Karya Akhir Perbandingan Hasil Identifikasi Metode ...repository.unair.ac.id/55488/13/PPDS. PK. 01-16 Sug p-min.pdf · Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

Karya Akhir

Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan

Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical

Dedicated Reasonable (TDR)-300B

Oleh:

I Gde Eka Sugiartha,dr.

NIM. 011218156301

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS 1 PATOLOGI KLINIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA -RSUD DR.SOETOMO

SURABAYA

2016

ADLN -PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

KARYA AKHIR PERBANDINGAN HASIL IDENTIFIKASI I GDE EKA SUGIARTHA,dr

Karya Akhir

Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan

Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical


Oleh:

I Gde Eka Sugiartha,dr.

Pembimbing:

I GAA Putri Sri Rejeki,dr., SpPK(K)

Dr. Puspa Wardhani,dr., SpPK

Bambang Pujo Semedi,dr.,SpAn.KIC

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS 1 PATOLOGI KLINIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA -RSUD DR.SOETOMO

SURABAYA

2016



iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkah dan rahmat-Nya sehingga karya akhir dengan judul Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B ini dapat diselesaikan. Terima kasih yang tulus saya sampaikan kepada IGAA Putri Sri Rejeki, dr.,SpPK(K), Dr. Puspa Wardhani,dr.,SpPK, Bambang Pujo Semedi, dr.,SpAn.KIC, dan Dr.Hari Basuki NH,dr.,MKes selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, dorongan, petunjuk, arahan dan evaluasi sehingga karya akhir ini dapat diselesaikan.

Ucapan terima kasih juga saya ucapkan kepada: Yetti Hernaningsih,dr.,SpPK sebagai Kepala Departemen Patologi Klinik

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga RSUD Dr.Soetomo, Surabaya Dr. Puspa Wardhani,dr.,SpPK selaku Kepala Pendidikan Studi Patologi Klinik

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga RSUD Dr.Soetomo, Surabaya Prof.Dr.Aryati,dr.,MS.,SpPK(K) atas bantuannya selaku penanggung jawab

Mikrobiologi di Laboratorium Granostik dan Parahita dan selama menjabat Kepala Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga RSUD Dr.Soetomo, Surabaya

Dr,Sidarti Soehita SFHS,dr.,SpPK(K) atas bantuanya selama menjabat Kepala Pendidikan Studi Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga RSUD Dr.Soetomo, Surabaya

Juli Soemarsono,dr.,SpPK (alm) selaku dosen wali mahasiswa Prof. Dr. Prihatini, dr., M.S., Sp.PK(K), Fery H. Soedewo, dr., M.S., Sp.PK(K)

dan Leonita Anniwati,dr.,SpPK(K) yang telah bersedia menjadi penguji dan memberikan masukan sejak pengajuan proposal hingga penelitian ini selesai

Seluruh staf pengajar Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga RSUD Dr.Soetomo, Surabaya

Verna,dr,SpPK, Mayfani,dr, Ni Luh,dr, Wulan,dr yang telah membantu penelitian ini

Isteri tercinta Ni Luh Deliyani,SKM.,MKes, anakku sayang Ayu Putu Githa Maheswari, Kadek Agus Surya Udiyana atas pengorbanannya

Kedua orang tua tercinta I Made Alit Antara, Ni Ketut Nariani atas pengorbanan yang tak akan terbalas

Kedua mertua I Wayan Bagia,SS, Ni Nengah Mariani,SPd.,MPd atas semua bantuannya

Seluruh karyawan dan PPDS Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga RSUD Dr.Soetomo, Surabaya Akhir kata saya minta maaf jika ada kesalahan dalam upaya menyelesaikan

penelitian ini. Surabaya, Maret 2016 I Gde Eka Sugiartha,dr



v

ABSTRAK Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan

Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B

IG Eka Sugiartha , IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi

Pendahuluan. Angka kematian infeksi aliran darah cukup tinggi, berkisar 20 - 50%. Patogen penyebab dapat dibuktikan dengan pemeriksaan kultur darah yang dilanjutkan dengan tes kepekaan antibiotika. Metode pemeriksaan dapat dilakukan secara konvensional atau automatis baik semiautomatis ataupun automatis penuh. Metode konvensional relatif tidak memerlukan investasi biaya yang besar dibandingkan metode automatisasi. Metode. Penelitian ini merupakan analisis observasional dengan rancangan cross sectional. Metode identifikasi konvensional memakai metode API dan tes kepekaan antibiotika konvensional menggunakan metode difusi cakram antibiotika Kirby Bauer. Kedua metode ini dibandingkan dengan metode semiautomatis TDR-300B. Metode automatis penuh VITEK 2 digunakan sebagai metode rujukan untuk menilai performa metode konvensional dan semiautomatis. Hasil. Bakteri penyebab infeksi aliran darah didominasi Gram negatif kebanyakan Eschericia coli dan Klebsiella pneumonia. Akurasi metode identifikasi API terhadap VITEK 2 sebesar 87,87%, akurasi identifikasi metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 adalah 90,9%. Hasil akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap metode VITEK 2 adalah 84,64%. Akurasi tes kepekaan antibiotika metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 sebesar 82,5%. Akurasi metode API terhadap metode TDR-300B sebesar 84,84%.Akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional terhadap metode TDR-300B sebesar 78,21%. Pembahasan. Hasil metode identifikasi dan tes kepekaan antibiotika konvensional tidak berbeda bermakna secara statistik dengan metode semiautomatis TDR-300B. Metode identifikasi dan tes kepekaan antibiotika konvensional masih dapat dipercaya terutama untuk daerah dengan keterbatasan finansial atau pemeriksaan masih sedikit. Kata kunci: Perbandingan, metode konvensional, API, difusi, TDR-300B



vi

ABSTRACT Comparison of Analytical Profile Index (API) Identification Method Results

and Conventional Antimicrobial Susceptibility Test with Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B Method

IG Eka Sugiartha, IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi

Background. The bloodstream infection death rate is quite high, ranging from 20% to 50%. Causable pathogens could be demonstrated by blood cultures followed by antimicrobial susceptibility tests. The test could be performed in a conventional, semiautomatic or fully automatic method. The conventional method does not require large investment costs compared to automatic methods. Method. This was an observational cross sectional design study. Conventional identification method used API and conventional antimicrobial susceptibility tests used disc diffusion method of Kirby Bauer. Both of the methods were compared to semiautomatic TDR-300B method. A fully automatic VITEK 2 method was used as the reference method for assessing the performance of conventional and semiautomatic methods. Results. Bacteria that cause bloodstream infections were mostly dominated by Gram-negative Escherichia coli and Klebsiella pneumonia. The accuracy of API identification method to the VITEK 2 was 87.87%, accuracy of TDR-300B identification method to VITEK 2 method was 90.9%. The accuracy results of conventional Kirby Bauer disc diffusion antimicrobial susceptibility tests method compared to VITEK 2 method was 84.64%. Accuracy of TDR-300B antimicrobial susceptibility tests method to VITEK 2 was 82.5%. The accuracy of API identification method to TDR-300B was 84.84%.The accuracy of conventional antimicrobial susceptibility test method to TDR-300B was 78.21%. Conclusion. The results of conventional identification and antimicrobial sensitivity tests were not statistically significant different with semiautomatic TDR-300B method. Conventional identification and antimicrobial susceptibility test methods could be trusted, especially for financial limited region or small number of examination. Key words: Comparison, conventional, API, disc diffusion, TDR-300B



vii

RINGKASAN

Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical


IG Eka Sugiartha, IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi

Infeksi aliran darah mempunyai angka kematian yang cukup tinggi yang berkisar 20 - 50%. Infeksi ini dibuktikan dengan pemeriksaan kultur untuk menentukan mikroorganisme penyebab infeksi yang dilanjutkan dengan pemeriksaan kepekaan terhadap antibiotika. Metode pemeriksaan identifikasi dan kepekaan secara fenotipe lebih banyak dilakukan dibandingkan secara genotipe. Metode fenotipe ini dapat dilakukan secara konvensional atau automatisasi. Automatisasi dibedakan menjadi automatis penuh dan semiautomatis. Metode konvensional tentu akan lebih murah dibandingkan yang automatis, sedangkan metode semiautomatis relatif lebih murah dibandingkan metode automatis penuh. Penelitian ini mencoba membandingkan metode konvensional dengan metode semiautomatis yang relatif lebih murah dengan menggunakan metode automatis penuh sebagai metode rujukan. Metode konvensional dikerjakan melalui tes identifikasi Analytical Profile Index (API) dan tes kepekaan antibiotika difusi cakram antibiotika Kirby Bauer. Metode semiautomatis menggunakan metode Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B sedangkan yang automatis penuh memakai metode VITEK 2. Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan rancangan cross sectional yang menggunakan 33 sampel isolat bakteri dari penderita infeksi aliran darah. Sampel darah diambil dari berbagai ruangan di RSUD Dr.Soetomo Surabaya. Akurasi metode identifikasi API terhadap metode VITEK 2 sebesar 87,87%, akurasi identifikasi metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 adalah 90,9%. Akurasi metode API terhadap metode TDR-300B sebesar 84,84%. Hasil akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap metode VITEK 2 adalah 84,64%. Akurasi tes kepekaan antibiotika metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 sebesar 82,5%. Akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional terhadap metode TDR-300B sebesar 78,21%. Perbandingan akurasi hasil identifikasi antara metode konvensional API dengan metode semiatomatis TDR-300B tidak berbeda secara statistik. Perbandingan akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap metode semiautomatis TDR-300B juga tidak berbeda secara statistik. Kemungkinan sumber kesalahan identifikasi disebabkan kesalahan pengamatan perubahan warna substrat pada metode API dan adanya polimikroba. Kemungkinan kesalahan tes kepekaan antibiotika diantaranya kesalahan membuat kekeruhan suspensi kuman pada metode konvensional, kesalahan pemipetan pada kedua metode, dan adanya polimikroba. Metode konvensional ternyata masih baik bila dibandingkan dengan metode semiautomatis tetapi metode konvensional sangat membutuhkan tenaga yang terlatih.



viii

SUMMARY Comparison of Analytical Profile Index (API) Identification Method

Results and Conventional Antimicrobial Susceptibility Test with Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B Method

IG Eka Sugiartha, IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi The mortality rate of bloodstream infection is high in the range 20% to

50%. The infection is proven by culture examination to determine the microorganisms causing the infection. It is followed by antimicrobial susceptibility test. Phenotype method of identification and antimicrobial susceptibility test are more common than genotype method. The method can be done conventionally or automatically. Automatic method can be done by fully automatic and semiautomatic. The conventional method is cheaper than the automatic, while the semiautomatic method is relatively cheaper than fully automatic method.

