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Klausur 26.07., 08:00 Uhr, Hörsaal Ost
FLI-Führung Anmeldung per Email an Dr. Finke bis 05.07.
Ankündigung!
QUELLEN:
Fields Virology 5th Edition
Flint Principles of Virology
Bozzola & Russell Electron Microscopy
Rolle & Mayr
Ultrastruktur von Viren
PD Dr. Jürgen [email protected]
PDF der Vorlesung
zum Download
https://lehre.fli.de
Ultrastruktur-Typen
Aufbau und Unterschiede
Von der Struktur zur Funktion
Ziele dieser Vorlesung
SEM TEM
Art der
Diagnostik
Methode Nachweis von Vorteile/
Nachteile
Direkter Erregernachweis
Virus-Isolierung Anzüchtung auf
Zellkulturen
Infektiösität,
Zytopathogenität
empfindlich,
aber langsam
Elektronen-
mikroskopie (EM)
Negativ-
Kontrastierung,
Transmissions-EM
Viruspartikel schnell, aber
wenig empfindlich
Antigen-Nachweis
im Pat.-Material
Immunfluoreszenz,
Ag-ELISA
Virusproteine schnell, aber nur
z.T. verfügbar
Nukleinsäure-
Nachweis
im Pat.-Material
Gensonde,
Polymerase-
Kettenreaktion
viraler Nukleinsäure
(DNA oder RNA)
schnell, aber kein
dir. Nachweis der
Infektiösität
Indirekter Nachweis
Serologie • Immun-
fluoreszenz
• ELISA
• Hämagglutinations
-Hemmtest
• Western Blot
spezifischen
antiviralen
Antikörpern
im Serum des
Patienten
retrospektive
Diagnose
https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/advanced-chemistryprize2017.pdf
Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels
Virion infektiöses Viruspartikel
Kapsid (Umhüllung, Coat) Proteinschicht, umgibt die genomische Nukleinsäure
Nukleokapsid (Kern, Core) Kapsid als diskrete Substruktur im Viruspartikel
Definitionen
Strukturbegriffe I
Protomer (asymmetrische (Struktur-)Einheit) bildet Kapside oder Nukleokapside, kann aus einer
oder mehreren gleichen oder verschiedenen Protein-
Untereinheiten bestehen
Proteinuntereinheit einzelne gefaltete Polypeptid-Kette
Kapsomer morphologische
Oberflächenstruktur aus
Elektronenmikroskopie(!),
mit Protomer nicht zwingend identisch!
Definitionen
Strukturbegriffe II
Genome Protection
Genome Delivery
Other interactions with the host
Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels
Rotavirus
Tabakmosaikvirus
(TMV)
Vesikuläres
Stomatitisvirus
(VSV)Herpesvirus
Nukleokapside: Ausnahmen
Konisches Nukleokapsid
bei Lentiviren, z. B. HIV
Komplexes Nukleokapsid
bei Pockenviren
Komplexes Nukleokapsid der Poxviridae
Konisches
Nukleokapsid
der Lentiviren
Bei den Retroviren wurde die alte Einteilung
nach Morphologie des Kapsids
durch funktionelle Kriterien ersetzt.
Neuere Ausnahme: „Riesenviren“
Neuere Ausnahme „Riesenviren“
Parachlamydia
Archaea
Verrucomicrobia
Mimivirus
microbe
mimicking
virus
ermöglichen die Selbst-Assemblierung.
Jede Untereinheit hat „identische“
Bindungsstellen zu ihren Nachbarn. Diese regelmäßigen Interaktionen chemisch
komplementärer Oberflächen ermöglichen ein
symmetrisches Arrangement.
Bei ikosaedrischen Nukleokapsiden mit mehr als 60
Untereinheiten gilt das Prinzip der Quasi-Äquivalenz (s. dort).
Diese Bindungskontakte sind nicht kovalent. Die reversible Bildung nicht-kovalenter Bindungen korrekt
gefalteter Untereinheiten führt zu einem fehlerfreien
Aufbau und minimiert die freie Energie.
Symmetrie-Regelnfür konventionelle Nukleokapside
Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels
Rotavirus
Tabakmosaikvirus
(TMV)
Vesikuläres
Stomatitisvirus
(VSV)Herpesvirus
Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels
Rotavirus
Herpesvirus
Ikosahedrales
Nukleokapsid
Zwei Hinweise führten zum … Alle runden Kapside haben genaue Zahlen an
Untereinheiten: Vielfache von 60 (60, 180, 240, …).
