KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah SWT yang telah begitu banyak menganugerahkan

nikmat jasmani dan rohani kepada penulis, sehingga sampai saat ini penulis dapat

menjalankan berbagai aktifitas termasuk pelaksanaan tugas akhir mulai dari

pencarian data hingga pada penyusunan laporan. Selawat serta salam selalu

tercurah pada manusia sempurna, kekasih Allah sekaligus pemimpin tauladan

umat dunia, Nabi besar Muhammad SAW, yang selalu menjadi inspirasi dan

contoh dalam melaksanakan aktifitas hablumminannas dan hablumminAllah.

Alhamdulillah atas dukungan dari semua pihak akhirnya penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini dengan tepat waktu yang berjudul ”Ekstraksi dan

Penentuan Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-Glukan dari Jamur Shiitake

(Lentinula edodes) “. Penulis mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya

kepada seluruh pihak yang telah membantu serta memudahkan penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini, antara lain

1. Dr. Syopiansyah Jaya Putra, M. Sis sebagai Dekan Fakultas Sains dan

Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Sri Yadial Chalid, M. Si sebagai Ketua Program Studi Kimia Fakultas Sains

dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Kedua orang tua yang telah memberikan biaya sehingga penulis dapat

melanjutkan kuliah, serta senantiasa memberikan doa dan semangat demi janji

masa depan lebih baik.

vi

4. Dr. Ira Djajanegara, sebagai dosen pembimbing I yang telah memberikan

saran-saran, kemudahan, motivasi, meluangkan waktu, serta mengarahkan

penulis selama melakukan penelitian.

5. Sandra Hermanto, M. Si, sebagai dosen pembimbing II yang telah

memberikan saran-saran, kemudahan, motivasi, meluangkan waktu, serta

mengarahkan penulis sehingga penulisan skripsi ini dapat berjalan dengan

baik.

6. Sri Yadial Chalid, M. Si dan Siti Nurbayti, M. Si, sebagai dosen penguji yang

memberikan banyak saran dalam perbaikan skripsi.

7. Seluruh dosen kimia yang telah banyak memberikan ilmunya.

8. Teman-temanku kimia angkatan 2005, HIMKA (Himpunan Mahasiswa

Kimia) dan teman-temanku di GCMS (Green Chemistry Movement Study)

yang banyak memberikan warna dalam perjalanan penulis selama menempuh

pendidikan di kimia UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis sadar skripsi ini masih jauh dari sempurna, untuk itu saran dan kritik

yang membangun diharapkan dari para pembaca. Akhir kata, penulis berharap

semoga skripsi ini dapat berguna bagi penulis khususnya dan bagi pembaca pada

umumnya.

Jakarta, Juni 2010

Penulis

vii

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ………………………………………………………..... vi

DAFTAR ISI ……………...………………………………………………..… viii

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………………... xi

DAFTAR TABEL …………………………………………………………...... xii

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….... xiii

ABSTRAK ……………………………………………………………………. xiv

ABSTRACT …………………….……………………………………………... xv

BAB I PENDAHULUAN ………………………………………………….....… 1

1.1 Latar Belakang ……………………………………………..………………... 1

1.2 Rumusan Masalah …………………………………………………..……..… 2

1.3 Tujuan Penelitan …………………………………………………….……..... 3

1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………………...... 4

2.1 Bahan Pangan Fungsional …………………………………………………… 4

2.2 Jamur Shiitake ………………………………………………………………. 6

2.2.1 Morfologi Jamur Shiitake …………..…………………....................... 7

2.2.2 Klasifikasi Jamur Shiitake ………………………………………….... 8

2.2.3 Kandungan Nutrisi Jamur Shiitake …………………………………... 9

2.2.4 Khasiat Jamur Shiitake …………………………………................... 10

2.3 Senyawa β-1,3:1,6-D-glukan ...................………………............................. 11

viii

2.4 Ekstraksi …………………………………………………………………… 14

2.5 Megazyme ....................................................................................................... 16

2.6 Congo Red ...................................................................................................... 17

2.7 Spektrofotometer UV-Vis ………………………………………………..... 19

2.8 Spektrofotometer IR …………………………………….............................. 23

BAB III METODE PENELITIAN ……...........…………………...…….…… 29

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ……………………………………............... 29

3.2 Alat dan Bahan …………………………………………………………….. 29

3.2.1 Alat …………………………………………………………………. 29

3.2.2 Bahan ……………………………………………………………….. 30

3.3 Prosedur Penelitian ………………………………………………………… 31

3.3.1 Pengambilan Sampel ……………………………………………...... 31

3.3.2 Preparasi Reagen …….............……………………………………... 31

3.3.3 Ekstraksi Jamur Shiitake dengan metode Yap & Ng .....………….... 31

3.3.4 Identifikasi Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering Jamur Shiitake dengan FTIR …............…........….… 32

3.3.5 Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering Jamur Shiitake dengan Metode Megazyme …..……. 33

3.3.6 Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering Jamur Shiitake dengan Metode Congo Red .............. 34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………....................... 36

4.1 Hasil Ekstraksi Jamur Shiitake ………………………………..…………... 37

4.2 Hasil Identifikasi Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering Jamur Shiitake dengan FTIR ..….............…....................…. 38

4.3 Hasil Analisis Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering Jamur Shiitake dengan Metode Megazyme ................…….. 40

ix

4.4 Hasil Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering Jamur Shiitake dengan Metode Congo Red ...…………….. 41

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………….…… 44

5.1 Kesimpulan ……………………………………………………………....... 44

5.2 Saran ……………………………………………………………………..... 44

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………….… 46

LAMPIRAN

x

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Jamur Shiitake …..…………………………………………………… 6

Gambar 2. Struktur Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan (Lentinan) .…………………. 12

Gambar 3. Mekanisme Penghambatan Sel Kanker oleh Senyawa β-1,3-Glukan …................................................................... 14

Gambar 4. Struktur Senyawa Congo Red ............................................................ 18

Gambar 5. Skema Alat Spektrofotometer UV-Vis Single Beam ………….…… 21

Gambar 6. Skema Alat Spektrofotometer UV-Vis Double Beam …………….... 21

Gambar 7. Spektrum IR Ekstrak Kering Jamur Shiitake dan β-1,3;1,6-Glukan Standar ...……........................................................ 38

xi

DAFTAR TABEL

Halaman

Table 1. Kandungan Nutrisi Jamur Shiitake ………………………………….... 9

Tabel 2. Senyawa Aktif di Dalam Jamur Shiitake ……………………………... 11

Tabel 3. Perbandingan Metode Ekstraksi Yp & Ng dan Chihara …………….... 15

Tabel 4. Beberapa Gugus Fungsi dengan Daerah Serapanya .............................. 26

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Desain penelitian …………………………………………………. 49

Lampiran 2. Data Hasil Ekstraksi ……………………..……………………..… 50

Lampiran 3. Gambar-gambar Tahapan Ekstraksi Hingga Freez Drying ………. 51

Lampiran 4. Data Hasil Pengukuran Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan Metode Megazyme .............................................................. 52

Lampiran 5. Reaksi Selama Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan Metode Megazyme .............................................................. 56

Lampiran 6. Data Hasil Pengukuran Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan Metode Congo Red ............................................................. 58

xiii

ABSTRAK

FAJRI, Ekstraksi dan Penentuan Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-Glukan dari Jamur Shiitake (Lentinula edodes). Di bawah bimbingan Dr. Ira Djajanegara dan Sandra Hermanto, M. Si.

Semakin meningkatnya kesadaran masyarakat terhadap pentingnya hidup sehat, membuat tuntutan terhadap bahan pangan bergeser. Kini masyarakat tidak hanya menginginkan bahan pangan yang mempunyai komposisi gizi baik, serta penampakan dan cita rasanya yang menarik, tetapi juga memiliki fungsi fisiologis seperti menurunkan tekanan darah, kadar kolesterol, serta aktivitas antikanker dan lainnya. Fenomena ini melahirkan konsep pangan fungsional. Salah satu bahan pangan yang memiliki potensi sebagai bahan pangan fungsional adalah jamur shiitake. Jamur shiitake memiliki fungsi fisiologis salah satunya sebagai antikanker. Aktivitas antikanker jamur shiitake ini disebabkan kandungan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan, Untuk mendapatkan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan, maka dilakukan proses ekstraksi untuk mengisolasi senyawa tersebut. Metode ekstraksi Yap & Ng (2001) dipilih karena proses ekstraksinya yang cepat, murah dan menggunakan pelarut yang aman (aquades) untuk bahan pangan. Identifikasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam ekstrak jamur shiitake, maka dilakukan analisis FTIR. Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan metode megazyme. Selain menggunakan metode megazyme, pada penelitian ini dikembangkan metode alternatif dengan biaya lebih efisien dan waktu pengerjaan yang lebih efektif yaitu menggunakan pewarna congo red, sebagai pengganti metode megazyme. Hasil ekstraksi metode Yap & Ng diperoleh kadar ekstrak kering jamur shiitake sebesar 4,4987 gr dengen rendemen hasil sebesar 0,4999%. Hasil analisis FTIR menunjukkan keberadaan senyawa senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam ekstrak jamur shiitake, yang teridentifikasi khususnya pada bilangan gelombang 890 nm yang menunjukkan ikatan β-1,3 yang spesifik untuk senyawa β-1,3;1,6-D-glukan. Hasil analisis metode megazyme diperoleh kadar rata-rata (triplo) senyawa β-1,3;1,6-D-glukan sebesar 30,8882%, sedangkan untuk hasil analisis metode congo red belum menunjukkan hasil yang spesifik untuk kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan. Kata Kunci: Pangan Fungsional, Jamur Shiitake, Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan, Metode Ekstraksi Yap & Ng, Metode Megazyme dan Congo Red

xiv

xv

ABSTRACT

FAJRI, Extraction and Determination of Concentration of β-1,3;1,6-D-Glukan Compound from Shiitake Mushroom (Lentinula edodes). Under the guidance of Dr. Ira Djajanegara and Sandra Hermanto, M. Si. Increasing of publics consciousness of the importance healthy living, making demands on food shift. Now people do not just want food that has a good nutrient composition, appearance and flavor is interesting, but also has physiological functions such as lowering blood pressure, cholesterol levels, anticancer and other activities. This phenomenon gave birth the concept of functional foods. One of the foodstuffs that have potential as functional food is shiitake mushroom. Shiitake mushroom have a physiological function as an anticancer. Its anticancer activity is due to β-1,3;1,6-D-glukan compound. Lentinan compound is a polysaccharide with a β-1,3 and 1,6-D-glucan bond. To get β-1,3;1,6-D-glukan of shiitake mushroom, then do the extraction process to isolate the β-1,3;1,6-D-glukan compound. Yap & Ng extraction method was chosen because the extraction proces is quick, cheap and safe used for solvents (distilled water) of food. To identification β-1,3;1,6-D-glukan compound in shiitake’s extract, then do the FTIR analysis. Further measured concentration of β-1,3;1,6-D-glukan compound by the megazyme method. In this research developed alternative methods with more efficient cost and effective time by using the Congo red dye, as chance of megazyme method . The Yap & Ng extraction method result obtained dry shiitake’s extract at 4.4987 gr (0,4999%). FTIR analysis result show the existence of β-1,3;1,6-D-glukan compound in the extract glucan, which identified particularly at wave numbers 890 nm is the β-1,3 bond wich specific for the β-1,3;1,6-D-glukan compound. The analysis megazyme method result obtained average (triplo) β-1,3;1,6-D-glukan compound at 30.8882%, while for analysis Congo red method result has not shown specific result for concentration of β-1,3;1,6-D-glukan compound. Keywords: Functional Food, Shiitake Mushroom, β-1,3;1,6-D-glukan compound, Yap & Ng Extraction Method, Megazyme and Congo Red method

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Seiring dengan makin meningkatnya kesadaran masyarakat akan

pentingnya hidup sehat, tuntutan konsumen terhadap bahan pangan juga bergeser.