The study tried to compare the conventional method to semiautomatic method that was relatively inexpensive by using a full automatic method as a reference. The conventional method was done by Analytical Profile Index (API) identification tests and conventional antimicrobial susceptibility test used Kirby Bauer disc diffusion method. Semiautomatic method used Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B method while full automatic used VITEK 2. This study was an observational cross sectional design study, using 33 samples of bacterial isolates from bloodstream infection patients. Blood was taken from various wards in Dr.Soetomo Surabaya Hospital.

Accuracy of API identification method compare to VITEK 2 was 87.87%, the accuracy of TDR-300B identification method was 90.9%. The accuracy of API method to TDR-300B was 84.84%. The accuracy results of conventional Kirby Bauer disc diffusion antimicrobial susceptibility test to VITEK 2 was 84.64%. Accuracy of TDR-300B antimicrobial susceptibility test method to VITEK 2 was 82.5%. Accuracy of conventional antimicrobial susceptibility test method to TDR-300B method was 78.21%.

Comparison of identification accuracy results between the API conventional methods to TDR-300B semiautomatic methods were not statistically different. Comparison of antimicrobial susceptibility test accuracy result between conventional Kirby Bauer disc diffusion method to TDR-300B semiautomatic method was also not statistically different. Possible causes of error in API method were observation misidentification of substrate colour and the presence of polymicrobial. Sources of antimicrobial susceptibility test possible errors were mistakes in making suspension turbidity in conventional method, pipetting errors in both methods, and the presence of polymicrobial. The conventional method was still reliable compared to semiautomatic methods but urgently need skilled personnel.



ix

DAFTAR ISI Sampul dalam..i Lembar pengesahanii Pernyataan keaslian...iii Kata pengantar...iv Abstrak.. v Ringkasan.vii Daftar Isi....ix Daftar Tabelx Daftar Gambar...xi Daftar Lampiran...xii Daftar Singkatan..xiii Bab 1. Pendahuluan.1

1.1 Latar Belakang..1 1.2 Rumusan Masalah.4 1.3 Tujuan Penelitian..5 1.4 Manfaat Penelitian6

Bab 2. Tinjauan Pustaka..7 2.1 Identifikasi Bakteri Dengan Metode API..7 2.1.1 API Staph...9 2.1.2 API Strep..13 2.1.3 API 20E20 2.1.4 API 20NE.27 2.2 Tes Kepekaan Antibiotika Metode Konvensional..29 2.3 Metode TDR-300B.39 2.3.1 Identifikasi bakteri metode TDR-300B42 2.3.2 Tes kepekaan antibiotika metode TDR-300B..44 2.4 Metode VITEK 250 2.4.1 Identifikasi bakteri metode VITEK 2...53 2.4.2 Tes kepekaan antibiotika metode VITEK 2.57 Bab 3. Kerangka Konseptual Dan Hipotesis Penelitian..60 3.1 Kerangka Konseptual..60 3.2 Penjelasan Kerangka Konseptual61 3.3 Hipotesis Penelitian66 Bab 4. Metode Penelitian67 4.1 Desain Penelitian67 4.2 Populasi Dan Sampel..67 4.3 Tempat Penelitian . 68 4.4 Variabel Penelitian Dan Definisi Operasional ....68 4.5 Alat Dan Bahan Penelitian..69 4.6 Cara Kerja...69 4.6.1 Identifikasi metode API...69 4.6.2 Tes kepekaan antibiotika konvensional75 4.6.3 Metode TDR-300B..76 4.6.4 Metode VITEK 2.77 4.7 Alur Penelitian78 4.8 Analisis Statistik.78



x

Bab 5. Hasil Penelitian 5.1 Hasil Penjaminan Mutu Penelitian81 5.1.1 Hasil penjaminan mutu alat dan bahan.81 5.1.2 Hasil penjaminan mutu melalui tes sterilitas.83 5.1.3 Hasil penjaminan mutu melalui tes performa83 5.2 Perbandingan Hasil Identifikasi83 5.3 Perbandingan Hasil Tes Kepekaan Antibiotika88 Bab 6. Pembahasan.94 6.1 Perbandingan Hasil Identifikasi Bakteri...95 6.2 Perbandingan Hasil Tes Kepekaan Antibiotika...101 Bab 7. Simpulan dan Saran..106 Daftar Pustaka.108 Lampiran 112



xi

DAFTAR TABEL 2.1 Jenis pemeriksaan metode API...8 2.2 Tes biokimia API Staph15 2.3 Tes biokimia API Strep.18 2.4 Tes biokimia API 20E...21 2.5 Tes biokimia API 20NE28 2.6 Tes biokimia TDR Staph 64..44 2.7 Tes biokimia TDR STR 6445 2.8 Tes biokimia TDR ONE 64..46 2.9 Tes biokimia TDR NF 64.47 2.10 Tes kepekaan antibiotika pada TDR Staph 64..48 2.11 Tes kepekaan antibiotika pada TDR STR 6449 2.12 Tes kepekaan antibiotika pada TDR NF 64..49 2.13 Tes kepekaan antibiotika pada TDR ONE 6450 2.14 Tes biokimia pada kartu GP VITEK 2..55 2.15 Tes biokimia pada kartu GN VITEK 2.56 4.1 Definisi operasional penelitian.70 4.2 Alat dan bahan penelitian..72 5.1 Penjaminan mutu alat dan bahan...82 5.2 Perbandingan identifikasi metode API,TDR terhadap VITEK.86 5.3 Perbandingan identifikasi API terhadap TDR...87 5.4 Uji statistik kesesuaian hasil identifikasi..87 5.5 Jenis antibiotika yang digunakan dan dianalisis89 5.6 Perbandingan TKA konvensional,TDR terhadap VITEK.91 5.7 Kesesuaian TKA konvensional terhadap VITEK.92 5.8 Tipe kesalahan TKA konvensional dan TDR93 5.9 Uji statistik kesesuaian TKA.93 6.1 Perbedaan warna yang sulit diamati pada API..97



xii

DAFTAR GAMBAR 2.1 Contoh strip plastic API....9 2.2 Cara membuka Ampule API medium . .10 2.3 Nampan, tutup nampan, penulisan identitas dan strip API11 2.4 Tube, cupule dan posisi PSIpette...11 2.5 Prosedur pemeriksaan API Staph..14 2.6 Hasil tes kimia positif dan negatif API Staph16 2.7 Contoh lembar hasil API Staph.16 2.8 Prosedur pemeriksaan API 20E24 2.9 Rujukan nilai positif dan negatif API 20E25 2.10 Contoh lembar hasil 20E...26 2.11 Hubungan zona inhibisi dengan MIC30 2.12 Pengambilan isolat bakteri dari kultur..32 2.13 Pembuatan suspensi bakteri..32 2.14 Membandingkan suspensi bakteri dengan standar Mc Farland33 2.15 Memasukkan suspensi bakteri ke media agar Mueller Hinton.33 2.16 Streaking suspensi bakteri dengan swab...........................34 2.17 Pemasangan cakram antibiotika di media agar Mueller Hinton34 2.18 Pengukuran zona inhibisi dengan penggaris.35 2.19 Pengukuran zona inhibisi dengan caliper.....35 2.20 Pengukuran zona inhibisi dengan template...36 2.21 Contoh hasil quality control pada tes kepekaan antibiotika..39 2.22 TDR X060 Automated Blood Culture System.40 2.23 TDR Z 200 Microtube Turbidimetre40 2.24 Kartu reagen TDR.41 2.25 TDR J 100 Automated Dosing System..41 2.26 TDR 300B Microorganism Analysis System...42 2.27 Pemilihan panel identifikasi TDR.43 2.28 Konsentrasi antibiotika pada tes kepekaan antibiotika dengan TDR48 2.29 VITEK 2 Analyzer51 2.30 Contoh kartu GN VITEK 2...51 2.31 Alur pemilihan kartu VITEK 2.53 3.1 Kerangka konseptual60 4.1 Alur kerja pemeriksaan TDR...74 4.2 Alur penelitian..79 5.1 Grafik persentase pertumbuhan bakteri84 5.2 Grafik persentase bakteri berdasarkan Gram84 5.3 Grafik persentase bakteri penyebab..85 6.1 Lokasi udara pada pemipetan TDR...98



xiii

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Informasi untuk disetujui subjek penelitian112 Lampiran 2. Persetujuan menjadi subjek penelitian115 Lampiran 3. Kelaikan etik...116 Lampiran 4. Lembaran pengumpulan data penderita infeksi aliran darah..117 Lampiran 5. Pengumpulan data ..118 Lampiran 6. Penjaminan mutu dengan tes performa...120 Lampiran 7. Hasil tes identifikasi bakteri129 Lampiran 8. Hasil tes kepekaan antibiotika130 Lampiran 9. Analisis statistik..135



xiv

DAFTAR SINGKATAN API = Analytical Profile Index AST = Antimicrobial Susceptibility Test ATCC = American Type Culture Collection CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute DIC = Disseminated Intravascular Coagulation HPLC = High Performance Liquid Chromatography I = Intermediate MIC = Minimal Inhibitory Concentration PCR = Polymerase Chain Reaction R = Resistant S = Susceptible TDR = Technical Dedicated Reasonable TKA = Tes Kepekaan Antibiotika VP = Voges Proskauer WHO = World Health Organization



1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Darah normal bersifat steril dan adanya bakteri dalam darah dikenal sebagai

bakteremia yang biasanya bersifat patologis. Masuknya bakteri ke aliran darah

dapat berakibat serius termasuk renjatan, kegagalan organ, Disseminated

Intravascular Coagulation (DIC), dan kematian. Data World Health Organization

(WHO) menyatakan kematian mencapai 85% pada kasus infeksi di seluruh dunia

pada tahun 2001 (WHO, 2001). Penyakit infeksi dinyatakan menjadi penyebab

kematian sekitar dua juta orang di India setiap tahun (Duggal, 2012). Angka

kematian pada infeksi aliran darah berkisar antara 20 50% (Forbes, 2007). Infeksi

aliran darah di sebelas rumah sakit di Jakarta sekitar 26,4% (Kemenkes,2011).

Kultur darah dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri atau mikroorganisme lain

dalam darah yang dilanjutkan dengan tes kepekaan antibiotika sehingga dapat

ditentukan antibiotika yang lebih tepat (Vanndepitte,2003).

Berbagai metode identifikasi dan tes kepekaan antibiotika dikelompokkan

menjadi metode pemeriksaan genotipe dan fenotipe dengan kelebihan dan

keterbatasan masing-masing. Pemeriksaan secara fenotipe lebih sering dilakukan,

biasanya melalui metode konvensional ataupun automatisasi. Metode identifikasi

konvensional dilakukan melalui metode tes biokimia secara manual atau dengan

media komersial seperti Analytical Profile Index (API). Tes kepekaan antibiotika

konvensional dilakukan melalui metode difusi cakram atau dilusi agar.

Automatisasi dalam identifikasi bakteri dan tes kepekaan antibiotika dibedakan



2

menjadi semiautomatis seperti pada metode Technical Dedicated Reasonable

(TDR)-300B dan metode automatis penuh seperti pada VITEK 2

(Biomerieux,2010; OHara,2005; Forbes,2007; Mindray,2013).