Diverse Kapsidgrößen sind bekannt, aber die Größen der
Kapsid-Proteine variieren von ca. 20 bis 60 kDa.
Strukturkonzept von Caspar & Klug (1962). Watson & Crick: Runde Kapside sind Ikosaeder, aber keine
anderen platonischen Körper.
Kapsid-Untereinheiten sind präferentiell als Hexamere und
Pentamere arrangiert.
Anzahlen dieser Untereinheiten sind Vielfache von 60.
Problem: „Runde“ Kapsideaus unregelmäßig geformten Proteinuntereinheiten?
Ikosaeder = Zwanzigflächner
größtes Volumen unter den Tetraedern
3 Rotationsachsen
mit unterschiedlichen
Freiheitsgraden fünffach
dreifach
zweifach
Ikosahedrales Nukleokapsid
geschlossene Struktur
Pico
RNA
viren
• Maul- und Klauenseuche-
Virus
• Poliovirus
• Hepatitis-A-Virus
• …
Nur bei den einfachsten Ikosaedern mit T=1
entspricht
1 Kapsomer einer asymmetrischen Einheit!
Ikosaeder: 20 Seitenflächen
Triangulationszahl: Wieviele Dreiecke je Seitenfläche?
Im einfachsten Ikosaeder findet sich
1 Seitenfläche = 1 Dreieck T=1 mit jeweils 3 Kapsomeren.
3 x 20 Seitenflächen = 60 Kapsomere
Alle größeren
ikosahedralen Kapside
haben T x 60 Kapsomere.
Alle Ecken sind von Pentameren
umschlossen.
Jede (dreieckige) Seitenfläche grenzt
an drei Pentamere.
h und k sind Anzahlen an Hexameren
als Abstände von einem zu den beiden
anderen Pentameren.
Geometrische Herleitung von T
T = h2 + hk + k2
T = h2 + hk + k2
h = 1, k = 1
T = 12 + 1x1 + 12
T = 3
Zwei Beispiele zur Berechnung
T = h2 + hk + k2
h = 2, k = 1
T = 22 + 2x1 + 12
T = 7
Zwei Beispiele zur Berechnung
T = h2 + hk + k2
h = 4, k = 0
T = 42 + 4x0 + 02
T = 16
Zwei Beispiele zur Berechnung
Prinzip der Quasi-Äquivalenz Bei mehr als 60 Untereinheiten besetzt jede eine
räumlich quasi-äquivalente Position.
Die nicht-kovalenten Bindungen dieser Unterein-
heiten sind einander ähnlich und nicht identisch.
Adenoviridae
Zwar ist das Virion ohne Hülle,
jedoch ist das Ikosaeder sehr komplex!
h = 5, k = 0, T = 25
Zwei
Ikosaeder-Schichten
Ikosaeder und Lipidhülle
bei DNA-Viren
unbehüllt
Parvoviridae – Parvovirus B19
Papillomaviridae – humane Papillomviren
Adenoviridae – humane Adenoviren A-F
behüllt
Hepadnaviridae – Hepatitis-B-Virus
Herpesviridae – Herpes-simplex-Virus I
Ikosahedrales Nukleokapsid
bei RNA-Viren
unbehüllt
Reoviridae – Blauzungenvirus
Birnaviridae – Virus der infektiösen Bursitis
Caliciviridae – Norwalkvirus
Picornaviridae – Poliomyelitisvirus
behüllt
Flaviviridae – Gelbfiebervirus
Togaviridae – Rötelnvirus
Ikosahedrales Nukleokapsid
Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels
Rotavirus
Tabakmosaikvirus
(TMV)
Vesikuläres
Stomatitisvirus
(VSV)Herpesvirus
Allgemeiner Aufbau eines Viruspartikels
Tabakmosaikvirus
(TMV)
Vesikuläres
Stomatitisvirus
(VSV)
Helikales
Nukleokapsid
Symmetrie: P = µ x p µ – Untereinheiten pro Windung
p – Zuwachs pro Untereinheit
P – Abstand pro Windung
Helikales Nukleokapsid
DNA-Viren Baculoviridae – Autographa californica
multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)
RNA-Viren Tobamovirus – Tabakmosaikvirus
Coronaviridae – SARS-Coronavirus
Filoviridae – Ebola-Zaire-Virus
Rhabdoviridae – VSV, Lyssavirus
Bunyaviridae – Hantaanvirus
Orthomyxoviridae – Influenzavirus A
Paramyxoviridae – Respiratorisches Synzytialvirus
Arenaviridae – Lymphocytic Choriomeningitis Virus
Helikales Nukleokapsid
Baltimore-Klassifikation: Genom mRNA
David Baltimore: Expression of Animal Virus Genomes. Bacteriological Reviews 1971.