Bahan pangan yang kini banyak diminati konsumen bukan saja yang mempunyai

komposisi gizi yang baik serta penampakan dan cita rasanya menarik, tetapi juga

harus memiliki fungsi fisiologis tertentu bagi tubuh, seperti dapat menurunkan

tekanan darah, kadar kolesterol, kadar gula darah, meningkatkan penyerapan

kalsium, serta aktivitas antikanker. Fenomena tersebut melahirkan konsep pangan

fungsional (litbang pertanian, Bogor).

Salah satu bahan pangan yang berpotensi sebagai bahan pangan fungsional

adalah jamur shiitake. Jamur shiitake dikenal sejak 199 M di China dan telah

dibudidayakan secara luas. Jamur shiitake mengandung senyawa β-1,3;1,6-D-

glukan, yang dalam jamur shiitake dikenal sebagai senyawa lentinan, yaitu

polisakarida yang larut di dalam air dan diakui memiliki aktivitas sebagai

antikanker (Hendry, 2005). Kemampuan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dari jamur

shiitake sebagai antikanker dibuktikan pada hasil penelitian di lingkungan Cancer

Center Institute di Tokyo, Jepang, dan beberapa lembaga sejenis di benua Eropa

dan AS menunjukkan ekstrak shiitake memiliki kemampuan menghambat

pertumbuhan kanker antara 72 %-92 % (Hendry, 2005).

11

Melihat pentingnya senyawa β-1,3;1,6-D-glukan tersebut dalam aktivitas

antikanker, maka pada penelitian ini dilakukan proses ekstraksi untuk mengisolasi

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam jamur shiitake. Metode ekstraksi yang dipilih

adalah metode Yap & Ng (2001) karena menggunakan pelarut aquades. Sehingga

diperoleh hasil ekstraksi yang aman untuk dikonsumsi (Widyastuti, 2009).

Identifikasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam ekstrak jamur shiitake dilakukan

analisis FTIR.

Penentuan kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak jamur shiitake

digunakan metode megazyme, metode ini dapat mengukur secara spesifik kadar

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan, namun kelemahan metode ini adalah dibutuhkan

biaya yang cukup mahal dan waktu analisis yang kurang efektif, selain bahan

ujinya sulit didapat dan memiliki batas waktu penggunaan. Untuk itu dalam

penelitian ini digunakan pula metode congo red, sebagai alternatif pengukuran

kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan biaya lebih efisien dan waktu

pengerjaannya lebih efektif dibandingkan metode megazyme.

Apabila metode congo red dapat secara spesifik mengukur kadar senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan, maka diharapkan metode ini nantinya dapat diaplikasikan

untuk industri jamur skala kecil dalam mengukur kadar β-1,3;1,6-D-glukan dari

jamur yang mereka miliki.

Rumusan Masalah

1. Berapakah berat kering ekstrak jamur shiitake yang diperoleh dengan

metode ekstraksi Yap & Ng?

2

2. Apakah senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak kering jamur shiitake

dapat teridentifikasi dengan analisis FTIR?

3. Bagaimana spesifitas hasil pengukuran kadar senyawa senyawa β-1,3;1,6-

D-glukan pada ekstrak kering jamur shiitake dengan metode congo red?

Tujuan Penelitian

1. Mendapatkan nilai berat kering ekstrak jamur shiitake hasil ekstraksi

metode Yap & Ng

2. Mengidentifikasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak kering jamur

shiitake dengan analisis FTIR.

3. Mengetahui spesifitas metode congo red dalam mengukur kadar senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak kering jamur shiitake.

Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi bahwa untuk mengisolasi senyawa β-1,3;1,6-D-

glukan pada jamur shiitake, maka dapat dilakukan metode ekstraksi Yap &

Ng (2001) dengan hasil ekstrak yang aman dikonsumsi, selain prosesnya

yang cepat dan murah.

2. Memberikan informasi bahwa metode congo red dapat digunakan sebagai

alternatif yang lebih murah dan efisien dalam menentukan kadar senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan jika dibandingkan dengan metode megazyme.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bahan Pangan Fungsional

Istilah pangan fungsional dipilih dari sederet istilah yang pernah

dipopulerkan sebelumnya seperti “pharmafoods”, “designer foods”,

“nutraceutical food”, “health foods”, “therapeutic foods” dan banyak lagi.

Secara mudah dapat dikatakan bahwa pangan fungsional adalah bahan pangan

yang berpengaruh positif terhadap kesehatan seseorang, selain kandungan gizi dan

cita-rasa yang dimilikinya. Jadi dalam hal ini keberadaan faktor ´plus´ bagi

kesehatan yang diperoleh karena adanya komponen aktif pada bahan pangan

tersebut adalah merupakan ´keharusan´ (Wijaya, 2002).

Menurut Wijaya (2002) bahwa fungsi bahan pangan tidak lagi ada dua

tetapi menjadi tiga, yaitu: segi nutrisi, cita-rasa dan kemampuan fisiologis

aktifnya. Bila kita melihat lebih jauh lagi fungsi bahan pangan yang terakhir ini

bukanlah hal baru dalam dunia kuliner. Masakan Tiongkok kuno misalnya,

banyak sekali yang memadukan antara khasiat dan cita-rasa dalam seni

kulinernya. Pada masakan ini banyak digunakan bahan baku yang dikenal

mempunyai komponen bioaktif yang berkhasiat bagi kesehatan tubuh. Ahli ilmu

pengobatan kuno, Hippocrates pun pernah berujar “Let Food be The Medicine”.

Menurut Wijaya (2002), suatu produk dapat disebut sebagai kelompok pangan

fungsional bila:

44

1. Harus berupa suatu produk pangan (bukan kapsul, tablet atau bubuk) yang

berasal dari bahan atau ingredient alami.

2. Layak dikonsumsi sebagai bagian dari diet atau menu setiap hari

3. Mempunyai fungsi tertentu pada saat dicerna.

4. Memberikan peran khusus dalam proses metabolisme tubuh seperti

meningkatkan imunitas tubuh, mencegah penyakit tertentu, membantu

pemulihan tubuh setelah menderita sakit, menjaga kondisi fisik dan mental

serta memperlambat proses penuaan.

Pangan fungsional dibedakan dari suplemen makanan atau obat

berdasarkan penampakan dan pengaruhnya terhadap kesehatan. Bila fungsi obat

terhadap penyakit bersifat penyembuhan, maka pangan fungsional lebih bersifat

pencegahan terhadap penyakit (litbang pertanian, Bogor). Sedangkan menurut

Mary K. Schmild dalam salah satu paparannya menyampaikan ada tiga hal utama

yang membedakan pangan dengan obat, yaitu:

1. Obat bersifat treatment (perlakuan penyembuhan), sedang pangan fungsional

lebih bersifat mengurangi resiko.

2. Pada obat, efek harus dapat dirasakan segera, sedang pada pangan fungsional

lebih pada keuntungan di masa mendatang.

3. Pemberian obat lebih ditujukan pada populasi tertentu (orang dengan penyakit

tertentu). Sedang makanan fungsional berpeluang dimanfaatkan oleh siapa saja

dengan kemungkinan cakupan konsumen yang lebih luas (Wijaya, 2002).

5

2.2 Jamur Shiitake

Jamur Shiitake, Lentinula edodes, atau Hioko, adalah jamur pangan asal

Asia Timur yang terkenal di seluruh dunia. Namanya diambil dari bahasa Jepang.

Shiitake secara harafiah berarti jamur dari pohon shii (Castanopsis cuspidate).

Batang pohon shii yang sudah lapuk merupakan tempat tumbuh jamur ini

(Widyastuti, 2009).

Gambar 1. Jamur Shiitake

Lentinula edodes atau Lentinus edodes adalah jamur kayu yang di Jepang

dikenal sebagai shiitake. Di China dikenal dengan nama shiang-gu, sedangkan di

pasar internasional dikenal sebagai chinese black mushroom atau black forest

mushroom (Widyastuti, 2009). Di Indonesia, jamur shiitake dikenal dengan nama

jamur kayu cokelat. Selain itu, jamur ini juga disebut jamur payung karena

tudungnya memang berbentuk seperti payung. Di Jawa Barat, khususnya di

daerah Pengalengan, shiitake terkenal dengan sebutan jamur jengkol karena

bentuk dan aromanya bagaikan jengkol (Sarwintyas dkk, 2001).

Shiitake termasuk rajanya jamur kayu karena harga, nilai gizi dan

khasiatnya memiliki potensi ekonomi yang tinggi. Jamur ini dapat tumbuh pada

kayu gelondongan yang sudah kering (bukan lapuk) ataupun pada produk

sampingan kayu, seperti serbuk gergaji kayu. Budi daya jamur shiitake secara

6

alami belum menggunakan bibit buatan, tetapi masih mengandalkan spora yang

berterbangan di udara atau dari miselium yang menempel di pepohonan ataupun

di tanah. Selain secara alami, shiitake juga dapat dibudidayakan secara tradisional

dengan balok kayu. Budidaya ini merupakan usaha agribisnis yang penting di

negeri Cina, Jepang dan Korea Selatan. Ada tiga jenis bibit jamur yang dapat

digunakan, yaitu jamur yang dapat membentuk tubuh buah pada suhu di atas

20oC, antara 10-15oC, dan pada suhu 10oC (Sarwintyas dkk, 2001).

2.2.1 Morfologi Jamur Shiitake

Morfologi dari jamur shiitake dapat dikenali dengan tudungnya yang

berbentuk payung, berwarna coklat muda sampai tua, kadang-kadang berbintik

putih yang sering disebut ‘renda’, bahkan ada juga yang retak-retak (bukan

pecah), lebar tudung bervariasi antara 2,5-9 cm dan terdapat selaput kutikula.

Bagian bawah tudung terdapat lamella (insang) yang berisi spora. Tangkai tudung

berwarna seperti tudungnya dan sedikit agak keras, panjang tangkai tudung 3-9

cm dan diameternya 0,5-1,5 cm (Sarwintyas dkk, 2001).

Pertumbuhan badan buah dibagi menjadi empat tingkatan atau stadium,

yaitu:

1. Stadium pinhead, berupa tonjolan, merupakan bentuk awal dari calon

jamur.

2. Stadium kancing (button stage), dengan bentuk kancing.

3. Jamur muda

7

4. Stadium masak, yakni jamur utuh yang tudungnya sudah mengembang

penuh tetapi lamella-nya belum membuka. Jamur seperti ini yang dipanen.

Dalam keadaan normal, dari bentuk pinhead sampai masak memerlukan waktu 2-

3 hari.