Metode identifikasi dan tes kepekaan antibiotika konvensional tidak

memerlukan peralatan analisis yang harganya mencapai milyaran rupiah sehingga

lebih memungkinkan dilakukan di daerah dengan sumber keuangan terbatas atau

jumlah pemeriksaan yang masih sedikit. Metode ini mungkin memerlukan sumber

daya manusia terlatih yang lebih banyak untuk pembuatan media, tetapi dapat

dikurangi dengan menggunakan media konvensional komersial yang sudah jadi

seperti API. Metode API dari Biomerieux merupakan salah satu metode

konvensional komersial yang sudah luas dipakai dan sudah dipakai sejak lama

yaitu dari tahun 1971. Metode API hanya terbatas untuk pemeriksaan identifikasi

melalui 20 tes biokimia, sehingga untuk tes kepekaan antibiotika dilanjutkan

dengan metode lain (Biomerieux,2010; OHara,2005). Akurasi metode

konvensional API terhadap kuman kontrol, bervariasi dari berbagai studi sekitar

77% - 94,6% (Robinson,1995).

Metode TDR-300B dari Mindray merupakan pemeriksaan semiautomatis

untuk pemeriksaan identifikasi mikroorganisme melalui 20-24 tes biokimia dan tes

kepekaan antibiotika berdasarkan prinsip kolorimetri. Metode ini terdiri dari

beberapa alat yang terpisah sehingga dapat dibeli sesuai dengan kebutuhan

laboratorium. Proses semiautomatis juga akan mengurangi kebutuhan sumber daya

manusia yang terlatih dan jumlah pemeriksaan dapat lebih banyak dari metode

konvensional. Metode ini termasuk metode yang masih relatif baru dengan harga

sedikit lebih murah dari metode automatis penuh. Publikasi uji klinis metode TDR-



3

300B masih belum banyak. Metode automatis penuh seperti VITEK dari

Biomerieux merupakan metode dengan prinsip kolorimetri untuk pemeriksaan

identifikasi melalui tes biokimia dan tes kepekaan antibiotika yang sudah dipakai

lebih lama dari TDR-300B. Akurasi VITEK terhadap kuman kontrol lebih baik,

berkisar 97,8% (OHara,2005) sampai 98,02% (Duggal,2012). Sumber daya

manusia terlatih yang dibutuhkan lebih sedikit, jumlah pemeriksaan yang dapat

dilakukan juga akan lebih banyak, sayangnya metode ini relatif mahal apalagi

untuk daerah dengan keterbatasan sumber daya (Biomerieux,2010;

Mindray,2013).

Daerah perifer biasanya mempunyai keterbatasan sumber daya manusia,

fasilitas dan keuangan sehingga metode pemeriksaan diupayakan membatasi

sumber daya yang digunakan. Metode yang digunakan untuk identifikasi bakteri

dan tes kepekaan antibiotika dipengaruhi beberapa faktor seperti sumber keuangan,

sumber daya manusia yang terlatih, ukuran fisik laboratorium, jumlah

pemeriksaan, dan akurasi. Pemeriksaan patogen infeksi aliran darah secara

genotipe mempunyai keterbatasan biaya yang besar sehingga sulit dilakukan.

Pemeriksaan identifikasi bakteri dan kepekaan antibiotika secara fenotipe relatif

lebih murah dari genotipe. Metode semiautomatis ataupun automatis tidak banyak

memerlukan sumber daya manusia tetapi masih membutuhkan biaya relatif besar

sehingga sulit juga dilakukan bila sumber keuangan masih kurang. Metode

konvensional menjadi alternatif pilihan untuk pemeriksaan identifikasi bakteri dan

tes kepekaan antibiotika bila ada keterbatasan keuangan atau jumlah pemeriksaan

masih sedikit. Metode konvensional mungkin memerlukan sumber daya manusia

lebih banyak untuk pembuatan media, tetapi dapat dikurangi dengan menggunakan



4

media konvensional yang komersial seperti API. (Card,2013; OHara,2005;

Pulidot,2013).

Perbandingan metode konvensional (API dan tes kepekaan antibiotika

konvensional) dengan metode semiautomatis (TDR-300B) dan automatis (VITEK

2) bertujuan untuk mengetahui performa metode konvensional. Perbandingan ini

diharapkan dapat memberi masukan jika mengunakan metode konvensional pada

kondisi keterbatasan keuangan atau memulai pemeriksaan dengan jumlah

pemeriksaan yang masih sedikit. Perbandingan kedua metode ini belum pernah

diteliti sebelumnya. Metode automatis VITEK 2 yang memiliki akurasi lebih baik

(berkisar 97,8% sampai 98,02%) dipakai sebagai metode rujukan untuk melihat

performa metode konvensional dan semiautomatis pada penelitian ini

(Duggal,2012; OHara,2005).

1.2 Rumusan Masalah

1) Bagaimana perbandingan akurasi identifikasi metode konvensional

Analytical Profile Index (API) dengan metode semiautomatis Technical

Dedicated Reasonable (TDR)-300B dalam mengidentifikasi bakteri

dari isolat bakteri kultur darah dengan menggunakan VITEK 2 sebagai

metode rujukan?

2) Bagaimana perbandingan akurasi tes kepekaan antibiotika

konvensional metode difusi cakram antibiotika Kirby Bauer dengan

metode semiautomatis Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B

dalam menilai resistensi bakteri dari isolat bakteri kultur darah dengan

menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan?



5

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

1) Membandingkan akurasi metode konvensional Analytical Profile Index

(API) dengan metode semiautomatis TDR-300B dalam mengidentifikasi

isolat bakteri kultur darah dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode

rujukan.

2) Membandingkan akurasi tes kepekaan antibiotika konvensional difusi

cakram antibiotika Kirby Bauer dengan metode semiautomatis TDR-300B

dalam menilai resistensi bakteri dari isolat bakteri kultur darah dengan

menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan.

1.3.2 Tujuan Khusus

1) Menganalisis akurasi identifikasi isolat bakteri kultur darah metode

konvensional API terhadap metode VITEK 2

2) Menganalisis akurasi identifikasi isolat bakteri kultur darah metode

semiautomatis TDR-300B terhadap metode VITEK 2

3) Menganalisis akurasi kepekaan bakteri terhadap antibiotika dengan metode

konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap VITEK 2

4) Menganalisis akurasi kepekaan bakteri terhadap antibiotika dengan metode

semiautomatis TDR-300B terhadap VITEK 2

5) Membandingkan akurasi metode konvensional API dengan metode

semiautomatis TDR-300B dalam mengidentifikasi bakteri kultur darah

dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan



6

6) Membandingkan akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional

difusi cakram antibiotika Kirby Bauer dengan metode semiautomatis TDR-

300B dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat keilmuan

Meningkatkan wawasan peneliti di bidang Patologi Klinik subdivisi

penyakit infeksi tentang peran identifikasi bakteri dan uji kepekaan

antibiotika

1.4.2 Manfaat terapan

1) Melalui uji kesesuaian identifikasi dan tes kepekaan antibiotika dapat

membantu mencari penyebab infeksi aliran darah sehingga pemberian

antibiotika lebih tepat

2) Menilai kesesuaian metode identifikasi konvensional API dan tes kepekaan

antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer

dengan metode semiautomatis dan metode automatis sebagai pertimbangan

untuk memilih metode yang lebih tepat berdasarkan sumber daya yang ada.



7

Bab 2

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri yang sering sebagai penyebab bakteremia antara lain

Staphylococcus aureus, Escherechia coli, Coagulase Negative Staphylococcus,

Enterococcus sp, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus

viridans, Streptococcus pneumoniae, Enterobacter cloacae, Proteus sp dan beta

hemolitic Streptococcus (Forbes, 2007; Vandepitte, 2003). Metode pemeriksaan

identifikasi bakteri ini secara fenotipe, dapat dilakukan dengan berbagai metode

baik konvensional ataupun automatis (OHara, 2005).

2.1 Identifikasi Bakteri Dengan Metode Analytical Profile Index (API)

Metode Analytical Profile Index (API) merupakan pemeriksaan identifikasi

manual komersial yang mulai dipublikasi pada tahun 1971. Awalnya produk ini

diproduksi oleh Analytab Product Division of American Home Product dan pada

tahun 1986 dibeli oleh Biomerieux. Metode API terdiri dari strip plastik (gambar

2.1) yang tersusun dari tube dan cupules (gambar 2.4). Setiap microtube terisi oleh

substrat yang terdehidrasi untuk tes yang berbeda. Awalnya metode ini diciptakan

oleh Buissiere dan Nardon yang banyak menciptakan metode micromethode dan

dimodifikasi oleh Hartman (Biomerieux, 2010; Smith et al 1972, Leboffe et al,

2011). Metode API dapat memeriksa berbagai bakteri untuk spesifikasi bakteri

tertentu seperti Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus,

Listeria, Yeast, Camylobacter, Listeria, Bacillus dan Neiserria seperti tampak pada

tabel 2.1 (Biomerieux, 2009).



8

Tabel 2.1. Jenis pemeriksaan metode API (Biomerieux, 2009)

Jenis API Mikroorganisme Suspensi Mc Farland

Inkubasi Atmosfer

API 20E Enterobacteriaceae, Batang Gram negatif

non fastidius lain

5mL NaCL 0,85%

1 koloni 370C 18-24 jam

Aerob

Rapid 20E Enterobacteriaceae 5mL NaCL 0,85%

0,5 370C 4 jam

Aerob

API 20S Enterobacteriaceae, Batang Gram negatif

non fastidius lain

5mL NaCL 0,85%

1 koloni 370C 18-24 jam

Aerob

API 20NE Non Enterobacteriaceae, Batang Gram negatif

non fastidius lain

2mL NaCL 0,85%

0,5 370C 24-48 jam

Aerob

API STAPH Staphylococcus, Micrococcus

API Staph medium

0,5 370C 24-48 jam

Aerob

API 20 STREP Streptococcus 2mL API 20 Strep medium

4 370C 24-48 jam

Aerob

API Coryne Corynebacterium sp 3mL medium 6 370C 24 jam

Aerob

Api Listeria Listeria 2mL medium 1 370C 18-24 jam

Aerob

API Candida Yeast 2mL NaCL 0,85%

3 370C 18-24 jam

Aerob

API 20 AUX Yeast 2mL NaCL 0,85%

2 300C 48-72 jam

Aerob

API 20 A Anaerob API 20A medium

3 370C 24 jam

Anaereob

API Campy Campylobacter 3mL NaCL 0,85%

6 370C 24-48 jam

Aerob

API NH Neisseria, Haemophilus

2mL NaCL 0,85%

4 370C 2 jam

Aerob

API 50 CH Bacillus 2mL NaCL 0,85% + medium

2 300C 24-48 jam

Aerob

API 50 CHL Lactobacillus API CHL medium

2 370C 48 jam

Aerob



9

Gambar 2.1. Strip plastik API (Leboffe, 2011)

2.1.1 API Staph

API Staph merupakan metode identifikasi bakteri genus Staphylococcus,

Micrococcus dan Kocuria dengan memakai tes biokimia dalam microtube dan

database yang dimodifikasi. Daftar lengkap bakteri yang dapat diidentifikasi oleh

metode ini, dapat dilihat pada lembar rujukan API. API Staph terdiri dari 20

microtube yang mengandung dehydrated substrat yang akan diinokulasi dengan

suspensi bakteri. Setiap API Staph kit terdiri dari 25 strip API Staph, 25 API Staph

medium dan 25 lembar hasil. Alat dan bahan yang diperlukan untuk identifikasi

bakteri dengan metode ini antara lain strip API Staph, media API Staph, mineral

oil, reagen VP 1 + VP 2, reagen NIT 1 + NIT 2, reagen ZYM A + ZYM B, standar

Mc Farland, pipet atau PSIpettes, rak ampul, dan pelindung ampul

(Biomerieux,2010).

