:• pokretljivost DNA u ionskim otopinama u električnom polju• gel matrica, vertikalni pločasti gelovi

• agar (prirodni ugljikohidrat)• agaroza (komponenta agara) postupno zamjenjuje agar• poliakrilamid sintetički gelovi, agaroza-akrilamid

• korelacija sa sedimentacijskim koeficijentom • otkriće RE + radioaktivno označavanje nukleinskih kiselina• cjevasti gel format preteča kapilarne elektroforeze • etidij bromid (EtBr)• horizontalni pločasti gelovi agaroze (McDonell i sur. )Analitička i preparativna primjena

• koristi se i u novim tehnologijama:• uređivanja genoma • sekvenciranje nove generacije (NGS)

Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 2

1960ih

1971

1972

1977

1967

Razlika pokretljivosti molekule ovisi izravno o:

veličini, obliku i naboju


Preuzeto sa: https://www.thermofisher.com

• migracija DNA u slobodnoj otopini je neovisna o Mr• mehanizam razdvajanja u gelu – dva glavna modela:Ogstonov model • široko prihvaćen prosijavanje molekula manjih od pora matriksa• kratke, kružne, zapetljane molekule DNAReptacijski model (model zmije/gusjenice)• kada su molekule znatno veće od pora


prema: Butler JM. Forensic DNA Typing. 2nd Ed, Elsevier Academic Press (2005)

kratka DNA duga DNA

Ogstonov model Reptacijski model

pore gela

Udaljenost migracije korelira s veličinom molekula

• moguće izračunati veličinu DNA nepoznatog uzorka

• samo za linearne dsDNA molekule:


udaljenost migracije ~1

log(𝑀𝑟)

mo

biln

ost

log

(vel

ičin

a)

1000bp

100bp

10bp

Dvije izvedbe:1. horizontalna (tzv. submarine elektroforeza) 2. vertikalna

Različite veličine, ovisi o broju uzoraka i Mr DNA• šira kadica više uzoraka • dulja kadica više redaka / dulja migracija u gelu

Veći formati za:• polimorfizam duljine fragmenta (RFLP) • Southern blot

Mini formati za:• brzo razdvajanje i manji broj uzoraka


Preuzeto sa: https://www.btlabsystems.com

Preuzeto sa: http://www.bio-rad.com

Preuzeto sa: https://www.agilent.com

Sastav ili gradijent pufera• nativna EF• alkalno denaturirajuća EF• gradijentna EF

Električno polje • elektroforeza pulsnog polja, PFGE

Matriksi• agaroza• poliakrilamid/PAGE (denaturirajući ili nativni)

• sredstva za denaturaciju (npr. NaOH + urea/formamid) • ssDNA (npr. tehnike SSCP, DGGE, ili DNA footprinting)• za kratke dsDNA• za RNA 20 - 60bp

• industrijske varijacije - različiti proizvođači• polimeri u uskim silikatnim kapilarama


U obliku:

• tanke "ploče" pravokutnog oblika (horiz./vert. EF)

• kapilarna elektroforeza, mikrouzorak – danas• komercijalni sustav s gotovim gelom ispunjenim kapilarama

• brzo, osjetljivo i standardizirano izvođenje elektroforeze

Agarozni gelovi:

• ugljikohidrat iz morske trave

• velike pore (~200nm), brža migracija

Akrilamidni gelovi:

• polimer akrilamidnih skupina

• male pore (~20nm), spora migracija/bolja rezolucija

Komercijalne izvedenice agaroze i PAG

• Clearose®, Spreadex®, TruPAGE™, Novex®…


• Gustoća gela• Veličina i linearnost DNA • Konformacija DNA • Priprema uzorka• Napon i vrijeme• Pufer (Tris/acetat/EDTA – TAE, Tris/borat/EDTA - TBE)

• Koncentracija boje pri bojenju gela (npr. EtBr)

Elektroforeza RNA:• provjera kontaminacije genomskom DNA • eukariotska RNA 28s i 18s rRNA• provjera degradacije RNA (razmazana vrpca)


Aem 605 nm

Aabs210/285nm (UV)

Preuzeto sa: https://www.hoelzel-biotech.com/en/infothek/nucleic-acid-detection/


GelRed•Biotium•sličan EtBr,osjetljiviji•dsDNA, ssDNA i RNA•nije kancerogen •nije toksičan

Amax ~ 280nmEmax ~ 590nm

SYBR Green I •Molecular Probes•karcinogen

Amax497nmEmax 520nm

GelGreen•Biotium•manje toksičan •dsDNA, ssDNA i RNA

Amax~500nmEmax ~520nm

Ostale cijaninske boje•SYBR Green II (za bojenje ssDNA i RNA)•SYBR Gold (pojačana osjetljivost)•Safe-green (manja toksičnost)

Etidij bromid•1950ih (homidium)•>20ng DNA/RNA 20X jači intenzitet

•mutagen•karcinogen

Amax210/285nmEmax 610nm


DNA standardi (Molecular Weight Markers)

• usporedba duljine fragmenata nepoznatog uzorka

• različitih duljina ili ljestvica (ladder)

184bp

124bp

213bp

234bp

267bp

MWM 1 2 3 4 5 6


Dijelovi• UV transiluminator (260-300-312nm)• kamera ili scanner• software za očitavanje i analizu• pojedinačno ili kao gel imaging sustav

By Bonnvenn - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=7861132

http://www.gelanalyzer.com/

Moguće varijacije:• količina i kvaliteta uzorka (5 – 8 – 10 – 12uL…)• postavke napona (60 - 80 - 100 - 120 - 150V…)• gustoća gela (0,5 - 0,8 - 1,0 - 2,0 - 5,0 - 10 - 16%)• duljina trajanja (15 – 30 – 60 – 120min …)• bojenje i vizualizacija (EtBr – GelRed – SYBR…)