Jamur shiitake adalah tumbuhan yang berinti spora, tidak mempunyai

klorofil dan berupa sel-sel yang menandung selulosa atau chitin. Tubuh jamur

dapat berupa sel-sel yang lepas tetapi dapat juga berupa sel-sel yang

bergandengan atau berupa benang. Benang ini merupakan tabung atau buluh yang

bersekat atau tidak bersekat. Satu helai benang disebut hifa dan kumpulan hifa

bercabang disebut miselium hifa, miselium merupakan jaringan tanaman jamur.

Hifa yang bersekat-sekat memiliki aliran protoplasma dari sel yang satu ke sel

yang lain melalui pori-pori yang terdapat di sekat. Inti sel dapat berpindah tempat

melalui pori-pori tersebut. Dinding sel atau dinding hifa yang mengandung

selulosa atau chitin merupakan polisakarida yang mengandung nitrogen

(Widyastuti, 2009).

2.2.2 Klasifikasi Jamur Shiitake

Menurut sistematikanya, jamur shiitake termasuk jamur dengan klasifikasi

sebagai berikut:

Kingdom : Mycota

Divisio : Amastigomycota

Sub division : Basidiomycota

Kelas : Homobasidiomycetes

8

Ordo : Agaricales

Famili : Marasmiaceae

Genus : Lentinula

Spesies : Lentinula edodes

Spesies ini dulu dikenal sebagai Lentinus edodes. Ahli botani Inggris bernama

Miles Joseph Berkeley menamai spesies ini sebagai Agaricus edodes di tahun

1878 (Widyastuti, 2009).

Kerabat dekat dari genus Lentinus adalah Lentinellus, misalnya Lentinellus

cochleats yang warna dan ukurannya mirip. Perbedaan yang mencolok terdapat

pada tangkai, yang mana bagian yang mengarah ke ujung membesar karena

bersatu dengan lamella (gill) (Widyastuti, 2009).

2.2.3 Kandungan Nutrisi Jamur Shiitake

Kandungan asam glutamat dalam shiitake cukup tinggi, asam amino

tersebut berhubungan dengan cita rasa yang timbul dari jamur ini sebagai

penyedap makanan. Selain mempunyai kandungan asam glutamat yang tinggi,

shiitake juga mengandung beberapa nutrisi berikut:

Tabel 1. Kandungan Nutrisi Jamur Shiitake

Gizi Dalam 100 gram Berat Kering (%)

Protein Kasar 13,4-17,5

Lemak Kasar 4,9-8,9

Total Karbohidrat (+N) 67,5-78

Karbohidrat (tanpa N) 59,5-70,7

Serat Kasar 7,3-8,0

9

Abu 3,7-7

Kalori 387-392

5 Ribonukleat 165,5 mg

Asam Amino Leucine, isoleucine, valine, tryptophan, lysine,

threonine, phenylalanine, methionine dan

histidine

Vitamin B1, B2, D

(Widyastuti, 2009).

2.2.4 Khasiat Jamur Shiitake

Ekstrak jamur shiitake memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan

kanker sampai 72-92 %. Penemuan paling baru mengungkapkan bahwa ekstrak

shiitake berpengaruh juga terhadap penurunan kolesterol dan gula darah, sehingga

sangat diharapkan dapat digunakan untuk pengobatan penyakit jantung dan

kencing manis. Kandungan protein dan polisakarida pada jamur ini juga

berkhasiat sebagai antivirus. Pengaruh buruk akibat rokok dan alkohol yang dapat

menyerang jantung dapat dinetralkan dengan mengonsumsi jamur shiitake.

Statistik kesehatan wanita di Jepang menunjukkan bahwa persentase wanita

penderita kanker uterus atau indung telur di Jepang sangat rendah jika

dibandingkan dengan wanita Inggris dan Amerika, karena wanita Jepang sering

mengkonsumsi jamur ini (Sarwintyas dkk, 2001).

Jamur shiitake juga mengandung senyawa β-1,3;1,6-D-glukan yang

memang sejak lama diakui memiliki kemampuan sebagai antikanker. Senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan juga memiliki kemampuan menstimulasi produksi limfosit T

10

dan sel natural killer serta sel darah putih lain, mengontrol kanker dan infeksi,

mempertinggi efektifitas kekebalan tubuh, mempercepat penyembuhan setelah

operasi kanker payudara dan saluran pencernaan, serta penyembuhan kanker leher

rahim dan kanker perut (Sarwintyas dkk, 2001). Kandungan senyawa β-1,3;1,6-D-

glukan tertinggi didapatkan di bagian batang dekat tudung dan bagian tudungnya.

Bagian batang pada umumnya merupakan makanan kaya serat yang sangat

bermanfaat untuk mencegah terjadinya kanker usus (Suriawiria, 2005).

Senyawa lainnya dalam jamur shiitake yang juga memiliki khasiat

ditunjukkan dalam tabel berikut:

Tabel 2. Senyawa Aktif di dalam Jamur Shiitake

No Senyawa Efek Jenis senyawa Aktivitas

1 Eritadenin Menurunkan

kolesterol

Antiviral

Turunan adenine Mempercepat metabolisme

kolesterol

2 Ac2P Antiviral Polisakarida Menghambat replikasi virus 3 KS-2 Antitumor

Antiviral

Polisakarida Menginduksi produksi

interferon

4 Lentinan Antikanker Polisakarida Menstimulasi sel T-helper

dalam sistem kekebalan

5 LAPI Antitumor Polisakarida Pengatur sistem kekebalan

6 Oksidase

polifenol

Antitumor Protein Tdk diketahui

7 Kartinelin Antibakteri Tdk diketahui Spektrum luas antibiotik

Sumber: Netty (2009)

2.3 Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan merupakan polisakarida dengan ikatan

glikosidik 1,3-β yang yang memilki cabang dengan ikatan 1,6-glukopiranosida

11

dan dikenal dengan nama senyawa 1,3-β glukan, senyawa ini terdapat pada

beberapa jamur seperti shiitake (Lentinula edodes), tiram (Pleurotus ostreatus)

dan Schizophyllum commune. Jika senyawa ini diekstraksi dari jamur shiitake

maka dikenal dengan nama senyawa lentinan, yang diambil dari bahasa latin

jamur shiitake ”Lentinula edodes”. Struktur Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dari

jamur shiitake terdiri dari lima residu 1,3-β-glukosa dalam ikatan rantai lurus

(rantai utama) dan dua cabang 1,6-β-glukopiranosida rantai samping yang

menghasilkan struktur triple helix kanan (Aryantha, 2005). Perbedaan senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan (lentinan) yang diisolasi dari jamur shiitake dengan jamur

lainnya adalah bentuk strukturnya. Misalnya, untuk senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

yang diisolasi dari Schizophyllum commune memiliki ikatan 1,3-β-glukosa dalam

ikatan lurus (rantai utama) dengan cabang 1,6-β-glukopiranosida setiap 2 atau 3

residu rantai utama.

Gambar 2. Stuktur senyawa β-1,3;1,6-D-glukan (lentinan) (Volman dkk, 2007)

12

Konformasi senyawa polisakarida antikanker meliputi bentuk single helix,

triple helix dan random coiled. Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan konformasi

triple helix memiliki berat molekul sekitar 400-800 x 103 kDa (Ooi & Liu, 2000).

Senyawa β-Glukan yang mengandung terutama ikatan 1,6 memiliki

aktivitas antikanker lebih rendah. Senyawa glukan dengan berat molekul yang

lebih tinggi tampak lebih efektif dibandingkan dengan yang berbobot molekul

lebih rendah. Ada berbagai variasi senyawa polisakarida anti tumor dengan

struktur kimia berbeda, seperti hetero-β-glukan, heteroglukan, β-glukan-protein,

α-manno-β-glukan, α-glukan, α-glukan-protein dan kompleks heteroglukan-

protein (Ooi & Liu, 2000).

Dr. Chihara yang banyak meneliti dalam masalah antikanker dari jamur

shiitake beranggapan bahwa penelitian kanker harus difokuskan terhadap

mekanisme peningkatan sistim intrinsik tubuh untuk melawan atau menangkal

kanker bukan ke obat pembunuh sel kankernya. Senyawa senyawa β-1,3;1,6-D-

glukan adalah salah satu bahan aktif dari jamur shiitake yang berperan dalam

meningkatkan sistim pertahanan tubuh terhadap serangan kanker melalui sistim

yang kompleks termasuk produksi sitokin dari immunocyte yang telah

direkomendasikan sebagai salah satu obat antikanker di Jepang

(Okamoto et al, 2004).

Menurut pemaparan dalam review Ooi & Lee (2000), senyawa β-1,3;1,6-

D-glukan berperan dalam pengobatan kanker melalui beberapa mekanisme tidak

langsung terhadap sistim intrinsik tubuh tanpa langsung membunuh sel kanker,

diantaranya mengaktifkan dan mengefektifkan sel makrofag untuk memakan sel

13

tumor dan menstimulasi sel-sel T-helper. Senyawa lentinan juga berperan sebagai

inducer interferon yang dapat mengontrol pertumbuhan dan replikasi sel kanker

(Aryantha, 2005).

Gambar 3. Mekanisme Penghambatan Sel Kanker oleh Senyawa β-1,3-glukan (Anonim)

2.4 Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pemisahan komponen yang diinginkan dari

penyusun-penyusun lain dalam suatu bahan atau campuran dengan menggunakan

pelarut. Jenis ekstraksi terdiri dari ekstraksi cair-cair dan padat-cair. Ekstraksi

padat-cair dapat dilakukan dengan dua cara yaitu aqueus phase dan organic

phase. Cara aqueus phase dilakukan dengan menggunakan pelarut air, sedangkan

dalam organic phase digunakan pelarut organik

(Pudjaatmaka dan Qodratillah, 2002).

Pada penelitian ini dilakukan proses ekstraksi padat-cair dengan cara

aqueus phase, yaitu melakukan ekstrasi untuk mendapatkan Senyawa β-1,3;1,6-

14

D-glukan dari jamur shiitake dengan pelarut aquades menggunakan metode

ekstraksi Yap & Ng.

Menurut Widyastuti (2009), Yap & Ng (2001) telah menetapkan prosedur

yang lebih efisien untuk melakukan ekstraksi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan jamur

shiitake. Uji kemurnian menggunakan kolom analisis karbohidrat, didapat

kemurnian β-1,3;1,6-D-glukan 87,5 %. Dari segi komersial, metode ini lebih

hemat waktu, lebih efisien dan relatif lebih rendah biaya dibanding metode asli

Chihara, et al (1970).

Prinsip metode ekstraksi Yap & Ng (2001) yaitu dengan proses perebusan

jamur shiitake menggunakan pelarut aquades pada suhu 100oC. Selanjutnya Hasil

ekstraksi diinkubasi pada suhu ruang dan kemudian ditambahkan alkohol 95%

dingin (4oC) untuk proses pengendapan ekstrak jamur shiitake. Presipitan (ekstrak

cair jamur shiitake) yang diperoleh dimurnikan dengan merebusnya kembali pada

suhu 100oC, kemudian didiamkan pada suhu ruang dan diendapkan kembali

dengan alkohol 95 % dingin (4oC). Selanjutnya presipitan yang diperoleh

dikeringkan dengan menggunakan metode freeze drying.

Berikut tabel yang menunjukkan perbandingan antara metode ekstraksi

Yap & Ng (2001) dan metode asli Chihara et, al (1970).

Table 3. Perbandingan Metode Ekstraksi Yap & Ng dan Chihara.