Sebelum digunakan untuk pemeriksaan, sebaiknya diperiksa terlebih dahulu

tanggal kedaluwarsa reagen dan strip, keutuhan kemasan dan komponen, kerusakan

cupule dan desicant. Strip dan media disimpan pada suhu 2-80C sampai tanggal



10

kedaluwarsa. Ampul dibuka dengan mengikuti prosedur sebagai berikut (gambar

2.2):

Gambar 2.2. Dua bentuk ampul dan cara membuka ampule API medium, tekan horizontal dilanjutkan tekan ke bawah (Biomerieux,2010)

1) ampul diletakkan pada ampule protector

2) ampul dipegang dengan satu tangan, dengan posisi vertikal dimana plastic cap

berada di atas

3) tekan cap ke bawah sejauh mungkin, kemudian cap ditutup dengan

bagian atas ibu jari

4) tekankan ibu jari ke secara horizontal setelah ditekan ke bawah

5) ampul dikeluarkan dari protector

6) cap dikeluarkan secara hati-hati (Biomerieux,2010).

Langkah pemeriksaan identifikasi dengan API Staph meliputi persiapan

strip, persiapan inokulum, inokulasi strip, pembacaan dan interpretasi hasil.

Persiapan strip dilakukan dengan menyiapkan kotak inkubasi yang terdiri dari

nampan dan tutup nampan (gambar 2.3). Tutup nampan dibuka, air suling atau

demineralized water (air tanpa zat aditif atau kimia yang dapat melepaskan gas

seperti Cl2, CO2) dimasukkan ke dalam honey comb well nampan untuk

menciptakan suasana lembab. Galur acuan atau identitas dicatat pada nampan,



11

jangan mencatat pada tutup nampan karena dapat tertukar selama pemeriksaan.

Strip diletakkan pada kotak inkubasi (Biomerieux,2010).

Gambar 2.3. Nampan (A), tutup nampan (B), penulisan identitas (C) dan Strip API (D) (dimodifikasi dari Darbandi,2010)

Gambar 2.4. Satu microtube, Tube (A), Cupule (B), dan PSIpette (C) ( dimodifikasi dari Biomerieux, 2010)



12

Isolat bakteri yang dipakai merupakan subkultur bakteri pada media

Columbia Blood Agar yang berumur 18-24 jam yang diinkubasi pada suhu 360C

20C. Isolat bakteri diperiksa secara morfologi, kemurnian isolat, pengecatan Gram,

dan uji katalase untuk menentukan apakah termasuk Micrococcaeae. Isolat bakteri

yang murni diambil dan dibuat suspensi bakteri 0,5 Mc Farland dengan melarutkan

isolat ke media API Staph. Pembuatan suspensi bakteri ini harus menggunakan

kultur yang berumur 18-24 jam. Suspensi bakteri digunakan segera setelah dibuat

(Biomerieux,2010).

Suspensi bakteri yang telah dibuat tersebut, diinokulasikan ke strip API

Staph dengan menggunakan pipette atau PSIpette. Microtube diisi tetapi cupule

jangan sampai terisi suspensi bakteri (gambar 2.4). Usahakan jangan sampai

terbentuk gelembung udara pada tube dengan cara strip dimiringkan sedikit ke

depan dan ujung tip pipette diletakkan pada sisi cupule. Tes untuk ADH dan URE

ditambahkan mineral oil untuk membuat suasana anaerob sampai terbentuk convex

meniscus. Tes kimia pada API Staph dapat dilihat pada tabel 2.2. Nampan dengan

ditutup dengan tutup nampan dan diinkubasi pada suhu 360C 20C selama 18-24

jam (Biomerieux,2010).

Pembacaan strip dilakukan setelah inkubasi selama 18-24 jam tersebut.

Beberapa tes kimia memerlukan penambahan satu tetes reagen sebagai berilut:

Tes VP : ditambahkan reagen VP 1 dan VP2, ditunggu 10 menit, reaksi

positif memperlihatkan warna violet merah muda. Reaksi yang

memperlihatkan warna merah muda pucat atau merah muda

terang setelah 10 menit dianggap negatif

Tes NIT : ditambahkan reagen NIT 1 dan NIT 2, ditunggu selama 10 menit,



13

warna merah menunjukkan reaksi positif

Tes PAL : ditambahkan reagen ZYM A dan ZYM B, ditunggu selama 10

menit. Warna violet menunjukkan reaksi positif.

Tes resistensi terhadap Lysostaphin dikerjakan untuk mengisi hasil tes ke-

21 jika diperlukan. Inokulasi permukaan P agar dengan suspensi bakteri, dibiarkan

kering pada suhu 360C20C selama 10 20 menit. Kemudian ditambahkan dengan

satu tetes larutan Lysostaphin (200 g/mL) dan diinkubasi pada suhu 350C-370C

selama 18-24 jam. Sussceptible menunjukkan adanya lisis parsial. Hasil tes positif

dan negatif dapat dilihat pada gambar 2.6. Prosedur kerja dilihat pada gambar 2.5

(Biomerieux,2010).

Identifikasi bakteri diperoleh melalui profil angka. Lembar hasil tes terdiri

dari tiga kelompok microtube yang berisi angka 1,2 dan 4. Hasil positif dijumlahkan

sehingga diperoleh tujuh digit angka (pada gambar 2.7 tujuh digit angka tersebut

adalah 6706113). Tujuh digit angka tersebut kemudian dicocokkan dengan tabel

profil atau dapat dimasukkan hasil positif dan negatif ke apiwebTM. Program

pemantapan mutu internal untuk metode API Staph dianjurkan dengan menilai

performa metode API Staph dalam mengidentifikasi kuman kontrol. Kuman kontrol

yang direkomendasikan untuk metode API Staph adalah Staphylococcus xylosus

ATCC (American Type Culture Collection) 700404, Staphylococcus lentus ATCC

700403, Staphylococcus capitis ATCC 35661 (Biomerieux, 2006,

Biomerieux,2010)

2.1.2 API 20 Strep

API 20 Strep mempunyai 20 tes biokimia (tabel 2.3.) yang mempunyai

kemampuan mengidentifikasi bakteri Streptococcus dan Enterococcus yang luas.



14

Strip API 20 Strep terdiri dari miniotube yang berisi dehydrated substrate untuk

memperlihatkan aktivitas enzim atau fermentasi gula. Reaksi enzimatik

memerlukan suspensi bakteri dengan tingkat kekeruhan yang pekat dan berasal dari

koloni yang murni.

Gambar 2.5. Ringkasan pemeriksaan dengan API Staph (Biomerieux,2010)

Kultur pada blood agar

Kokus Gram +,

katalase +

Tes

resistensi

terhadap

Lysostaphin



15

Tabel 2.2. Tes biokimia pada API Staph (Biomerieux,2010)

Test Komposisi Reaksi Hasil Negatif Positif

0 Tanpa substrat Kontrol negatif Merah - GLU D-glukosa Kontrol positif Merah Kuning FRU D-Fruktosa Fermentasi

fruktosa Merah Kuning

MNE D-Manosa Fermentasi mannosa

Merah Kuning

MAL D-Maltosa Fermentasi maltosa Merah Kuning

LAC D-laktosa Fermentasi laktosa Merah Kuning TRE D-trehalosa Fermentasi

trehalosa Merah Kuning

MAN D-manitol Fermentasi manitol Merah Kuning XLT Xylitol Fermentasi xylitol Merah Kuning MEL D-melibiose Fermentasi

melibiose Merah Kuning

NIT Potassium nitrate Reduksi nitrat menjadi nitrit

Pucat-merah muda pucat

Merah

PAL Naphthyl phosphate

Alkaline phosphatase

Kuning Violet

VP Sodium pyruvate Produksi Acetyl methyl carbinol

(VP)

Tidak berwarna merah muda

pucat

Violet-merah muda

RAF D-rafinose Fermentasi raffinosa

Merah Kuning

XYL D-xylose Fermentasi xylosa Merah Kuning SAC D-saccharose Fermentasi

saccharosa Merah Kuning

MDG Methyl D-glucopyranoside

Fermentasi methyl D-

glucopyranoside

Merah Kuning

NAG N acethyl glucosamine

Fermentasi N acethyl

glucosamine

Merah Kuning

ADH L-Arginine Arginine dihydrolase

Kuning Oranye-merah

URE Urea Urease Kuning Merah-violet



16

Gambar 2.6. Hasil tes kimia positif (bawah) dan negatif (atas) pada API Staph (Biomerieux,2002).

Gambar 2.7. Lembar hasil API Staph (Biomerieux,2010)

Proses metabolisme selama inkubasi akan memerlukan suspensi bakteri dengan

tingkat kekeruhan yang pekat dan berasal dari koloni yang murni. Proses

metabolisme selama inkubasi akan menghasilkan perubahan warna pada substrat

baik terjadi secara spontan ataupun setelah penambahan reagen tambahan. Tes

fermentasi substrat gula menggunakan rehydrated sugar substrate, dimana reaksi

dinilai berdasarkan perubahan pH. Hasil dibaca berdasarkan reading table dan hasil

identifikasi ditentukan berdasarkan profile index atau melalui software

(Biomerieux, 2006, Biomerieux, 2007).



17

Setiap API 20 Strep kit berisi masing-masing 25 strip API Strep, kotak

inkubasi, dan lembar hasil. Reagen dan peralatan lain yang dibutuhkan tetapi tidak

termasuk dalam kit adalah reagen VP1,VP2, ZYM A, ZYM B, NIN, mineral oil,

standar 4 Mc Farland, API profile index atau apiweb identification software.

Peralatan yang digunakan pada metode ini antara lain swab, pipette, ampule rack,

ampule protector, anaerobic jar, dan peralatan laboratorium mikrobiologi lainnya.