Priprema gelova:• zahtjevan postupak:

• kuhanje agaroze, izlijevanje gela • priprema i pranje kalupa, polimerizacija akrilamida• problemi sa zaostalim mjehurićima zraka• nanošenje malih količina uzorka• prelijevanje uzorka iz jažica

• neurotoksičnost akrilamida, kancerogene boje


• RFLP, kvantifikacija, preparacija, ispitivanje kvalitete• nije za određivanje SNP

• 0,7% (5–10kb) – vrlo krhki gelovi• 2% (0,2–1kb) • 3% za vrlo kratke fragmente• 1% - najčešće

• Postupak:1. Izvagati točnu količinu agaroznog praha, dodati pufer

• npr. 1% agaroza = 1g + 99ml H2O2. Zagrijati u vodenoj kupelji u mikrovalnoj/magnetskom grijaču

• bistra otopina (70°C)3. Pripremiti kalup izliti otopinu gela, umetnuti češalj4. Ohladiti gel, izvaditi češalj5. Postaviti gel u kadicu6. Pripremiti uzorke i molekularni standard (marker), 7. Nanositi 5-10uL, pomiješan sa obojenim puferom za

nanošenje (npr. BFP+glicerol)


• razdvajanje fragmenata slične duljine, SNP polimorfizmi, insercije/delecije >1-2bp..

• tipično: 6%, 8%, 10%, 12% ili 15% gelovi

Postupak:1. Temeljito oprati i posušiti stakla za vertikalni kalup (1-3mm razmak!)2. Izvagati točne količine (akrilamid, bis-akrilamid, TEMED, APS)3. Pripremiti kalup stakla, razmaknice i češalj4. Pripremiti polimer, odmah po dodavanju TEMEDa izliti gel, (mj. zraka!)5. Nanošenje uzorka (boja za nanošenje - loading buffer!)

Problemi:• mjehurići zraka!• zagrijavanje gela tokom elektroforeze (‘smile effect’)

• zakrivljena fronta, teško odrediti veličinu• otapanje gela• hlađenje sustava za elektroforezu (hladna komora, protok hlađenog

pufera)


Aga

roza

(EtB

r)PA

GE

(SY

BR

Go

ld)

Smile efekt• previsoka T gela• loša homogenost gela

Ispravan geloštre jasno odijeljene vrpce

Mjehurići zrakaNehomogen gel• previsoka T, loša homogenost


Sekvenciranje Maxam - Gilbert

• radioaktivno obilježavanje 5‘ kraja

• kemijsko cijepanje• A+G, G, C, C+T

Preuzeto sa: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/6/66/Maxam_gilbert_sequencing.png

Preuzeto sa: http://www.generasibiologi.com/2016/03/metode-sekuensing-kimiawi-maxam-gilbert.html

1976


Sekvenciranje Sanger (terminacija lanca)• dideoksi nukleotidi – ddNTP (terminacija)

• fluorescentno obilježeni primer

• Novi DNA lanac s obilježenim dNTP, ili

• Obilježenim ddNTP

NN 1980

Preuzeto sa: http://dnamismatch.com/dna-sequencing/methods-in-development/microfluidic-sanger-sequencing/


• PCR cijepanje RE EF u gelu agaroze/PAGE

Elektroforeza

PC

R

mut/w

t

wt/

wt

wt/w

t

mu

t/w

t

wtmut

DNA

Puna krv PCR


RE

• DNA profiling (DNA fingerprinting) individualni jedinstveni DNA profil

• razdvajanje dugačkih fragmenata (PCR, RFLP, STR i VNTR lokusi i sl.)

• elektroforeza na 14°C, 18-24h

• promjena smjera napona za 60° svakih 90sekundi

1500kb

900kb

700kb

300kb

100kb+

--

+

+

-


• denaturirajući uvjeti (formamid, 95°C) 0°C

• PAGE elektroforeza na 4°C razdvajanje ssDNA

PC

R

mut/w

t

wt/w

t

wt/

wt

mut/w

t


wt/wtmut/wt mut/mut

Elektroforeza

ssDNA

DNA

Puna krvPCRmut/mut wt/wt

• povećana rezolucija razdvajanja, bez sekundarnih struktura

• denaturirajući PAGE gel:• denaturacija za vrijeme EF ssDNA (NaOH + formamid/urea, 95°C)

mut/mut wt/wt mut/wtmut/mut wt/wt

ds

ss

30%

ele

ktro

fore

za

de

ntu

rant

60%


• Fleksibilne staklene kapilare + gel matriks• Uzorak i pufer uvučen u kapilaru pod djelovanjem napona• Dugačka DNA putuje sporije od kratke• Napon viši nego kod gel elektroforeze (bolji odvod topline)• Lasersko očitavanje vezane bojePrednosti:• Nema pripreme gelova• brzo (unutar minuta), jeftino, male količine uzorka• može se automatizirati, • trenutna detekcija po završetku

Nedostaci:• Mali broj istovremenih uzoraka (kapacitet) - jedna kapilara

po uzorku• Danas postoje sustavi sa paralelnih 96 kapilara• Skupi automatizirani sustavi, skupi reagensi i kapilarni nosači


Documents

Klinički zavod za kemiju KBC Sestre milosrdnice...•DNA profiling (DNA fingerprinting) individualni jedinstveni DNA profil •razdvajanje dugačkih fragmenata (PR, RFLP, STR i VNTR