Metode Ekstraksi Lentinan Karakteristik Metode Metode Chihara Metode Yp & Ng

1. Waktu untuk mendapatkan ekstrak

2. Syarat untuk alat dan bahan kimia yang

jarang digunakan oleh tenaga ahli

14 hari

Banyak

5 hari

Tidak kecuali

nitrogen cair

15

3. Biaya preparasi

4. Total hasil dari 100gr jamur segar

5. Persen Lentinan dari ekstrak yang

dihasilkan (%)

6. Kemurnian

Tinggi

4 mg

96,03

99,23

Rendah

325 mg

87,50

87,65

Sumber: Widyastuti, 2009

2.5 Megazyme

Megazyme merupakan salah satu metode analisis yang spesifik untuk

mengukur kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dari yeast dan jamur, namun metode

ini memiliki kelemahan dari segi biaya pengujian yang cukup mahal, waktu

pengujian yang kurang efisien dan sulitnya mendapatkan bahan uji. Pengukuran

kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dilakukan secara tidak langsung yaitu dengan

mengukur terlebih dahulu kadar total glukan dan α-glukan dalam ekstrak glukan,

kemudian kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan didapat dengan menghitung selisih

antara kadar total glukan dan α-glukan.

Prinsip analisis senyawa β-1,3;1,6-D-glukan secara umum dengan megazyme

adalah dengan menghidrolisis ekstrak glukan dengan HCl (37 %) yang dilanjutkan

dengan pemanasan pada suhu 100oC selama 2 jam menjadi D-glucose. Untuk

menyempurnakan proses hidrolisis, ditambahkan exo-1,3-β-glucanase dan β-

glucosidase yang berfungsi menghidrolisis Laminarisaccharides (dihasilkan dari

proses hidrolisis yang belum sempurna dengan HCl 37 %) menjadi D-glucose.

Selanjutnya ditambahkan GOPOD (Glucose Oxidase and Peroxidase) dan

menghasilkan senyawa quinoneimine yang berwarna merah. Senyawa

16

quinoneimine yang dihasilkan, diukur dengan spektrofotometer UV-Vis sebagai

nilai yang menunjukkan kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan ((McCleary, 2009).

Metode megazyme teramasuk kedalam metode enzimatis karena dalam

analisisnya digunakan beberapa enzim yang berperan dalam proses hidrolisis,

enzim yang digunakan diantaranya (McCleary, 2009):

1. (exo-1,3-β-glucanase + β-glucosidase), enzim ini berperan dalam

menghidrolisis Laminarisaccharides + H2O menjadi D-glucose,

Laminarisaccharides merupakan hasil hidrolisis pertama pada

pengukuran total glukan menggunakan HCl 37 %.

2. Glucose oxidase, enzim ini berperan dalam mengoksidasi D-glucose

+ H2O + O2 menjadi D-gluconate + H2O2.

3. Amyloglucosidase, enzim ini berperan dalam menghidrolisis ikatan α-

glukan menghasilkan D-glucose pada analisis kadar α-glukan.

4. Peroxidase, enzim ini berperan dalam mempercepat reaksi antara

H2O2 yang dihasilkan dengan p-hydroxybenzoic acid + 4-

aminoantipyrine menghasilkan quinoneimine (warna merah).

Quinoneimine yang dihasilkan diukur menggunakan spektrofotometer

UV-Vis.

2.6 Congo Red

Congo red adalah suatu garam natrium dari benzidinediazo-bis-1-

naftilamin-4-asam sulfonat dengan rumus molekul C32H22N6Na2O6S2 dan dengan

17

berat molekul 696,66 g/mol. Congo red larut dalam air, dan kelarutan congo red

paling baik dalam pelarut organik (wikipedia.com).

Gambar 4. Struktur Senyawa Congo Red (Anonim)

Pada penelitian ini pereaksi warna congo red coba dikembangkan sebagai

salah satu metode analisis alternatif yang digunakan untuk menentukan adanya

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak kering jamur shiitake. Uji kuantitatif

kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan pereaksi congo-red diharapkan

menjadi prosedur pengujian yang memiliki kelebihan dari segi keefektifan waktu

dan biaya yang lebih efisien dibandingkan metode megazyme.

Pertimbangan dalam melakukan analisis kadar lentinan menggunakan

pereaksi warna congo red didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Ronald

M. Teather dan Peter J. Wood (1981) bahwa terjadi interaksi signifikan antara

congo-red dengan ikatan β-1,3-D-glukan: “Percobaan terbaru dimana congo red

memperlihatkan interaksi dengan polisakarida yang mengandung unit ikatan β-

(1,4)-D-glukopiranosil dan interaksi signifikan dengan β-(1,3)-D-glukan dan

kemungkinan beberapa hemiselulosa galaktoglukomannan (17-19).

Pada penelitian ini, hasil pengukuran kadar senyawa senyawa β-1,3;1,6-D-

glukan menggunakan pewarna congo red diharapkan memperoleh hasil

18

pengukuran yang signifikan, dengan hasil pengukuran yang mendekati hasil

pengukuran metode megazyme.

2.7 Spektrofotometer UV-Vis

Pengukuran absorbansi atau transmitansi dalam spektrofotometer

ultraviolet dan sinar tampak digunakan untuk analisis kuantitatif spesies kimia.

Pengukuran UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang 200 nm - 800 nm.

Absorbansi spesies ini berlangsung dalam dua tahapan, yaitu:

1. Tahap pertama M + hv = M*, merupakan eksitasi spesies akibat absorbsi foton

(hv) dengan waktu hidup terbatas (10-8-10-9 detik).

2. Tahap kedua adalah relaksasi dengan berubahnya M* menjadi spesies baru

dengan reaksi fotokimia.

Absorpsi dalam daerah ultraviolet dan daerah tampak menyebabkan

eksitasi elektron ikatan. Puncak absorpsi (λ maks) dapat dihubungkan dengan jenis

ikatan-ikatan yang ada dalam spesies. Spektroskopi absorpsi berguna untuk

mengkarakterisasikan gugus fungsi dalam suatu molekul dan untuk analisis

kuantitatif (Khopkar, 2003).

Menurut Sudjadi (1986), panjang gelombang serapan merupakan ukuran

perbedaan tingkat-tingkat energi dari orbital yang bersangkutan. Supaya elektron

dalam ikatan sigma tereksitasi maka diperlukan energi paling tinggi dan akan

memberikan serapan pada 120-200 nm (1 nm = 10-7 cm = 10 Å = 1 mu). Daerah

ini dikenal sebagai daerah ultraviolet hampa, karena pada pengukuran harus tidak

boleh ada udara, sehingga sukar dilakukan dan juga relatif tidak banyak

19

memberikan keterangan untuk penetuan struktur. Di atas 200 nm merupakan

daerah eksitasi elektron dari orbital molekul π dan n, terutama sistem π

terkonjugasi mudah pengukurannya dan spektrumnya memberikan banyak

keterangan. Karena alasan praktis maka spektrometri ultraviolet-tampak biasa

dilakukan di atas 200 nm. Untuk keperluan penentuan sruktur, spektrofotometri

ultraviolet-tampak penggunaanya tidak seluas spektrometri inframerah,

spektrometri massa dan spektrometri resonansi magnit proton. Kegunaan

spektrometri ultraviolet-tampak ini terletak pada kemampuannya mengukur

jumlah ikatan rangkap atau konjugasi aromatik di dalam suatu molekul. Elektron

sunyi pada oksigen, nitrogen dan sulfur dapat juga termasuk dalam perluasan

konjugasi dari sistem rangkap.

Dua hukum empiris telah merumuskan tentang intensitas serapan. Hukum

Lambert menyatakan bahwa fraksi penyerapan sinar tidak bergantung dari

intensitas sumber cahaya. Hukum Beer mengatakan bahwa penyerapan sebanding

dengan jumlah molekul yang menyerap. Dari hukum Lambert-Beer dapat

diketahui bahwa hubungan antara transmitansi, tebal cuplikan dan konsentrasi.

Hubungan ini dinyatakan sebagai berikut:

Log Io/I = kcb = A

Dimana:

Io dan I = intensitas sinar awal dan sinar yang diteruskan

k = suatu tetapan karakteristik dari zat terlarut (cm-1)

c = konsentrasi (ppm)

20

b = tebal sel (cm) dan

A = serapan

Alat spektrofotometer UV-Vis ada dua macam yaitu single beam dan

double beam, perbedaan antara keduanya adalah pada tempat sampel dan standar.

Untuk single beam, tempat sampel dan standar digunakan bergantian, sehingga

dalam pengukuranya harus dilakukan bergantian. Sedangkan untuk double beam

sampel dan standar memiliki tempat masing-masing, sehingga dalam

pengukuranya dilakukan secara bersama.

Berikut perbedaan skema alat antara single beam dan double beam:

Gambar 5. Skema Alat Spektrofotometer UV-Vis single beam (Hermanto, 2008)

Gambar 6. Skema Alat Spektrofotometer UV-Vis double beam (Hermanto, 2008)

21

Walaupun Spektrofotometer single beam dan double beam memiliki

perbedaan dalam susunan alatnya, namun keduanya terdiri dari bagian-bagian

yang sama. Bagian-bagian dari alat spektrofotometer UV-Vis terdiri dari

(Khopkar, 2003):

1. Sumber cahaya: sumber yang biasa digunakan dalam spektrofotometer UV-

Vis adalah lampu hidrogen atau lampu deuterium. Kebaikan lampu wolfram

adalah energi radiasi yang dibebaskan tidak bervariasi pada berbagai panjang

gelombang. Untuk memperoleh tegangan yang stabil dapat digunakan

transformator. Jika potensial tidak stabil kita akan mendapatkan energi yang

bervariasi. Untuk mengkompensasi hal ini maka dilakukan pengukuran

transmitan larutan sampel selalu disertai larutan pembanding

2. Monokromator: digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang

monokromatis. Alatnya dapat berupa prisma atau grating. Untuk mengarahkan

sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian ini dapat digunakan

celah. Jika celah posisinya tetap maka prisma atau gratingnya yang dirotasikan

untuk mendapatkan λ yang diinginkan. Ada dua tipe prisma yaitu susunan

cornu dan susunan littrow. Secara umum tipe cornu menggunakan sudut 60°,

sedangkan tipe littrow menggunakan prisma dimana pada sisinya tegak lurus

dengan arah sinar yang berlapis alumunium serta mempunyai sudut optik 30°.

3. Sel absorpsi: pada pengukuran di daerah tampak, kuvet kaca atau kuvet kaca

corex dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus

menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini.

Umumnya tebal kuvetnya adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang

22

lebih besar dapat digunakan. Sel yang biasa digunakan berbentuk persegi,

tetapi bentuk silinder juga dapat digunakan. Kita harus menggunakan kuvet

yang bertutup untuk pelarut organik. Sel yang baik adalah kuarsa dan gelas

hasil leburan, serta seragam keseluruhannya.

4. Detektor: peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap

cahaya pada berbagai panjang gelombang.