Sebelum digunakan untuk pemeriksaan, sebaiknya diperiksa terlebih dahulu

tanggal kedaluwarsa reagen dan strip, keutuhan kemasan dan komponen, kerusakan

cupule dan desicant. Strip dan media disimpan pada suhu 2-80C sampai tanggal

kedaluwarsa. Ampul dibuka dengan mengikuti prosedur seperti gambar 2.2


Strip API Strep disiapkan sama seperti pada strip API Staph, tutup nampan

dibuka dan dipisahkan dari nampan. Air suling atau demineralized water (air tanpa

zat aditif atau zat kimia yang dapat melepaskan gas seperti Cl2, CO2) dimasukkan

ke dalam honey comb well nampan untuk menciptakan suasana lembab. Referensi

strain atau identitas dicatat pada nampan, jangan mencatat pada tutup nampan

karena dapat tertukar selama pemeriksaan (gambar 2.3 dan gambar 2.4). Strip API

Strep kemudian diletakkan pada kotak inkubasi. (Biomerieux,2006; Biomerieux,

2007).

Isolat bakteri yang dipakai merupakan subkultur bakteri pada media

Columbia Blood Agar yang berumur 18-24 jam yang diinkubasi pada suhu 360C

20C ( haemolytic Streptococcus dan Enterococci) atau 48 jam untuk Streptococcus

sp lainnya dalam suasana anaerob.



18

Tabel 2.3 Tes biokimia pada API 20 Strep (Biomerieux, 2006, Biomerieux, 2007)

Test Komposisi Reaksi/Enzim Hasil Negatif Positif

VP Sodium pyruvate

Produksi acetoin

Tak berwarna Merah muda-merah

HIP Hippuric acid Hidrolisis (Hippuric acid)

Tak berwarna, pucat kebiruan/

kehijauan

Biru gelap/ Ungu

ESC Esculin ferric citrate

-glucosidase hydrolysis

4 jam 24 jam 4 jam 24 jam

Tak berwarna, kuning

pucat

Tak berwar

na, kuning pucat, hijau

terang

Hitam, abu-abu

Hitam

PYRA Pyroglutamic acid-

napthylamide

Pyrrolidonyl arylamidase

Tak berwarna, pucat

Oranye

GAL 6-bromo-2-naphtyl

Dgalactopyranoside

Galactosidase

Tak berwarna Oranye

GUR NaphtholASBI-glucoronic

Glucoronidase Tak berwarna Biru

GAL 2-napthyl D galactopyrano

side

Galactosidase

Tak berwarna, pucat

Ungu

PAL 2 napthyl phosphate

Alkaline phosphatase

Tak berwarna, pucat

Ungu

LAP L leucine napthylamide

Leucine aminopeptidase

Tak berwarna Oranye

ADH L arginine Arginine dihydolase

Kuning Merah

4 jam 24 jam 4 jam 24 jam RIB D ribose acidificaation Merah Oranye

-merah Oranye/ kuning

Kuning

ARA L arabinose acidification Merah Oranye-merah

Oranye/ kuning

Kuning

MAN D manitol acidification Merah Oranye-merah

Oranye/ kuning

Kuning

SOR D sorbitol acidification Merah Oranye- merah

Oranye/ kuning

Kuning



19

Lanjutan tabel 2.3

Test Komposisi Reaksi/Enzim Hasil Negatif Positif

4 jam 24 jam 4 jam 24 jam LAC D lactose acidification Merah Oranye-

merah Oranye/ kuning

Kuning

TRE D trehalose acidification Merah Oranye- merah

Oranye/ kuning

Kuning

INU Inulin acidification Merah Oranye- merah

Oranye/ kuning

Kuning

RAF D raffinose acidification Merah Oranye- merah

Oranye/ kuning

Kuning

AMD Starch acidification Merah Oranye- merah

Oranye/ kuning

Kuning

GLYG Glycogen acidification Merah Oranye- merah

Oranye/ kuning

Kuning

Bakteri fastidious dikultur pada Schaedler broth pada 360C 20C selama 5 jam

kemudian seluruh koloni digenangkan di Columbia Blood Agar dan diinkubasi lagi

selama 18-24 jam. Isolat bakteri yang murni diambil dan dibuat suspensi bakteri

dengan kekeruhan lebih dari 4 Mc Farland dengan melarutkan isolat ke media API

Strep (volume 2 mL). Suspensi bakteri digunakan segera setelah dibuat


Suspensi bakteri diinokulasikan dahulu ke tes VP, HIP, ESC, PYRA,

GAL, GUR, GAL, PAL, LAP, dan ADH. Diusahakan agar tidak terbentuk

gelembung udara. Tes VP sampai LAP diinokulasi sekitar 100L. Untuk tes RIB,

ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD, dan GLYG disiapkan suspensi

baru. Ampule API GP medium dibuka, dan semua sisa suspensi bakteri dimasukkan

ke dalamnya dan dicampur secara merata. Suspensi baru ini kemudian

diinokulasikan ke tes tersebut untuk mengisi bagian tube saja, cupule tidak terisi



20

suspensi. Tes yang ditandai dengan tanda garis bawah ( ADH sampai GLYG)

diberi mineral oil sampai terbentuk meniskus yang konveks. Nampan kemudian

ditutup dan diinkubasi pada suhu 360C 20C selama 4 4,5 jam dalam suasana

aerob. Strip kemudian dibaca, jika bakteria belum teridentifikasi maka dilanjutkan

dengan inkubasi kedua selama 24 jam 2 jam untuk pembacaan kedua


Setelah inkubasi 4 jam, maka ditambahkan 1 tetes reagen VP1 dan VP2

untuk tes VP, 2 tetes reagen NIN untuk tes HIP, serta masing-masing satu tetes

reagen ZYM A dan ZYM B untuk tes PYRA, GAL, GUR, GAL, PAL, dan

LAP. Hasil dibaca dengan memasukkan data ke apiweb. Inkubasi ulang dikerjakan

jika hasil bacaan apiweb pada inkubasi pertama low discrimination,

unacceptable, doubtful atau not valid. Inkubasi kedua ini untuk membaca

tes ESC, ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD dan GLYG.

Reaksi enzimatik tidak boleh dibaca ulang. Program pemantapan mutu metode ini

direkomendasikan menggunakan kuman kontrol Streptococcus equi spp

zooepidemicus ATCC 700400 atau Streptococcus uberis ATCC 700407

(Biomerieux,2006; Biomerieux, 2007).

2.1.3 API 20 E

API 20 E merupakan metode pemeriksaan bakteri untuk batang Gram

negatif golongan Enterobacteriaceae dan non fastidius lainnya. Strip API 20 E

terdiri dari 20 compartment microtube untuk tes biokimia. Bahan kimia yang

dipakai untuk tes biokimia pada microtube API 20 E tampak seperti tabel 2.4

(OHara,2005; Biomeriux,2008;2009;2010;Darbandi,2010).



21

Tabel 2.4. Tes biokimia dan reaksi substrat pada API 20E (Biomeriux,2010)


ONPG 2 Nitrophenyl D Galactopyranoside

Ortho Nitrophenyl D Galactopyranosidase

Tidak berwarna

Kuning

ADH L-Arginine Arginine Dihydrolase Kuning Merah-orange LDC L-Lysin Lysine Decarboxilase Kuning Merah-Orange ODC L-Ornithin Ornithine decarboxilase Kuning Merah-Orange [CIT] Trinatriumcitrat Citrate utilization Hijau-kuning

pucat Hijau kebiruan-

biru H2S Natriumthiosulfat Produksi H2S Tidak

berwarna-kehijauan

Deposit hitam

URE Urea Urease Kuning Merah-orange TDA L-Tryptophane Trypthophane deaminase Kuning Cokelat

kemerahan IND L-Tryptophane Produksi indol Tidak

berwarna-hijau pucat- kuning

pucat

Merah muda

[VP] Natriumpyruvat Produksi acetoin Tidak berwarna-

merah muda pucat

Merah muda-merah

[Gel] Gelatin Gelatinase Tidak ada difusi

Pigmen hitam

Glu D-glukosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning kuning

kehijauan Man D-manitol Fermentasi-oksidasi Biru-biru

kehijauan

Kuning

INO Inositol Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning

SOR D-sorbitol Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning

RHA L-Rhamnosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning

SAC D-sakarosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning

MEL D-melibiosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning

AMY Amygdalin Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning

ARA L-arabinosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru kehijauan

Kuning

OX Tes oksidase (tidak termasuk

dalam paket)

Cytochrome-oksidase



22

Metode ini memerlukan beberapa reagen dan material lain yang tidak termasuk

dalam paket seperti medium API NaCl 0.85 %, API Suspension Medium, API 20 E

reagent kit, JAMES, VP 1 + VP 2, NIT 1 + NIT 2, reagen Zn , oksidase, mineral

oil, dan API Web identification software (Biomerieux,2010)

Sebelum melakukan pemeriksaan, sebaiknya diperiksa tanggal

kedaluwarsa, perubahan bentuk cupule, keutuhan kemasan dan kemasan desiccant.

Pemakaian strip yang mengalami kerusakan akan mempengaruhi hasil analisis.

Prosedur pemeriksaan harus diikuti dan interpretasi dibuat dengan memperhatikan

riwayat penderita, jenis spesimen dan pemeriksaan mikroskopik morfologi isolat.

Strip dikemas dalam kemasan clip seal aluminium dengan desiccant sachet, strip

disimpan pada suhu 2-80C dan tahan sampai 10 bulan setelah kemasan aluminium

dibuka. API 20 E tidak dapat digunakan untuk memeriksa spesimen secara

langsung. Bakteri yang akan diidentifikasi harus diisolasi dahulu di media kultur.

Prosedur identifikasi bakteri dengan API 20 E dapat dilihat pada gambar 2.3

(Biomerieux,2010).

Sebelum membuat suspensi bakteri, terlebih dahulu dilakukan tes oksidase.

Hasil tes oksidase akan dimasukkan ke lembar hasil akhir. Secara garis besar

langkah pemeriksaan meliputi persiapan strip tes API, persiapan inokulum dan

inokulasi strip API. Setiap strip API terdiri dari nampan inkubasi (tray) dan

tutupnya (lid). Honey combed dalam nampan diisi dengan 5 mL distilled water atau

demineralized water untuk membuat suasana lembab. Identitas penderita ditulis di

nampan dan sebaiknya jangan menulis identitas pada tutup nampan karena dapat

tertukar. Nampan (tray) dan tutup nampan (lid) serta penulisan identitas dapat

dilihat pada gambar 2.3 (Biomerieux,2010).



23

Inokulum disiapkan dengan membuka ampul media API (NaCl 0,85% 5 mL) atau

dapat juga menggunakan 5 mL saline atau distiled water steril dalam tabung steril.

Isolat bakteri tunggal yang terisolasi dengan baik kemudian diemulsikan ke dalam

tabung tersebut dengan menggunakan PSIpette atau ose steril. Isolat bakteri

diemulsikan secara hati-hati sehingga diperoleh suspensi bakteri yang homogen.

