kimia klinis

  • View
    65

  • Download
    8

Embed Size (px)

Text of kimia klinis

KIMIA KLINISKELOMPOK 2 GANESHA EKA MURTI ALVIAN MARTINA WENNY BUDI YANTI ANIS KHOIRUN NISA YUS MARDIANA FELIKS ANTONIUS TETTY RIYANTI VILLIA ANGGARINI

1043050001 1043050011 1043050024 1043050037 1043050055 1043050068 1043050074 1043050075 10430570

PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION)Teknik amplifikasi DNA dengan suatu enzim DNA polymerase yang akan mengamplifikasi fraksi genom dan menghasilkan replikasi DNA yang merupakan salinan seluruh genom yang tepa dan adekuat untuk diperiksa. PCR memungkinkan terjadinya amplifikasi secara selektif pada suatu DNA target spesifik atau bertambah beberapa juta kali dalam waktu beberapa jam saja Hal ini memungkinkan metode PCR digunakan dalam pemeriksaan genetik dan penyakit infeksi

PCR umumnya menggunakan DNA sebagai target dibanding RNA karena sifatnya yang lebih stabil dan DNA lebih mudah diisolasi. PCR dapat digunakan dalam identifikasi penyakit akibat virus/bakteri dan keganasannya serta pemeriksaan pada kematian akibat tindak kriminal yang dicurigai

PCR membutuhkan waktu yang lebih singkat dalam pemeriksaannya dibandingkan teknik konvensional seperti kultur bakteri atau penggunaan antibodi. PCR merupakan pemeriksaan yang cepat dan reliable dan dapat mendeteksi semua cara mutasi akibat penyakit genetik

Komponen PCR DNA template : biasanya terdiri dari 1000 pasangan basa Primer : sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi dan membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) : penyusun DNA baru, terdiri dari 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA: dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Buffer Ion Logam : Valensi 2 ( Mg+2) & valensi 1 (K+)

Tahapan Utama Reaksi PCRTerdiri dar 3 tahap : 1. Denaturasi : pemanasan DNA hingga 96oC selama 30-60 detik, DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

2. Annealing : Penurunan suhu sampai 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

3. Ekstensi/Elongasi : menaikkan suhu ke suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya.

Pada akhir dari siklus PCR pertama diperoleh DNA baru yang identik dengan DNA target.

Aplikasi PCR Isolasi Gen DNA sequencing Forensik Diagnosa Penyakit

Kelebihan PCR Cepat Akurat Dapat menganalisa sampel dengan DNA yang sedikit

Kekurangan PCR Biaya mahal Tahapan kerja lebih panjang Rentan kontaminasi

Enzim linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben yang melekat pada enzim, merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan perkembangan IPTEK teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bidang patologi tumbuhan, kedokteran, dll.

Sejarah ELISA Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai signal.

ALAT Microtiter : berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (12 X 8). Microtiter ini terbuat dari bahan polistirena. Cekungan dari microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm.

Metode1. 2. 3. 4. 5. 6. ELISA Direct ELISA Indirect ELISA Sandwich (mirip Dengan Direct) ELISA Biotin Streptavidin (Jenis Modern) ELISA Kompetitif (pengembangan teknik) ELISA Multiplex (pengembangan teknik)

Prinsip Dasar ELISA1.

2.

3.

4.

5.

Antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu secara penempelan secara non spesifik dengan adsorbsi ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibodi atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah Melekat dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel=> bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik; sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatu substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang melekat dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

ELISA Direct Teknik ELISA Direct merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel. ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

kelebihan dari ELISA Direct Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

Kelemahan ELISA Direct Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan yang berbeda. Amplifikasi signal hanya sedikit. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

ELISA INDIRECT

Prinsip ELISA indirect Teknik ELISA indirect merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik yang melekat pada enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang di inginkan pada sampel yang diuji

Contoh Cara kerja ELISA indirect1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit. 2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer 3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik ( Contoh : larutan susu bubuk), 4. Membilas protein yang tidak melekat. 5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibodi spesifik untuk berikatan dengan antigen. 6. Membilas antibodi yang tidak terikat. 7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah (fragmen cristallizable) Fc pada antibody yang spesifik . Sebagai contoh, anti-rantai gamma yang berikatan dengan Ig G . Daerah Fc pada anti-Ig G akan berikatan secara kovalen dengan enzim. 8. Membilas kompleks antibodi-enzim yang tidak terikat. 9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat tidak berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk. 10. Inkubasi sampai muncul warna 11. Kemudian ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteksi, maka makin besar kadar antibodi spesifik dalam sampel.

kelebihan dari ELISA Indirect Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara komersial di pasar. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder.

Kelemahan ELISA Indirect Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal.

ELISA SANDWICH

Prinsip ELISA SANDWICHTeknik ELISA Sandwich menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder yang melekat pada enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA Direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi

Contoh Cara kerja ELISA Sandwich1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antibodi menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit. 2. Membilas antibodi (yang tidak terikat) dengan buffer 3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk), 4. Membilas protein yang tidak melekat. 5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibody untuk berikatan dengan antigen