2.8 Spektrofotometer IR

Daerah radiasi spektrofotometer infra red (IR) berkisar pada bilangan

gelombang 10-12800 cm-1, atau panjang gelombang 0,78-1000μm. Umumnya

daerah radiasi IR terbagi dalam IR dekat (4000-12800 cm-1; 1,2-3,8 x 1014 Hz;

0,78-2,5 μm), dan daerah IR tengah (200-4000 cm-1; 0,012-6 x 1014 Hz; 2,5-

50μm), dan daerah IR jauh (10-200 cm-1; 3-60 x 1011 Hz; 50-1000 μm). Daerah

yang paling banyak digunakan untuk berbagai keperluan praktis adalah 690-4000

cm-1 (2-12 x 1013 Hz; 2,5-1,5 μm). Daerah ini biasa disebut sebagai daerah IR

tengah. Spektrofotometer IR juga biasa digunakan sebagai penentuan struktur,

khususnya senyawa organik dan juga untuk analisis kuantitatif, seperti analisis

kuantitatif untuk pencemar udara, misalnya karbon monoksida dalam udara

dengan teknik non-dispersive. Spektrum infra merah memberikan puncak-puncak

maksimal yang jelas sebagai puncak minimumnya. Spektrum absorpsi dibuat

dengan bilangan gelombang pada sumbu X dan persentase transmitan (T) pada

sumbu Y. Bila dibandingkan dengan spektrofotometer UV-tampak, dimana energi

dalam daerah ini dibutuhkan untuk transisi elektronik. Maka radisasi infra merah

23

hanya terbatas pada perubahan energi setingkat molekul. Untuk tingkat molekul,

perbedaan dalam keadaan vibrasi dan rotasi digunakan untuk mengabsorpsi sinar

infra merah. Jadi untuk dapat mengabsorpsi, molekul harus memiliki perubahan

momen dipole sebagai akibat dari vibrasi. Berarti radiasi medan listrik yang

berubah-ubah akan berinteraksi dengan molekul dan akan menyebabkan

perubahan amplitudo salah satu gerakan molekul (Khopkar, 2003).

Posisi relatif atom dalam molekul tidak pasti, tetapi berubah-ubah terus-

menerus karena vibrasi. Untuk molekul dwi-atom dan tri-atom, vibrasi dapat

dianggap dan dihubungkan dengan energi absorpsi tetapi untuk molekul poliatom,

vibrasi tidak dapat dengan mudah diperkirakan, karena banyaknya pusat vibrasi

yang berinteraksi. Umumnya vibrasi diklasifikasikan sebagai vibrasi ulur dan

vibrasi tekuk. Vibrasi ulur menyangkut konstanta vibrasi antara dua atom

sepanjang sumbu ikatan, sedangkan vibrasi tekuk karena berubahnya sudut antara

dua ikatan dan ada empat tipe, yaitu scrissoring, rocking, wagging, dan twisting.

Keempat vibrasi tersebut hanya mungkin bagi molekul yang mempunyai lebih

dari dua atom (Khopkar, 2003).

Berikut bentuk-bentuk vibrasi:

1. bending

2. streching

24

3. wagging (kibasan) : atom-atomnya bergerak bolak balik keluar bidang atau

molekul

4. rocking (goyangan) : atom-atomnya bergerak bolak-balik dalam bidang

5. scissoring (guntingan) : dimana atom-atom yang terikat pada atom pusat

bergerak mendekat dan menjauh satu sama lain sehingga sudutnya

berubah-ubah

6. twisting (plintiran) : atom-atom yang terikat pada molekul yang diam

berotasi disekitar ikatanya

25

Berikut ini adalah beberapa gugus fungsi dengan daerah serapannya:

Tabel 4. Beberapa Gugus Fungsi dengan Daerah Serapanya

Gugus Jenis Senyawa Daerah Serapan (cm-1) C-H C-H C-H C-H C=H C≡H C=C C-H C-O C=O O-H O-H O-H N-H C-N C≡N -NO2

Alkana Alkena Aromatik Alkuna Alkena Alkuna Aromatik Alkana Alkohol, eter, asam karboksilat, ester Aldehid, keton, asam karboksilat, ester Alkohol, fenol (monomer) Alkohol, fenol (ikatan H) Asam karboksilat Amina Amina Nitril Nitro

2850-2960, 1350-1470 3020-3080, 675-1000 3000-3100, 675-870 3300 1640-1680 2100-2260 1500-1600 2850-2960, 1350-1470 1080-1300 1690-1760 3610-3640 200-3500 (lebar) 500-3000 (lebar) 3300-3500 1180-1360 2210-2260 1515-1560, 1345-1385

Sumber: Takeuchi (2009)

Spektrofotometer infra merah biasanya merupakan spektrofotometer ganda

dan terdiri dari 5 bagian utama yaitu sumber radiasi, daerah cuplikan, kisi difraksi

(monokromator), dan detektor.

1. Sumber radiasi, radiasi infra merah biasanya dihasilkan oleh pemijar Nernst

dan Globar. Pemijar Globar merupakan batangan silikon karbida yang dipanasi

sekitar 1200oC, sehingga memancarkan radiasi kontinyu pada daerah 1-40 μm.

Globar merupakan sumber radiasi yang sangat stabil. Pijar Nernst merupakan

26

batang cekung dari sirkonium dan yitrium oksida yang dipanasi sekitar 1500oC

dengan arus listrik. Sumber ini memancarkan radiasi antara 0,4-20 μm dan

kurang stabil jika dibandingkan dengan globar, tetapi globar memerlukan

pendinginan air.

2. Monokromator, monokromator terdiri dari sistim celah masuk dan celah

keluar, alat pendispersi yang berupa kisi difraksi atau prisma, dan beberapa

cermin untuk memantulkan dan memfokuskan berkas sinar. Bahan yang lazim

digunakan prisma adalah natrium klorida, kalium bromida, sesium bromida dan

litium fluorida. Prisma natrium klorida paling banyak digunakan untuk

monokromator infra merah, karena dispersinya tinggi untuk daerah antara 5,0-

16 μm, tetapi dispersinya kurang baik untuk daerah antara 1,0-5,0 μm. Kalium

bromida dan sesium bromida merupakan bahan prisma yang baik untuk infra

merah jauh. Litium fluorida merupakan bahan yang baik untuk infra merah

dekat. Bahan-bahan tersebut diatas bersifat higroskopis, sehingga dapat dirusak

oleh uap air.

Sekarang spektrofotometer infra merah kebanyakan menggunakan kisi

difraksi, bukan prisma. Keuntungan kisi difraksi adalah resolusi lebih baik,

energi sinar yang hilang lebih sedikit sehingga dapat digunakan lebar celah

yang lebih sempit, memberikan disperse yang linier dan tahan terhadap uap air.

Sedangkan kekurangan dari kisi difraksi adalah jumlah sinar hamburan lebih

banyak dan dihasilkannya lebih dari satu spektrum dari berbagai orde. Untuk

mengatasi kelemahan ini maka digunakan prisma dan filter bersama kisi

difraksi (monokromator ganda), sehingga hanya dihasilkan spektrum dari satu

27

orde saja. Hal yang sama juga dapat diperoleh dengan membuat sudut jalur kisi

sedemikian rupa sehingga sinar yang didispersikan terpusat hanya pada satu

orde saja.

3. Detektor. Sebagian besar alat modern menggunakan detektor panas. Detektor

fotolistrik tidak dapat digunakan untuk mendeteksi sinar infra merah, karena

energi foton infra merah tidak cukup besar untuk membebaskan elektron dari

permukaan katoda dari suatu tabung foton. Detektor panas untuk mendeteksi

sinar infra merah yaitu termokopel, bolometer dan sel golay. Ketiga detektor

ini bekerja berdasarkan efek pemanasan yang ditimbulkan oleh sinar infra

merah.

28

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di tiga tempat yaitu Laboratorium Bahan Alam,

Kimia LIPI-PUSPIPTEK, Serpong, Tanggerang; Laboratorium Mikologi,

Teknologi Bioindustri, gedung 1 LAPTIAB, BPPT-PUSPIPTEK, Serpong,

Tanggerang dan Laboratorium Pangan, Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif

Hidayatullah, Jakarta. Penelitian ini dilakukan mulai bulan Oktober 2009 hingga

Januari 2010.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Peralatan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari peralatan untuk

ekstraksi, yaitu: blender, beackerglass, hot plate, magnetic stirrer, sentrifius

(sigma 201m) dan batang pengaduk. Peralatan untuk pengeringan sampel hasil

ekstraksi, yaitu: cawan petri dan alat freeze-dryer (telstar iyoalfa 15). Peralatan

untuk uji megazyme dan congo red, yaitu: tabung uji dengan tutup, tabung reaksi,

waterbath (Kottermann Labortechnik), mikro pipet, magnetic strirrer, vortex,

sentrifius (HIMAC CR 21G), rak tabung reaksi, hot plate, termometer raksa.

Sedangkan instrumen yang digunakan untuk analisis adalah Spektrometer

Infra Red Perkin Elmer tipe spectrum-one (untuk identifikasi keberadaan senyawa

2929

lentinan), Spektrometer UV-Vis double beam Hitachi tipe V-2001 (untuk analisis

kadar senyawa lentinan).

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang dipakai pada penelitian ini terdiri dari bahan sampel

dan bahan untuk analisis. Bahan sampel adalah jamur shiitake yang diperoleh dari

swalayan jln. Ampera Raya No.38 Cilandak Timur, Jakarta-Selatan dan β-1,3;1,6-

D-glukan Standar (from barley, SIGMA, (C6H10O5)n, powder, glukosa >95 %)

diperoleh dari Kimia LIPI Pasar Jumat, Lebak Bulus, Jakarta-Selatan.

Bahan untuk analisis terdiri dari: bahan ekstraksi adalah aquades dan

alkohol 96%. Bahan analisis FTIR adalah serbuk KBr. Bahan untuk analisis kadar

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan metode congo red terdiri dari NaOH 1 M

dan pereaksi congo red. Bahan analisis kadar senyawa β-1,3;1,6-glukan dengan

metode Megazyme yaitu Megazyme kits (dari Irlandia) dipesan oleh laboratorium

Mikologi, laboratorium Teknologi Bioindustri, BPPT-PUSPIPTEK, serpong,

tanggerang, terdiri dari Kit: botol 1 (suspensi exo-1,3-β-Glucanase (100 U/mL) +

β-Glucosidase (20 U/mL), 2.0 mL); botol 2 (larutan Amyloglucosidase (1630

U/mL) + invertase (500 U/mL) dalam 50 % v/v gliserol, 20 mL); botol 3 (pereaksi

buffer glukosa (pekat; 50 mL)); botol 4 (Glucose oxidase >12,000 U/L,

Peroxidase >650 U/L, 4-Aminoantipyrine 0.4 mM); botol 5 (larutan standar

D-Glucose (5 mL, 1.00 mg/mL) in 0.2 % w/v asam benzoid); botol 6 (control

yeast β-glucan, 56 %), dan Reagen: buffer sodium asetat (1,2 M; pH-3,8), buffer

sodium asetat (200 mM; pH-5), KOH 2M, HCl (37% v/v; ~10M), KOH 2N.

30

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pengambilan Sampel

Jamur shiitake diperoleh dari swalayan jln. Ampera Raya No.38 Cilandak

Timur, Jakarta-Selatan pada tanggal 12 Oktober 2009. Jamur shiitake yang

digunakan merupakan jamur shiitake segar.