Isolat bakteri yang dipakai adalah isolat yang berumur 18-24 jam. Suspensi bakteri

ini segera diinokulasikan ke strip API 20 E dengan menggunakan pipette.

Diusahakan agar tidak terbentuk gelembung udara pada microtube, nampan

dimiringkan dan microtube diisi dengan menempatkan ujung pipette pada sisi

cupule. Tes ADH, LDC, ODC, H2S dan URE diisi inokulum bakteri hanya pada

tube kemudian bagian cupule diisi mineral oil untuk menciptakan suasana anaerob.

Tes [CIT], [VP] dan [GEL] diisi suspensi bakteri pada tube dan cupule. Tes yang

lain diisi inokulum bakteri hanya pada tube (Biomerieux,2010; Smith,1972;

Darbandi,2010).

Setelah semua microtube pada strip diinokulasi dengan suspensi bakteri,

nampan ditutup dan diinkubasi pada suhu 360C 2 selama 18-24 jam. Strip dibaca

dengan merujuk pada warna rujukan API 20 E (gambar 2.9). Jika tiga atau lebih tes

hasilnya positif, catat hasil spontan pada lembar hasil (gambar 2.10) dan lanjutkan

tes yang memerlukan reagen tambahan seperti pada tes:

Tes TDA : tambahkan 1 tetes reagen PDA, hasil positif berwarna cokelat

kemerahan

Tes IND : tambahkan 1 tetes reagen James, reaksi positif menunjukkan warna

merah muda. Tes indol harus dikerjakan paling akhir

karena dapat memproduksi gas yang dapat mengganggu tes lainnya.



24

Gambar 2.8. Prosedur pemeriksaan dengan API 20 E (Biomerieux,2002)

Satu koloni

Tes positif

kurang

dari 3



25

Gambar 2.9. Rujukan nilai positif dan negatif API 20 E (Biomerieux,2002).

Tes VP : tambahkan masing-masing 1 tetes reagen VP 1 dan VP 2 , ditunggu

selama 10 menit. Reaksi positif menunjukkan warna merah muda

atau merah. Warna merah muda yang pucat setelah 10 menit

memungkinkan reaksi yang negatif.

Interpretasi hasil identifikasi dilakukan dengan memasukkan hasil tes

positif atau negatif ke lembar hasil (gambar 2.10). Lembar hasil terdiri dari

kelompok tes yang setiap kelompok berisi tiga jenis tes. Setiap tes mempunyai nilai

1, 2 atau 4. Nilai pada kelompok yang terdiri dari tiga tes tadi dijumlahkan, sehingga

diperoleh tujuh digit angka yang menunjukkan profile bakteri (gambar 2.10 angka

itu 5315173). Identifikasi bakteri profile tersebut dicocokkan dengan tabel profile

atau dapat disesuaikan dengan apiweb software. tujuh digit angka tersebut tidak

cukup untuk identifikasi bakteri pada beberapa kasus, sehingga diperlukan tes

tambahan seperti reduksi nitrat, adanya gas N2, motility (MOB), growth on Mc



26

Conkey (McC), oksidasi glukosa (OF-O), fermentasi glukosa (OF-F)

(Biomerieux,2010).

Tes reduksi nitrat menjadi nitrit (NO2) dan produksi gas N2 dilakukan

dengan menambahkan reagen NIT 1 dan NIT 2 ke cupule glukosa kemudian

ditunggu 2-5 menit. Warna merah menunjukkan reaksi nitrit positif sedangkan

warna kuning menunjukkan reaksi negatif. Reduksi menjadi gas N2 diperiksa

dengan menambahkan 2-3 mg reagen Zn ke cupule glukosa, setelah 5 menit dan

warna tetap kuning menunjukkan reaksi N2 positif. Warna jingga-merah

menunjukkan reaksi N2 negatif, nitrat masih ada di cupule setelah direduksi oleh

Zn (Biomerieux,2010). Tes motility dikerjakan dengan inokulasi bakteri pada

media API M, pertumbuhan di media Mc Conkey, media OF-O dan OF-F juga

dikerjakan sehingga diperoleh sembilan digit angka (Biomerieux,2010).

Gambar 2.10. Contoh kertas hasil tes API 20 E (Biomerieux,2010)

Program pemantapan mutu metode ini dilakukan dengan menilai performa

metode terhadap kuman kontrol yang dilakukan sesuai dengan instruksi. Beberapa

kuman kontrol yang direkomendasikan antara lain Proteus mirabilis ATCC 35659,

Stenotrophomonas malthophilia ATCC 51331, Enterobacter cloacae ATCC

13047, Eschericia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumonia ssp pneumoniae ATCC

35657 (Biomerieux,2010).



27

2.1.4 API 20NE

Strip API 20NE merupakan sistem identifikasi batang Gram negatif non

enterik dan non fastidious seperti Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium,

Moraxella, Vibrio, Aeromonas dan lain sebagainya. Strip terdiri dari 20 buah

microtube yang mengandung dehydrated substrate untuk tes biokimia. Substrat ini

diinokulasi dengan suspensi bakteri dalam larutan salin sehingga proses

metabolisme akan menghasilkan perubahan warna yang terjadi secara spontan

ataupun setelah ditambahi dengan reagen tambahan. Setiap kit API 20NE terdiri

dari masing-masing 25 buah strip API 20NE, kotak inkubasi, API AUX medium,

dan lembar hasil. Reagen tambahan yang tidak termasuk dalam kit antara lain API

medium, reagen James, reagen NIT 1 + NIT2, dan reagen Zn. Tes biokimia yang

digunakan pada API 20NE dapat dilihat di tabel 2.5 (Biomerieux,2009;

Biomerieux,2010).

Pemeriksaan dengan API 20E, didahului dengan tes oksidase. Hasil tes

oksidase ini akan dimasukkan ke lembar hasil akhir. Secara garis besar langkah

pemeriksaan meliputi persiapan strip tes API, persiapan inokulum, inokulasi strip

API dan interpretasi hasil. Honey comb dalam nampan diisi dengan 5 mL distilled

water atau demineralized water untuk membuat suasana lembab. Identitas penderita

ditulis di nampan dan sebaiknya jangan menulis identitas di tutup nampan karena

dapat tertukar. Persiapan inokulum juga sama dengan API 20E, dimana dibuat

suspensi bakteri dengan memasukkan isolat ke API medium. Kekeruhan suspensi

bakteri dibuat 0,5 Mc Farland. (Biomerieux,2009;Biomerieux,2010).

Inokulasi suspensi bakteri dilakukan secara hati-hati dan diusahakan agar

tidak terbentuk gelembung udara. Inokulasi tes NO3 sampai PNPG dilakukan dulu.



28

Tabel 2.5. Tes biokimia pada API 20NE (Biomerieux,2010)


NO3 Potassium nitrate Reduksi nitrat menjadi nitrit

Tak berwarna

Merah muda- merah

Reduksi nitrat menjadi nitrogen

Merah muda Tak berwarna

TRP L trypthophan Produksi indol Tak berwarna,

pucat kehijauan/ kekuningan

Merah muda

GLU D glucose fermentasi Biru-hijau Kuning ADH L arginine Arginine dihydrolase Kuning Oranye/merah

muda/merah

URE Urea Urease Kuning Oranye/merah muda/merah

ESC Esculine ferric citrate

Hidrolisis esculine Kuning Abu-abu/ cokelat/ hitam

GEL Gelatin Hidrolisis gelatin Tanpa pigmen

Pigmen hitam

PNPG 4-nitrophenyl D galactopyranoside

galactosidase Tak berwarna

Kuning

[GLU] D glucose asimilasi Transparan Opaq [ARA] Larabinose asimilasi Transparan Opaq [MNE] D mannose asimilasi Transparan Opaq [MAN] D mannitol asimilasi Transparan Opaq [NAG] N acethyl

glucosamine asimilasi Transparan Opaq

[MAL] D maltose asimilasi Transparan Opaq [GNT] Potassium

gluconate asimilasi Transparan Opaq

[CAP] Capric acid asimilasi Transparan Opaq [ADI] Adiptic acid asimilasi Transparan Opaq [MLT] Malic acid asimilasi Transparan Opaq [CIT] Trisodium citrate asimilasi Transparan Opaq [PAC] Phenylacetic acid asimilasi Transparan Opaq



29

Sisa 200 L suspensi bakteri kemudian dimasukkan ke API AUX Medium dan

dihomogenkan. Suspensi yang baru dibuat ini kemudian diinokulasikan ke tes

[GLU] sampai [PAC]. Tes ini diisi sampai cupule sampai sedikit konveks dan tidak

boleh konkaf. Tambahkan mineral oil sampai cupule pada tes GLU, ADH, dan

URE. Strip diinkubasi pada 290C 20C selama 24 jam (Biomerieux,2010).

2.2 Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional

Tes kepekaan antibiotika dilakukan untuk menilai kemampuan antibiotika

untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme secara in vitro. Kemampuan ini

dinilai melalui metode dilusi dan difusi. Metode dilusi menilai kemampuan

antibiotika secara kuantitatif dengan melakukan pengenceran terhadap antibiotika

dalam media broth atau agar. Konsentrasi minimal antibiotika yang dapat

menghambat pertumbuhan mikroorganisme setelah diinkubasi selama satu malam

dikenal sebagai Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Nilai MIC ini kemudian

dibandingkan dengan konsentrasi obat tersebut dalam serum untuk menilai respon

klinis (Forbes,2007;Vandepitte,2003). Metode yang akan dipakai dalam penelitian

ini adalah metode konvensional dengan tes difusi cakram antibiotika .

2.2.1 Tes difusi cakram antibiotika Kirby Bauer

Metode ini menggunakan kertas cakram antibiotika dalam konsentrasi

tertentu yang diletakkan di atas media agar Mueller Hinton. Media ini

diinokulasikan dulu dengan mikroorganisme yang akan diuji. Gradien konsentrasi

antimikroba yang terbentuk oleh difusi dari cakram antibiotika dan hambatan

pertumbuhan mikroorganisme dalam jarak tertentu dari cakram antibiotika (zona

hambatan) akan menentukan tingkat kepekaan mikroorganisme tersebut terhadap



30

antibiotika yang diujikan. Hubungan nilai zona hambatan (metode difusi) dengan

MIC (metode dilusi) dalam menentukan respon klinis sebagai sensitif, intermediate

dan resisten dapat dilihat pada gambar 2.11 (Forbes,2007;Vandepitte,2003) .

Gambar 2.11. Contoh hubungan interpretasi Minimal Inhibitory Concentration/MIC (sumbu X) dengan diameter zona hambatan (sumbu Y), semakin besar zona hambatan (S >27mm) pada

sumbu Y, berbanding terbalik dengan semakin kecilnya MIC (S

31

tambahan yang khusus di suatu tempat karena adanya endemik atau epidemik strain

yang resisten terhadap beberapa obat primer, terapi penderita yang alergi, terapi

organisme yang tidak biasanya seperti Salmonella pada infeksi ekstraintestinal.