Klassifikation DNA-Viren
Ikosaedrische und helikale Nukleokapside
innerhalb der Baltimore-Klasse I!
Klassifikation RNA-Viren
Ikosaedrische und helikale Nukleokapside
innerhalb der Baltimore-Klasse IV!
Jenseits
der
Nukleokapside …
Taxonomie: Ordnung: Nidovirales
Familie: Coronaviridae, Genus: Coronaviren
Eigenschaften:- Spike-Proteine bilden Corona im EM-Bild
- einzelsträngiges RNA-Genom positiver
Polarität von 27-32 kb Länge
- umhüllte Virionen von 100-140 nm Größe
- Nukleokapsid-Protein umhüllt RNA-Genom
Coronavirus
Namensgebung: lat. corona Krone, nach Morphologie im EM
Systematik: Ordnung Nidovirales, (nested set of mRNAs), Familie Coronoviridae, 3
Serotypen
Genomaufbau: 1 einsträngige plussträngige polyadenylierte RNA mit Cap am 5‘-Ende,
27 bis 32 kB (grösstes RNA-Virusgenom).
Virionstruktur: umhülltes Nukleokapsid, in Hülle eingelagert: S (spike) Glykoprotein, bei
allen CV, bei manchen Hämagglutinin-Esterase, M, transmembrane protein,
envelope protein
Replikationsstrategie und Expression: zwei PolyproteineORF 1a 1b, ribosomaler Frameshift und für kleinere
Proteine diskontinuierliche Transkription in mehrere mRNAs
Epidemiologie und Krankheitsbilder: humanes CV: banale
respiratorische Infekte von Nase, Trachea, Alveolen, Reinfektionen häufig, auch
Darminfektionen; SARS – schwere Pneumonie
Virusreservoir: Mensch, Schwein und div. Säugetiere, Hühnervögel
Genus Coronavirus
Murphy & Whitfield Bull WHO 1975
Familie Arenaviridae - Namensgebung
Namensgebung lat. arena Sand, sandartiges Bild in EM wg.
eingelagerten Ribosomen im Virion
Systematik 2 Genera: Mamm- und Reptarenavirus
Genomaufbau 2 „ambisense“-Segmente
Virionstruktur helikales Nukleokapsid (RNA, L-, N-Protein), umhüllt, GP1/GP2, Z-
Protein, zelluläre Ribosomen
Replikationsstrategie und Expression Transkription von vRNA in mRNA des L- und N-Proteins, Replikation
von vRNA zu cRNA zu vRNA, von cRNA Transkription in mRNA der Z-
und GPC-Proteine (Replikation im Zytoplasma)
Epidemiologie und Krankheitsbilder weltweit, hämorrhagisches Fieber, Lassa-Fieber, lymphozytäre
Choriomeningitis
Virusreservoir Nager oder auch früchtefressende Fledermäuse
Familie Arenaviridae
Abgrenzung aller Virenzu anderen intrazellulären Pathogenen
wie
Rickettsien,
Chlamydien oder
Mykoplasmen
besteht weder in Größe (Ultrafiltrierbarkeit)
noch im obligaten Zellparasitismus
sondern in der Abwesenheit von
eigenen Ribosomen.
RotavirusTabakmosaikvirus
(TMV)
Vesikuläres
Stomatitisvirus
(VSV)
Herpesvirus
Typische Morphologie
Arenavirus
Coronavirus
MasernvirusInfluenzavirus A
Adenovirus
Picornavirus
Nukleokapside: Ausnahmen
Konisches Nukleokapsid
bei Lentiviren, z. B. HIV
Komplexes Nukleokapsid
bei Pockenviren
Rhabdoviridae (VSV)
Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped
Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010
Virion enthält zwei Helices: Nukleo(N)-Protein + RNA sowie Matrix(M)-Protein
Andere umhüllte Viren sind pleomorph: rigide Geschoßform der Rhaboviren
durch N-N und M-N Interaktionen zu erklären
Kristallstruktur des M-Proteins in Elektronendichtekarte eingepasst
Interaktion zwischen N und M gezeigt
Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped
Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010
Kristallstruktur (Decamer-Ring)
von N-Protein und RNA in
Elektronendichtekarte
eingepasst
-> Orientierung der vRNA im
Virion: 5‘-Ende beginnt mit
Spitze
Hypothese: Assembly beginnt
mit Bildung der Spitze, durch
elektrostatische Wechsel-
wirkung mit RNA werden die
Windungen vergrößert
C-Terminus des G-Proteins interagiert mit M
Cryo-EM Model of the Bullet-Shaped
Vesicular Stomatitis Virus (VSV) Ge et al., Science 2010
Familie Paramyxoviridae
Influenza-A-Viren
Namensgebung: griech. orthos richtig, myxa Schleim
Systematik: 6 Genera: Influenzavirus A, B, C, Thogotovirus, Isavirus,
Genomaufbau: Quaranjavirus
8 negativsträngige Segmente
Virionstruktur: 8 helikale Nukleokapside (RNA, NP, Polymerase (=RNP)) umhüllt von
M1+Hülle, darin eingelagert Oberflächenproteine HA, NA, M2
Replikationsstrategie und Expression: primerunabhängige Replikation der vRNA zu cRNA zu vRNA im Zellkern,
Transkription von vRNA im Zellkern nach Cap-Snatching zu mRNA,
Spleißen einzelner mRNA, alternative ORF
Epidemiologie und Krankheitsbilder: Pandemien (Influenza A), jährliche Epidemien, Bronchiolitis,
Bronchopneumonie
Virusreservoir: Influenza A: vor allem Entenvögel, Hühnervögel, Schwein, Mensch
Familie Orthomyxoviridae (Influenza A und B)
Influenza- und Masernviren
werden
am apikalen Pol,
VSV hingegen
am basolateralen Pol
freigesetzt.
Die Virus-Knospung ist polarisiert.
Ribonukleoprotein(RNP)-Komplexe
von Influenza-A-Viren
Nukleoproteine (NP)
heterotrimerer
Polymerase-
Komplex
Structural Organization of a Filamentous Influenza A
Virus Calder et al., PNAS 2010
Virion polar organisiert: Ribonukleoproteine (RNP) beginnen am
Knospungs-Ende, Neuraminidase (NA) vorwiegend am entgegengesetzten Pol
RNP
Coil (M1)
HA
NA
Virionen
kapselförmig
oder
filamentös
Matrix(M1)-Proteine bilden Helix.
Niedriger pH führt zum Verlust der Filament-Struktur.
Verpackung der vRNP-Segmente: zufällig oder spezifisch?Gerber // Marquet, Trends Microbiol 2014
Begrenzt die spezifische Verpackung der vRNP-Segmente
das Reassortment?
Gerber // Marquet, Trends Microbiol 2014
HIV Env: Konformationsstadien
und neutralisierende Antikörper?
Relevant,
aber
unbekannt!
Trkola,
Nature
2019,
p321
Von Struktur zur Funktion Eine effiziente Kodierung des Nukleokapsides im
Virusgenom wird durch den Aufbau aus identischen
Untereinheiten ermöglicht.
Ikosahedrale Nukleokapside führen zu einer sehr
effizienten Nutzung des Volumens und damit dichten
Verpackung des Genoms, erlauben aber deutlich
weniger Veränderungen.
Helikale Nukleokapside hingegen tolerieren
Anpassungen in der Genom-Länge. Oft ist das
Nukleoprotein in die Replikation und Transkription
involviert.
Enzyme im Virion
Attachment & Penetration ● Genomreplikation ●
Freisetzung ● Virusreifung
Genomaufbau & Baltimore-Klasse
Transkription ● Genexpression ● Genomreplikation
Cap-Erwerb
Genexpression: Initiation der Translation
Kapsidtyp
Uncoating ● Genomreplikation ● Assembly
Lipidhülle?
Attachment & Penetration ● Freisetzung (Knospung)
Morphologische und funktionelle Kriterien
versus
Stadien im Replikationszyklus
Vielen Dank!