3.3.2 Preparasi Reagen

Reagen 1: ditambahkan 8 mL buffer natrium asetat (200 mM, pH-5,0) ke

dalam botol 1, kemudian disimpan dalam tabung polypropylene pada suhu -20oC

(reagen stabil > 2 tahun pada suhu -20oC). Reagen 2: diencerkan isi botol 3

(pereaksi buffer glukosa (pekat; 50 mL)) menjadi 1 L dengan air yang didistilasi

atau diionisasi (stabil >2 tahun pada suhu 4oC). Reagen 3: dilarutkan isi botol 4

(Glucose oxidase >12,000 U/L, Peroxidase >650 U/L, 4-Aminoantipyrine 0.4

mM) kedalam isi botol 3 yang telah diencerkan (stabil 2-3 bulan pada suhu 4oC

dalam botol gelap, atau >12 bulan pada suhu -20oC).

3.3.3 Ekstraksi Jamur Shiitake dengan Metode Yap & Ng

Ditimbang 900 g jamur shiitake yang telah dicuci dan dipotong-potong

terlebih dahulu. Kemudian dihaluskan dengan blender dan direbus dengan

aquades (100oC) selama 1 jam, kemudian ekstrak jamur shiitake diinkubasi pada

suhu ruang hingga suhunya mencapai suhu ruang (±27oC). Selanjutnya

disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dengan residu (ampas) dari jamur

shiitake. Supernatan yang didapat ditambahkan etanol 95 % (4oC) dengan volume

31

1:1 dan disimpan dalam freezer pada suhu -15oC selama 1 malam untuk

mengendapkan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan yang terlarut dalam pelarut aquades.

Endapan ekstrak basah jamur shiitake (berbentuk gel) yang diperoleh dipisahkan,

kemudian direbus kembali dengan aquades (100oC) hingga larut. Setelah semua

endapan larut kemudian diinkubasi pada suhu ruang, hingga suhunya ±27oC dan

disaring. Selanjutnya ditambahkan kembali etanol 95 % (4oC) dengan volume 1:1

dan disimpan dalam freezer pada suhu -15oC selama satu malam untuk

mengendapkan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan kembali. Residu (ampas) dari jamur

shiitake diekstrak kembali, ekstraksi berulang dilakukan hingga didapatkan

ekstrak basah jamur shiitake dengan berat minimun. Setelah diperoleh ekstrak

basah jamur shiitake, kemudian dilakukan proses pengeringan dengan metode

freeze drying selama 5 hari, untuk selanjutnya dihaluskan menjadi serbuk.

3.3.4 Identifikasi Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering Jamur

Shiitake dengan FTIR

Identifikasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan (lentinan) pada ekstrak kering

jamur shiitake dilakukan menggunakan FTIR dengan teknik cakram KBr.

Sebanyak 2 mg ekstrak kering jamur shiitake glukan dicampurkan dengan 200

mg serbuk KBr kering dengan lumpang agate atau “vibrating ball mill” hingga

benar-benar homogen. Setelah itu campuran tersebut dimasukkan ke dalam

pencetak dengan alat press. Lalu cakram KBr dilepas dari alat press. Selanjutnya

dilakukan scanning dengan frekuensi berkisar antara 400-4000 cm-1. Dilakukan

pula analisis yang sama untuk β-1,3;1,6-glukan standar.

32

3.3.5 Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering

Jamur Shiitake dengan Metode Megazyme

1. Penentuan Kadar Total Glukan

Ditimbang 100 mg ekstrak kering jamur shiitake, kemudian ditambahkan

1,5 ml HCl pekat (37 % v/v) kedalam tabung reaksi, selanjutnya divortex pelan-

pelan. Kemudian diinkubasi dalam waterbath 30oC, selama 45 menit dan divortex

setiap 15 menit sekali. Ditambahkan 10ml aquades dan divortex, diinkubasi

kembali dalam waterbath 100oC selama 2 jam, selanjutnya ditambahkan 10 ml

KOH 2 N, kemudian dipindahkan ke labu volumetric 100 ml, dicuci sisa pada

labu volumetric dengan buffer sodium asetat pH-5, dicampur dengan hati-hati

dengan dibolak-balik. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm

selama 10 menit. Kemudian diambil 0,1 ml supernatan (duplo), masing-masing

ditambahkan 0,1 ml reagen 1 (campuran 8 mL buffer sodium asetat 200 mM, pH-

5,0 dan suspensi exo-1,3-β-Glucanase (100 U/mL) + β-Glucosidase (20 U/mL),

2.0 mL) dan divortex, selanjutnya diinkubasi pada 40oC selama 60menit,

ditambahkan 3 ml reagen 3 (GOPOD) dan divortex, diinkubasi kembali pada 40oC

selama 20 menit, kemudian divortex. Selanjutnya diukur absorbansi dengan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 510 nm. Penentuan kadar total

glukan dilakukan sebanyak tiga kali (triplo). Dilakukan pula penentuan kadar total

glukan dari yeast dengan perlakuan dan waktu yang sama.

33

2. Penentuan Kadar α-glukan

Ditimbang 100 mg ekstrak kering jamur shiitake, kemudian ditambahkan 2

ml KOH 2 M, kemudian divortex selama 20 menit, ditambahkan 8ml buffer

natrium Asetat 1,2 M pH-3,8 dan divortex, kemudian ditambahkan 0,2 ml enzim

botol 2 (larutan Amyloglucosidase (1630 U/mL) + invertase (500 U/mL) dalam 50

% v/v gliserol, 20 mL) dan divortex kembali, selanjutnya diinkubasi pada 40oC

selama 30 menit dan divortex pelan-pelan. Kemudian disentrifugasi selama 10

menit, diambil 0,1 ml supernatan dan ditambahkan 0,1 ml buffer sodium asetat

pH-5 dan divortex, ditambahkan kembali 3 ml reagen 3 (GOPOD) dan divortex,

diinkubasi pada 40oC selama 20 menit. Diukur absorbansi dengan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 510 nm. Penentuan Kadar α-

glukan dilakukan sebanyak tiga kali (triplo). Dilakukan pula Penentuan Kadar α-

glukan dari yeast dengan perlakuan dan waktu yang sama.

3.3.6 Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering

Jamur Shiitake dengan Metode Congo Red

Ditimbang 0,02 g ekstrak kering jamur shiitake, kemudian ditambahkan

1,4 ml NaOH 1M dan diaduk dengan stirer hingga serbuk glukan larut.

Ditambahkan kembali 0,6 ml aquades dan diaduk kembali hingga tercampur.

Kemudian campuran tersebut dipipet masing-masing 1 ml dan dimasukkan

kedalam tabung sentrifius ukuran 1,5 ml. Selanjutnya disentrifugasi untuk

memisahkan ekstrak kering jamur shiitake yang sudah larut (filtrat) dengan yang

belum larut (residu) . Filtrat yang terpisah kemudian diambil dan ditambahkan

34

500 μl NaOH 0,2 M dan divortex. Selanjutnya ditambahkan 400 μl pereaksi congo

red dan divortex kembali untuk mencampurnya dan diinkubasi selama 20 menit

pada ruang gelap. Selanjutnya diukur absorbansi dengan alat spektrofotometer

UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm

35

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Ekstraksi Jamur Shiitake

Hasil Ekstraksi jamur shiitake menggunakan metode Yap & Ng dengan

proses ekstraksi berulang sebanyak tujuh kali, maka dari 900 g sample jamur

diperoleh total ekstrak basah jamur shiitake basah sebesar 84 g. Dengan hasil

berat kering sebesar 4,4987 g atau 0,4999 % (w/w) . Menurut penelitian yang

dilakukan Yap & Ng (2001), bahwa dengan metode ekstraksi yang sama dari 100

g sample jamur shiitake diperoleh berat kering sebesar 325 mg (0,3250 % w/w)

Penggunaan pelarut aquades panas dalam proses ekstraksi jamur shiitake

didasarkan pada sifat kelarutan senyawa β-glukan yang akan diekstraksi, menurut

Widyastuti (2009): β-glukan adalah polisakarida yang larut dalam pelarut aquades

panas dan NaOH. Terekstraknya senyawa β-1,3;1,6-D-glukan oleh aquades panas,

dapat terjadi karena pada saat proses pemanasan membuat rantai cabang dari

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan terbuka, kondisi ini memungkinkan aquades untuk

masuk kedalam struktur polisakarida β-1,3;1,6-D-glukan dan berinteraksi ikatan

hidrogen dengan gugus –OH dari senyawa β-1,3;1,6-D-glukan. Sehingga senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan dapat terekstrak kedalam pelarut aquades. Pada proses ini

terjadi gelatinisasi yang dapat terlihat dari supernatan hasil ekstraksi yang

mengental.

Penambahan etanol dingin 95 % (4oC) kedalam supernatan hasil ekstraksi

bertujuan untuk memisahkan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan yang terlarut dalam

3636

pelarut aqudes. Dengan penambahan etanol maka interaksi hidrogen antara

aquades dengan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan tergantikan dengan interaksi antara

etanol dengan aquades, sehingga menyebabkan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

mengendap. Ketidakmampuan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan untuk berinteraksi

dengan etanol karena sifat kelarutanya yang kecil. Menurut penelitian yang

dilakukan oleh Kusmawati dan Irma, telah dibuktikan bahwa semakin rendah suhu

etanol yang digunakan dalam proses pengendapan, maka semakin banyak

polisakarida yang dapat diendapkan. Untuk lebih mengoptimalkan proses

pengendapan ekstrak glukan, maka setelah penambahan etanol dingin 95 % (4oC)

dilanjutkan dengan proses penyimpanan dalam freezer (-150C) selama 1 malam,

sehingga diharapkan semakin banyak ekstrak glukan yang terendapkan.

Perebusan kembali endapan ekstrak basah jamur shiitake yang telah

diperoleh dilakukan untuk menghilangkan partikel pengotor ataupun senyawa lain

yang masih terbawa selama proses perebusan pertama ataupun selama proses

pengendapan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan. Proses pengeringan ekstrak basah

jamur shiitake menggunakan metode freeze drying dipilih agar supaya struktur

ekstrak kering jamur shiitake yang diperoleh tidak rusak, karena dalam metode

freeze drying tidak digunakan panas yang tinggi. Sedangkan jika proses

pengeringan menggunakan oven dapat merusak struktur ekstrak kering jamur

shiitake yang diperoleh.

.

37

4.2 Hasil Identifikasi Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering

Jamur Shiitake dengan FTIR

Identifikasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam ekstrak kering jamur

shiitake dapat ditentukan dengan melihat kemiripan peak-peak yang muncul pada

spektrum ekstrak kering jamur shiitake dengan spektrum β-1,3;1,6-D-glukan

standar (from barley, sigma, kemurnian >95 %).

Hasil analisis IR menghasilkan data spektrum sebagai berikut:

4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 450.010.0

15

20

25

30

35

40

45

50

55

59.4

cm-1

%T

Lentinan

Standar B-Glukan

3840.30

3424.24

2892.74

1650.75

1375.65

1070.34

895.57

600.17

890

Standar

470.44

653.21Ekstrak Shiitake

1431.10

1541.64

3395.21

2927.96

1651.791076.20

Gambar 7. Spektrum IR Ekstrak Kering Jamur Shiitake dan β-1,3;1,6-Glukan Standar (Barley)

Seperti terlihat pada hasil spektrum FT-IR diatas (gambar 7), dengan

membandingkan bentuk kedua spektrum maka terlihat bahwa peak-peak yang

terdapat pada spektrum β-1,3;1,6-D-glukan standar muncul juga pada spektrum

ekstrak kering jamur shiitake. Namun masih ada perbedaan beberapa peak antara

kedua spektrum tersebut, dimana ada peak yang muncul pada spektrum ekstrak

kering jamur shiitake tetapi tidak muncul pada spektrum β-1,3;1,6-D-glukan

38

standar, sehingga perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut terhadap peak-peak

yang muncul pada spektrum ekstrak kering jamur shiitake tersebut.