Grup U (Urine) merupakan antimikroba yang khusus atau primer digunakan untuk

pengobatan infeksi saluran kencing seperti Nitrofurantoin dan Quinolone.

Antimikroba ini seharusnya tidak dilaporkan rutin untuk infeksi selain infeksi

saluran kencing (Forbes,2007;Vandepitte,2003,Patel,2015).

Selain cakram antibiotika, metode ini juga membutuhkan beberapa

peralatan dan bahan lain seperti standar kekeruhan Mc Farland, cotton swab steril

dan media agar Mueller Hinton. Standar kekeruhan dapat dibeli atau dibuat dengan

menuangkan 0,6 mL larutan Barium klorida dihidrat 1% ke dalam graduated

cylinder dan ditambahkan dengan asam sulfat 1% sampai volume menjadi 100 mL.

Standar ini dituangkan ke tabung seperti tabung untuk broth agar dan disimpan

dalam kondisi tertutup di tempat gelap di suhu ruang. Standar ini dapat bertahan

selama 6 bulan. Cotton swab steril diperlukan untuk melakukan pulasan bakteri

yang diuji ke media lempeng agar Mueller Hinton. Media Mueller Hinton plate

agar dibuat dari dehydrated based sesuai dengan instruksi pabrik. Ketebalan media

sekitar 4 mm, dengan volume media kurang lebih 25-30 mL pada plate dengan

diameter 10 cm. Performa media plate ini dinilai dengan menanamkan kuman

kontrol (Patel,2015).

Inokulum disiapkan dari kultur plate primer di mana isolat bakteri yang

diuji diambil dengan sengkelit (gambar 2.12). Sengkelit disterilkan dengan dibakar

terlebih dahulu. Koloni yang diambil adalah koloni yang tampak serupa supaya

isolat yang didapatkan murni. Isolat kemudian dipindahkan ke tabung yang berisi



32

salin (gambar 2.13). Sengkelit yang berisi bakteri disuspensikan secara merata di

tabung salin.

Gambar 2.12. Pengambilan isolat bakteri dari kultur plate primer (http://www.123rf.com/stock-photo/bacteria_culture.html)

Suspensi bakteri yang telah dibuat, diperiksa kekeruhannya dengan

membandingkan dengan standar turbidity yang telah dibuat (gambar 2.14).

Sesuaikan kekeruhan suspensi bakteri dengan menambahkan isolat bakteri atau

menambahkan salin steril. Kekeruhan inokulum dapat mempengaruhi hasil tes

(Vandepitte,2003).

Gambar 2.13. Pembuatan suspensi bakteri dengan sengkelit (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)



http://www.123rf.com/stock-photo/bacteria_culture.html

33

Gambar 2.14. Membandingkan kekeruhan suspensi bakteri dengan

standar Mc Farland dengan latar belakang warna hitam (Vandepitte,2003)

Gambar 2.15. Memindahkan suspensi bakteri ke plate dengan cotton swab (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)



34

Gambar 2.16. Streaking dengan cotton swab (http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/engl/pract1.htm)

Gambar 2.17. Pemasangan cakram antibiotika pada plate (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)

Lempeng agar Mueller Hinton diinokulasi bakteri dengan cara mencelupkan swab

steril ke tabung suspensi bakteri. Kelebihan inokulum dikurangi dengan cara

menekankan dan memutar swab di sisi tabung (gambar 2.15). Ulasan dilakukan

secara merata di permukaan media Mueller Hinton sebanyak tiga kali, putar plate

600 setiap habis aplikasi. Terakhir usapkan swab pada pinggir plate (gambar 2.16).



35

Gambar 2.18. Pengukuran zona hambatan dengan penggaris (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)

Gambar 2.19. Pengukuran zona hambatan dengan calipers (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)



36

Gambar 2.20. Pengukuran zona hambatan dengan template (atas) dan interpretasi template (bawah) (Vandepitte,2003)

Cakram antibiotika ditempelkan di permukaan agar, inokulasi dengan

menggunakan forceps steril (gambar 2.17). Jumlah cakram antibiotika yang

digunakan pada tes kepekaan antibiotika disesuaikan dengan pedoman CLSI yaitu

maksimal 12 cakram pada plate dengan diameter 150 mm atau 6 cakram pada plate

dengan diameter 100 mm. Plate yang sudah berisi cakram antibiotika yang diuji ini

ditempatkan dalam inkubator selama 16-20 jam pada suhu 350C. Diameter zona

hambatan diukur setelah inkubasi dengan menggunakan penggaris atau calipers

atau template (gambar 2.18 ;2.19; dan 2.20). Nilai yang didapat disesuaikan dengan

pedoman dari CLSI (Forbes,2007; (Vandepitte,2003;Patel,2015).



37

Interpretasi hasil tes kepekaan antibiotika dikategorikan menjadi sensitif,

intermediate dan resisten. Sensitif menunjukkan suatu mikroorganisme penyebab

infeksi yang masih berespon terhadap terapi antibiotika dalam dosis yang

dianjurkan. Intermediate di mana respon isolat dengan antibiotika pada konsentrasi

Minimal Inhibitory Concentration (MIC) yang biasanya mencapai darah atau

jaringan, mempunyai respon lebih buruk dibandingkan isolat yang sensitif.

Efektivitas klinis tercapai di bagian tubuh di mana obat terkonsentrasi secara

fisiologi (misalnya Quinolone atau Beta lactam pada urine) atau dengan

memberikan dosis yang lebih besar sampai dosis maksimal. Resisten di mana

mikroorganisme tidak dihambat oleh antibiotika dosis normal dan atau dosis MIC,

diameter zona hambatan tidak masuk dalam rentang yang diakibatkan oleh

mekanisme resistensi yang spesifik terhadap antibiotika tersebut (Patel,2015).

Faktor yang mempengaruhi diameter zona hambatan di metode difusi

cakram antara lain kekeruhan inokulum, keterlambatan pemasangan cakram

antibiotika, suhu inkubasi, lama inkubasi, ukuran plate, ketebalan media agar, jarak

antara cakram antibiotika di plate, potensi cakram antibiotika dan komposisi media.

Kekeruhan inokulum yang rendah dapat menyebabkan zona hambatan yang lebih

besar sehingga strain akan relatif lebih sensitif. Begitu juga, jika densitas inokulum

lebih pekat dapat menyebabkan strain nampak lebih resisten. Keterlambatan

pemasangan cakram antibiotika dapat menyebabkan inokulum bakteri

memperbanyak diri sehingga zona hambatan menjadi lebih kecil dan strain akan

relatif lebih resisten. Suhu yang lebih rendah dari 350C akan menyebabkan waktu

yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri akan lebih lama sehingga zona



38

hambatan dapat lebih besar. Dampak dari hal ini akan menyebabkan strain nampak

lebih sensitif (Forbes,2007;Vandepitte,2003).

Waktu inkubasi yang kurang dari 16 jam akan mempengaruhi pertumbuhan

efektif bakteri sehingga tidak direkomendasikan untuk dilakukan. Diameter plate

yang digunakan juga akan berpengaruh terhadap jumlah maksimal cakram

antibiotika yang dapat dipasang. Jika cakram yang dipasang melebihi kapasitas

plate maka akan mempengaruhi zona hambatan yang terbentuk. Ketebalan media

agar juga dapat berpengaruh terhadap difusi cakram antibiotika. Media yang terlalu

tebal akan menghambat difusi antibiotika sehingga zona yang terbentuk dapat lebih

kecil dan strain nampak relatif lebih resisten. Sedangkan media yang tipis dapat

menyebabkan zona hambatan lebih besar sehingga strain nampak lebih sensitif.

Jarak antara cakram antibiotika dapat mempengaruhi zona hambatan yang

terbentuk sehingga dapat mempengaruhi pembacaan. Potensi cakram antibiotika

sangat penting untuk pembentukan zona hambatan. Penyimpanan yang lama atau

tidak benar dapat membuat zona hambatan lebih kecil sehingga strain nampak

relatif lebih resisten. Komposisi medium juga akan berpengaruh terhadap

pertumbuhan bakteri sehingga kerusakan terhadap komposisi media dapat

menyebabakan zona yang lebih besar (Forbes,2007;Vandepitte,2003).

Program pemantapan mutu pada tes kepekaan antibiotika metode

konvensional secara difusi cakram dengan memperhatikan faktor yang

mempengaruhi hasil tes seperti disebutkan sebelumnya. Beberapa faktor mungkin

dapat diawasi lebih mudah seperti densitas inokulum, suhu inkubasi, lamanya

pemasangan cakram dan waktu inkubasi. Faktor yang sulit dievaluasi adalah

komposisi media, variasi kualitas media dan potensi cakram antibiotika. Kontrol



39

presisi dan akurasi metode ini dilakukan dengan memeriksa strain kontrol yang

sudah diketahui sensitivitas dan resistensinya. Beberapa strain yang dianjurkan

antara lain Staphylococcus aureus ATCC 25923, Eschericia coli ATCC 25922 dan

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Forbes,2007, Vandepitte,2003,

Patel,2015). Contoh hasil pemantapan mutu internal tes kepekaan antibiotika dapat

dilihat pada gambar 2.21.

Gambar 2.21.Contoh lembar hasil quality control tes kepekaan antibiotika harian dengan bias yang diijinkan (misalkan 16-22 mm, kontrol tanggal 8 keluar rentang)

(Vandepitte,2003).

2.3 Metode Technical Dedicated Reasonable (TDR)

Technical Dedicated Reasonable (TDR) merupakan serangkaian sistem analisis

identifikasi bakteri dan tes kepekaan antibiotika yang dikembangkan oleh

perusahaan Mindray. Metode ini terdiri dari beberapa alat yaitu TDR-X060

Automated Blood Culture Systems, TDR-J100 Automated Dosing System, TDR-

Z200 Microbe Turbidimetre dan TDR-300B microorganism analysis system

(Mindray,2013,2014). TDR-X060 Automated Blood Culture Systems (gambar

2.22) merupakan inkubator untuk menumbuhkan bakteri di botol kultur darah.

Tabung kultur darah diletakkan pada rak inkubator TDR-X060 dan pertumbuhan

mikroorgnaisme ditandai dengan perubahan warna lampu indikator di monitor dan



40

perubahan warna dasar tabung kultur (biru menjadi kuning). Alat ini menilai

perubahan warna di dasar botol kultur karena peningkatan konsentrasi CO2 yang

dihasilkan pertumbuhan bakteri (Mindray,2014).