Dari beberapa peak-peak yang muncul pada spektrum ekstrak kering jamur

shiitake maka dapat teridentifikasi beberapa gugus fungsi sebagai berikut: pada

bilangan gelombang 3395,21 cm-1 menunjukkan gugus fungsi OH asam, pada

bilangan gelombang 2927,96 cm-1 menunjukkan gugus fungsi CH aromatik, pada

bilangan gelombang 1076,20 cm-1 menunjukkan gugus fungsi C-O-C stretching

dan yang paling spesifik adalah keberadaan peak pada bilangan gelombang 890

cm-1 yang menunjukkan ikatan 1,3-β-glikosidik.

Keberadaan gugus-gugus fungsi tersebut sebagai identifikasi β-1,3;1,6-D-

glukan dibuktikan juga dengan penelitian yang dilakukan oleh Synytsya dkk

(2008) bahwa adanya senyawa β-1,3;1,6-glukan dapat dilihat dari ikatan

polisakarida yang kuat terutama dalam cincin piran yang ditunjukkan pada

bilangan gelombang 950-1200 cm-1, adanya C-O-C stretching dari ikatan

glikosida pada bilangan gelombang 1150-1160 cm-1, ikatan β-glikosidik yang

spesifik pada bilangan gelombang 894 cm-1.

Selain mengidentifikasi peak-peak yang menunjukkan gugus fungsi dari

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan, perlu diidentifikasi pula peak yang muncul pada

spektrum ekstrak kering jamur shiitake yaitu menunjukkan gugus C=O pada

bilangan gelombang 1541,64 cm-1 dan gugus N-H pada bilangan gelombang

1651,79cm-1. Kedua peak ini tidak menunjukkan gugus fungsi dari senyawa β-

1,3;1,6-D-glukan, kemungkinan kedua peak ini berasal dari senyawa amida yang

terikat pada glukan (proteoglukan). Hal tersebut didukung oleh penelitian yang

39

dilakukan oleh Werning (2008) pada penentuan β-glukan, dimana pada bilangan

gelombang tersebut menunjukkan adanya vibrasi CO-NH dari protein atau

proteoglukan. Ini diperkuat pula oleh penelitian yang dilakukan oleh Synytsya

dkk (2008), bahwa pada sekitar bilangan gelombang 1650 cm-1 dan 1540 cm-1

menunjukkan vibrasi amida dari protein.

Dengan demikian, dari hasil analisis FTIR dapat diidentifikasi senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak kering jamur shiitake. Namun demikian dari

hasil tersebut belum bisa memastikan kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan secara

kuantitatif. Sehingga, perlu dilakukan pengujian lebih lanjut.

4.3 Hasil Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering

Jamur Shiitake dengan Metode Megazyme

Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

pada ekstrak kering jamur shiitake. Hasil pengukuran (triplo) kadar senyawa β-

1,3;1,6-D-glukan menggunakan metode megazyme dengan proses perhitungan

melalui program komputerisasi Mega-Cal Yeast and Mushroom β-glucan

Determination maka diperoleh kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan sebesar

32,8279 %; 30,5821 %; 29,2545 % dengan kadar rata-rata sebesar 30,8882 %.

Sedangkan untuk pengukuran (triplo) kadar β-1,3;1,6-D-glukan dari yeast

diperoleh nilai sebesar 54,2977 %; 54,2433 % dan 53,2018 %.

Tujuan dari melakukan pengukuran terhadap kadar β-1,3;1,6-D-glukan

dari yeast yang sebelumnya telah diketahui kadarnya sebesar 56 % (pada

kemasan) adalah digunakan sebagai kontrol positif terhadap prosedur pengukuran

40

kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan menggunakan metode megazyme. Sebagai

kontrol positif maka pengukuran kadar β-1,3;1,6-D-glukan dari yeast dilakukan

dengan perlakuan dan waktu yang sama terhadap pengukuran kadar β-1,3;1,6-D-

glukan pada ekstrak kering jamur shiitake, selain itu kadar β-1,3;1,6-D-glukan

dari yeast yang diperoleh harus berkisar antara 50-56 %, sebagaimana yang

ditetapkan dalam prosedur pengukuran metode megazyme. Apabila kadar β-

1,3;1,6-D-glukan dari yeast yang diperoleh <50% maka prosedur pengujian kadar

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dari sampel harus diulang.

Terjadinya penurunan kadar dari setiap pengulangan pada pengujian kadar

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak kering jamur shiitake maupun kadar β-

1,3;1,6-D-glukan dari yeast, kemungkinan dapat disebabkan oleh kerja enzim

yang digunakan dalam pengujian kurang optimum. Berkurangnya aktivitas enzim

ini kemungkinan bisa disebabkan karena terkontaminasinya enzim selama

perlakuan. Namun karena penurunan kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam

eksrak kering jamur shiitake maupun kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dari

yeast tidak terlalu signifikan maka tidak terlalu jadi masalah untuk menyimpulkan

kadar yang diperoleh.

4.4 Hasil Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan pada Ekstrak Kering

Jamur Shiitake dengan Metode Congo Red

Hasil analisis dengan metode congo red didapat nilai absorban ekstrak

kering jamur shiitake sebesar 0,2850, dengan memasukkan nilai absorban tersebut

kedalam persamaan regresi linier dari β-1,3;1,6-D-glukan standar (from barley,

41

sigma, kemurnian >95 %), maka didapat konsentrasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

sebesar 44.5200 ppm dengan rendemen hasil sebesar 890,0400 %.

Jika dilihat dari persen kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan yang didapat

maka nilai ini sangat tidak mungkin menunjukkan hasil pengukuran yang tepat.

Begitu juga jika hasil tersebut dibandingkan dengan hasil pengukuran kadar

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan metode megazyme, maka kedua metode ini

menunjukkan hasil yang sangat jauh berbeda.

Dari hasil ini maka dapat terlihat ketidakmampuan metode congo red

dalam menentukan kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan secara spesifik, hal ini

kemungkinan disebabkan karena pada pengukuran dengan metode congo red

bukan hanya senyawa β-1,3;1,6-D-glukan yang terukur, melainkan seluruh

polisakarida (ikatan β dan α-glukan). Kemungkinan ikut terukurnya polisakarida

lain dikarenakan terjadinya interaksi antara pewarna congo red dengan

polisakarida lain. Hal ini dapat dibuktikan dari penelitian yang dilakukan oleh

Anugraha (2008) bahwa Congo red akan bereaksi dengan polisakarida, termasuk

D-glukan dan selulosa yang telah disubstitusi (CMC) menjadi polisakarida

kompleks yang berwarna merah.

Walaupun metode congo red memiliki kelebihan dari segi biaya yang

lebih efisien dan waktu pengerjaan yang lebih efektif dibandingkan dengan

metode megazyme, namun metode congo red belum dapat menentukan kadar

senyawa β-1,3;1,6-D-glukan secara spesifik, namun dengan melihat kemampuan

pewarna congo red dalam berinteraksi dengan semua polisakarida maka untuk

42

penelitian selanjutnya metode congo red diharapkan dapat digunakan dalam

pengukuran total glukan.

43

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan:

1. Hasil ekstraksi metode Yap & Ng diperoleh berat kering ekstrak jamur

shiitake (ekstrak glukan) sebesar 4,4987 g dengan rendemen hasil per berat

sampel adalah 0,4999 %

2. Analisis dengan FTIR dapat mengidentifikasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

pada ekstrak kering jamur shiitake, yang ditunjukkan dengan keberadaan

beberapa gugus fungsi seperti OH dari asam pada bilangan gelombang

3395,21 cm-1, gugus fungsi CH aromatik pada bilangan gelombang 2927,96

cm-1, gugus fungsi C-O-C stretching pada bilangan gelombang 1076,20 cm-1

dan ikatan 1,3-β-glikosidik pada bilangan gelombang 890 cm-1.

3. Metode congo red belum mampu secara spesifik menentukan kadar senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan pada ekstrak kering jamur shiitake, terlihat dari hasil

pengukuran kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan yang diperoleh berbeda jauh

dengan hasil pengukuran metode megazyme

5.2 Saran

1. Dalam melakukan penentuan kadar β-1,3;1,6-D-glukan menggunakan metode

megazyme, perlu diperhatikan proses penyimpanan (harus dalam lemari es dan

tetap pada kondisi dingin) dan penggunaan enzim agar tidak terkontaminasi.

4444

2. Untuk mengetahui aktivitas antikanker senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam

ekstrak glukan jamur shiitake perlu dilakukan uji aktivitas menggunakan

metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test).

45

DAFTAR PUSTAKA

Anugraha, Prasidi. 2008. Deteksi Aktivitas Enzim Eksoglukanase Bakteri

Selulolitik dalam Menghidrolisis Secara In-vitro. Surabaya:

Perpustakaan Universitas Erlangga.

Anonim. Beta-Glucan And The Immune System. New Zealand : Glucagel.

Anonim. Struktur Congo Red. Wikipedia. Com.

Anonim. Peluang Tanaman Rempah dan Obat Sebagai Sumber Bahan Pangan.

Bogor: Litbang Pertanian.

Aryantha, I Nyoman P. 2005. Pengembangan Produk Kesehatan dari Jamur

Shiitake. Jakarta: BPPT.

Hendry, Reni Efita. 2005. Manfaat Jamur Sebagai Bahan Pangan & Obat.

Majalah Health Today.

Hermanto, Sandra. 2008. Mengenal Lebih Jauh Teknik Analisa Kromatografi &

Spektrofotometri. Jakarta: Pusat Laboratorium Terpadu UIN syahid.

Khopkar, S. M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas

Indonesia (UI-Press).

Kusmawati, Ati dan Irma Budi P. Pengambilan Polisakarida Acemannan dari

Aloe vera menggunakan Etanol Sebagai Pengendap. Seamarang:

Universitas Diponegoro.

Kusmiati, dkk. 2007. Produksi β-Glukan Dari Dua Galur Agrobacterium sp.

Pada Media Mengandung Kombinasi Molase dan Urasil. Surakarta:

Jurusan Biologi FMIPA UNS.

McCleary, Barry V. 2009. Mushroom and Yeast Beta-Glucan Assay Procedure.

Irlandia: Megazym. Com.

McCleary, Barry V. 2009. Advanced Bio-Analysis Test Kits for the Food, Feed &

Fermentation, Wine, Brewing & Dairy Industries. Irlandia:

4646

Megazym.com.

Okamoto et al. 2004. Lentinan From Shiitake Mushroom (Lentinus edodes)

Suppresses Expression of Cytochromen P450 IA Subfamily in The

Mouse Liver. Biofactors. 21(1-4):407-9.

Ooi, V. E. C. dan F. Liu. 2000. Immunomodulation and Anti-Cancer Activity of

Polysaccharide-Protein Complexes, Current Medicinal Chemistry, (7)

715-729.

Pudjaatmaka, A. H dan M. T Qodratillah. 2002. Kamus Kimia. Jakarta: Balai

Pustaka.

Sarwintyas, dkk. 2001. Tinjauan Literatur Jamur Kegunaan Kimia dan Khasiat.

Jakarta: LIPI.

Sudjadi. 1986. Metode Pemisahan. Yogyakarta: UGM Press.

Suriawiria, Unus. 2005. Teknologi Produksi Shiitake. Makalah Pra Workshop

Pengembangan Produk dan Industri Jamur Pangan, BPPT Jakarta 1-2

Agustus 2005.

Synytsya, Andriy. dkk. 2008. Glucans from fruit bodies of cultivated mushrooms

Pleurotus ostreatus and leurotus eryngii: Structure and potential

prebiotic activity. Czech Republic: www.elsevier.com/locate/carbpol.

Synytsya, Andriy. 2008. Mushrooms of Genus Pleurotus as a Source of Dietary

Fibres and Glucans for Food Supplements. Czech Journal Food Sci.

Takeuchi, Yoshito. 2009. Metode Spektroskopik. Situs Resmi Kimia Indonesia:

Chem-is-try. Org.

Theather, Ronald M dan Peter J. Wood. 1981. Use of Congo Red-Polysaccharide

Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic

Bacteria from the Bovine Rument. Kanada.

Volman, Julia J dkk. 2007. Dietary Modulation of Immune Function by β-Glukan.

www.sciencedirect.com.

47

Werning, Laura Maria. 2008. Heterologous Expression of a Position 2-Substituted

(1,3)-β-D-Glucan in Lactococcus lactis. Journal of American Society

for Microbiology.

Widyastuti, Netty. 2009. Jamur Shiitake-Budidaya & Pengolahan Si Jamur

Penakluk Kanker. Jakarta: Lily Publisher.

Wijaya, Hanny. 2002. Pangan Fungsional dan Kontribusinya Bagi Kesehatan.

Jakarta: KHARISMA women & education.

48

Lampiran 1. Desain penelitian

Jamur Shiitake

Dicuci dan Diblender Ekstraksi (7x pengulangan)

Jamur Shiitake Halus

Ekstrak Basah Jamur Shiitake

freeze drying

Ekstrak Kering Jamur Shiitake

Penghalusan

Serbuk

Analisa Kualitatif Analisa Kuantitatif

Analisa FTIR

Teknik Cakram KBr Metode Megazym

Pj. Gel 540nm

Metode Congo Red

Pj. Gel 510nm

Analisa Spektrofotometer UV-Vis

49

Lampiran 2. Data Hasil Ekstraksi

Hasil Ekstraksi Jamur Shiitake dengan Ekstraksi Berulang Pengulangan ∑ Pelarut Aquades (L) Ekstrak Glukan (grm)

1 2,55 27

2 2,30 24

3 1,45 17

4 1,05 7

5 0,95 4

6 0,65 3

7 0,90 2

Perhitungan Rendemen Ekstrak Kering Jamur Shiitake:

% rendemen = berat ekstrak kering jamur shiitake x 100% berat jamur shiitake yang diekstrak

50

Lampiran 3. Gambar-gambar Tahapan Ekstraksi Hingga Freeze Drying

Penghalusan

Jamur Shiitake Kasar Jamur Shiitake Halus

+ Aquades

sentrifugasi

Proses Perebusan Ekstrak dan Residu Terpisah

Proses Presipitasi I Ekstrak Basah Jamur Shiitake I

Proses Perebusan Proses Penyaringan

Proses Presipitasi II Ekstrak Basah Jamur Shiitake II

Freez Drying

Pemisahan

+ alkohol 4oC

Disaring

Pemisahan

+ alkohol 4oC

Pemurnian

Ekstrak Kering Jamur Shiitake

51

Lampiran 4. Data Hasil Pengukuran Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

dengan Metode Megazyme

Tabel Absorbansi Total Glukan, α-glukan dan Glukosa Hasil Analisis Spektrofotometer UV-Vis

Ulangan 1 A1 A2 A1-rata2 Blanko A2-rata2 Blanko ∆E Ekstrak shiitake:

- total glukan

- alfa glukan

Ekstrak Yeast:

- total glukan

- alfa glukan

Glukosa

Blanko

0,438

0,053

0,693

0,079

1,063

0,017

0,451

0,060

0,651

0,076

1,090

0,017

0,421

0,036

0,676

0,062

1,046

-

0,434

0,043

0,634

0,059

1,073

-

0,4275

0,0395

0,6550

0,0605

1,0595

- Ulangan 2 Ekstrak shiitake:

- total glukan

- alfa glukan

Ekstrak Yeast:

- total glukan

- alfa glukan

Glukosa

Blanko

0,433

0,083

0,675

0,078

1,088

0,016

0,439

0,061

0,676

0,080

1,079

0,016

0,417

0,067

0,659

0,062

1,072

-

0,423

0,045

0,660

0,064

1,063

-

0,4200

0,0560

0,6595

0,0630

1,0675

Ulangan 3 Ekstrak shiitake:

- total glukan

- alfa glukan

Ekstrak Yeast:

- total glukan

- alfa glukan

Glukosa

Blanko

0,397

0,075

0,613

0,086

1,015

0,030

0,399

0,078

0,626

0,086

1,017

0,032

0,366

0,044

0,582

0,055

0,984

-

0,368

0,047

0,595

0,055

0,986

-

0,3675

0,0455

0,5885

0,0550

0,9850

52

Tabel Hasil Pengukuran Kadar Total Glukan, α-glukan dan β-glukan

% Total Glukan % α-glukan % β-glukan Ulangan ke-1 Ekstrak Shiitake 36,1336 3,3058 32,8279 Ekstrak Yeast 54,8172 0,5195 54,2977 Ulangan ke-2 Ekstrak Shiitake 35,2337 4,6515 30,5821 Ekstrak Yeast 54,7802 0,5369 54,2433 Ulangan ke-3 Ekstrak Shiitake 33,3994 4,1449 29,2545 Ekstrak Yeast 53,7179 0,5161 53,2018

• Cara Perhitungan Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan

Persamaan

Total Glukan (% w/w) = ∆E x F x 100 x 1 x 100 x 162 (+ oligomer dll) 0.1 1000 W 180

= ∆E x F/W x 90

α-glukan (% w/w) = ∆E x F x 1000 x 1 x 100 x 162 (+ oligomer dll) (or 103) 1000 W 180

= ∆E x F/W x 90 (volume akhir 100 ml)

= ∆E x F/W x 9.27 (volume akhir 10.3 ml)

β-glukan = Total glukan - α-glukan

(+ oligomer dll) (+ oligomer dll)

Dimana:

∆E = absorban sampel – absorban blanko

F = faktor untuk mengkonversi absorban ke μg dari D-glukosa

100/0,1= faktor koreksi volume; untuk total glukan (yeast)

103 = faktor koreksi volume; untuk α-glucan (10,3 ml yang dianalisa)

atau 1000 = faktor koreksi volume; untuk α-glucan (100 ml yang dianalisa)

1/1000 = konversi dari μg ke miligram

100/W = konversi balik ke 100 mg dari sampel (%w/w)

W = berat sampel yang dianalisis

53

162/180 = faktor untuk mengkonversi dari D-glukosa bebas, yang diukur,

untuk anhidroglukosa

Contoh Perhitungan Pada Ulangan Pertama

Shiitake :

Total glukan (%w/w) = 0,4275 x (94,3841/100,5) x 90

= 36,1336

α-glukan (%w/w) = 0,0395 x (94,3841/101,5) x 90

= 3,3058

% β-glukan = 36,1336 – 3,3058 = 32,8279

Yeast :

Total glukan (%w/w) = 0,6550 x (94,3841/101,5) x 90

= 54,8172

α-glukan (%w/w) = 0.0605 x (94,3841/101,9) x 9,27

= 0,5195

% β-glukan = 54,8172 – 0,5195 = 54,2977

54

• Cara Perhitungan Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dengan Program

Komputerisasi

Contoh Perhitungan Pada Ulangan Pertama

Dengan melihat hasil perhitungan kadar senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dari jamur

shiitake pada ulangan pertama, ternyata hasil perhitungan dengan cara manual dan

komputerisasi diperoleh kadar yang sama. Namun untuk memperoleh hasil

perhitungan yang cepat, maka pada penelitian ini penentuan kadar senyawa

β-1,3;1,6-D-glukan dilakukan dengan program komputerisasi.

55

Lampiran 5. Reaksi Selama Analisis Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

dengan Metode Megazyme

Reaksi selama Analisis α-glukan

Tahap 1

α-glukan(s) + KOH α-glukan(l)

Tahap 2

α-glukan(l) + H2O amyloglucosidase

Tahap 3

+ O2 + glucose oxidase

+

Tahap 4

+ +

Peroxidase

+ 4

Gambar 9. Reaksi Penentuan α-Glukan (McCleary, 2009)

56

Reaksi selama analisis total glukan

Tahap 1

1,3:1,6-β-glukan(s) + 1,3- β-glukan + α-glukan(s) + H2O HCl, 30 C, 45 menit

Glukan(l) + H2O

1,3 M HCl, 100 C, 2jam

exo-1,3- β-glucanase + β -glucosidase

laminarisaccharides + H2O

Tahap 2

+ O2 + glucose oxidase

+

Tahap 3

+ +

peroxidase

+ 4

Gambar 10. Reaksi Penentuan Total Glukan (McCleary, 2009)

57

Lampiran 6. Data Hasil Pengukuran Kadar Senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

dengan Metode Congo Red

Nilai Absorban Ekstrak Kering Jamur Shiitake Sampel Absorban 1 Absorban 2 Rata2 Absorban

Ekstrak kering jamur shiitake

Ekstrak kering (pengenceran 2x)

Blanko

0,572

0,287

0

0,565

0,283

0

0,569

0,285

0

Nilai Absorbansi dari Beragam Konsentrasi β-1,3;1,6-glukan Standar (Barley) [β-glucan] ppm Abs 1

0 0,000 5.000 0,070 15.000 0,158 35.000 0,228 50.000 0,302

Kurva Standar Barley

kurva diatas memiliki persamaan regresi linier

Y = 5.10-6 X + 0,0624 dengan R2 = 0,972

Berikut cara penentuan kadar lentinan melalui persamaan regresi linier:

58

59

Nilai absorbansi dari ekstrak kering jamur shiitake, dimasukkan kedalam

persamaan regresi linier dari kurva standar barley sebagai nilai Y

0,285 = 5.10-6 X + 0,0624

0,285 – 0,0624 = 5.10-6 X

X = 0,2226 : 5.10-6

X = 0,04452.106 = 44.520 ppm

Karena ekstrak kering jamur shiitake yang diukur merupakan hasil pengenceran

2x, maka konsentrasi sebenarnya dari kandungan senyawa β-1,3;1,6-D-glukan

yang diukur adalah 44.520 x 2 = 89.040 ppm.

Untuk menghitung konsentrasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan dalam %

maka konsentrasi yang didapat dalam ppm (mg/L) terlebih dahulu dikonversi ke

(gr/ml), maka konsentrasinya menjadi 0,089040 gr/ml.

Selanjutnya dihitung dengan rumus:

konsentrasi senyawa β-1,3;1,6-D-glukan x 100%

Konsentrasi ekstrak kering jamur shiitae

Konsentrasi ekstrak kering jamur shiitake didapat dengan membagi berat ekstrak

glukan yang dianalisis dengan volume pelarut yang digunakan yaitu 0,02 gr : 2ml

= 0,01 gr/ml

Maka persen (%) senyawa β-1,3;1,6-D-glukan yang didapat:

0,089040 gr/ml x 100% = 890,040% 0,01 gr/ml