Gambar 2.22 .TDR-X060 Automated Blood Culture Systems (Mindray,2014)

TDR-Z200 Microbe Turbidemetre (gambar 2.23) merupakan alat untuk

menilai tingkat kekeruhan suspensi bakteri dalam botol dalam satuan Mc Farland

berdasarkan prinsip turbidimetri. Suspensi bakteri ini akan diinokulasikan pada

Gambar 2.23.TDR-Z200 Microbe Turbidimetre (Mindray,2014)



41

kartu reagen TDR (gambar 2.24). Kartu ini terdiri dari sumuran untuk tes

identifikasi bakteri (tiga baris atas A,B,C) dan sisa baris sumuran lainnya untuk tes

kepekaan antibiotika (Mindray,2014). TDR-J100 Automate Dosing System (gambar

2.25) merupakan alat pemipetan otomatis yang digunakan untuk menanam suspensi

bakteri ke dalam sumuran kartu reagen TDR.

Gambar 2.24 Kartu reagen pada TDR (Mindray,2014)

Gambar 2.25.TDR-J100 Automate Dosing System (Mindray,2014)



42

Alat TDR-300B Microorganism Analysis System (gambar 2.26) merupakan

analyzer yang menentukan identifikasi dan tes kepekaan antibiotika bakteri. Alat

ini bekerja berdasarkan metode kolorimetri dengan mendeteksi metabolit yang

dihasilkan oleh strain bakteri selama pertumbuhannya atau kemampuan untuk

memetabolisme nitrogen atau karbon sehingga dapat diidentifikasi. Tes kepekaan

antibiotika menggunakan prinsip broth microdilution berdasarkan standar dari

Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Hasil uji kepekaan antibiotika

dapat diperoleh secara otomatis menggunakan TDR-300B. Hasil berupa nilai

Minimal Inhibitory Concentration (MIC) dan diinterpretasi sebagai sensitif,

intermediate dan resisten (Mindray,2013).

Gambar 2.26 .TDR300B Microorganism Analysis System (Mindray,2014)

2.3.1 Identifikasi dengan TDR-300B

Uji identifikasi pada metode TDR menggunakan jenis kartu reagen yang

sesuai. Kartu reagen ini teridiri dari 10 jenis kartu yaitu TDR STAPH-64, TDR

STR-64, TDR CB-64, TDR BAC-64, TDR ONE-64, TDR NF-64, TDR VIB-64,



43

TDR NH-64, TDR ANA-64, TDR YEAST-64. Pemilihan kartu reagen yang akan

digunakan sangat tergantung kepada morfologi bakteri melalui identifikasi koloni

pada media agar dan pengecatan Gram. TDR YEAST-64 digunakan untuk

identifikasi jamur, TDR ANA-64 untuk identifikasi bakteri anaerob (Mindray,

2013).

TDR STAPH-64 digunakan untuk identifikasi bakteri kokus Gram positif

dengan tes katalase positif, sedangkan kokus Gram positif dengan katalase negatif

diidentifikasi dengan TDR STR-64, bakteri batang Gram positif dengan spora

diidentifikasi dengan TDR BAC-64 sedangkan Gram positif tanpa spora

diidentifikasi dengan TDR CB-64. Batang Gram negatif dengan tes oksidase

negatif diidentifikasi dengan TDR ONE-64. Batang Gram negatif dengan oksidase

positif dan fermentasi laktosa diidentifikasi dengan TDR VIB-64 sedangakan yang

non fermentasi laktosa dengan TDR NF-64 (gambar 2.27). Kartu reagen yang

sering digunakan pada kultur darah antara lain (Mindray,2013).

Gambar 2. 27 Pemilihan panel identifikasi bakteri dengan TDR 300B (Mindray, 2014)



44

TDR STAPH-64, TDR STR-64, TDR ONE-64 dan TDR NF-64. Substrat kimia

yang digunakan pada kartu tersebut dapat dilihat di tabel 2.6 sampai dengan 2.9

(Mindray,2014).

Tabel 2.6 Uji biokimia pada TDR STAPH-64 (Mindray,2013)

2.3.2 Tes kepekaan antibiotika TDR 300B

Tes kepekaan antibiotika pada TDR-300B menggunakan metode broth

microdilution yang menghasilkan nilai MIC. Hasil MIC kemudian dibandingkan

dengan standar yang ada pada Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

Media Mueller Hinton yang digunakan, terdiri dari ekstrak sapi, casein acid

hydrolystate, soluble starch, glukosa, ion inorganik, agar dan deionized water.



45

Tabel 2.7 Uji biokimia pada TDR STR-64 (Mindray,2013)

No Uji Singkatan Komponen Negatif Positif

A1 CDEX -cyclo dextrin

Ungu-Biru Kuning B1 MBDG Methyl -D glucopyranidose

Ungu-Biru Kuning

C1 LAR Arabinose Ungu-Biru Kuning A2 ADH Arginine Kuning Merah B2 ESC Esculin Tak berwarna Hitam atau

abu-abu C2 ALP 4-Nitrophenyl phosphate

disodium salt hexahydrate

Tak berwarna atau kuning

Kuning

A3 LAA L-Leucine P-nitroanilide hydro chloride

Tak berewarna

atau kuning

Kuning

B3 AGA p-Nitrophenyl-a-D-galactopyranoside

Tak berwarna atau kunig

Kuning

C3 BGU 4-Nitrophenyl -D-glucuronide

Tak berwarna Kuning

A4 BGA 2-Nitrophenyl -D- galactopyranoside

Tak berwarna Kuning

B4 RIB Ribose Ungu-biru Kuning C4 MAN Mannitol Ungu-biru Kuning A5 TRE Trehalose Ungu-biru Kuning B5 LAC Lactose Ungu-biru Kuning C5 RAF Raffinose Ungu-biru Kuning C6 PG Penicillin Merah atau

oranye Kuning

A7 INU Inulin Ungu-biru Kuning B7 SOR Sorbitol Ungu-biru Kuning C7 GLYG Glycogen Ungu-biru Kuning A8 MAL Maltose Ungu-biru Kuning

Antibiotika yang digunakan pada TDR STAPH-64 terdiri dari 17 antibiotika, pada

TDR STR-64 terdiri dari 13 ntibiotika, TDR ONE-64 terdiri dari 20 antibiotika dan

TDR NF-64 terdiri dari 19 antibiotika. Jenis antibiotika dan kuman kontrol yang

digunakan pada setiap kartu TDR dapat dilihat di tabel 2.10 sampai 2.13.

Konsentrasi antibiotika yang digunakan pada kartu reagen menggunakan

konsentrasi rendah dan tinggi (gambar 2.28) (Mindray,2013; Mindray,2014).



46

Tabel 2.8 Uji biokimia pada TDR ONE-64 (Mindray,2013)


A1 LDC Lysine Kuning Ungu B1 ODC Ornithine Kuning Ungu C1 URE Urea Kuning Merah A2 PD Phenylalanine

Tak berwarna Kuning B2 5KG 5-Keto-D-Glucoronic acid

potassium salt

Hijau atau biru

Kuning

C2 ESC Esculin Tak berwarna Hitam atau hijau gelap

A3 MAU Sodium malonate

Kuning atau hijau terang

Biru

B3 HYS Sodium thiosulfate

Tak berwarna Hitam

C3 BGA 2-Nitrophenyl -D- galactopyranoside

Tak berwarna Kuning

A4 GLU Glucose Ungu Kuning B4 ADO Adonitol Ungu Kuning C4 MAN Mannitol Ungu Kuning A5 INO Inositol Ungu Kuning B5 MEL Melibiose Ungu Kuning C5 CEL Cellobiose Ungu Kuning A6 RHA Rhamnose Ungu Kuning B6 SOR Sorbitol Ungu Kuning C6 SUC Sucrose Ungu Kuning A7 ADH Arginine Kuning Merah B7 AMG Alpha-D-Methylglucoside

Ungu Kuning

C7 LAC Lactose Ungu Kuning A8 CIT Sodium Citrate

Kuning atau

hijau Biru

B8 DUL Dulcitol Ungu Kuning C8 MAL Maltose Ungu Kuning

Isolat bakteri dikatakan sensitif (S) jika hasil jernih pada antibiotika

konsentasi rendah dan tinggi, isolat bakteri intermediate (I) didapatkan hasil yang

keruh pada antibiotika konsentrasi rendah tetapi masih jernih pada konsentrasi

tinggi. Isolat bakteri yang resisten menunjukkan kekeruhan pada antibiotika

konsentrasi rendah dan tinggi. Jika bakteri tumbuh dalam bentuk partikel tapi kultur



47

masih jernih, maka harus diinterpretasikan bahwa bakteri resisten terhadap

antibiotika pada konsentrasi tersebut. Bila terdapat hasil jernih pada antibiotika

konsentrasi rendah, tapi keruh pada antibiotika konsentrasi tinggi, maka tes

dikatakan tidak valid dan harus diulang lagi (gambar 2.28) (Mindray,2013).

Tabel 2.9 Uji biokimia pada TDR NF-64 (Mindray,2013)


A1 ADH Arginine Kuning Merah B1 LDC Lysine Kuning Ungu C1 URE Urea Kuning Merah A2 NIT Potassium nitrate Kuning Merah atau

tak ada perubahan

B2 CIT Sodium citrate Hijau Biru C2 ESC Esculin Tak berwarna Hitam A3 GEL Gelatin Partikel hitam Hitam larut B3 BGA 2-Nitrophenyl -D-

galactopyranoside

Tak berwarna atau kuning

Kuning

C3 GLU Glucose Hijau kebiruan

Kuning

A4 DXY Xylose Hijau kebiruan

Kuning

B4 LAC Lactose Hijau kebiruan

Kuning

C4 SUC Sucrose Hijau kebiruan

Kuning

A5 MAL Maltose Hijau kebiruan

Kuning

B5 MAN Mannitol Hijau kebiruan

Kuning

C5 FRU Fructose Hijau kebiruan

Kuning

A7 PD Phenylalanine Kuning terang Hijau kebiruan

B7 GLU Glucose Ungu Kuning C7 NaCl 6.5% Soddium chloride No growth Growth A8 IND L-tryptophan Kuning terang Merah B8 GAL Galactose Hijau

kebiruan Kuning



48

Tabel 2.10 Antibiotika pada tes kepekaan antibiotika TDR STAPH-64 dengan hasil quality control menggunakan Staphylococcus aureus ATCC 29213

(Mindray,2013) No Antibiotika Rentang Quality control

ATCC29213 (g/ml)

Hasil quality control ATCC29213 (g/ml)

1 Penicillin 0,25-2 0,25 atau 0,5 2 Oxacilin 0,12-0,5 0,25 atau 0,5 3 Vancomycin 0,5-2 2 4 Azithromycin 0,5-2 2 5 Erythromycin 0,25-1 0,5 atau 1-4 6 Linezolid 1-4 4 7 Gentamicin 0,12-1 4 8 Doxycycline 0,12-0,5 4 9 Minocycline 0,06-0,5 4

10 Ofloxacin 0,12-1 1 11 Norfloxacin 0,5-2 4 12 Moxifloxacin 0,015-0,12 0,5 13 Ciprofl

Documents

Karya Akhir Perbandingan Hasil Identifikasi Metode ...repository.unair.ac.id/55488/13/PPDS. PK. 01-16 Sug p-min.pdf · Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas