Upload
matja-deelak
View
300
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
Matjaž DEŽELAK
KARAKTERIZACIJA MONO-ADP-RIBOZILACIJE
TRETJE ZNOTRAJCELIČNE ZANKE
RECEPTORJA ZA GLUKAGONU PODOBNI PEPTID-1
doktorska disertacija
Ljubljana, 2014
- II -
Matjaž DEŽELAK, univ. dipl. biol.
KARAKTERIZACIJA MONO-ADP-RIBOZILACIJE
TRETJE ZNOTRAJCELIČNE ZANKE
RECEPTORJA ZA GLUKAGONU PODOBNI PEPTID-1
CHARACTERIZATION OF MONO-ADP-RIBOSYLATION
OF THE THIRD INTRACELLULAR LOOP
OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 RECEPTOR
Imenovanje mentorja na 30. seji Senata, dne 04. julija 2012
Komisija za oceno in zagovor imenovana na 11. seji Senata, dne 30. junija 2014
Datum zagovora: 21. oktober 2014
Mentor: izr. prof. dr. Aljoša BAVEC
Predsednica komisije: prof. dr. Ana PLEMENITAŠ
Član: prof. dr. Matjaž ZORKO
Članica: prof. dr. Milka VRECL
Doktorska disertacija je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Matjaž DEŽELAK
__________________________
- III -
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA VSEBINA (KDI)
ŠD Dd
DK UDK 577.124.4:57.012-021.4:577.171.6:543.645.6
KG receptor za glukagonu podobni peptid-1 / mono-ADP-ribozilacija / prenos
signala / celično signaliziranje / potranslacijske spremembe / peptidna
zdravila / sladkorna bolezen tipa 2 / debelost
AV DEŽELAK, Matjaž
SA BAVEC, Aljoša (mentor)
KZ SI-1000, Vrazov trg 2
ZA Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Interdisciplinarni doktorski
študij Biomedicina, znanstveno področje Biokemija in molekularna
biologija
LI 2014
IN KARAKTERIZACIJA MONO-ADP-RIBOZILACIJE TRETJE
ZNOTRAJCELIČNE ZANKE RECEPTORJA ZA GLUKAGONU
PODOBNI PEPTID-1
TD Doktorska disertacija
OP XIV, 77 str., 2 pregl., 27 sl., 131 vir.
IJ sl
JI sl/en
- IV -
KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)
DN Dd
DC UDC 577.124.4:57.012-021.4:577.171.6:543.645.6
CX glucagon-like peptide-1 receptor / mono-ADP-ribosylation / signal
transduction / cellular signalling / post-translational modifications / peptide
drugs / diabetes mellitus type 2 obesity
AU DEŽELAK, Matjaž
AA BAVEC, Aljoša (supervisor)
PP SI-1000, Vrazov trg 2
PB University of Ljubljana, Faculty of Medicine, Interdisciplinary Doctoral
Programme in Biomedicine, Scientific field Biochemistry and Molecular
Biology
PY 2014
TI CHARACTERIZATION OF MONO-ADP-RIBOSYLATION OF THE
THIRD INTRACELLULAR LOOP OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1
RECEPTOR
DT Doctoral Dissertation
NO XIV, 77 p., 2 tab., 27 fig., 131 ref.
LA sl
AL sl/en
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- V -
KAZALO VSEBINE
KAZALO VSEBINE ........................................................................................................... V
KAZALO SLIK ................................................................................................................ VII
KAZALO PREGLEDNIC .................................................................................................IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ............................................................................................... X
POVZETEK .................................................................................................................... XIII
SUMMARY ..................................................................................................................... XIV
1 UVOD ......................................................................................................................... 1
1.1 Z G-PROTEINI SKLOPLJENI RECEPTORJI ............................................................ 1
1.1.1 RECEPTOR ZA GLUKAGONU PODOBNI PEPTID-1 IN NJEGOV LIGAND
GLP-1 ........................................................................................................................ 9
1.2 RECEPTOR ZA GLUKAGONU PODOBNI PEPTID-1 PRI ZDRAVLJENJU
SLADKORNE BOLEZNI TIPA 2 IN DEBELOSTI ................................................. 16
1.3 POTRANSLACIJSKE SPREMEMBE CELIČNIH RECEPTORJEV ........................ 19
1.3.1 MONO-ADP-RIBOZILACIJA .................................................................................. 20
1.4 SINTETIČNI PEPTIDI KOT PEPTIDNA ZDRAVILA ............................................. 25
2 NAMEN DELA IN ZNANSTVENA HIPOTEZA .................................................. 28
3 PRIČAKOVANI REZULTATI .............................................................................. 29
4 MATERIALI IN METODE .................................................................................... 30
4.1 MATERIALI ............................................................................................................. 30
4.2 CELIČNE KULTURE ............................................................................................... 30
4.3 IZOLACIJA PLAZEMSKIH MEMBRAN CELIC CHO ........................................... 30
4.4 DOLOČANJE HITROSTI VEZAVE [35
S]GTPγS NA G-PROTEINE V
PLAZEMSKIH MEMBRANAH CELIC CHO ......................................................... 31
4.5 LOČITEV PROTEINOV Z NaDS-PAGE, PRENOS NA NITROCELULOZNO
MEMBRANO IN DETEKCIJA PODENOTE β ........................................................ 32
4.6 MONO-ADP-RIBOZILACIJA PEPTIDOV IC3, IC3(R348A), IC3(C341A) IN
IC3(R348A,C341A) IN PODENOTE β HETEROTRIMERNIH G-PROTEINOV
PLAZEMSKIH MEMBRAN CELIC CHO ............................................................... 33
4.7 TANKOPLASTNA KROMATOGRAFIJA ............................................................... 34
4.8 UGOTAVLJANJE SEKUNDARNE STRUKTURE PEPTIDA IC3 Z MERJENJEM
CIRKULARNEGA DIKROIZMA (CD SPEKTROSKOPIJA) .................................. 34
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- VI -
4.9 KINETIČNE ŠTUDIJE ............................................................................................. 35
4.10 STATISTIČNA ANALIZA ....................................................................................... 36
5 REZULTATI ........................................................................................................... 37
5.1 UČINEK PEPTIDA IC3 NA ZAČETNO HITROST VEZAVE [35
S]GTPγS NA G-
PROTEINE V PLAZEMSKIH MEMBRANAH CELIC CHO .................................. 37
5.2 UČINEK PEPTIDA IC3 NA MONO-ADP-RIBOZILACIJO PODENOTE β G-
PROTEINOV V CELICAH CHO ............................................................................. 38
5.3 UČINEK PEPTIDA IC3 NA MONO-ADP-RIBOZILACIJO PODENOTE β G-
PROTEINOV V CELICAH CHO V PRISOTNOSTI PTX ........................................ 39
5.4 MONO-ADP-RIBOZILACIJA PEPTIDA IC3 Z ART V PLAZEMSKIH
MEMBRANAH CELIC CHO ................................................................................... 40
5.5 MONO-ADP-RIBOZILACIJA PEPTIDOV IC3(R348A), IC3(C341A) IN
IC3(R348A,C341A) TER NJIHOV UČINEK NA MONO-ADP-RIBOZILACIJO
PODENOTE β G-PROTEINOV V CELICAH CHO ................................................. 43
5.6 SEKUNDARNA STRUKTURA PEPTIDA IC3 ......................................................... 50
6 RAZPRAVA............................................................................................................. 52
6.1 BIOKEMIJSKI VIDIK .............................................................................................. 52
6.2 FARMACEVTSKI VIDIK ........................................................................................ 60
7 ZAKLJUČKI ........................................................................................................... 64
8 LITERATURA ........................................................................................................ 65
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- VII -
KAZALO SLIK
Slika 1: Shematski prikaz štirih tipov celičnih receptorjev na osnovi njihove strukture in
mehanizma delovanja. ....................................................................................... 2
Slika 2: Filogenetska predstavitev človeške naddružine z G-proteini sklopljenih
receptorjev na osnovi podobnosti v aminokislinskem zaporedju
transmembranskih območij (Stevens s sod., 2013). ............................................ 3
Slika 3: Model trojnega kompleksa interakcije med agonistom, receptorjem in G-proteini
(Lefkowitz, 2004). ............................................................................................. 4
Slika 4: Shematski prikaz cikla prenosa signala preko G-proteinov (Offermanns, 2003). 7
Slika 5: Shematski prikaz strukture (A) preproglukagonskega gena, (B) njegovega mRNA
prepisa in (C) proteina (Baggio in Drucker, 2007). .......................................... 10
Slika 6: Učinki GLP-1 v različnih tkivih oz. organih (Baggio in Drucker, 2007). .......... 11
Slika 7: Shematski prikaz GLP-1R (Bavec, 2003). ........................................................ 12
Slika 8: Stereoskopska slika tridimenzionalnega modela človeškega GLP-1R (Frimurer
in Bywater, 1999). ........................................................................................... 13
Slika 9: Od GLP-1R odvisen znotrajceličen prenos signala v celicah trebušne slinavke
(Baggio in Drucker, 2007). .............................................................................. 15
Slika 10: Shematski prikaz z DPP-IV posredovane deaktivacije GLP-1. Zaradi jasnosti je
prikazanih samo prvih 11 aminokislin GLP-1(7-36) (Arulmozhi in Portha,
2006). .............................................................................................................. 18
Slika 11: Shematski prikaz reverzibilnosti mono-ADP-ribozilacije, ki jo katalizirata mono-
ADP-riboziltransferaza in mono-ADP-hidrolaza (Corda in Di Girolamo, 2003).
........................................................................................................................ 22
Slika 12: Shematski prikaz mono-ADP-ribozilacijskega/deribozilacijskega cikla podenote
β G-proteinov, kataliziranega z ART (iART) in ARH (Di Girolamo s sod.,
2005). .............................................................................................................. 24
Slika 13: Učinek peptida IC3 na hitrost vezave [35
S]GTPγS na G-proteine v plazemskih
membranah celic CHO. ................................................................................... 37
Slika 14: Učinek peptida IC3 na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov v
plazemskih membranah celic CHO. ................................................................. 39
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- VIII -
Slika 15: Učinek peptida IC3 na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov v celicah
CHO v prisotnosti PTX. .................................................................................. 40
Slika 16: Primerjava aminokislinskih ostankov na enakih položajih glede na spremenjen
argininski ostanek v podenoti β in peptidu IC3. ................................................ 41
Slika 17: Mono-ADP-ribozilacija peptida IC3 v celicah CHO v prisotnosti in odsotnosti
meta-jodobenzil gvanidina (MIBG). ................................................................ 42
Slika 18: Ugotavljanje nespecifične vezave ADP-riboze in/ali β-NAD+ na peptid IC3 oz.
njegove neencimske mono-ADP-ribozilacije. .................................................. 43
Slika 19: Mono-ADP-ribozilacija peptidov IC3, IC3(R348A), IC3(C341A) in IC3(R348A,
C341A) z ART plazemskih membran celic CHO. ............................................ 44
Slika 20: Učinek peptida IC3(R348A) na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov
v plazemskih membranah celic CHO. .............................................................. 45
Slika 21: Shematski prikaz teoretične napovedi sekundarne strukture peptida IC3 s
pomočjo spletnega orodja PredictProtein (Rost s sod., 2004). .......................... 46
Slika 22: Učinek peptida IC3(C341A) na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov
v plazemskih membranah celic CHO. .............................................................. 47
Slika 23: Učinek peptida IC3(R348A,C341A) na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-
proteinov v celicah CHO. ................................................................................ 48
Slika 24: Grafična primerjava stopnje mono-ADP-ribozilacije peptida IC3, vsote mono-
ADP-ribozilacij peptidov IC3(R348A) in IC3(C341A) ter vsote mono-ADP-
ribozilacij peptidov IC3(R348A), IC3(C341A) in IC3(R348A,C341A) pri
različnih koncentracijah peptidov. ................................................................... 49
Slika 25: CD spekter peptida IC3 pri (A) 1 µM, (B) 5 µM, (C) 50 µM in (D) 500 µM in
predstavlja povprečje štirih neodvisnih eksperimentov..................................... 50
Slika 26: Shematski prikaz predpostavljene regulacije GLP-1R z ART. .......................... 61
Slika 27: Shematski prikaz predpostavljene regulacije GLP-1R z ART skupaj s
predlaganim terapevtskim učinkom peptida IC3. .............................................. 62
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- IX -
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Numerična primerjava stopnje mono-ADP-ribozilacije peptida IC3, vsote
mono-ADP-ribozilacij peptidov IC3(R348A) in IC3(C341A) ter vsote
mono-ADP-ribozilacij peptidov IC3(R348A), IC3(C341A) in
IC3(R348A,C341A) pri različnih koncentracijah peptidov. ..................... 49
Preglednica 2: Relativni delež posameznih tipov sekundarne strukture peptida IC3 pri 1, 5,
50 in 500 µM. ......................................................................................... 51
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- X -
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
7-TMR 7-transmembranski receptor
ADP adenozindifosfat
ART endogena mono-ADP-riboziltransferaza
ARH citosolna mono-ADP-ribozilhidrolaza
CHO celice ovarija kitajskega hrčka
DRAT bakterijski encim dinitrogenaza reduktaza ADP-ribozilhidrolaza
EDTA etilendiaminotetraetanojska kislina
g težni pospešek Zemlje
Gcg preproglukagonski gen
GIP od glukoze odvisni inzulinotropični polipeptid
GLP-1 glukagonu podobni peptid-1
GLP-1R receptor za glukagonu podobni peptid-1
GPI glikofosfatidilinozitol
Hepes 4-(2-Hidroksietil)piperazin-1-etansulfonska kislina
IC3 peptid z aminokislinskim zaporedjem, ki ustreza tretji znotrajcelični zanki
GLP-1R
NAD+ nikotinamidadenin dinukleotid
PTS potranslacijska sprememba
TB Tris pufer
TBS Tris pufer z NaCl
TE Tris-EDTA
TES N-[Tris(hidroksimetil)metil]-2-aminoetansulfonska kislina
TTBS 0.05% Tween 20 v Tris pufru z NaCl
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- XI -
Različni deli vsebine te doktorske disertacije so bili objavljeni v več
znanstvenih člankih in zbornikih povzetkov ter predstavljeni v obliki
kratkih predavanj ali postra, in sicer:
1.01 – Izvirni znanstveni članek
1. DEŽELAK, Matjaž, BAVEC, Aljoša. Third intracellular loop of glucagon like-peptide-1
receptor is coupled with endogenous mono-ADP-ribosyltransferase - Novel type of receptor
regulation?. European Journal of Pharmacology, ISSN 0014-2999. [Print ed.], 2011, vol. 666,
str. 35-42, doi: 10.1016/j.ejphar.2011.05.033. [COBISS.SI-ID 28681945]
2. DEŽELAK, Matjaž, BAVEC, Aljoša. Glucagon like-peptide-1 receptor is covalently modified
by endogenous mono-ADP-ribosyltransferase. Molecular biology reports, ISSN 0301-4851,
2012, vol. 39, no. 4, str. 4375-4381, doi: 10.1007/s11033-011-1225-0. [COBISS.SI-ID
29195993]
1.02 – Pregledni znanstveni članek
1. DEŽELAK, Matjaž, BAVEC, Aljoša. Peptidni agonisti receptorja za glukagonu podobni peptid-
1 ter njihova uporaba pri zdravljenju sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti = Glucagon like
peptide-1 receptor agonists and their application in treatment of diabetes mellitus type 2 and
obesity. Farmacevtski vestnik, ISSN 0014-8229, avg. 2013, letn. 64, št. 3, str. 211-217, ilustr.
http://www.sfd.si/?mod=catalog&action=view&group=1. [COBISS.SI-ID 30773721]
1.08 - Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci (kratko predavanje)
1. DEŽELAK, Matjaž, BAVEC, Aljoša. Third intracellular loop of glucagon like-peptide-1
receptor is coupled with endogenous mono-ADP-ribosyltransferase - novel type of receptor
regulation?. V: 9th Congress of the Slovenian Biochemical Society [also] 5th Congress of the
Slovenian Microbiological Society with International Participation [also] 3rd CEFORM
(Central European Forum for Microbiology), Maribor, 12th - 15th October 2011. JANEŽIČ,
Sandra (ur.), et al. Abstract book. Maribor: Zavod za zdravstveno varstvo, 2011, str. 96.
[COBISS.SI-ID 28998361]
2. DEŽELAK, Matjaž, BAVEC, Aljoša. The third intracellular loop of glucagon like-peptide-1
receptor is covalently modified with endogenous mono-ADP-ribosyltransferase - novel type of
receptor regulation?. V: DUMIĆ, Jerka (ur.). From molecules to life and back : book of
abstract. [Rijeka]: Croatian Society of Biochemistry and Molecular biology, 2012, str. 114.
[COBISS.SI-ID 29983449]
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- XII -
1.08 - Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci (poster)
1. DEŽELAK, Matjaž, BAVEC, Aljoša. Cysteine 341 of the third intracellular loop of glucagon
like-peptide-1 receptor as an alternative mono-ADP-ribosylated amino acid residue. V:
Simpozij z mednarodno udele bo ob 40. obletnici In tituta za biokemijo in 20. obletnici
Medicinskega centra za molekularno biologijo = International Symposium at 40th Anniversary
of Institute of Biochemistry and_ 20th Anniversary of Medical Centre for Molecular Biology,
Ljubljana, 27-29 June 2012. HUDLER, Petra (ur.), VIDETIČ PASKA, Alja (ur.), JUVAN,
Peter (ur.). Molekularna medicina in biotehnologija = Molecular medicine and biotechnology:
book of abstracts. Ljubljana: Inštitut za biokemijo, Medicinska fakulteta: = Institute of
Biochemistry, Faculty of Medicine, 2012, str. 65. [COBISS.SI-ID 29999577]
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- XIII -
POVZETEK
Receptor za glukagonu podobni peptid-1 (GLP-1R) je med drugim membranski receptor β-
celic trebušne slinavke in med najbolj proučevanimi celičnimi proteini pri odkrivanju
zdravil in postopkov za zdravljenje sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti. Opažena, vendar
nepojasnjena ostajata način in vloga mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke
GLP-1R pri prenosu signala na efektorske molekule, ki sodelujejo pri odgovoru celice na
signalno molekulo. Namen tega dela je proučiti mono-ADP-ribozilacijo GLP-1R kot
morebiten nov način potranslacijskega uravnavanja aktivnosti receptorja. Kot model za
proučevanje mono-ADP-ribozilacije smo uporabili izolirane plazemske membrane celične
linije iz celic ovarija kitajskega hrčka. Pri delu smo uporabili sintetičen peptid z
aminokislinskim zaporedjem, ki ustreza zaporedju tretje znotrajcelične zanke GLP-1R
(IC3) in tri njegove točkovno mutirane oblike [IC3(R348A), IC3(C341A),
IC3(R348A,C341A)]. Opazovali smo mono-ADP-ribozilacijo teh peptidov in njihove
učinke na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov. Poleg tega smo ugotavljali
udeleženost G0/i-proteinov pri inhibiciji mono-ADP-ribozilacije podenote β s peptidi,
morebitno nespecifično oz. neencimsko vezavo β-NAD+ in ADP-riboze na peptid IC3 ter
okarakterizirali deleže posameznih tipov sekundarne strukture peptida IC3 v odvisnosti od
njegove koncentracije. Rezultati so pokazali, da se z izjemo dvojnega mutantnega peptida
vsi uporabljeni peptidi značilno specifično, kovalentno in encimsko katalizirano mono-
ADP-ribozilirajo, in sicer v odvisnosti od njihove koncentracije. Pri tem je mono-ADP-
ribozilacija peptida IC3(R348A) večja kot pri peptidu IC3(C341A), vsota obeh pa je
primerljiva z mono-ADP-ribozilacijo peptida IC3. Peptida IC3 in IC3(C341A) inhibirata
mono-ADP-ribozilacijo podenote β v odvisnosti od njune koncentracije, različne
koncentracije peptidov IC3(R348A) in IC3(R348A,C341A) pa ne kažejo posebnih učinkov
v primerjavi z bazalnim stanjem. Rezultati kažejo, da je za mono-ADP-ribozilacijo
peptidov odgovoren isti encim kot v primeru podenote β G-proteinov. Arg348
in Cys341
sta
najverjetneje edini mesti mono-ADP-ribozilacije peptida IC3. Ker je peptid IC3 v odnosu
do mono-ADP-riboziltransferaze (ART) kompetitivni inhibitor, obstaja možnost njegove
uporabe v terapevtske namene. Njegova uporaba skupaj z agonisti GLP-1R bi tako
verjetno preprečila oz. vsaj zmanjšala z ART posredovano inaktivacijo podenote β G-
proteinov in morebitno inaktivacijo GLP-1R. Poleg tega bi vsaj deloma izničila tudi
homologno in heterologno desenzibilizacijo, saj peptid IC3 aktivira G-proteine, podobno
kot aktiviran receptor. Vse to bi bistveno izboljšalo postopke zdravljenja sladkorne bolezni
tipa 2 in debelosti, dveh po pojavnosti naraščajočih nadlog sodobnega načina življenja.
Ključne besede: Receptor za glukagonu podobni peptid-1, mono-ADP-ribozilacija,
prenos signala, celično signaliziranje, potranslacijske spremembe, peptidna zdravila,
sladkorna bolezen tipa 2, debelost
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- XIV -
SUMMARY
Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R) is a plasma membrane receptor of pancreatic
β-cells and one of the most examined cellular proteins in discovery of medicines and
treatment procedures for diabetes mellitus type 2 and obesity. Mono-ADP-ribosylation of
the GLP-1R's third intracellular loop-derived peptide was already observed previously but
its nature and involvement in signal transduction were not sufficiently characterized. The
aim of this research was to give better insights whether this process could represent a novel
type of post-translational regulation of GLP-1R activity. Isolated plasma membranes from
Chinese hamster ovary cell line were used as a model for mono-ADP-ribosylation process.
Besides, synthetic peptide (IC3), with the amino acid sequence which corresponded to the
third intracellular loop of GLP-1R, and its three point mutants [IC3(R348A), IC3(C341A),
IC3(R348A,C341A)] were used. We followed mono-ADP-ribosylation of these peptides
and their effects on mono-ADP-ribosylation of β subunit of G-proteins. In addition, we
examined (i) the involvement of G0/i-proteins in IC3 peptide-mediated inhibition of mono-
ADP-ribosylation of β subunit, (ii) non-specific and/or non-enzymatic binding of β-NAD+
and ADP-ribose to IC3 peptide, and (iii) proportions of different types of secondary
structure of IC3 peptide as a function of its concentration. Results showed that, with the
exception of the double mutant, all used peptides were significantly specifically, covalently
and enzymatically mono-ADP-ribosylated and this process was peptide concentration-
dependent. Mono-ADP-ribosylation of IC3(R348A) peptide was higher that mono-ADP-
ribosylation of IC3(C341A) and their sum was comparable to mono-ADP-ribosylation of
IC3 peptide. IC3 and IC3(C341A) peptides inhibited mono-ADP-ribosylation of β subunit
in a concentration-dependent manner whereas different concentrations of IC3(R348A) and
IC3(R348A,C341A) peptides showed no difference in regard to the basal state. For peptide
mono-ADP-ribosylation, results indicated the involvement of the same enzyme as in the
case of G-protein β subunit. Arg348
and Cys341
seemed the only sites of IC3 peptide mono-
ADP-ribosylation. Since IC3 peptide is a competitive inhibitor in relation to mono-ADP-
ribosyltransferaze (ART), it has a therapeutic potential. Its use together with GLP-1R
agonists could prevent, or at least decrease, ART-mediated inactivation ob β subunit as
well as a proposed inactivation of GLP-1R. Besides, its use could, at least partly, abolish
the effects of homologous and heterologous desensitization of GLP-1R since IC3 peptide
has the ability to activate G-proteins, similarly as the activated receptor. All this could
fundamentally improve existing treatment procedures of diabetes mellitus type 2 and
obesity, i.e. two by incidence expanding health concerns of nowadays.
Keywords: Glucagon-like peptide-1 receptor, mono-ADP-ribosylation, signal
transduction, cellular signalling, post-translational modification, peptide drugs, diabetes
mellitus type 2, obesity
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 1 -
1 UVOD
1.1 Z G-PROTEINI SKLOPLJENI RECEPTORJI
V biokemijskem smislu z izrazom receptor označujemo proteinsko molekulo v notranjosti
ali na površini celice, ki sprejema kemijske in fizikalne signale iz njene okolice. Na
podlagi strukture in funkcije ločimo štiri tipe receptorjev (Slika 1), in sicer:
(i) Tip 1 oz. ionotropni receptorji, katerih aktivacija ima za posledico premik
anorganskih ionov preko bioloških membran, zgrajeni pa so iz več med sabo
različnih podenot, od katerih vsaka vsebuje štiri transmembranske α-vijačnice.
(ii) Tip 2 oz. metabotrobni receptorji so bolje znani pod imenom "z G-proteini sklopljeni
receptorji", njihova aktivacija sproži različne znotrajcelične efektorske sisteme,
sestavlja pa jih ena sama polipeptidna veriga, za katero je značilnih sedem
transmembranskih α-vijačnic.
(iii) Tip 3 oz. s kinazami povezani ali kinazam podobni receptorji, katerih znotrajcelični
del ima praviloma encimsko funkcijo, sestavlja pa jih ena polipeptidna veriga, za
katero je značilna ena transmembranska α-vijačnica. Pogosto so v dimerni obliki ali
sestavljeni iz več podenot.
(iv) Tip 4 oz. jedrni receptorji se nahajajo prosto v citosolu in po vezavi agonista
migrirajo v celično jedro. Sestavljeni so iz več domen, funkcionalno pa ločimo tri
domene, in sicer ligand-vezavni C-konec, osrednjo DNA-vezavno domeno in N-
konec z AF1 regijo, ki se neodvisno od vezave liganda povezuje z ostalimi celičnimi
transkripcijskimi faktorji.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 2 -
Slika 1: Shematski prikaz štirih tipov celičnih receptorjev na osnovi njihove strukture in mehanizma
delovanja.
(http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_receptor#mediaviewer/File:Membrane_Receptors.svg)
Izmed naštetih so z G-proteini sklopljeni receptorji (angl. G-protein-coupled receptors,
GPCR) največja, najbolj raznolika in najbolj razširjena skupina receptorjev (Pierce s sod.,
2002). V človeškem genomu je bilo najdeno približno tisoč različnih genov z zapisom
zanje (Fredriksson s sod., 2003), pri sesalcih pa so udeleženi praktično pri vseh znanih
fizioloških procesih, pri čemer so njihovi agonisti molekule, ki določajo vonje in okuse,
Ca2+
, peptidi, lipidi, amini in celo HIV (Pierce s sod., 2002). Začetki njihovega
raziskovanja segajo v 70. leta 20. stoletja in v tem času je bilo pojasnjenega zelo veliko
glede njihove strukture, funkcije in filogenije, vendar smo še zelo daleč od popolnega
razumevanja. Predstavniki naddružine GPCR so na osnovi homologij aminokislinskega
zaporedja in funkcionalnih podobnosti razdeljeni v pet družin (Stevens s sod., 2013), vsem
pa je skupna topologija transmembranskega dela. Polipeptidna veriga oblikuje sedem
transmembranskih α-vijačnic in posledično tri zunajcelične in tri znotrajcelične zanke ter
zunajcelični N-konec in znotrajcelični C-konec, zaradi česar jih pogosto imenujemo tudi
sedem-transmembranski receptorji (7-TMR). Poleg osnovnega razumevanja signaliziranja
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 3 -
preko GPCR v bioloških sistemih je njihovo poznavanje bistvenega pomena na področju
medicine in farmacije. Že sedaj se uporablja veliko zdravil, ki učinkujejo na GPCR, mnogo
pa jih je v različnih fazah raziskav oz. registracije.
Slika 2: Filogenetska predstavitev človeške naddružine z G-proteini sklopljenih receptorjev na osnovi
podobnosti v aminokislinskem zaporedju transmembranskih območij (Stevens s sod., 2013).
Opazimo lahko, da je glede na število članov daleč največja rodopsinska družina, ostale pa so v tem pogledu
primerljive med sabo. Rodopsinska družina je zato dalje razdeljena v štiri skupine, imenovane α, β, γ in δ.
Posamezni člani z že znano kristalno zgradbo so predstavljeni z belim tekstom na barvnem ozadju. Številka v
oklepaju zraven imena družine predstavlja število do sedaj poznanih članov.
Leta 1971 je Rodbell predlagal obstoj z gvaninskim nukleotidom povezanega
regulatornega proteina, ki naj bi imel vlogo posrednika med hormonskim receptorjem in
adenilat-ciklazo (Rodbell s sod., 1971). Kar nekaj časa je minilo, da sta Ross in Gilman
(1977) obstoj takega proteina dokazala, še kasneje pa je prišlo do njegove izolacije in
poimenovanja kot Gs (Gilman, 1987). A v vsem tem času je bil dejanski obstoj receptorjev
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 4 -
še vedno sporen, saj ni bilo ustreznih načinov za njihovo učinkovito empirično
karakterizacijo. To se je spremenilo z razvojem biokemijskih in molekularno bioloških
metod, kot so vezava radioaktivnih ligandov, afinitetno označevanje, raztapljanje membran
z detergenti, čiščenje z afinitetno kromatografijo in lipidna rekonstrukcija. Od vseh
naštetih je najpomembnejša uporaba radioaktivnih ligandov, ki je tako rekoč začetek
molekularne dobe pri raziskovanju receptorjev. Tako je namreč prišlo do razvoja
pomembnega 'modela trojnega kompleksa' (angl. ternary complex model), ki pojasnjuje
interakcijo agonista, receptorja in G-proteinov (Slika 3) (De Lean s sod., 1980) in do
kvantifikacije visoko in nizko afinitetnega stanja receptorja (Kent s sod., 1980).
Slika 3: Model trojnega kompleksa interakcije med agonistom, receptorjem in G-proteini (Lefkowitz, 2004).
Klasični model nakazuje za začetno tvorbo nizkoafinitetnega kompleksa agonista (npr. hormona) z
receptorjem, kateri sledi interkacija tega agonist-receptor kompleksa s tretjo komponento, ki je tu
predstavljena z X. H – hormon, tj. agonist. R – receptor. X – tretja komponenta kompleksa, kasneje se je
pokazalo, da je to gvanin-nukleotidni regulatorni protein.
Z uporabo afinitetne kromatografije v kombinaciji z običajno kromatografijo so sledili
uspešni poskusi čiščenja in izolacije GPCR, predvsem na primeru različnih podtipov
adrenergičnega receptorja (Benovic s sod., 1984; Caron s sod., 1979; Shorr s sod., 1981),
vendar so bile pridobljene količine proteina izredno majhne, tj. nekaj deset mikrogramov.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 5 -
Dokončen dokaz obstoja celičnih receptorjev kot samostojne entitete je predstavljala
funkcionalna aktivnost v fosfolipidnih veziklih rekonstituiranega receptorja (Cerione s
sod., 1984; May s sod., 1985), ki je hkrati definirala tudi minimalno število komponent,
potrebnih za prenos signala do končnega efektorja. Leta 1986 je prišlo do novega preboja
pri raziskovanju GPCR. Določanje kratkih aminokislinskih zaporedij izoliranih receptorjev
je bilo dovolj za konstrukcijo oligonukleotidnih začetnikov, uporabnih za kloniranje genov
oz. cDNA zapisa za konkretni receptor (Dixon s sod., 1986). Presejalne raziskave
genomskih knjižnic so med drugim pokazale tudi, da so nekateri GPCR brez intronov
(Dixon s sod., 1986; Kobilka s sod., 1987), kar danes velja za kar nekaj članov te
receptorske družine. Poleg tega je bila takrat še posebej presenetljiva ugotovitev, da je β2-
adrenergični receptor glede aminokislinskega zaporedja in predpostavljene strukture
homologen vidnemu pigmentu rodopsinu (Dixon s sod, 1986). V večini primerov
funkcionalna identiteta GPCR genov ni bila znana in takšni so dobili ime 'receptorji sirote'
(angl. orphan receptors). Mnoge od njih so kasneje funkcionalno okarakterizirali, vendar je
še vedno na stotine GPCR brez znane funkcije oz. agonista, večina od njih pa je iz skupine
vohalnih receptorjev (Buck in Axel, 1991). Sledile so raziskave funkcije GPCR v
odvisnosti od njihove strukture, za kar sta bili najprimernejši mutageneza GPCR in študije
njihovih himernih oblik. Tako so prišli do spoznanja, katere znotrajcelične regije so
odgovorne za interakcijo z G-proteini, katere zunajcelične za vezavo agonistov in
antagonistov ter kakšne so posledične konformacijske spremembe receptorja. V začetku
80. let 20. stoletja je sledila še ena pomembna prelomnica, in sicer odkritje 'od signala
odvisne fosforilacija receptorja' (angl. stimulus-dependent receptor phosphorylation). Ta
proces predstavlja desenzibilizacijo receptorja, za katero so odgovorne posebne kinaze,
imenovane GRKs (angl. G-protein-coupled receptor kinases). Fosforilacija receptorja je
predpogoj za vezavo -arestinov, ki preprečijo signalizacijo preko receptorja in povzročijo
njegovo internalizacijo (Stadel s sod, 1983; Wilden in Kuhn, 1982). Relativno hitro je bilo
ugotovljeno tudi, da je desenzibilizacija lahko za agoniste nespecifična oz. 'heterologna'
(Benovic s sod., 1985) ali za agoniste specifična oz. 'homologna' (Benovic s sod., 1986).
Danes praktično brez izjeme torej velja, da so GPCR poleg aktivnosti agonistov in
inhibitorjev natančno regulirani tudi z -arestini in GRK.
Izmed petih prej omenjenih družin GPCR je za našo obravnavo pomembna receptorska
družina B oz. sekretinska receptorska družina, v katero spada tudi receptor za glukagonu
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 6 -
podobni peptid-1 (GLP-1R) (Dillon s sod., 1993; Thorens, 1992). Ti receptorji imajo ~120
aminokislinskih ostankov veliko vezavno domeno za hormon (HBD) na zunajceličnem N-
koncu. Vsem receptorjem te družine je skupen ohranjen aspartatni aminokislinski ostanek
na začetku prve zunajcelične zanke, na meji z drugo transmembransko α-vijačnico (Langer
s sod., 2003). Z izjemo glukagonskega receptorja je neposredno pred omenjenim
aspartatnim ohranjen tudi bazičen aminokislinski ostanek. Eksperimenti usmerjene
točkovne mutageneze so pokazali, da sta oba aminokislinska ostanka ključna za vezavo
liganda in aktivacijo receptorja (Langer s sod., 2003). Korelacijska mutacijska analiza je
pokazala, da se do sedem aminokislinskih ostankov N-konca peptidnega liganda veže s
transmembranskimi α-vijačnicami, preostali C-konec peptidnega liganda pa z N-koncem in
zunajceličnimi zankami receptorja. Najpopularnejši model vezave liganda na receptor
predpostavlja zaporedje dveh dogodkov. Nizkoafinitetni vezavi C-konca liganda na HBD
sledi vezava N-konca liganda v področje transmembranskih α-vijačnic. V primeru GLP-1R
so bile ab initio metode napovedovanja strukture HBD (Taylor s sod., 2003) povsem v
skladu z eksperimentalnimi podatki, kot je povezljivost preko disulfidnih mostičkov
(Bazarsuren s sod., 2002).
Heterotrimerni G-proteini so ključni pri signaliziranju preko GPCR, saj niso le preprosti
prenašalci signala, ampak so osrednji del prefinjenega molekularnega mehanizma, ki
sprejema, obdeluje in posreduje sprejete signale, poleg tega pa tudi prilagaja občutljivost
celotnega receptorskega sistema. Poleg receptorja, heterotrimernih G-proteinov in
efektorja, obstajajo še drugi faktorji, ki modulirajo, senzibilizirajo in desenzibilizirajo
signalizacijski proces, na primer proteini RGS (angl. regulators of G-protein signaling) in
proteini AGS (angl. activators of G-protein signaling). Heterotrimerne G-proteine
sestavljajo tri različne podenote, imenovane α, β in γ. Podenota α je strukturno in
funkcijsko homologna ostalim proteinom iz naddružine 'GTP vezavnih proteinov'.
Podenoti β in γ tvorita v fizioloških pogojih nerazdružljiv in biološko funkcionalen
kompleks. Heterotrimerni G-proteini so sposobni cikličnega izmenjevanja stanj aktivacije
in inaktivacije, zaradi česar sploh lahko imajo pri signaliziranju vlogo regulatornega
molekularnega stikala (Slika 4) (Offermanns, 2003).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 7 -
Slika 4: Shematski prikaz cikla prenosa signala preko G-proteinov (Offermanns, 2003).
A − agonist. CTX – kolera toksin. RGS – regulator signalizacije G-proteinov.
Bistvo signalizacije preko G-proteinov je veriga nekovalentnih interakcij med
posameznimi komponentami in njihovih znotrajmolekularnih konformacijskih sprememb.
V osnovnem stanju je na podenoto α vezan GDP, kar je pogoj za njeno povezavo z
dimerom βγ. Takšen trimer se lahko veže z receptorjem, kar povzroči disociacijo GDP, z
večjo afiniteto pa se na njegovo mesto veže GTP. Vezava slednjega povzroči
konformacijsko spremembo podenote α in posledično njen odcep od dimera βγ. Tako
dimer βγ kot podenota α z vezanim GTP sta sposobna učinkovati na različne celične
proteine, predvsem na encime in membranske kanalčke. Trajanje aktivnosti obeh podenot
je omejeno s kinetiko podenoti α lastne GTP-azne aktivnosti. Po hidrolizi γ-fosfatne
skupine molekule GTP zopet nastane izhodno stanje, in sicer trimer αβγ z vezanim GDP na
podenti α (Offermans, 2003).
efektor
A B
efektor efektor
efektor efektor
efektor
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 8 -
Dva bakterijska toksina imata sposobnost prekiniti običajen signalizacijski cikel G-
proteinov, in sicer pertusis (PTX) ter kolera toksin (CTX). Z vidika medicine sta zelo
nezaželjena, saj povzročata nadležni bolezni, oslovski kašelj in kolero, široko uporabna pa
sta v biomolekularnih raziskavah signaliziranja preko GPCR. Oba katalizirata reakcijo
mono-ADP-ribozilacije podenote α, razlika pa je v tem, da PTX kovalentno veže ADP-
ribozni ostanek na cisteinski aminokislinski ostanek podenote αi/0, ko ima le-ta vezan GDP
in je del trimera αβγ, CTX pa na argininski aminokislinski ostanek podenote αs, ko ima le-
ta vezan GTP in ni povezana v trimer (Offermans, 2003).
Pri sesalcih poznamo več kot dvajset različnih podenot α, posamezna celica pa jih izraža
do deset. Za specifično vezavo G-proteinov na receptor je odgovorna izključno podenota α.
Različni receptorji lahko aktivirajo iste G-proteine in isti receptor lahko aktivira več
različnih G-proteinov. V praksi načeloma velja tudi, da različni receptorji, ki aktivirajo G-
proteine istega tipa, vodijo do podobnega odziva na celični ravni. Na osnovi strukturnih in
funkcionalnih homologij delimo podenote α v 4 skupine (Simon s sod., 1991):
(i) Družina Gαi/0 – z izjemo αz so ostali člani občutljivi na PTX. Najbolj razširjene so
predvsem podenote αi1, αi2 in αi3, katerih funkcija je inhibicija različnih tipov
adenilat-ciklaze. V primerjavi z ostalimi G-proteini je glavna značilnost podenote α0,
da se večina signalov prenese preko dimera βγ.
(ii) Družina Gαq – štiri podenote α te družine niso občutljive na PTX, njihovi efektorji pa
so β- izoforme fosfolipaze C (Rhee, 2001). Aktivirani receptorji načeloma ne ločijo
med αq in α11, minimalne pa so tudi razlike v njunih sposobnostih aktivacije
fosfolipaze C. Podenoti α14 in α15 sicer kažeta različen profil izražanja v organizmu,
vendar študije njune inaktivacije niso pokazale očitnih fenotipskih sprememb
(Davignon s sod., 2000).
(iii) Družina Gα12/13 – družino sestavljata dva predstavnika, katerih izražanje ni omejeno
na posamezna tkiva (Strathmann in Simon, 1990). Čeprav je bila vloga Gα12 in Gα13
opisana v že kar nekaj celičnih procesih, je raziskovanje njune vloge pri
signaliziranju težavno, saj isti receptorji poleg njiju aktivirajo tudi G-proteine iz
družine Gq.
(iv) Družina Gαs – v nasprotju z Gi/0, člani te družine stimulirajo delovanje adenilat-
ciklaz, in sicer vseh do sedaj poznanih različic (Sunahara s sod., 1996). Posebnost
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 9 -
vsesplošno izraženega gena za αs je, da lahko rezultira v štirih različno dolgih
proteinskih verigah, ki pa so funkcionalno med sabo nerazločljive (Freissmuth s sod.,
1991). Podenota αolf se izraža izključno v centralnem živčnem sistemu in čutilnih
vohalnih nevronih.
Dimer βγ je pri sesalcih lahko sestavljen iz petih različnih podenot β in dvanajstih podenot
γ (Schwindinger in Robishaw, 2001). Podenotam β je skupna terciarna struktura v obliki
propelerja iz sedmih β-listov, z izjemo β5 pa imajo tudi visoko stopnjo homolognih
aminokislinskih zaporedij (79-90%). Podenote γ so po drugi strani bolj heterogene, na
podenoto β pa se vežejo preko ovite vijačne domene na eni strani propelerju podobne
strukture (Sprang, 1997). Dimer βγ je dolgo bil razumljen kot pretežno pasiven partner
podenote α brez konkretne vloge pri prenosu signala, vendar je sedaj znano, da ima
pomembno vlogo pri regulaciji efektorjev, naprimer K+ kanalčkov, nekaterih izoform
adenilat-ciklaze in fosfolipaze C, nekaterih podtipov napetostno odvisnih Ca2+
kanalčkov
ter β- in γ-izoform fosfoinozitid-3-kinaz. Z izjemo nekaj redkih primerov velja, da glede
sposobnosti regulacije efektorjev, ni bistvenih razlik med posameznimi kombinacijami
podenot β in γ (Clapham in Neer, 1997).
1.1.1 Receptor za glukagonu podobni peptid-1 in njegov ligand GLP-1
Fiziološki ligand GLP-1R je 30 oz. 31 aminokislin velik peptidni hormon, imenovan
glukagonu podobni peptid-1 (GLP-1). Njegovo izražanje v specializiranih črevesno-
endokrinih celicah L, ki so locirane pretežno v distalnem predelu tankega in debelega
črevesa, je posledica zaužitja hranilnih snovi (Marathe s sod., 2013). Zapis zanj nosi
preproglukagonski gen (Gcg) (Slika 5A), ki skupaj z od glukoze odvisnim
inzulinotropičnim polipeptidom (GIP) in sekretinom spada v skupino genov devetih
bioaktivnih peptidov, imenovano PACAP/glukagonska naddružina (Marathe s sod., 2013).
Gen Gcg se nahaja na daljši roki drugega kromosoma (2q36-q37) in ima šest eksonov, pri
čemer posamezni eksoni 3, 4 in 5 nosijo zapis za glukagon, GLP-1 in GLP-2 (Schroeder s
sod., 1984). Tekom prepisovanja nastane skupna mRNA (Baggio in Drucker, 2007) (Slika
5B), ki nastopa kot celota tudi med prevajanjem v protein (White and Saunders, 1986)
(Slika 5C). Do tkivno-specifičnega peptidnega profila trebušne slinavke ter črevesja in
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 10 -
možganov pride šele na potranslacijskem nivoju (Slika 5D), pri čemer sodelujejo encimi
prohormon konvertaze (Rouille s sod., 1995). Iz tega razloga je aktivni GLP-1 označen kot
GLP-1(7-36), saj prvih šest aminokislin predstavlja vmesni peptid 1 (IP-1).
Slika 5: Shematski prikaz strukture (A) preproglukagonskega gena, (B) njegovega mRNA prepisa in (C)
proteina (Baggio in Drucker, 2007).
Poenostavljen diagram pleiotropnosti proglukagonskega gena. Poleg raznolikih učinkov proglukagonskih
produktov so le-ti v nekaterih primerih tudi nasprotujoči drug drugemu. Naprimer, glukagon in GLP-1 imata
nasprotno delovanje pri uravnavanju ravni glukoze v krvi. Fiziološki pomen IP-1 in IP-2 zaenkrat še ni znan.
GRPP − glicentinu podoben polipeptid. IP-1 in IP-2 − vmesni peptid 1 in 2.
Sam Gcg je bil odkrit pred približno 30 leti. Njegova genetika, fiziologija in biokemija so
relativno dobro poznani, predvsem zaradi uporabnosti tega znanja na področju medicine in
farmacije. Konkretno, GLP-1 ima učinke tako v centralnem živčnem sistemu (During s
sod., 2003; Navaro s sod., 1996) kot tudi v perifernem delu telesa (Barragan s sod., 1994;
Kreymann s sod., 1987). Poleg glavnih inzulinotropičnih in glukagonostatičnih učinkov
namreč vpliva na različna tkiva in organske sisteme, tako posredno kot neposredno (Slika
6).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 11 -
Slika 6: Učinki GLP-1 v različnih tkivih oz. organih (Baggio in Drucker, 2007).
Večina dosedaj poznanih učinkov je neposrednih, tj. preko direktne interakcije GLP-1 z receptorjem na
površini ciljnih celic trebušne slinavke, možganov, srca in želodca, medtem ko so učinki na jetra, skeletne
mišice in maščobno tkivo verjetno posredni, saj izražanje GLP-1R tam ni bilo opaženo.
GLP-1R je 64 kDa velik integralni membranski protein sestavljen iz 463 aminokislinskih
ostankov (Thorens, 1992) (Slika 7). Sedem transmembranskih regij v obliki α-heliksov je
dolgih 20-25 aminokislinskih ostankov. Znotrajcelični C-terminalni konec ni zaestren s
palmitatom in vsebuje tri pomembne serinske pare, na katerih poteka regulacijski
fosforilacijski/ defosforilacijski cikel (Widmann s sod., 1997). N-terminalni konec iz 120
aminokislinskih ostankov je relativno dolg ter vključuje več asparaginskih mest, ki so
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 12 -
potencialna mesta za N-glikozilacijo, in šest evolucijsko ohranjenih cisteinskih
aminokislinskih ostankov.
Slika 7: Shematski prikaz GLP-1R (Bavec, 2003).
Kristalna struktura GLP-1R še ni poznana, objavljena pa je bila stereoskopska slika
njegovega tridimenzionalnega modela (Frimurer in Bywater, 1999) (Slika 8). Postavljen je
bil na osnovi elektronske kristalografske slike transmembranske domene žabjega rodopsina
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 13 -
(Unger s sod., 1997) in ob predpostavki, da sta med proteini iste družine oz. naddružine
ohranjeni predvsem funkcija in terciarna struktura in ne toliko aminokislinsko zaporedje.
Pri modeliranju tridimenzionalne strukture so se še kot posebej uporabne izkazale
soodnosne mutacije, ki so pomembne za ohranitev strukture oz. funkcije proteina (Horn s
sod., 1998). Ker vsebujejo informacijo o interakcijah med receptorjem in hormonom
(Pazos s sod., 1997) so v praksi uporabne kot "evolucijska sledilna" metoda (Lichtarge s
sod., 1996). Velja namreč, da so aminokislinska mesta, neposredno odgovorna za funkcijo,
popolnoma ohranjena, medtem ko aminokislinska mesta, odgovorna za ohranjanje
strukture, ki to funkcijo omogoča, lahko mutirajo soodnosno, vse dokler posledico
spremembe enega aminokislinskega ostanka nadomesti oz. izniči sprememba
drugega/drugih aminokislinskih ostankov (Frimurer in Bywater, 1999). Torej takšnim
mutacijam, ki ne vplivajo na strukturo na način, da bi bila prizadeta funkcija proteina,
pravimo soodnosne mutacije.
Slika 8: Stereoskopska slika tridimenzionalnega modela človeškega GLP-1R (Frimurer in Bywater, 1999).
Zunajcelični predel je zgoraj, znotrajcelični pa spodaj. Receptor je orientiran ortogonalno glede na
membrano, Z-os kaže navzdol. Z rdečo, rožnato, rjavo ter temno in svetlo modro barvo so označeni
aminokislinski ostanki s soodnosnimi mutacijami, z rumeno pa mesto ExxY (aminokislinski motiv, ki je
bistven za konformacijske spremembe ob aktivaciji receptorjev GPCR (Scheer s sod., 1996)).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 14 -
Z GLP-1 posredovano signaliziranje vključuje aktivacijo vsaj dveh signalnih poti (Slika 9):
(i) adenilat-ciklazno/cAMP/protein kinazno A pot, ki poveča od glukoze odvisno izločanje
inzulina (Göke in Conlon, 1988; Wheeler s sod., 1993) in (ii) fosfatidilinozitol 3-kinazno/z
zunajceličnim signalom povezano kinazno/protein kinazno Cξ pot, ki v β celicah vpliva na
izražanje inzulinskih genov ter celično proliferacijo (Buteau et al., 1999; Edvell and
Lindstrom, 1999). Čezmerno izražen GLP-1R se v celicah CHO sklaplja z različnimi tipi
podenot α G-proteinov (Montrose-Rafizadeh s sod., 1999) in celic sf9 (Bavec s sod.,
2003). Točkovne mutacije, delecije in študije vezave peptid-receptor so nakazale na
pomembno vlogo tretje znotrajcelične zanke pri aktivaciji G-proteinov in adenilat-ciklaze
(Bavec s sod., 2007; Mathi s sod., 1997; Takhar s sod., 1996). Konkretno, prejšnja študija
je z uporabo treh sintetičnih peptidov, katerih zaporedje je ustrezalo znotrajceličnim
zankam, pokazala, da imajo le-te različne vloge pri sklapljanju z G-proteini; prva in druga
zanka imata pomembno vlogo pri razločevanju med posameznimi tipi G-proteinov, s
katerimi se receptor sklaplja, medtem ko je tretja tista, preko katere se signal dejansko
prenese naprej (Bavec s sod. 2003). Kot kaže, je pri tem še posebej pomemben argininski
aminokislinski ostanek na mestu 348, saj njegova mutacija v glicin zmanjša afiniteto
receptorja do agonista in skoraj popolnoma prepreči proizvodnjo cAMP (Heller s sod.,
1996).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 15 -
Slika 9: Od GLP-1R odvisen znotrajceličen prenos signala v celicah trebušne slinavke (Baggio in Drucker,
2007).
Efektorji so označeni z različnimi barvami glede na njihovo najpomembnejšo fiziološko vlogo, odvisno ot
tega, ali so udeleženi pri sintezi in izločanju inzulina (zeleno), neogenezi in proliferaciji celic (modro),
zaviranju apoptoze (rdeče) ali zmanjševanju posledic stresa endoplazmatskega retikuluma (vijolično).
Negativna modulacija GLP-1R poteka s homologno oz. heterologno desenzibilizacijo
preko fosforilacije (Widmann s sod., 1996a,b; 1997). Poznana je še ena regulacija signalne
poti, in sicer preko mono-ADP-ribozilacije podenote β (Lupi s sod., 2000; 2002) in α (Di
Girolamo in Corda, 2003) G-proteinov, opaženi pri celicah CHO.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 16 -
1.2 RECEPTOR ZA GLUKAGONU PODOBNI PEPTID-1 PRI
ZDRAVLJENJU SLADKORNE BOLEZNI TIPA 2 IN DEBELOSTI
Proučevanje fiziologije GLP-1R že nekaj časa zelo pomembno z vidika iskanja novih
zdravil in postopkov zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti (Baggio in Drucker,
2007; Barber s sod., 2010; Ahren, 2011). Med tema dvema boleznima obstaja patogena in
epidemiološka povezava, za kar so vsaj delno odgovorni pleiotropni učinki endogenih
inkretinskih hormonov (Barber s sod., 2010). Inkretini so skupina gastrointestinalnih
hormonov, ki se izločijo iz celic prebavil kot posledica zaužitja hranilnih snovi (Barber s
sod., 2010). Odgovorni so za t.i. "inkretinski učinek", za katerega je značilno mnogo višje
izločanje inzulina iz β-celic po peroralni aplikaciji glukoze v primerjavi z intravensko
(McIntyre s sod., 1964). Obema boleznima je skupno nepravilno delovanje inkretinskih
hormonov, zato je primerno, da ju obravnavamo skupaj.
Sladkorna bolezen tipa 2 je v razvitem svetu v porastu. Pri tej bolezni gre za inzulinsko
neobčutljivost perifernih tkiv (npr. skeletnih mišic) in moteno izločanje samega inzulina,
dejavniki tveganja za razvoj bolezni pa so predvsem debelost, telesno neaktiven način
življenja in starost (Arulmozhi in Portha, 2006). Uveljavljeno zdravljenje izvajamo z dieto,
telesno aktivnostjo in farmakološkimi učinkovinami, kot so inzulin, bigvanidi, derivati
sulfonil uree in tiazolidindioni (Arulmozhi in Portha, 2006). Vendar imajo ta zdravila kar
nekaj stranskih učinkov, npr. hipoglikemijo, porast telesne mase in edem. Pri zdravljenju je
po navadi potrebna kombinacija več različnih zdravil hkrati, zato je potreba po novih
načinih zdravljenja velika (Arulmozhi in Portha, 2006). Kot uporabno se je že izkazalo
zdravljenje z inkretini, predvsem z GLP-1, saj le-ta stimulira izražanje inzulinskega gena,
posredno poveča inzulinsko občutljivost, stimulira proliferacijo obstoječih in zorenje
izvornih β-celic ter zavira njihovo apoptozo (Holst, 2003).
Debelost je značilna težava modernega časa in posredno ali neposredno vpliva na številne
zdravstvene probleme, kot so srčno-žilne bolezni, psiho-socialne in psihične motnje, težave
s sklepi, apnejo med spanjem in druge (Barber s sod., 2010). Svetovna zdravstvena
organizacija debelost definira kot stanje posameznika, ko je njegov indeks telesne mase
(ITM) večji od 30,0 kg/m2. Morda najpomembnejšo vlogo pri uravnavanju telesne mase
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 17 -
imajo ravno inkretini (Barber s sod., 2010). Danes je jasno, da ima GLP-1 neposreden
(zaviranje poobednega sproščanja glukagona iz α-celic, povečanje poobednega sproščanja
inzulina iz β-celic, inhibitoren vpliv na center za apetit v hipotalamusu) in posreden vpliv
(zaviranje apetita preko zakasnjenega praznjenja želodčne vsebine) na prehranjevalno
obnašanje posameznika (Barber s sod., 2010). Debelost zdravimo predvsem z ne-
peptidnimi zdravilnimi učinkovinami, npr. z orlistatom (Igel s sod., 2012), vendar pa k
zmanjšanju prevelike telesne mase prispevajo tudi peptidna zdravila, ki jih primarno
uporabljamo za zdravljenje sladkorne bolezni, npr. eksenatid in pramlintid (Igel s sod.,
2012).
GLP-1 ima pozitivne učinke tako pri zdravljenju debelosti kot tudi sladkorne bolezni tipa
2, vendar njegova terapevtska uporaba ni učinkovita, saj ga že po eni do dveh minutah
(razpolovni čas t1/2 < 2 min) inaktivira encim dipeptidil peptidaza IV (DPP IV) (Slika 10)
(Arulmozhi in Portha, 2006). Z odcepitvijo histidina in alanina na N-koncu peptida nastane
GLP-1(9-36)amid, ki je šibek antagonist za receptor GLP-1 (Arulmozhi in Portha, 2006).
Na GLP-1 temelječe zdravljenje zato poteka z učinkovinami, ki jih delimo v dve skupini:
peptidni agonisti receptorja GLP-1, ki niso substrat DPP-IV in inhibitorji DPP-IV
(Arulmozhi in Portha, 2006). Ker inhibitorji DPP-IV niso peptidi, temveč običajno majhne
molekule, jih na tem mestu ne bomo obravnavali, podrobneje pa so pregledno opisani
drugje (Arulmozhi in Portha, 2006; Holst, 2003; Nauck, 2011). Omenimo naj le tri
bistvene razlike med tema dvema skupinama: (i) agonisti receptorja GLP-1 vplivajo na
zmanjšanje telesne mase, medtem ko so inhibitorji DPP-IV glede tega nevtralni in zato
primerni le za zdravljenje sladkorne bolezni tipa 2 (Ahrén, 2011); (ii) inhibitorji DPP-IV
načeloma niso zelo selektivni, inhibirajo lahko tudi DPP-II, DPP-VIII, DPP-IX,
prolilendopeptidazo (PEP) in fibroblaste-aktivirajoči protein α (FAP-α) (Arulmozhi in
Portha, 2006); (iii) DPP-IV je pleiotropen encim (inaktivacija nekaterih peptidnih
hormonov, nevropeptidov in kemokinov, vezava fibronektina in adenozin deaminaze),
katerega inhibicija ima lahko stranske učinke, ki pri agonistih receptorja GLP-1 niso
mogoči (Arulmozhi in Portha, 2006).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 18 -
Slika 10: Shematski prikaz z DPP-IV posredovane deaktivacije GLP-1. Zaradi jasnosti je prikazanih samo
prvih 11 aminokislin GLP-1(7-36) (Arulmozhi in Portha, 2006).
Pri načrtovanju agonistov receptorja GLP-1 lahko izhajamo iz strukture samega GLP-1 (t.i.
analogi GLP-1) ali pa iz eksendina-4 (peptid, izoliran iz žleze slinavke kuščarja Heloderma
suspectum) (Arulmozhi in Portha, 2006). Poleg učinkovitosti in netoksičnosti sta bistvena
pogoja, ki ju mora analog oz. peptidomimetik izpolnjevati, odpornost proti encimskemu
delovanju DPP-IV in čim manjše izločanje preko ledvic, pri čemer si pogosto pomagamo z
vezavo na albumin (Ahrén, 2011). Subkutani vnos se izvrši dvakrat (eksanatid) ali enkrat
(liraglutid in liksisenatid) na dan oz. enkrat na teden (taspoglutid in albiglutid) (Ahrén,
2011). Eksenatid je bil prvi agonist receptorja GLP-1 na tržišču, odobren za klinično
uporabo leta 2005. Je sintezen ekvivalent eksendina-4 in kljub temu, da kaže le 53%
homologijo z GLP-1, se na receptor veže s primerljivo afiniteto (Ahrén, 2011). Razpolovni
čas je občutno daljši (okrog 2 uri) v primerjavi z GLP-1 (1-2 min). Učinkovita terapevtska
koncentracija pa se v telesu ohrani od 6 do 8 ur (Ahrén, 2011), predvsem zaradi
zmanjšanega ledvičnega izločanja (Arulmozhi in Portha, 2006). Neželeni učinki
eksenatida, ki se pojavljajo pri približno 40% bolnikov, so predvsem občutek slabosti in
bruhanje (ta dva sčasoma oslabita), nekje v enakem deležu pa bolniki razvijejo protitelesa
proti zdravilu (Ahrén, 2011). Najhujši domnevni stranski učinek pa je akutni pankreatitis, a
je vzročno-posledično povezavo težko pripisati zgolj eksenatidu, saj je ta bolezen pri
sladkornih bolnikih per se trikrat pogostejša (Nauck, 2011).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 19 -
Glavne omejitve in slabosti agonistov receptorja GLP-1 so (Arulmozhi in Portha, 2006):
(i) Mesto vnosa: potreba po subkutanem oz. intravenskem vnosu omejuje njihovo
uporabo. Najprimernejša bi bila peroralna uporaba.
(ii) Kemijska stabilnost: GLP-1 je v raztopini stabilen le kratek čas. Neoptimalni pogoji
(pH, temperatura) pospešujejo racemizacijo, hidrolizo peptidnih vezi, deamidacijo in
oksidacijo aminokislin. Eksenatid in liraglutid naj bi bila zadovoljivo stabilna.
(iii) Imunogenost: pri eksenatidu in liraglutidu se razvijejo protitelesa proti zdravilu.
Čeprav se še noben od ostalih novih testiranih peptidov ni izkazal za imunogenega,
jih moramo potencialno smatrati kot take.
(iv) Neželeni učinki: občutek slabosti in bruhanje sta pričakovana in logična neželena
učinka, saj agonisti receptorja GLP-1 upočasnijo praznjenje želodca, pojavita se
lahko povišan srčni utrip in krvni tlak, povečano pa je tudi tveganje za razvoj
akutnega pankreatitisa.
1.3 POTRANSLACIJSKE SPREMEMBE CELIČNIH RECEPTORJEV
Potranslacijska sprememba (PTS) je biokemijski mehanizem, pri katerem se na specifičen
aminokislinski ostanek kovalentno, večinoma encimsko katalizirano, veže funkcionalna
skupina ali majhna molekula (Walsh, 2006). Zanimiv pogled na PTS z vidika evolucije je
podal Prabakaran s sod. (2012), ki zagovarja tezo, da so PTS "osvoboditev žive narave od
genetskega ujetništva". Zaporedja baznih parov nekega gena se namreč bistveno
spreminjajo le na evolucijski časovni skali, ne pa tudi v obdobju življenja posameznega
organizma (če pa se neka mutacija že zgodi, je običajo naključna in je redko v korist
preživetja tega organizma). Zaradi tega dejstva genetska zasnova organizma pogosto
predstavlja bistveno omejitev pri njegovem razvoju, fiziološkem razponu v odrasli dobi ter
nenehnem boju proti povzročiteljem bolezni in drugim škodljivim vplivom okolja. PTS
tako omogočajo spremembe lastnosti proteinov takrat, ko je to potrebno in točno tiste, ki so
potrebne. Delitev PTS je običajno na dveh nivojih: glede na spremenjeni aminokislinski
ostanek in glede na molekulo, ki se je nanj vezala (Walsh, 2006). Kovalentna vezava
molekule praviloma poteče le z reaktivnimi funkcionalnimi skupinami (−OH, −SH, −NH2,
−NH) na stranski verigi Asp, Glu, Ser, Lys, Asn, Thr, Arg, Gln, His, Tyr in Ser, veliko
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 20 -
večja raznolikost pa obstaja na nivoju vezanih molekul. Znanih je že več kot 50 različnih
funkcionalnih skupin in malih molekul, ki so udeležene pri PTS. Najbolj znani in pogosti
so alkilacija, izoprenilacija, GPI-zacija, fosforilacija, mono-ADP-ribozilacija, glikozilacija,
hidroksilacija, in druge. Fiziološki pomen in posledice PTS (lokalizacija v membrani,
sprememba encimske aktivnosti oz. specifike, sprememba strukture, sprememba prenosa
signala, in druge) so manj odvisne od kovalentno vezane molekule, bolj pa od same
običajne funkcije spremenjenega proteina in predela njegove tridimenzionalne strukture,
kjer je do spremembe prišlo (Walsh, 2006).
Pri evkariontih je regulacija funkcije proteinov s PTS osrednji molekularni mehanizem,
preko katerega se uravnava dejavnost signalnih poti (Hess in Stamler, 2011). PTS so bodisi
ireverzibilne (strukturna in lokalizacijska vloga) bodisi reverzibilne (signalizacijska vloga).
Pri efektorjih in modulatorjih so reverzibilne PTS povsem običajne in pogosto celo nujni
del prenosa signala, pri samih receptorjih pa imajo reverzibilne PTS običajno vlogo
oslabitve oz. prekinitve prenosa signala (Walsh, 2006). Pri GPCR že sama 7-
transmembranska topografija predstavlja relativno visoko stopnjo strukturne in funkcijske
kompleksnosti, PTS pa le-to še bistveno povečajo (Qanbar in Bouvier, 2003). Na
zunajceličnem področju GPCR je najobičajnejša glikozilacija, pri čemer je N-glikozilacija
bila pokazana že zelo zgodaj v začetku raziskovanja teh receptorjev (Renthal s sod., 1973),
medtem ko je O-glikozilacija bila ugotovljena še ne tako dolgo nazaj (Petäjä-Repo s sod.,
2000; Sadeghi in Birnbaumer, 1999). Poleg glikozilacije je zelo pogosta tudi fosforilacija,
ki večinoma poteče na znotrajceličnih serinskih aminokislinskih ostankih C-konca in tretje
zanke, ima pa regulatorno vlogo pri prenosu signala (desenzibilizacija in internalizacija
receptorja) (Tsao in von Zastrow, 2001). Izmed alkilacij je omembe vredna palmitoilacija,
ki ima običajno vlogi sidranja v membrano (npr. dolgega C-konca), a dejstvo, da je lahko
protein tekom svoje življenske dobe večkrat (de)palmitoiliran, kaže na morebitno
regulatorno vlogo te PTS (Mumby, 1997).
1.3.1 Mono-ADP-ribozilacija
Mono-ADP-ribozilacija je PTS celičnih proteinov, kjer se molekula ADP-riboze iz
molekule β-NAD+ prenese na specifičen aminokislinski ostanek različnih celičnih
proteinov, s čimer se njihova biološka vloga spremeni. Encimsko katalizirana mono-ADP-
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 21 -
ribozilacija je bila prvič opisana kot mehanizem delovanja nekaterih bakterijskih toksinov
(Ueda in Hayaishi, 1985), kot so difteria, kolera, pertusis in klostridia toksin. Kasneje je
bilo pri evkariontih ugotovljenih mnogo celicam lastnih mono-ADP-riboziltransferaz
(ART), ki podobno kot bakterijski toksini vežejo ADP-ribozni ostanek preko N- ali S-
glikozidne vezi. Po lokalizaciji ločimo zunajcelične (GPI-sidrane ali sekretorne), udeležene
pri miogenezi, imunskem odzivu in aktivnosti rastnih faktorjev, ter znotrajcelične (proste
ali z membrano povezane), ki sodelujejo pri sintezi in procesiranju proteinov v
endoplazmatskem retikulumu, pri aktivnosti mitohondrijske glutamat dehidrogenaze, pri
strukturi citoskeleta in pri prenosu signala (Corda in Di Girolamo, 2002; 2003; Di
Girolamo s sod., 2005; Hassa s sod., 2006; Koch-Nolte s sod., 1996; 2001). Na tem mestu
je zanimivo omeniti, da spadajo zunaj- in znotrajcelične ART z vidika strukture v dve
povsem različni skupini (Di Girolamo s sod, 2005), kar nakazuje na njihov različen
evolucijski izvor oz. razvoj.
Fosforilacija/defosforilacija specifičnih aminokislinskih ostankov je najbolj poznana
ciklična in reverzibilna PTS proteinov, ki spremeni njihovo biološko funkcijo. Vendar je
vedno več dokazov, da ima endogena arginin-specifična mono-ADP-ribozilacija podobno
vlogo, tako pri bakterijah kot pri evkariontih (Haag in Koch-Nolte, 1997; Corda in Di
Girolamo, 2002; 2003). Poleg ART je v tem procesu udeležena tudi ADP-ribozilhidrolaza
(ARH), katera specifično odstrani ADP-ribozni ostanek in tako regenerira prosti
aminokislinski ostanek (Slika 11).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 22 -
Slika 11: Shematski prikaz reverzibilnosti mono-ADP-ribozilacije, ki jo katalizirata mono-ADP-
riboziltransferaza in mono-ADP-hidrolaza (Corda in Di Girolamo, 2003).
Namesto argininskega aminokislinskega ostanka so lahko mesto mono-ADP-ribozilacije še cistein, diftamid
in asparagin.
Prvi takšen primer je bil opisan pri bakteriji Rhodospirillum rubrum, pri kateri mono-ADP-
ribozilacija sodeluje pri uravnavanju dušikovega metabolizma (Ludden, 1994). V ciklični
reverzibilni reakciji sodelujeta encima dinitrogenaza reduktaza ADP-riboziltransferaza
(DRAT) in dinitrogenaza reduktaza ADP-ribozilhidrolaza (DRAG). Razlogov, zakaj
sprememba ravno na argininskem ostanku in ne na katerem drugem (npr. serinskem,
asparaginskem, diftamidnem, aspartatnem ali glutamatnem), je več. Mono-ADP-
ribozilacija argininskega ostanka nekega proteina je namreč v živih sistemih najpogostejša
in tudi spremenjene lastnosti takega proteina so relativno velike, saj so posledica tako
steričnih ovir (velikost ADP-riboznega ostanka približno ustreza velikosti treh
aminokislin), kot tudi spremembe električnega naboja (pri fiziološkem pH je stranka veriga
argininskega ostanka enkrat pozitivno nabita, ADP-ribozni ostanek pa je dvakrat negativno
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 23 -
nabit) (Laing s sod., 2011). Poleg tega je bila pri sesalcih identificirana le arginin-
specifična ARH, imenovana ADP-ribozilhidrolaza-1 (ARH1), ki je homolog bakterijske
DRAG z enako encimsko specifiko (Moss s sod, 1988). ARH1 je do neke mere namreč
sposobna odpraviti posledice bakterijskih arginin-specifičnih ART, kar je nenazadnje
zanimivo tudi z medicinskega vidika (Kato s sod., 2007).
Primer mono-ADP-ribozilacije kot regulacijskega mehanizma pri sesalcih je mono-ADP-
ribozilacija podenote β G-proteinov (Lupi s sod., 2000; 2002) (Slika 12). V tem primeru je
mono-ADP-ribozilacija katalizirana z arginin-specifično in s plazemsko membrano
povezano (a ne GPI-sidrano) ART (Corda in Di Girolamo, 2003). Ta encim specifično
spremeni argininski aminokislinski ostanek na mestu 129, ki se nahaja v efektor-vezavni
domeni podenote β (Corda in Di Girolamo, 2003), s čimer je preprečena modulacija
efektorjev, kot so adenilat-ciklaza tipa 1 (Lupi s sod., 2000), fosfoinozitid 3-kinaza-γ in
fosfolipaza C-β2 (Lupi s sod., 2002). Regulacijski cikel je zaključen, ko citosolna mono-
ADP-ribozilhidrolaza (ARH) odcepi kovalentno vezan ADP-ribozni ostanek (Lupi s sod.,
2000) (Slika 12).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 24 -
Slika 12: Shematski prikaz mono-ADP-ribozilacijskega/deribozilacijskega cikla podenote β G-proteinov,
kataliziranega z ART (iART) in ARH (Di Girolamo s sod., 2005).
Črtkana puščica nakazuje na možno hormonalno regulacijo ART s strani receptorja. Rožnata puščica
predstavlja sklopitev z efektorji, rožnata črta pa odsotnost sklopitve. Spodaj: Shematski prikaz kovalentne N-
glikozidne povezave med ADP-ribozo in Arg129, ki je posledica katalize z ART. α, β, γ – podenote α, β in γ
G-proteinov. PI3Kγ – fosfoinozitid-3-kinaza γ. PLC-β2 – fosfolipaza C-β2. AC1 – adenilat-ciklaza tipa 1.
NAM – nikotinamid. iART – endogena mono-ADP-riboziltransferaza. ARH – citosolna mono-ADP-
ribozilhidrolaza.
Kolikor nam je znano, mono-ADP-ribozilacija do sedaj še ni bila pokazana kot možen
regulacijski mehanizem pri nobenem izmed GPCR. Naše ugotovitve zato predstavljajo prvi
korak v to smer in odpirajo povsem nov pogled na še neraziskane možnosti regulacije te
največje skupine membranskih receptorjev.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 25 -
1.4 SINTETIČNI PEPTIDI KOT PEPTIDNA ZDRAVILA
Peptidna zdravila so postala prva izbira pri zdravljenju alergij, mikrobnih bolezni, rakavih
tvorb, sladkorne bolezni, srčno-žilnih obolenj, debelosti, artritisa in drugih (Ayoub in
Scheidegger, 2006). Še posebej v zadnjem desetletju njihova uporaba in popularnost še
vedno naraščata, predvsem zaradi napredka v sintezni kemiji, nanotehnologiji, tehnologiji
čiščenja in strategijah pri dostavi zdravil (Glaser, 2009). Peptidi so sestavljeni iz 2 do 50
aminokislin, ki se v procesu kemijske kondenzacije med seboj povežejo s peptidno vezjo.
Od proteinov se razlikujejo le v številu aminokislinskih ostankov. Zgornja meja za peptid
je približno 50 aminokislinskih ostankov, poudariti pa je potrebno, da je ta omejitev zgolj
arbitrarna saj natančne definicije ni. Kot zdravilne učinkovine uporabljamo naravne
peptide, s tehnologijo rekombinantne DNA spremenjene peptide in kemijsko spremenjene
peptide. Najobičajnejše spremembe so dodajanje, odvzemanje ali zamenjava standardnih
aminokislin, lahko pa poleg slednjih peptidi vsebujejo še druge aminokisline in/ali imajo
kovalentno vezane razne organske spojine oz. funkcionalne skupine (Frokjaer in Otzen,
2005). V splošnem peptidna zdravila povzročajo manj stranskih učinkov kot nizko-
molekularne učinkovine. Njihove prednosti pred ostalimi skupinami zdravil so predvsem
visoka aktivnost in specifičnost, visoka učinkovitost, minimalne interakcije zdravilo–
zdravilo, nizka raven kopičenja v tkivih in posledično nizka toksičnost, nudijo pa tudi
veliko biološko in kemijsko raznolikost (Ayoub in Scheidegger, 2006).
Da pa razvoj in uporaba peptidnih zdravil nista še večja, so v prvi vrsti krive še nerešene
pomanjkljivosti, vezane na stabilnost peptidov, ki se kažejo kot kratek razpolovni čas,
težavna dostava do mesta delovanja ter zahtevna in draga proizvodnja (Ayoub in
Scheidegger, 2006). Obstajata dva glavna načina proizvodnje vsak s svojim naborom
prednosti. Metode na osnovi tehnologije rekombinantne DNA so v določenih primerih
proizvodnje velikih količin lahko cenovno najugodnejše (Peptide Synthesis…, 2009).
Biotehnološki postopek je zelo učinkovit tudi pri daljših aminokislinskih zaporedjih npr.
100 in več aminokislinskih ostankov (Peptide Synthesis…, 2009). Vendar je lahko razvoj
učinkovitega rekombinantnega programa proizvodnje drag in zamuden, pogosto so
potrebni kompleksni proizvodni koraki (Peptide Synthesis…, 2009). Nasprotno je
kemijska sinteza bolj prilagodljiva in ni omejena na uporabo zgolj proteinogenih
aminokislin (Peptide Synthesis…, 2009). Primerna je za proizvodnjo različnih količin
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 26 -
peptidne učinkovine, saj je stroškovno ugodna pri količinah nekaj gramov do več
kilogramov (Peptide Synthesis…, 2009).
Mesto in način vnosa sta zelo pomembna dejavnika, saj vplivata tako na kemijsko in
fizikalno obliko zdravila kot tudi na sestavo in obliko pomožnih snovi. Peroralni vnos, na
primer, pogojuje obliko, ki je stabilna pri različnih vrednostih pH in odporna na proteolizo,
medtem ko vnos preko mukoznih membran nosne votline zahteva velikost delcev več μm
ter večjo stopnjo lipofilnosti. Intravenski vnos je seveda najbolj učinkovit, saj vnesemo
zdravilo neposredno v sistemski krvni obtok, hkrati pa tudi najmanj praktičen in
sprejemljiv za bolnika. Možen je za večino zdravil. Problemi pri drugih načinih vnosa
peptidnih zdravil so relativno velika molekulska masa, električni naboj, relativna hidrofilna
narava (zato oteženo prehajanje skozi membrane) in nestabilnost v okoljih s proteolizno
aktivnostjo ter nizkimi in visokimi vrednostmi pH (Pettit in Gombotz, 1998). Glavna mesta
vnosa zdravila v telo poleg intravenskega so pljuča, sluznice in koža (Pettit in Gombotz,
1998).
Za učinkovito in natančno ciljanje izkoriščamo specifične fizikalne in/ali kemijske
značilnosti tkiv oz. organov, kot so prisotnost specifičnih receptorjev, povišan pretok krvi,
izbirna prepustnost membran, površinski električni naboj, idr., ali pa si pomagamo z
njihovimi svojstvenimi fiziološkimi parametri, kot so na primer nizke in visoke vrednosti
pH (Pettit in Gombotz, 1998). V določenih primerih, pri katerih (še) ni razvitih načinov za
ciljanje, zdravila vnašamo v sistemski krvni obtok, s čimer se nespecifično in bolj ali manj
enakomerno razporejajo po celem telesu. S tem je seveda nevarnost stranskih učinkov
večja in učinkovitost zdravila manjša. Pri sistemskem vnosu je zelo pomembno doseči čim
manjšo odstranitev zdravila iz krvi preko ledvic ter zmanjšati biotransformacijo v jetrih
(Okada s sod., 1994; Pettit in Gombotz, 1998). Mnogi peptidi, kot na primer inzulin, že
zaradi svoje narave ciljajo specifičen receptor oz. makromolekulo, medtem ko drugi
peptidi niso selektivno specifični oz. se vežejo na celične strukture z manjšo afiniteto.
Slednjim lahko z ustreznimi kemijskimi spremembami strukture in/ali tehnikami dostave, s
pomočjo katerih jih usmerimo čim bliže mestu delovanja, močno povečamo učinkovitost.
Tudi peptide z že obstoječo specifično vezavo lahko naredimo učinkovitejše, če jim
afiniteto povečamo (Pettit in Gombotz, 1998). Najuporabnejši so trije splošni pristopi:
fuzijski kompleks peptida s protitelesom ali delom protitelesa (npr. fuzija peptida z enojno
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 27 -
verigo variabilne regije imunoglobulina, scFv), fuzija peptida z drugimi proteini, ki se
specifično vežejo z receptorji (npr. fuzija peptida z transformirajočim rastnim faktorjem α,
TGFα) in fuzija peptida z ogljikovimi hidrati, ki se vežejo z receptorji, ki prepoznajo
specifične monosaharide (npr. fuzija peptida z oligosaharidi, ki vsebujejo manozo) (Pettit
in Gombotz, 1998).
V naši raziskavi uporabljeni sintetični peptidi so ustrezali aminokislinskemu zaporedju
tretje znotrajcelične zanke oz. točkovnim mutantam le-tega. V prejšnjih študijah so se že
pokazali kot učinkovito orodje za študij prenosa signala preko GLP-1R (Bavec, 2003;
Bavec s sod., 2003; Bavec s sod., 2007), nobeden izmed njih pa še ni bil predlagan v
terapevtske namene. Torej tudi s tega vidika naša študija predstavlja bistveno novost in
prvi korak v to smer.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 28 -
2 NAMEN DELA IN ZNANSTVENA HIPOTEZA
GLP-1R je membranski receptor β-celic trebušne slinavke in med najbolj proučevanimi
celičnimi proteini pri odkrivanju zdravil in postopkov za zdravljenje sladkorne bolezni tipa
2 in debelosti. Opažena, vendar nepojasnjena ostajata način in vloga mono-ADP-
ribozilacije tretje znotrajcelične zanke GLP-1R pri prenosu signala na končne molekule, ki
sodelujejo pri odgovoru celice na signalno molekulo. Namen tega dela je proučiti mono-
ADP-ribozilacijo GLP-1R kot morebiten nov način potranslacijskega uravnavanja
aktivnosti receptorja.
Edina do sedaj poznana PTS GLP-1R z regulacijsko vlogo pri prenosu signala je
fosforilacija na C-koncu, česar posledica je homologna desenzibilizacija in internalizacija
receptorja (Widmann s sod., 1996a; Widmann s sod., 1996b, Widmann s sod., 1997). Na
osnovi naslednjih dejstev smo prišli do ideje, da bi lahko mono-ADP-ribozilacija arginina
348 predstavljala nov način regulacije aktivnosti receptorja, in sicer: (i) tretja
znotrajcelična zanka je potrjeno glavna pri prenosu signala do G-proteinov (Bavec s sod.,
2003; Mathi s sod., 1997: Takhar s sod., 1996), (ii) možnost mono-ADP-ribozilacije je že
bila pokazana (Bavec, 2003), (iii) mutacija arginina 348 v glicin zmanjša afiniteto
receptorja do agonista in utiša signalizacijo posredovano z Gαs (Heller s sod., 1996) ter (iv)
opažena je bila visoka stopnja podobnosti med aminokislinami okrog spremenjenega
arginina podenote β ter predpostavljenega arginina 348 GLP-1R. Na osnovi tega smo
postavili naslednjo hipotezo:
Endogena mono-ADP-riboziltransferaza je odgovorna za in vitro mono-ADP-
ribozilacijo ne samo podenote β G-proteinov, ampak tudi tretje znotrajcelične
zanke GLP-1R, in sicer na argininskem ostanku na mestu 348 v GLP-1R.
Poleg ugotavljanja potranslacijske regulacije aktivnosti GLP-1R obstaja tudi potencialna
uporabnost naše raziskave pri zdravljenju sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti. Aktivacija
GLP-1R stimulira izražanje inzulinskega gena, posredno poveča inzulinsko občutljivost,
stimulira proliferacijo obstoječih in zorenje izvornih celic β in zavira njihovo apoptozo.
Prav tako vpliva na prehranjevalno obnašanje posameznika, neposredno (zaviranje
poobednega sproščanja glukagona iz -celic, povečanje poobednega sproščanja inzulina iz
celic β, inhibitoren vpliv na center za apetit v hipotalamusu) in posredno (zakasnjeno
praznjenje želodca). Ravno zato lahko vsako dodatno poznavanje fiziologije GLP-1R
močno pripomore k izboljšanju načinov zdravljenja teh dveh nadlog modernega časa.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 29 -
3 PRIČAKOVANI REZULTATI
Z naraščajočimi koncentracijami peptida IC3 se stopnjuje inhibicija mono-ADP-ribozilacije
podenote β G-proteinov.
Tudi peptid IC3 se mono-ADP-ribozilira, zato inhibicija mono-ADP-ribozilacije podenote
β G-proteinov ne poteka preko G-proteinov ali kako drugače, temveč prihaja do
neposredne interakcije med endogeno mono-ADP-riboziltransferazo in peptidom IC3 v
procesu kompetitivne inhibicije.
Nespecifične vezave β-NAD+ oz. ADP-riboze ter neencimske kovalentne vezave ADP-
riboze na peptid IC3 ni.
Mono-ADP-ribozilacija peptida IC3 se zgodi na argininskem ostanku na mestu 348
molekule GLP-1R.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 30 -
4 MATERIALI IN METODE
4.1 MATERIALI
Pri delu smo uporabili kemikalije in reagente visoke čistosti (p.a. oz. analytical grade),
katere smo naročili pri Sigma Aldrich Co. (ZDA), z izjemo naslednjih: celice ovarija
kitajskega hrčka CHO-K1 (ECACC, Velika Britanija); [32
P]β-NAD+, ECL paket reagentov
RPN 2106 in dekstran 500 (Amersham Pharmacia Biotech, Velika Britanija); Hank's
Balanced Salt Solution (Gibco, Velika Britanija); fetusni serum goveda (Biochrom,
Nemčija); Dulbecco's Modified Eagle's Medium, akrilamid/bis-akrilamid in ostale
elektroforetske reagente (Eurobio, Francija); sintetične peptide IC3 (CIVIAKLKAN
LMCKTDIKCR LAK), IC3(R348A) (CIVIAKLKAN LMCKTDIKCA LAK), IC3(C341A)
(CIVIAKLKAN LMAKTDIKCR LAK) in IC3(R348A,C341A) (CIVIAKLKAN
LMAKTDIKCA LAK) (GenicBio, ZDA); nitrocelulozne membrane (Schleicher in
Schuell, Nemčija); scintilacijsko tekočino Ultima Gold (Packard, ZDA); polietilen glikol
4000 (Merck, ZDA); primarna zajčja poliklonska anti-β protitelesa T-20 (Santa Cruz
Biotechnology, ZDA) in sekundarna kozja anti-zajčja protitelesa s konjugirano hrenovo
peroksidazo (Calbiochem, ZDA).
4.2 CELIČNE KULTURE
Celice ovarija kitajskega hrčka (CHO) smo gojili v enoplastni kulturi na plastičnih
petrijevih posodah premera 100 mm v 10 mL medija Dulbecco's Modified Eagle's Medium
(DMEM) z dodatkom 10% fetusnega seruma goveda (FBS), 0,39% NaHCO3 58 mg/L
prolina, 53 mg/L asparaginske kisline, 59 mg/L glutaminske kisline, 60 mg/L asparagina,
100 enot/mL penicilina in 100 µg/mL streptomicina pri 37°C v atmosferi s 5% CO2.
4.3 IZOLACIJA PLAZEMSKIH MEMBRAN CELIC CHO
Plazemske membrane smo izolirali po predhodno uporabljenem protokolu (Bavec, 2004), z
manjšimi spremembami. Celicam (prib. 2 x 108) smo odstranili gojišče, jih sprali s pufrom
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 31 -
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) brez Ca2+
in Mg2+
ter jih ločili od podlage s
pomočjo hipotoničnega pufra (10 mM TES, pH 7,5 in 1 mM EDTA). Vse nadaljnje delo je
potekalo pri 4°C. Za homogenizacijo celic smo uporabili Potterjev homogenizator
(Teflon/steklo), sledilo je 10 min centrifugiranje pri 300 g in nadaljnje 20 min
centrifugiranje supernatanta pri 42.000 g. Supernatant smo zavrgli, usedlino celokupnih
membran pa resuspendirali v 1 mL 10 mM pufra TES (pH 7,5) z 0,25 M saharozo.
Plazemske membrane smo ločili od preostale raztopine z vodnim dvofaznim sistemom
dekstran/polietilenglikol tako, da smo 1 mL celokupnih membran zmešali z 2,72 g 20 %
dekstrana 500, 1,156 g 40% polietilen glikola 4000, 800 µL 1 M saharoze, 2,124 mL
deionizirane vode in 200 µL 0,2 M kalij fosfatnega pufra (pH 7,4). Po 15 min neprestanem
mešanju smo zmes centrifugirali 20 min pri 2500 g, nato zgornjo dekstransko fazo
prenesli v tubico, preostali polietilenglikolni fazi pa dodali svežo dekstransko fazo, ki smo
jo pridobili iz kontrolne epruvete brez plazemskih membran po 20 min centrifugiranju pri
2500 g. Ekstrakcijo smo ponovili s 15 min mešanjem in 20 min centrifugiranjem pri
2500 g. Zgornjo dekstransko fazo smo združili s tisto iz prve ekstrakcije, kamor smo
dodali 5-kratno prostornino 10 mM pufra TES (pH 7,5) z 0,25 M saharoze. Sledilo je 35
min centrifugiranje pri 48.000 g. Usedlino smo resuspendirali v 500 µL 25 mM Hepes
pufra (pH 7,5) s 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Mešanici smo dodali inhibitorje proteaz,
500 µM O-fenantrolin, 2 µM pepstatin in 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid. Nazadnje smo
tej mešanici izmerili koncentracijo proteinov z Bioradovo metodo pri 595 nm.
4.4 DOLOČANJE HITROSTI VEZAVE [35
S]GTPγS NA G-PROTEINE V
PLAZEMSKIH MEMBRANAH CELIC CHO
Vezavo [35
S]GTPγS na G-proteine smo ugotavljali po že znanem protokolu (Bavec s sod.,
1999), z manjšimi spremembami. Pripravili smo 100 µL reakcijske mešanice v pufru TE
(10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA) s 500 µg/mL plazemskih membran, 5 mM
MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 150 mM NaCl, 1 µM GDP in 0,5-1 nM [35
S]GTPγS
(prib. 140.000 cpm) ter inkubirali 2 min brez peptida oz. z različnimi koncentracijami
posameznega peptida. Nevezani [35
S]GTPγS smo odstranili s hitro filtracijo reakcijske
mešanice skozi filter s steklenimi vlakni Millipore GF/C s pomočjo podtlaka in sprali 3-
krat s 5 mL pufra TE. Ekstrakcija radioaktivne snovi na filtru z 20 mL scintilacijske
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 32 -
tekočine Emulsier-safe (Packard, ZDA) je potekala preko noči. Naslednji dan smo s
scintilacijskim števcem LKB 1214 Rackbeta izmerili stopnjo radioaktivnosti. Predhodni
poskusi so pokazali zanemarljivo nespecifično vezavo. Slepo vrednost je predstavljala
meritev vzorca, pripravljenega po enakem postopku, pri čemer smo plazemske membrane
nadomestili s pufrom.
4.5 LOČITEV PROTEINOV Z NaDS-PAGE, PRENOS NA
NITROCELULOZNO MEMBRANO IN DETEKCIJA PODENOTE β
Na 11% elektroforetski gel (Hoefer SE600) dolžine 16 cm smo nanesli 50 µL vzorca
proteinov (50 µg proteinov) in 50 µL 2 koncentriranega Laemmli pufra (0,125 M Tris-
HCl (pH 6,8), 4% NaDS, 20% glicerol, 1,25 M β-merkaptoetanol, 0,002% pironin). Vzorce
smo pred nanosom na gel segrevali 5 minut pri 100 0C. Za ločevanje proteinov v zbiralnem
gelu (2,5 mL 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 1.5 mL 40% mešanice akrilamida (37,5 : 1), 100
µL 10% NaDS, 100 µL 10% amonijevega persulfata, 10 µL TEMED in 5,8 mL distilirane
vode) smo uporabili električni tok 30 mA, za ločevanje v ločevalnem gelu (7,5 mL 1,5 M
Tris-HCl (pH 8,8), 8,25 mL 40% mešanice akrilamida (37,5 : 1), 300 µL 10% NaDS, 300
µL 10% amonijevega persulfata, 20 µL TEMED in 14.25 mL distilirane vode) pa 45 mA.
Ločevanje z aparatom EPS 601 (Amersham Biosciences) v elektroforetskem pufru (3,0 g
Tris baze, 14,4 g glicina, 1,0 g NaDS in 1 L distilirane vode) je trajalo 2-3 h. Temperaturo
elektroforetskega pufra smo s pomočjo hladilnika in vodne črpalke (MultiTemp III)
vzdrževali pri 11°C. Po ločitvi na gelu smo proteine z aparatom TE 62 Transphor II
prenesli na nitrocelulozno membrano. Prenos pri 400 mA v prenašalnem pufru (1 L
metanola, 3,5 L distilirane vode, 500 mL 10 TB, 60 g Tris baze in 288 g glicina) je trajal
5 h. Kot prej smo temperaturo prenašalnega pufra vzdrževali pri stalni temperaturi
(MultiTemp III), in sicer pri 6°C. Po končanem prenosu smo proteine na membrani
obarvali z 0,2% raztopino Ponceu S v 5% etanojski kislini. Sledila je 1 h inkubacija v
blokirnem pufru (2% goveji serumski albumin v pufru TBS, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5),
500 mM NaCl), nato smo blokirni pufer zamenjali s pufrom TTBS (0,05% Tween 20 v
TBS), ki je vseboval primarna poliklonska zajčja protitelesa IgG proti podenoti β (T20,
1:1.000, Santa Cruz) in inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi. Odvečna primarna protitelesa
smo sprali s pufrom TTBS, in sicer trikrat po 10 min, nato pa membrano 1 h inkubirali na
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 33 -
sobni temperaturi v pufru TTBS z dodanimi sekundarnimi poliklonskimi kozjimi
protitelesi IgG proti primarnim zajčjim s konjugirano hrenovo peroksidazo (Calbiochem,
1:1000). Odvečna sekundarna protitelesa smo zopet spirali trikrat po 10 min v pufru TTBS
in enkrat po 10 min v pufru TBS. Za identifikacijo podenote β na nitrocelulozni membrani
smo uporabili tehniko elektrokemoluminiscence in ECL komplet reagentov (Bavec in
Ličar, 2009).
4.6 MONO-ADP-RIBOZILACIJA PEPTIDOV IC3, IC3(R348A), IC3(C341A) IN
IC3(R348A,C341A) IN PODENOTE β HETEROTRIMERNIH G-
PROTEINOV PLAZEMSKIH MEMBRAN CELIC CHO
Encimsko kataliziran prenos [32
P]ADP-riboze iz [32
P]β-NAD+ na podenoto β
heterotrimernih G-proteinov in mono-ADP-ribozilacijo peptidov IC3, IC3(R348A),
IC3(C341A) in IC3(R348A,C341A) smo ugotavljali po protokolu (Bavec, 2004), z
manjšimi spremembami. 50 µL reakcijske zmesi (5 µg plazemskih membran celic CHO,
50 mM kalij fosfatni pufer (pH 7,5), 0,5 mM MgCl2, 4 mM DTT, 5 106 cpm oz. 2,3 µCi
[32
P]β-NAD+ (specifična aktivnost 1.000 Ci/mmol) in 6 µM β-NAD
+) smo inkubirali 1 h
pri 37°C brez peptida oz. z različnimi koncentracijami posameznega peptida.
V primeru, ko smo ugotavljali vpliv pertusis toksina (PTX), smo le-tega najprej aktivirali 1
uro v 62,5 mM DTT na sobni temperaturi. Nato smo pripravili 50 µL reakcijske zmesi (10
µg plazemskih membran celic CHO, 13 µg/mL PTX, 50 mM pufer Tris (pH 8,0), 25 mM
DTT, 0,5 mM EDTA, 1 mM ATP, 5 106 cpm oz. 2,3 µCi [
32P]β-NAD
+ (specifična
aktivnost 1.000 Ci/mmol) in 10 µM β-NAD+) in jo inkubirali 1 uro pri 37°C. Sledilo je 15
min centrifugiranje pri 10.000 g. Usedlino smo resuspendirali v 100 µL 1 M KCl in
ponovno 15 min centrifugirali pri 10.000 g. Usedlino smo resuspendirali v 50 µL ADP-
ribozilacijskega pufra (50 mM kalij fosfatni pufer (pH 7,5), 0,5 mM MgCl2, 4 mM DTT, 5
106 cpm oz. 2,3 µCi [
32P]β-NAD
+ (specifična aktivnost 1.000 Ci/mmol) in 6 µM β-
NAD+) in inkubirali 1 h pri 37°C brez peptida oz. z različnimi koncentracijami
posameznega peptida.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 34 -
V obeh primerih je sledila zaustavitev reakcije z dodatkom 50 µL dvakrat koncentriranega
pufra Laemmli. Sledila je 5 min inkubacija v termobloku pri 100°C in ločitev proteinov z
elektroforezo NaDS-PAGE in prenos proteinov na nitrocelulozno membrano (poglavje
4.5). Z aparatom Instant Imager (Packard, ZDA) smo izmerili stopnjo radioaktivnosti
posameznih lis. Za identifikacijo podenote β na nitrocelulozni membrani smo uporabili
tehniko elektrokemoluminiscence (ECL) (poglavje 4.5).
4.7 TANKOPLASTNA KROMATOGRAFIJA
Za ugotavljanje morebitne nespecifične vezave ADP-riboze in/ali β-NAD+ na peptid IC3
oz. njegove neencimske mono-ADP-ribozilacije smo najprej pripravili dve 50 µL
reakcijski mešanici. Obe sta vsebovali 50 mM kalij fosfatnega pufra (pH 7,5), 0,5 mM
MgCl2, 4 mM DTT, 5106 cpm [
32P]β-NAD
+ in 6 µM β-NAD
+, le da smo eni dodali 50
µM IC3, drugi pa ne, in ju inkubirali 1 h pri 37°C. Poleg tega smo pripravili enaki
reakcijski mešanici, kot je opisano v prejšnjem stavku in jima dodali encim NAD+
glikohidrolazo (0,2 U/mL) (E.C. 3.2.2.5) in ju prav tako inkubirali 1 h pri 37°C. Po
končani inkubaciji smo 5 µL vzorca nanesli na ploščo za tankoplastno kromatografijo
(TLC). Čez 1 h smo ploščo razvili v stekleni komori z mobilno fazo (11,85 g/L NH4HCO3)
in izmerili radioaktivnost z aparatom Instant Imager (Packard).
4.8 UGOTAVLJANJE SEKUNDARNE STRUKTURE PEPTIDA IC3 Z
MERJENJEM CIRKULARNEGA DIKROIZMA (CD SPEKTROSKOPIJA)
Meritve smo izvajali pri temperaturi 25°C z AVIV CD spektrometrom, model 62A DS
(Aviv Biomedical, ZDA). Pri snemanju spektra v štirih ponovitvah smo uporabili naslednje
parametre: dolžina pasu = 1 nm, korak = 0,5 nm, povprečen čas = 1 s, hitrost = 50 nm/min.
Pripravili smo različne koncentracije peptida IC3 v 5 mM kalij fosfatnem pufru (pH 7,4).
Snemanje spektrov različnih koncentracij peptida IC3 smo izvedli v različnih celicah: 1 in
5 µM peptid IC3 v 10 mm celici, 50 µM peptid IC3 v 1 mm celici in 500 µM peptid IC3 v
0,1 mm celici. Območje meritve spektrov pri 50 in 500 µM peptidu IC3 je bilo med 185 in
250 nm, pri 1 in 5 µM peptidu IC3 pa med 200 in 250 nm zaradi motečega signala same 10
mm celice pri valovnih dolžinah manjših od 200 nm. Od posameznega posnetega spektra
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 35 -
smo odšteli tako spekter kalij fosfatnega pufra kot spekter zraka. Izračunali smo molarno
eliptičnost θ po naslednji enačbi
kjer je
θ – eliptičnost [deg cm2/dmol]
θmrw – eliptičnost na aminokislinski ostanek [deg cm2/dmol]
Mmrw – povprečna molekulska masa aminokislin peptida IC3, tj. 122,48 g/mol
c – masna koncentracija IC3 [g/L] l – dolžina optične poti [cm]
in podali rezultat v obliki grafa molarne eliptičnosti θ na en aminokislinski ostanek v
odvisnosti od valovne dolžine [nm]. Izračun sekundarne strukture peptida IC3 smo opravili
s programsko opremo PROSEC, priloženo aparatu in rezultat podali v tabeli.
4.9 KINETIČNE ŠTUDIJE
Pri meritvah časovnega poteka hitrosti vezave [35
S]GTPγS na G-proteine v plazemskih
membranah celic CHO je krivulja skozi eksperimentalne točke ustrezala enačbi za
enofazno eksponentno vezavno funkcijo:
Enačba 1
kjer je
Y – količina vezanega [35
S]GTPγS
Ymax – maksimalna količina vezanega [35
S]GTPγS
k – hitrostna konstanta t – čas
Pri meritvah začetne hitrosti vezave [35
S]GTPγS na G-proteine v plazemskih membranah
celic CHO v odvisnosti od koncentracije peptida IC3 v koncentracijskem območju 1-100
µM, je krivulja skozi eksperimentalne točke ustrezala enačbi enofazne dozne odvisnosti
(angl. dose response curve):
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 36 -
Enačba 2
kjer je
Y0 – začetna hitrost vezave [35
S]GTPγS
x – desetiški logaritem koncentracije peptida IC3
EC50 – koncentracija peptida IC3, pri kateri je hitrost vezave [35
S]GTPγS polovica maksimalne
A in B – spodnja in zgornja meja hitrosti vezave [35
S]GTPγS
nH – Hillov koeficient
4.10 STATISTIČNA ANALIZA
Rezultati so predstavljeni kot povprečje vsaj treh neodvisnih eksperimentov ± standardna
variacija. Za nelinearno prileganje regresijske krivulje z metodo najmanjših kvadratov,
enosmerno analizo variance in grafično predstavitev rezultatov smo uporabili računalniški
program GraphPad Prism verzije 5.00 za Microsoft Windows (GraphPad Software, San
Diego, USA). Pri enosmerni analizi variance (ANOVA) smo za iskanje značilnih razlik
med skupinami podatkov uporabili Tuckey-Kramerjev primerjalni test. Razlike pri p <
0,05 smo šteli kot statistično značilne.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 37 -
5 REZULTATI
5.1 UČINEK PEPTIDA IC3 NA ZAČETNO HITROST VEZAVE [35
S]GTPγS
NA G-PROTEINE V PLAZEMSKIH MEMBRANAH CELIC CHO
Pomembnost tretje znotrajcelične zanke GLP-1R pri sklopitvi z G-proteini je že dobro
znana iz literature (Takhar s sod., 1996; Heller s sod., 1996; Mathi s sod., 1997; Hällbrink s
sod., 2001; Bavec s sod, 2003). Najprej smo preverili ali je peptid IC3 sposoben oponašati
aktivirani receptor, tj. pospešiti zamenjavo na G-proteine vezanega GDP z GTP. Namesto
GTP smo uporabili njegov stabilni radioaktivni analog [35
S]GTPγS. Vezava [35
S]GTPγS na
G-proteine v plazemskih membranah celic CHO je odvisna od časa. Izvedli smo prileganje
eksperimentalnih točk enofazni eksponentni vezavni krivulji, ki jo opisuje Enačba 1.
Maksimalna količina vezanega [35
S]GTPγS je znašala 470 fmol/mg. Začetno hitrost vezave
smo določili iz navidezno linearnega območja 0-5 min in je znašala 11 fmol/mgmin
(podatki niso prikazani).
Slika 13: Učinek peptida IC3 na hitrost vezave [35S]GTPγS na G-proteine v plazemskih membranah celic
CHO.
Vsaka točka z označenim standardnim odklonom predstavlja povprečje štirih neodvisnih poskusov. Začetna
hitrost vezave, brez dodanega peptida (100%) = 11 fmol/min na miligram proteinov in predstavlja začetno
aktivnost.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 38 -
Peptid IC3 je povečal začetno hitrost vezave, in sicer v odvisnosti od koncentracije v
območju od 1 M do 100 M. Izvedli smo prileganje eksperimentalnih podatkov krivulji
enofazne dozne odvisnosti (Slika 13), ki jo opisuje Enačba 2, in dobili naslednje
parametre: maksimalna začetna hitrost vezave [35
S]GTPγS = 248%, EC50 = 18 µM in
Hillov koeficient = 2,9.
5.2 UČINEK PEPTIDA IC3 NA MONO-ADP-RIBOZILACIJO PODENOTE β
G-PROTEINOV V CELICAH CHO
Znotrajcelična ART je dobro izražena v plazemskih membranah celic CHO (Lupi s sod.,
2000), njen najbolj okarakterizirani substrat pa je podenota β heterotrimernih G-proteinov
v plazemskih membranah celic CHO. Pri našem delu nas je zanimal vpliv peptida IC3 na
mono-ADP-ribozilacijo podenote β z ART. Upravičeno smo pričakovali naslednje: peptid
IC3 oponaša aktiviran GLP-1 (Slika 13), s čimer se poveča delež prostega dimera βγ, ki je
substrat za ART. To pomeni, da bi stopnja mono-ADP-ribozilacije podenote β morala biti
značilno povečana. Vendar je v literaturi že bil opisan nasproten učinek; stopnja mono-
ADP-ribozilacije podenote β v odvisnosti od naraščajoče koncentracije peptida IC3 se je
namreč zmanjšala (Bavec, 2003).
Z merjenjem radioaktivnosti (Slika 14A) smo ugotovili mono-ADP-ribozilacijo proteina z
očitno molekulsko maso ~36 kDa, ki ustreza velikosti podenote β (Slika 14B).
Identifikacijo podenote β smo potrdili tudi z imunološko analizo (Slika 14C). Pri
koncentracijah peptida IC3 10 µM in nižjih nismo opazili nobenega statistično značilnega
vpliva, pri višjih pa se stopnjuje inhibitoren vpliv. Tako smo torej potrdili, da je peptid IC3
odgovoren za inhibicijo mono-ADP-ribozilacije podenote β G-proteinov.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 39 -
Slika 14: Učinek peptida IC3 na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov v plazemskih membranah
celic CHO.
(A) Kvantitativna analiza mono-ADP-ribozilacije podenote β. Vsak stolpec z označenim standardnim
odklonom predstavlja povprečje petih neodvisnih poskusov. ANOVA F(9, 40) = 46,21; P < 0,0001. (B)
Radioaktivnost mono-ADP-ribozilirane podenote β po ločitvi z NaDS-PAGE in prenosu na nitrocelulozno
membrano. (C) Odtis western podenote β.
5.3 UČINEK PEPTIDA IC3 NA MONO-ADP-RIBOZILACIJO PODENOTE β
G-PROTEINOV V CELICAH CHO V PRISOTNOSTI PTX
V nadaljevanju nas je zanimalo ozadje te inhibicije oz. mehanizem njenega delovanja.
Peptid IC3 aktivira različne vrste G-proteinov, med drugim tudi Gi in G0 (Bavec s sod.,
2003) in ravno G0/i-proteini so bili najverjetnejši vmesni člen pri s peptidom IC3
posredovani inhibiciji mono-ADP-ribozilacije podenote β. Njihova značilnost je namreč,
da pri prenosu signala na efektorje delujejo inhibitorno. Ugotavljali smo učinek peptida IC3
na mono-ADP-ribozilacijo podenote β v prisotnosti PTX. Če namreč peptid IC3 izkazuje
svoj inhibitoren vpliv preko na PTX občutljivih G-proteinov, bi do inhibicije mono-ADP-
ribozilacije podenote β ne smelo priti v prisotnosti PTX. Kot je razvidno s Slika 15 se to ne
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 40 -
zgodi. Ta rezultat nakazuje na neposredeno medsebojno delovanje peptida IC3 in ART ali
pa so pri procesu inhibicije ART udeleženi na PTX neobčutljivi G-proteini.
Slika 15: Učinek peptida IC3 na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov v celicah CHO v prisotnosti
PTX.
(A) Kvantitativna analiza mono-ADP-ribozilacije podenote β. Vsak stolpec z označenim standardnim
odklonom predstavlja povprečje treh neodvisnih poskusov. (B) Radioaktivnost mono-ADP-ribozilirane
podenote β po ločitvi z NaDS-PAGE in prenosu na nitrocelulozno membrano. (C) Odtis western podenote β.
5.4 MONO-ADP-RIBOZILACIJA PEPTIDA IC3 Z ART V PLAZEMSKIH
MEMBRANAH CELIC CHO
Rezultati, prikazani v poglavju 5.3, kažejo na neposredno inhibicijo ART s peptidom IC3.
Sicer obstaja več vrst encimskih inhibicij, vendar smo na osnovi strukturne podobnosti
med podenoto β in peptidom IC3 (Slika 16) predpostavili mehanizem kompetitivne
inhibicije. ART je za arginin specifičen encim, in sicer prenese mono-ADP-ribozo iz β-
NAD+
na argininski ostanek na 129. mestu podenote β. Tudi peptid IC3 vsebuje arginin na
mestu 20 (mesto 348 v GLP-1R) in s tem potencialno mesto za encimsko mono-ADP-
ribozilacijo. Vendar je pri prepoznavi podenote β pomembna tudi bližnja aminokislinska
okolica Arg129
. Medsebojna primerjava aminokislinskih zaporedij peptida IC3 in podenote
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 41 -
β v okolici obeh argininov kaže visoko stopnjo strukturne in elektrostatske podobnosti, kar
lahko pomeni, da je peptid IC3 analog podenote β in možen substrat encima ART.
Slika 16: Primerjava aminokislinskih ostankov na enakih položajih glede na spremenjen argininski ostanek v
podenoti β in peptidu IC3.
Primerjava je bila narejena na podlagi splošne, kvalitativne podobnosti med strukturo stranske verige in
porazdelitvijo električnega naboja na njej. Dvojno podčrtani aminokislinski ostanek: mesto mono-ADP-
ribozilacije. Neprekinjen okvirček: Visoka stopnja podobnosti. Črtkan okvirček: Nizka stopnja podobnosti.
Brez okvirčka: Odsotnost podobnosti. *Številčenje aminokislinskih ostankov peptida IC3 je zaradi lažje
razumljivosti prirejeno mestom teh aminokislinskih ostankov v GLP-1R.
Rezultati mono-ADP-ribozilacije peptida IC3 so predstavljeni na Slika 17. Z merjenjem
radioaktivnosti (Slika 17A, prazni stolpci) smo ugotovili mono-ADP-ribozilacijo peptida z
očitno molekulsko maso ~3 kDa (Slika 17B, bel kvadratek), ki ustreza velikosti mono-
ADP-riboziliranega peptida IC3 (MIC3 = 2577 Da, MADP-riboza = 576 Da). S kvantifikacijo
podenote β s protitelesi (Slika 17C) smo preverjali stopnjo izražanja proteinov v
plazemskih membranah celic CHO. Mono-ADP-ribozilacija peptida IC3 je odvisna od
koncentracije substrata in sledi krivulji enofazne dozne odvisnosti.
Da gre za mono-ADP-ribozilacijo peptida IC3 z isto vrsto ART kot v primeru podenote β,
lahko potrdimo z uporabo meta-jodobenzilgvanidina (MIBG), ki je kompetitivni inhibitor
arginin-specifičnih mono-ADP-riboziltransferaz (Kharadia s sod., 1992; Loesberg s sod.,
1990; Yau s sod., 2008). Kot je razvidno iz poskusa merjenja radioaktivnosti (Slika 17B,
kockasti kvadratek), MIBG inhibira mono-ADP-ribozilacijo peptida IC3 za približno 50%
(Slika 17A, kockasti stolpec).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 42 -
Slika 17: Mono-ADP-ribozilacija peptida IC3 v celicah CHO v prisotnosti in odsotnosti meta-jodobenzil
gvanidina (MIBG).
(A) Kvantitativna analiza mono-ADP-ribozilacije peptida IC3 v odsotnosti MIBG (prazni stolpci) in ob
njegovi prisotnosti (kockasti stolpci). Vsak stolpec z označenim standardnim odklonom predstavlja povprečje
treh neodvisnih poskusov. (B) Radioaktivnost mono-ADP-riboziliranega peptida IC3 v odsotnosti MIBG (bel
kvadratek) in ob njegovi prisotnosti (kockast kvadratek) po ločitvi z NaDS-PAGE in prenosu na
nitrocelulozno membrano. (C) Odtis western podenote β.
Inhibicija mono-ADP-ribozilacije peptida IC3 z MIBG sicer potrjuje encimsko kataliziran
proces (Slika 17), vendar bi vsaj del radioaktivnega signala lahko bil posledica
nespecifične vezave [32
P]ADP-riboze in/ali [32
P]β-NAD+ na peptid IC3 oz. njegove
neencimske mono-ADP-ribozilacije. Da to ne drži, je že bilo pokazano (Bavec, 2003) in
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 43 -
tudi naš poskus to potrjuje (Slika 18). [32
P]β-NAD+ se ne veže na peptid IC3 (primerjava A
in C). Prav tako je razvidno, da se nanj ne veže [32
P]ADP-riboza (primerjava B in D).
Slika 18: Ugotavljanje nespecifične vezave ADP-riboze in/ali β-NAD+ na peptid IC3 oz. njegove neencimske
mono-ADP-ribozilacije.
(A) [32P]β-NAD+, (B) [32P]β-NAD+ + NADaza, (C) [32P]β-NAD+ + peptid IC3, (D) [32P]β-NAD+ + NADaza
+ peptid IC3.
5.5 MONO-ADP-RIBOZILACIJA PEPTIDOV IC3(R348A), IC3(C341A) IN
IC3(R348A,C341A) TER NJIHOV UČINEK NA MONO-ADP-
RIBOZILACIJO PODENOTE β G-PROTEINOV V CELICAH CHO
Vsi dosedanji rezultati (Slika 14, Slika 15 in Slika 17) nakazujejo, da peptid IC3 inhibira
mono-ADP-ribozilacijo podenote β po mehanizmu kompetitivne inhibicije. Da bi potrdili
to domnevo, smo uporabili peptid IC3(R348A), ki je enojni mutant peptida IC3; arginin na
mestu 20 (Arg348
, mesto 348 v GLP-1R) smo zamenjali z alaninom. Če predpostavka o
kompetitivni inhibiciji mono-ADP-ribozilacije podenote β z encimsko modifikacijo Arg348
ostanka peptida IC3 drži, potem bi morala popolnoma izginiti tako mono-ADP-ribozilacija
peptida IC3(R348A) kot tudi njegov učinek na mono-ADP-ribozilacijo podenote β.
Rezultati poskusa so pokazali, da se količina mono-ADP-ribozilacije peptida IC3(R348A)
(Slika 19A, kockasti stolpci) v primerjavi s peptidom IC3 (Slika 19A, črni stolpci) znatno
zmanjša, stopnja tega zmanjšanja pa je odvisna od koncentracije peptida. Pri 25 µM
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 44 -
koncentraciji peptida IC3(R348A) znaša mono-ADP-ribozilacija ~45% tiste, opažene pri
isti koncentraciji peptida IC3, pri 50 µM le ~40% in pri 100 µM le še okrog 30%.
Slika 19: Mono-ADP-ribozilacija peptidov IC3, IC3(R348A), IC3(C341A) in IC3(R348A,C341A) z ART
plazemskih membran celic CHO.
(A) Kvantitativna analiza mono-ADP-ribozilacije peptidov IC3 (polni stolpci), IC3(R348A) (kockasti stolpci),
IC3(C341A) (opečnati stolpci) in IC3(R348A,C341A) (prazni stolpci). Vsak stolpec z označenim standardnim
odklonom predstavlja povprečje treh neodvisnih poskusov. (B) Radioaktivnost mono-ADP-riboziliranih
peptidov IC3 (črn kvadratek), IC3(R348A) (kockast kvadratek), IC3(C341A) (opečnat kvadratek) in
IC3(R348A,C341A) (bel kvadratek) po ločitvi z NaDS-PAGE in prenosu na nitrocelulozno membrano. (C)
Odtis Western podenote β.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 45 -
S Slika 20 je razvidno, da naraščajoče koncentracije peptida IC3(R348A) nimajo statistično
značilnega učinka na mono-ADP-ribozilacijo podenote β. Z merjenjem radioaktivnosti
(Slika 20A) smo ugotovili mono-ADP-ribozilacijo proteina z očitno molekulsko maso ~36
kDa, ki ravno ustreza velikosti podenote β (Slika 20B). Identifikacijo podenote β smo
potrdili tudi z imunološko analizo (Slika 20C). Uporabili smo enako statistično analizo kot
v primeru ugotavljanja vpliva peptida IC3 na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-
proteinov, vendar v primerjavi z začetno hitrostjo statistično značilnih razlik nismo opazili.
Na ta način smo torej potrdili našo predpostavko, da je Arg348
peptida IC3 mesto mono-
ADP-ribozilacije (Slika 19 in Slika 20).
Slika 20: Učinek peptida IC3(R348A) na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov v plazemskih
membranah celic CHO.
(A) Kvantitativna analiza mono-ADP-ribozilacije podenote β. Vsak stolpec z označenim standardnim
odklonom predstavlja povprečje treh neodvisnih poskusov. ANOVA F(6, 14) = 1,453; P < 0,26. Tukey-
Kramerjev test ni pokazal statistično značilnih razlik za p > 0,05. (B) Radioaktivnost mono-ADP-ribozilirane
podenote β po ločitvi z NaDS-PAGE in prenosu na nitrocelulozno membrano. (C) Odtis western podenote β.
Količina mono-ADP-ribozilacije peptida IC3(R348A) je manjša kot pri peptidu IC3,
vendar se je pojavilo vprašanje, kaj predstavlja preostanek ADP-ribozilacije peptida IC3.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 46 -
Ker smo že ovrgli možnost nespecifične oz. neencimske vezave radioaktivnega β-NAD+
oz. ADP-riboze (Slika 18), je bila edina smiselna razlaga obstoj alternativnega mono-ADP-
ribozilacijskega mesta. Sicer peptid IC3 nima več argininov, ima pa cistein in asparagin, ki
sta tudi znana kot mono-ADP-ribozilacijsko mesto (Corda in Girolamo, 2003). Pri
odločanju kateri aminokislinski ostanek preveriti smo si pomagali tudi s teoretično
napovedjo sekundarne strukture (Slika 21).
Slika 21: Shematski prikaz teoretične napovedi sekundarne strukture peptida IC3 s pomočjo spletnega orodja
PredictProtein (Rost s sod., 2004).
Na podlagi določenih dejstev in predpostavk iz literature (poglavje 6.1) je veljal cistein na
mestu 13 (Cys341
, mesto 341 v GLP-1R) za najverjetnejše mono-ADP-ribozilacijsko mesto.
Če predpostavka o kompetitivni inhibiciji mono-ADP-ribozilacije podenote β z encimsko
modifikacijo Cys341
v peptidu IC3 drži, potem bi se morala količina mono-ADP-ribozilacije
peptida IC3(C341A) zmanjšati in zmanjšati bi se moral tudi njegov učinek na mono-ADP-
ribozilacijo podenote β v primerjavi z IC3. Rezultati poskusa povsem očitno kažejo, da se
mono-ADP-ribozilacija peptida IC3(C341A) zmanjša (Slika 19A, opečnati stolpci). Tako
pri 25 µM, 50 µM in pri 100 µM koncentraciji peptida IC3(C341A) znaša njegova mono-
ADP-ribozilacija približno 50% tiste, opažene pri isti koncentraciji peptida IC3.
Peptid IC3(C341A) inhibira mono-ADP-ribozilacijo podenote β v odvisnosti od odmerka
(Slika 22). Z merjenjem radioaktivnosti (Slika 22A) smo ugotovili mono-ADP-ribozilacijo
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 47 -
proteina z očitno molekulsko maso ~36 kDa, ki ustreza velikosti podenote β (Slika 22B).
Identifikacijo podenote β smo potrdili tudi z imunološko analizo (Slika 22C). Uporabili
smo enako statistično analizo kot v primeru ugotavljanja vpliva peptida IC3 na mono-ADP-
ribozilacijo podenote β in ugotovili podobne značilne razlike med vplivi posameznih
koncentracij peptida. Na ta način smo torej potrdili našo predpostavko; tudi cistein na
mestu 13 peptida IC3 je, poleg arginina na mestu 20, mesto mono-ADP-ribozilacije (Slika
19 in Slika 22).
Slika 22: Učinek peptida IC3(C341A) na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov v plazemskih
membranah celic CHO.
(A) Kvantitativna analiza mono-ADP-ribozilacije podenote β. Vsak stolpec z označenim standardnim
odklonom predstavlja povprečje štirih neodvisnih poskusov. ANOVA: F(5, 18) = 11,84; P < 0,0001. (B)
Radioaktivnost mono-ADP-ribozilirane podenote β po ločitvi z NaDS-PAGE in prenosu na nitrocelulozno
membrano. (C) Odtis western podenote β.
Dosedanje zaključke glede mono-ADP-ribozilacije Arg348
in Cys341
ter njunih vplivov na
mono-ADP-ribozilacijo podenote β smo dodatno preverili z uporabo dvojnega mutanta teh
dveh aminokislin, tj. peptida IC3(R348A,C341A). Če predpostavka o kompetitivni
inhibiciji mono-ADP-ribozilacije podenote β z encimsko modifikacijo Arg348
in Cys341
ostankov peptida IC3 drži, potem ne bi smeli opaziti mono-ADP-ribozilacije peptida
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 48 -
IC3(R348A,C341A) kot tudi ne njegovega učinka na mono-ADP-ribozilacijo podenote β.
Rezultati našega poskusa kažejo, da se količina mono-ADP-ribozilacije peptida
IC3(R348A,C341A) zmanjša v primerjavi s tisto pri peptidu IC3 (Slika 19A, prazni
stolpci). Stopnja tega zmanjšanja je očitno odvisna od koncentracije peptida. Pri 25 in 50
µM koncentraciji peptida IC3(R348A,C341A) znaša njegova mono-ADP-ribozilacija ~20%
tiste, opažene pri isti koncentraciji peptida IC3 in pri 100 µM le še okrog 15%.
Naraščajoče koncentracije peptida IC3(R348A,C341A) nimajo učinka na mono-ADP-
ribozilacijo podenote β (Slika 23A). Z merjenjem radioaktivnosti smo ugotovili mono-
ADP-ribozilacijo proteina z očitno molekulsko maso ~36 kDa, ki ustreza velikosti
podenote β (Slika 23B). Identifikacijo podenote β smo potrdili tudi z imunološko analizo
(Slika 23C). Uporabili smo enako statistično analizo kot v primeru ugotavljanja vpliva
peptida IC3, vendar značilnih razlik nismo opazili. Na ta način smo torej potrdili našo
predpostavko, da sta aminokislinska ostanka Arg348
in Cys341
v peptidu IC3 mesti mono-
ADP-ribozilacije z encimom ART.
Slika 23: Učinek peptida IC3(R348A,C341A) na mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov v celicah
CHO.
(A) Kvantitativna analiza mono-ADP-ribozilacije podenote β. Vsak stolpec z označenim standardnim
odklonom predstavlja povprečje treh neodvisnih poskusov. ANOVA F(5, 12) = 3,512; P < 0,25. Tukey-
Kramerjev test ni pokazal statistično značilnih razlik za p > 0.05. (B) Radioaktivnost mono-ADP-ribozilirane
podenote β po ločitvi z NaDS-PAGE in prenosu na nitrocelulozno membrano. (C) Odtis western podenote β.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 49 -
Veliko verjetnost, da sta Arg348
in Cys341
edini mesti encimske modifikacije, potrjuje
kvantitativna primerjava mono-ADP-ribozilacije peptida IC3 in obeh enojnih mutantov
(Slika 24, Preglednica 1). Z upoštevanjem statističnih negotovosti ugotovimo, da sta vsota
mono-ADP-ribozilacije obeh enojnih mutantov in mono-ADP-ribozilacija peptida IC3 zelo
podobni pri vseh izmerjenih koncentracijah.
Slika 24: Grafična primerjava stopnje mono-ADP-ribozilacije peptida IC3, vsote mono-ADP-ribozilacij
peptidov IC3(R348A) in IC3(C341A) ter vsote mono-ADP-ribozilacij peptidov IC3(R348A), IC3(C341A) in
IC3(R348A,C341A) pri različnih koncentracijah peptidov.
Preglednica 1: Numerična primerjava stopnje mono-ADP-ribozilacije peptida IC3, vsote mono-ADP-
ribozilacij peptidov IC3(R348A) in IC3(C341A) ter vsote mono-ADP-ribozilacij peptidov IC3(R348A),
IC3(C341A) in IC3(R348A,C341A) pri različnih koncentracijah peptidov.
koncentracija
[µM]
Stopnja mono-ADP-ribozilacije peptidov
IC3
[% od 1 µM]
IC3(R348A) + IC3(C341A)
[% od 1 µM]
IC3(R348A) + IC3(C341A) +
+ IC3(R348A,C341A) [% od 1 µM]
25 803 ± 50 823 ± 52 981 ± 113
50 1321 ± 106 1176 ± 67 1389 ± 152
100 2025 ± 185 1677 ± 106 1991 ± 219
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 50 -
5.6 SEKUNDARNA STRUKTURA PEPTIDA IC3
Učinki peptida IC3 na začetno hitrost vezave [35
S]GTPγS so najočitnejši v območju 5-50
µM (Slika 13), učinki na mono-ADP-ribozilacijo podenote β pa šele nad 50 µM (Slika 14).
Vzročnost med strukturo in funkcijo je zelo običajna, zato nas je zanimala morebitna
odvisnost aktivnosti peptida IC3 od njegove strukture.
CD spekter peptida IC3 (Slika 25) prikazuje odvisnost eliptičnosti na aminokislinski
ostanek od valovne dolžine. Posamezni tipi sekundarne strukture imajo v UV območju
180-250 nm različne absorpcijske značilnosti, in sicer: (i) β-struktura ima negativen vrh pri
217 nm in pozitiven vrh pri 193 nm, (ii) α-vijačnica ima dva negativna vrha pri 208 in 222
nm, (iii) naključni klobčič pa ima negativen vrh pri 204 nm. Tako je že iz samega spektra
opazno povečevanje deleža β-strukture z naraščajočo koncentracijo peptida IC3.
Slika 25: CD spekter peptida IC3 pri (A) 1 µM, (B) 5 µM, (C) 50 µM in (D) 500 µM in predstavlja povprečje
štirih neodvisnih eksperimentov.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 51 -
Na osnovi eksperimentalnih podatkov spektra CD smo nato z računalniškim programom
PROSEC izračunali deleže posameznih sekundarnih struktur (Preglednica 2). Pri
koncentraciji med 5 in 50 µM pride do ~100% povečanja deleža β-strukture, in sicer na
račun 100% zmanjšanja deleža β-zavoja. Ker je zastopanost posameznih sekundarnih
struktur pri 1 µM praktično enak tisti pri 5 µM sklepamo, da se pod 5 µM sekundarna
struktura ne spremeni. Zaradi enake zastopanosti posameznih sekundarnih struktur pri 50
in 500 µM, velja enak sklep tudi za koncentracije nad 50 µM.
Preglednica 2: Relativni delež posameznih tipov sekundarne strukture peptida IC3 pri 1, 5, 50 in 500 µM.
Izračun je bil opravljen s pomočjo računalniškega programa PROSEC na osnovi meritev CD spektra štirih
neodvisnih eksperimentov.
sekundarna struktura
relativni delež posamezne sekundarne strukture
1 µM IC3 5 µM IC3 50 µM IC3 500 µM IC3
α-vijačnica 7% 8% 5% 7%
β-struktura 27% 28% 66% 63%
naključni klobčič 32% 31% 29% 30%
β-zavoj 34% 33% 0% 0%
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 52 -
6 RAZPRAVA
6.1 BIOKEMIJSKI VIDIK
Ker je GLP-1R udeležen pri množici bioloških procesov, nujnih za delovanje celice in tudi
celotnega organizma, je natančno uravnavanje njegove aktivnosti bistvenega pomena.
Poleg splošnega mehanizma uravnavanja aktivnosti receptorja (prisotnost ali odsotnost
agonista oz. antagonista), sta pri GLP-1R dobro poznani še homologna in heterologna
desenzibilizacija preko fosforilacije receptorja (Widmann s sod., 1996a; 1996b; 1997).
Vendar to verjetno niso edini načini regulacije, saj smo na osnovi kritičnega razmisleka
prej omenjenih dejstev (poglavje 2) iz literature prišli do sklepa, da je tudi mono-ADP-
ribozilacija GLP-1R lahko odgovorna za zmanjšanje prenosa signala. V naši raziskavi smo
kot prvi do sedaj pokazali, da je mono-ADP-ribozilacija tretje znotrajcelične zanke GLP-
1R možna in vitro. Zelo verjetno je, da ta proces predstavlja nov način regulacije aktivnosti
GLP-1R in vivo, neodvisno od tega pa imajo naši rezultati potencial pri izboljšanju
obstoječih in razvoju novih postopkov zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti.
Glede na to, da je za prenos signala v notranjost celice in aktivacijo G-proteinov
odgovorna izključno tretja znotrajcelična zanka GLP-1R, smo za simulacijo aktiviranega
receptorja uporabili kar sintetični peptid katerega aminokislinsko zaporedje ustreza tretji
znotrajcelični zanki receptorja. Čeprav so takšni peptidi v raztopini bolj mobilni od zank
receptorja in tudi strukturno spremenljivi (Bavec s sod., 2003) so vseeno zelo uporabni pri
študiju interakcij med G-proteini in receptorjem. Slednje je bilo večkrat pokazano za
peptide z zaporedjem, ki ustreza zaporedju znotrajceličnih zank β2 adrenergičnega (Daaka
s sod., 1997) in D2 dopaminskega receptorja (Malek s sod., 1993), receptorja za hormon, ki
vzpodbuja razvoj foliklov (Grasso s sod., 1995) ter GLP-1R (Bavec s sod., 2003).
Mehanizem delovanja je v teh primerih vključeval prenos signala preko specifične stične
G-protein−receptor površine. Tudi velikost naših peptidov je bila ustrezna saj so najmanjši
peptidi z zaporedjem zank različnih GPCR, ki so bili uspešno uporabljeni pri študijah
interakcij G-protein−receptor, vsebovali med 9 in 15 aminokislinskih ostankov (Grasso s
sod., 1995; Okamoto in Nishimoto, 1992).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 53 -
Znotrajcelična aktivacija G-proteinov preko GLP-1R je regulirana s strukturnimi
lastnostmi predvsem N-konca tretje znotrajcelične zanke omenjenega receptorja (Mathi s
sod., 1997). Sintetični peptid IC3 učinkovito oponaša aktiviran GLP-1R (Bavec s sod.,
2003; Bavec s sod., 2007), prav tako peptida IC3(R348A) in IC3(C341A) (Bavec s sod.,
2007). To povzroči zamenjavo GDP z GTP na α podenoti trimera αβγ z disociacijo
podenote α in dimera βγ. Podenota β je le v obliki dimera βγ dober substrat za mono-ADP-
ribozilacijo z endogeno ART. V skladu s tem je bilo pričakovati, da bodo naraščajoče
koncentracije IC3 peptida povečevale delež mono-ADP-riboziliranega dimera βγ.
Aktivacijo G-proteinov opisuje naraščajoča sigmoidna krivulja enofazne dozne odvisnosti
(Slika 13). Vendar v nasprotju od pričakovanega, torej povečanja mono-ADP-ribozilacije,
se je stopnja mono-ADP-ribozilacije podenote β v odvisnosti od koncentracije peptida IC3
zmanjšala (Slika 14). Kakorkoli, prej opisani model povečanja deleža dimera βγ v
odvisnosti od koncentracije peptida IC3 je v osnovi še vedno pravilen (Slika 13), poleg tega
pa smo opazili statistično neznačilno povečanje mono-ADP-ribozilacije podenote β do
koncentracije peptida IC3 0,5 µM. A kot kaže, obstaja še nek drug, že opažen a še ne v
celoti pojasnjen mehanizem (Bavec, 2003), ki v območju koncentracij peptida IC3 1-200
µM prevladuje nad tem, da je dimer βγ dober substrat in postopno zmanjšuje mono-ADP-
ribozilacijo podenote β. Le-ta je pri koncentracijah peptida IC3 50 µM in višjih celo nižja
od bazalne vrednosti (Slika 14A in B) in pri 200 µM peptida IC3 znaša le še 30,56 ± 6.28%
le-te. Jakost inhibicije EC50 je med 25 in 50 µM (Slika 14) in dobro korelira z afiniteto
vezave peptida IC3 na G-proteine (EC50 = 18 µM) (Slika 13). Podobna afiniteta vezave
peptida IC3 na G-proteine je bila opažena tudi pri plazemskih membranah iz drugih
celičnih linij (Bavec s sod., 2003), kot tudi pri peptidu z aminokislinskim zaporedjem tretje
znotrajcelične zanke človeškega α2-adrenergičnega receptorja (Okamoto in Nishimoto,
1992). Iz tega lahko sklepamo, da je najmanjša efektivna koncentracija peptidov, izpeljanih
iz zank GPCR, v mikromolarnem območju.
Splošno sprejeto dejstvo je, da je funkcija biološko aktivnih molekul v tesni vzročni
povezavi z njihovo strukturo, kar se je izkazalo tudi pri naši raziskavi. Izračun na osnovi
spektra CD je pokazal, da se peptidu IC3 z naraščajočo koncentracijo bistveno spremeni
sekundarna struktura, in sicer v območju 5-50 µM (Slika 25, Preglednica 2). Prav to
koncentracijsko območje je tudi tisto, v katerem se začnejo vsi do sedaj poznani procesi,
odvisni od koncentracije peptida IC3, tj. (i) stimulacija vezave [35
S]GTPγS na G-proteine
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 54 -
(Slika 13), (ii) inhibicija mono-ADP-ribozilacije podenote β G-proteinov (Slika 14) in (iii)
inhibicija s PTX posredovane mono-ADP-ribozilacije podenote α G-proteinov (Bavec s
sod., 2003). Takšno diskretno spremembo peptida IC3 iz enega v drugo strukturno stanje
lahko z vidika biološke aktivnosti razumemo v smislu spremembe iz "IZKLOP" v
"VKLOP" konformacijo.
Nadalje smo preverili, če so pri inhibiciji na kakršenkoli način udeleženi G0/i-proteini,
podobno kot je bilo ugotovljeno za mnogo signalnih poti, na primer za inhibicijo adenilat-
ciklaze (Oka s sod., 1997), za inhibicijo prenosa signala do fosfolipaze C, ki sodeluje pri
izražanju kemotaktičnih citokinov (Kang s sod., 2014) in za relaksacijo žilnih
gladkomišičnih celic preko kanabinoidnih receptorjev (Su in Vo, 2007). V ta namen smo
ugotavljali učinek koncentracije peptida IC3 na mono-ADP-ribozilacijo podenote β po
predhodnem tretiranju plazemskih membran s PTX in rezultat primerjali s tistim brez
tretiranja s PTX. Če bi G0/i-proteini dejansko imeli pomembno vlogo pri inhibiciji ART, po
tretiranju s PTX ne bi dobili inhibitornega učinka. PTX deluje namreč tako, da prepreči
disociacijo podenote α od dimera βγ (Abood s sod., 1987). S Slika 15 je jasno razvidno, da
inaktivacija G0/i-proteinov s PTX ne vpliva na odvisnost mono-ADP-ribozilacije podenote
β od koncentracije peptida IC3, kar pomeni, da IC3 verjetno učinkuje direktno na ART,
lahko tudi preko PTX neobčutljivih G-proteinov, vsekakor pa ne preko G0/i-proteinov.
Kljub temu pa je moč opaziti majhno, statistično neznačilno zmanjšanje ADP-ribozilacije v
prisotnosti PTX, kar pa je moč pripisati zmanjšanju količine prostega dimera βγ saj ga
PTX določen delež "zaklene" s podenoto α0/i v trimer αβγ (Abood s sod., 1987). Učinka
peptida IC3 na mono-ADP-ribozilacijo podenote α0/i s PTX in podenote αs s CTX nismo
preverjali, saj so že prejšnje študije pokazale, da peptid IC3 aktivira tako na PTX kot na
CTX občutljive G-proteine v odvisnosti od koncentracije v območju od 1 do 100 µM
(Bavec s sod., 2003).
Na osnovi dobljenih podatkov smo sklepali na direkten učinek peptida IC3 na ART, torej
na neposreden tip inhibicije. Spodbudna je bila informacija, da se v istem
koncentracijskem območju peptida IC3, v katerem je bila opazna inhibicija mono-ADP-
ribozilacije podenote β, spremeni tudi razmerje elementov njegove sekundarne strukture
(Slika 25, Preglednica 2). Pri povečevanju koncentracije se med 5 in 50 µM peptida IC3
delež β-strukture podvoji na račun β-zavoja, kar je močno v prid predpostavki
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 55 -
kompetitivne inhibicije. Znano je namreč, da uspešna interakcija med mono-ADP-
riboziltransferazo in substratom ni odvisna samo od aminokislinskega zaporedja substrata,
ampak ima pomembno vlogo tudi tip sekundarne strukture vmesne ploskve (Jørgensen s
sod., 2008), pri čemer so aminokislinski ostanki v β-strukturi primernejši za encimsko
modifikacijo. Poleg tega peptid IC3 vsebuje več potencialnih mono-ADP-ribozilacijskih
mest, npr. arginin, cistein in asparagin. Po natančnem pregledu okolice kandidatnih
aminokislinskih ostankov peptida IC3 smo predvsem pri argininu 348 našli nekatere
kvalitativne podobnosti z okolico arginina na mestu 129 v podenoti β, in sicer v smislu
strukture stranske verige aminokislinskih ostankov in razporeditve električnega naboja na
njih (Slika 16). Mono-ADP-ribozilacijo peptida IC3 prikazuje Slika 17. Radioaktivni signal
proteinske lise z molekulsko maso ~3 kDa, ki ustreza molekulski masi mono-ADP-
riboziliranega peptida IC3, narašča v odvisnosti od koncentracije peptida IC3.
Vendar radioaktivni signal peptida IC3 še ne pomeni nujno, da je za to odgovoren encimski
proces, zato smo s pomočjo tankoplastne kromatografije preverili morebitno nespecifično
vezavo ADP-riboze in/ali β-NAD+ na peptid IC3 oz. njegovo neencimsko mono-ADP-
ribozilacijo. Iz Slika 18 je razvidno, da prisotnost peptida IC3 ne povzroči spremembe
radiokromatografske slike, iz česar je povsem jasno, da nespecifične in/ali neencimske
vezave β-NAD na peptid IC3 ni.
Rezultat tankoplastne kromatografije je sicer potrdil, da je mono-ADP-ribozilacija peptida
IC3 encimsko kataliziran proces, vendar je bilo potrebno ugotoviti, ali je za to odgovoren
isti tip ART kot za mono-ADP-ribozilacijo podenote β. V ta namen smo izvedli poskus
mono-ADP-ribozilacije peptida IC3 v prisotnosti MIBG, ki specifično inhibira t.i.
argininske ART (Kharadia s sod., 1992; Loesberg s sod., 1990; Yau s sod., 2008). S Slika
17 je razvidno, da se zaradi prisotnosti MIBG (kockasti stolpci) mono-ADP-ribozilacija
peptida IC3 zmanjša za več kot polovico.
V nadaljevanju smo hoteli ugotoviti, kateri aminokislinski ostanek peptida IC3 je mesto
mono-ADP-ribozilacije. Kot je pojasnjeno zgoraj, je bil najverjetnejši kandidat Arg348
, zato
smo preverili morebitno mono-ADP-ribozilacijo peptida IC3(R348A) in njegov vpliv na
mono-ADP-ribozilacijo podenote β. Če je za kompetitivno inhibicijo odgovorna mono-
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 56 -
ADP-ribozilacija na argininu 348, potem je za pričakovati zmanjšanje mono-ADP-
ribozilacije peptida IC3(R348A), kot tudi zmanjšanje inhibicije podenote β. Mono-ADP-
ribozilacija argininskega mutanta je bila v primerjavi z mono-ADP-ribozilacijo peptida IC3
bistveno zmanjšana (Slika 19, kockasti stolpci) (Slika 19, polni stolpci), mono-ADP-
ribozilacija podenote β pa se z naraščajočo koncentracijo peptida IC3 (R348A) ni niti
zmanjšala, niti povečala (Slika 20). Oba rezultata sta bila le deloma pričakovana, zato sta
se pojavili dve novi vprašanji: (i) zakaj je mono-ADP-ribozilacija peptida IC3(R348A) še
vedno statistično značilna in (ii) zakaj ni prišlo do povečanja mono-ADP-ribozilacije
podenote β. Slednje bi lahko bila posledica nezmožnosti peptida IC3(R348A) oponašati
aktiviran receptor, kar pa ne drži, saj je že bilo pokazano, da je podobno kot peptid IC3 tudi
njegov argininski mutant sposoben aktivirati Gs, Gi1, G0 in G11 proteine (Bavec s sod.,
2007) in posledično povečati količino dimera βγ. Najbolj logična razlaga, s katero je moč
pojasniti oba pojava, je bil obstoj alternativnega mono-ADP-ribozilacijskega mesta.
V literaturi je moč najti primere mono-ADP-ribozilacije tudi na nekaterih drugih
aminokislinskih ostankih, naprimer na cisteinskem ali asparaginskem (Okazaki in Moss,
1999). V našem primeru je bil najbolj zanimiv cisteinski, saj je za argininom drugo najbolj
znano mesto mono-ADP-ribozilacije (Hassa s sod., 2006), poleg tega pa so v peptidu IC3
kar trije. Mogoče je bilo, da je udeležena kakšna cistein-specifična ART, obstajala pa je
tudi možnost, da ista ART, katere glavni substrat je argininski aminokislinski ostanek,
katalizira tudi modifikacijo cisteina (Han s sod., 2001; Koch-Nolte s sod., 2001; Maehama
s sod., 1996; Tsuge s sod., 2008).
Poleg argininskega, je tudi cisteinski aminokislinski ostanek dobro poznano mesto mono-
ADP-ribozilacije (Okazaki in Moss, 1999, Hassa s sod., 2006). ART, ki encimsko mono-
ADP-ribozilira podenoto β, je sicer okarakterizirana kot arginin-specifična (Corda in Di
Girolamo, 2003), ampak takšna specifika mono-ADP-riboziltransferaz v splošnem ni
neposredno vezana na spremenjen aminokislinski ostanek, temveč se nanaša na okoliško
vezavno območje (Hottiger s sod., 2010). Eksperimenti z uporabo usmerjene mutageneze
posameznih aminokislin, presaditev polipeptidnih zank in hkratne kristalizacije encima in
substrata (Han s sod., 2001; Koch-Nolte s sod., 2001) so pokazale, da encimi iz skupine
ART ne prepoznavajo substrata na osnovi konkretne ciljne aminokisline, ampak je osnovna
specifika prepoznave odvisna od površine bližnje okolice. Na primer, če v encimu dve
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 57 -
mesti naprej od katalitičnega glutamatnega aminokislinskega ostanka zamenjamo prav tako
glutamatnega z glutaminskim, se sprva NAD+-hidrolaza transformira v arginin-specifično
transferazo (in obratno) (Hara s sod., 1996; Maehama s sod., 1996) oz. asparagin-
specifična ART v arginin-specifično (Vogelsgesang in Aktories, 2006). Poleg tega so
študije s sočasno kristalizacijo različnih ART in njihovih substratov pokazale, da obstaja
posebna polipetidna zanka (t.i. ARTT zanka), ki ima pri večini članov te encimske družine
splošno vlogo prepoznave in vezave substrata (Jørgensen s sod., 2008; Tsuge s sod., 2008).
In nenazadnje, eksperimenti z uporabo mišje ART1 so nakazali na obstoj polipeptidnih
zaporedij izven katalitičnega območja, ki preko konformacijskih napetosti uravnavajo
specifiko vezave substrata in aktivnost celotne katalize (Bourgeois s sod., 2003). Torej
vidimo, da ni nekega posebnega pravila, na osnovi katerega bi lahko iz primarne strukture
neposredno sklepali na motiv za prepoznavo substrata, zato je substratno specifiko
določene mono-ADP-riboziltransferaze mogoče ugotoviti le eksperimentalno (Hottiger s
sod., 2010).
Zaradi časovne in finančne smotrnosti smo namesto naključne izbire kandidatnega
cisteinskega ostanka oz. hkratnega preizkušanja vseh treh poskusili dobiti kakšno
informacijo o obliki oz. sekundarni strukturi peptida IC3 in iz tega sklepati na najbolj
verjetne cisteinske ostanke. Za mono-ADP-ribozilacijo so verjetno najprimernejši
aminokislinski ostanki na področjih z β-strukturo (Slika 25, Preglednica 2). Rezultati so
pokazali, da peptid IC3 pri večjih koncentracijah zavzame β-strukturo, vendar ne povedo
katere regije peptida zavzamejo β-strukturo, zato smo uporabili spletno orodje za
napovedovanje sekundarne strukture. Sicer obstaja veliko spletnih orodij za napovedovanje
sekundarne strukture peptidov oz. proteinov, vendar je med uporabniki kot najzanesljivejši
veljal spletni portal PredictProtein (Rost s sod., 2004), saj za informacijsko podporo
uporablja najpomembnejše podatkovne zbirke, kot so UniRef, PDB, Pfam in PROSITE. Z
njegovo pomočjo smo prišli do predlagane razporeditve elementov sekundarne strukture,
kot je prikazano na Slika 21. Spodbudna je bila predpostavljena β-struktura v predelu
Arg348
, za katerega smo že ugotovili, da se mono-ADP-ribozilira, predpostavljene β-
strukture pa so se žal nahajale tudi na področju vseh treh Cys ostankov. Po premisleku smo
Cys329
, tj. prvi Cys peptida IC3, izključili iz obravnave. Njegova mono-ADP-ribozilacija je
bila le malo verjetna, saj takšen primer, tj. mono-ADP-ribozilacija terminalnega
aminokislinskega ostanka, dosedaj še ni bil opisan, poleg tega pa bi bila takšna reakcija
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 58 -
zaradi neposredne bližine plazemske membrane manj verjetna. Tudi Cys347
ostanek se
zaradi neposredne bližine Arg348
ni zdel verjeten kandidat za mono-ADP-ribozilacijo, saj
bi kovalentna vezava ADP-riboze na en aminokislinski ostanek najverjetneje sterično in
elektrostatsko ovirala njeno vezavo na sosednjega. Po izločitvi ostalih dveh cisteinskih
ostankov smo se nazadnje odločili preveriti, ali je tako kot Arg348
tudi Cys341
mesto
encimske mono-ADP-ribozilacije. Ta odločitev je bila še smiselna tudi zaradi vpletenosti
Cys341
v domnevno dimerizacijo GLP-1R. Pri modelu dimera GLP-1R (Bavec, 2003) sta
namreč tretji znotrajcelični zanki obrnjeni druga proti drugi tako, da lahko pride do
neposredne interakcije med dvema Cys341
in do povečanja deleža β-strukture.
Kot v primeru preverjanja Arg348
smo tudi v tem primeru uporabili točkovnega mutanta
peptida IC3, ki ima Cys341
zamenjan z alaninom. V enakih pogojih smo opazovali mono-
ADP-ribozilacijo peptida IC3(C341A) in njegov vpliv na mono-ADP-ribozilacijo podenote
β. A nasprotno kot v primeru peptida IC3(R348A) smo sedaj že v osnovi pričakovali zgolj
delno zmanjšano mono-ADP-ribozilacijo peptida IC3(C341A) kot tudi še vedno prisotno
inhibicijo mono-ADP-ribozilacije podenote β v odvisnosti od koncentracije peptida (a
manjšo kot pri peptidu IC3). Rezultati, prikazani na Slika 19 (opečnati stolpci) so
pričakovani. Mono-ADP-ribozilacija peptida IC3(C341A) se je v primerjavi z mono-ADP-
ribozilacijo peptida IC3 zmanjšala, a očitno manj kot pri peptidu IC3(R348A). Tudi mono-
ADP-ribozilacija podenote β je odvisna od koncentracije peptida IC3(C341A) (Slika 22), in
sicer pri 25 µM in višjih. To opažanje je bilo pričakovano kot posledica mono-ADP-
ribozilacije Arg348
ostanka.
Vendar je na prvi pogled videti, kot da mono-ADP-ribozilacija Cys341
ni imela
inhibitornega učinka na mono-ADP-ribozilacijo podenote β, saj sta bili inhibiciji s
peptidoma IC3 (Slika 13) in IC3(C341A) (Slika 22) med sabo podobni, prav tako kot sta
bili podobni inhibiciji s peptidoma IC3(R348A) (Slika 20) in IC3(R348A,C341A) (Slika
23). Takšno stanje samo po sebi ni bilo mogoče, zato je bila inhibicija na račun mono-
ADP-ribozilacije Cys341
še vedno prisotna, vendar verjetno nevtralizirana z nekim drugim
procesom. Dejstvo je, da ima peptid IC3(R348A) – odvisno od tipa podenote α – enako ali
celo boljšo sposobnost aktivacije G-proteinov kot peptid IC3 (Bavec s sod., 2007). To
pomeni več dimera βγ in s tem več substrata za ART, ki tekmuje s peptidom IC3(R348A).
Poleg tega je bila mono-ADP-ribozilacija Cys341
ostanka (Slika 19, kockasti stolpci) znatno
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 59 -
manjša kot Arg348
(Slika 19, opečnati stolpci), zaradi česar je bil njen učinek na mono-
ADP-ribozilacijo podenote β ustrezno manjši.
Dodatna potrditev Arg348
ostanka kot primarnega mono-ADP-ribozilacijskega mesta je bil
statistično neznačilen vpliv peptida IC3(R348A,C341A) na mono-ADP-ribozilacijo
podenote β (Slika 23), podobno kot pri peptidu IC3(R348A). Pri slednjemu smo odsotnost
stimulacije mono-ADP-ribozilacije podenote β pojasnili z obstojem alternativnega
aminokislinskega ostanka in ga kasneje tudi pokazali (Slika 19, opečnati stolpci). Pri
peptidu IC3(R348A,C341A) pa zaradi odsotnosti tako Arg348
kot Cys341
kompetitivna
inhibicija sploh ni mogoča, kakor tudi ne aktivacija G-proteinov zaradi njegove
nezmožnosti njihove aktivacije (Bavec s sod., 2007). Mono-ADP-ribozilacija peptida
IC3(R348A,C341A) je v primerjavi s peptidom IC3 skoraj popolnoma izginila (Slika 19,
prazni stolpci). Zaključimo lahko, da sta Arg348
in Cys341
peptida IC3 edini mesti encimsko
katalizirane kovalentne vezave ADP-riboze, kar dodatno potrjuje dejstvo, da sta stopnja
mono-ADP-ribozilacije peptida IC3 in vsota stopenj mono-ADP-ribozilacije peptidov
IC3(R348A) in IC3(C341A) med sabo primerljivi (Slika 24, Preglednica 1).
S pričujočo študijo smo torej nedvomno pokazali, da je z ART katalizirana mono-ADP-
ribozilacija peptida, katerega aminokislinsko zaporedje ustreza zaporedju tretje
znotrajcelične zanke GLP-1R, možna v in vitro pogojih. Mesti kovalentne vezave ADP-
riboze sta Arg348
in Cys341
in z vidika podenote β G-proteinov omenjeni proces predstavlja
kompetitivno inhibicijo. Poleg tega obstaja velika verjetnost, da mono-ADP-ribozilacija
predstavlja tudi PTS GLP-1R in vivo in s tem nov način njegove regulacije, vendar bodo za
potrditev te hipoteze potrebne nadaljnje študije z uporabo različnih biokemijskih pristopov
tako in vitro kot in vivo. Stopnja mono-ADP-ribozilacije Arg348
je v in vitro pogojih večja
od tiste pri Cys341
, kar je verjetno posledica večje podobnosti med okoliškimi
aminokislinskimi ostanki Arg348
GLP-1R in Arg129
podenote β. Glede na to, da je Arg348
nujno potreben za uspešen prenos signala do G-proteinov (Heller s sod, 1996), le-ta z
biološkega vidika verjetno predstavlja primarno, izvorno mesto mono-ADP-ribozilacije,
mono-ADP-ribozilacija Cys341
pa bi se z vidika evolucije lahko razvila ne tako dolgo nazaj
kot alternativno mesto argininu.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 60 -
6.2 FARMACEVTSKI VIDIK
V prejšnjem poglavju smo podrobno opisali biokemijski vidik naše raziskave in rezultati so
z vidika bazične znanosti nedvomno pomembni in zanimivi, saj kažejo na zelo verjeten
obstoj novega načina regulacije GLP-1R. Obstaja pa tudi izjemna in povsem realna
uporabnost naših ugotovitev na področju medicine oz. farmacije, konkretno pri zdravljenju
sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti, kot bo podrobneje pojasnjeno v nadaljevanju. Med
obema boleznima obstaja patogena in epidemiološka povezava, razlog za to pa je moč najti
v pleiotropnem delovanju inkretinskih hormonov (Barber s sod., 2010), katerih nepravilno
delovanje je skupno obema boleznima. Izmed inkretinskih hormonov je za zdravljenje
sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti trenutno najbolj aktualen prav GLP-1 oz. njegovi
analogi, vendar ima njihova uporaba mnogo pomanjkljivosti in slabosti (Arulmozhi in
Portha, 2006). Nadaljnje izpopolnjevanje je seveda ena možnost, vendar je lahko iskanje
novih (peptidnih) zdravil in načinov zdravljenja s še sprejemljivimi stranskimi učinki zelo
dolgotrajno in morda nikoli v celoti izvedljivo. Druga možnost pa je izkoristiti vse
prednosti že obstoječih pristopov in zgolj odpraviti njihove slabosti in ravno pri tem
pristopu vidimo ogromno uporabnost naših ugotovitev.
GLP-1R je eden izmed tistih receptorjev, ki se izražajo v različnih vrstah tkiv in organov in
tako rekoč po celem telesu (Ahrén, 2011). Za našo razpravo sta pomembni predvsem
njegova prisotnost in aktivnost v trebušni slinavki, kjer stimulira proliferacijo obstoječih in
zorenje izvornih celic β ter zavira njihovo apoptozo, poleg tega pa stimulira sintezo in
izločanje inzulina iz njih (Holst, 2003). Poenostavljeno se prenos signala začne z vezavo
agonista na zunajcelično stran receptorja, to povzroči konformacijske spremembe tudi na
njegovi notranji strani, kar je pogoj za aktivacijo Gs proteinov, ti pa so pogoj za aktivno
adenilat-ciklazo (Doyle in Egan, 2007). Posledica je lokalno povečana koncentracija
cAMP, majhnih molekul, ki prenesejo signal do protein kinaz A ter do Epac 1 in 2, le-ti pa
učinkujejo na množico efektorjev, ki v končni fazi vodijo do sproščanja inzulina v krvni
obtok (Doyle in Egan, 2007). A kot rečeno, to je zgolj poenostavljen model. Sama
prisotnost agonista v zadostni količini je le nujen sprožilec prenosa signala, vzdolž
signalne poti pa je običajno še več drugih regulatornih točk, ki po potrebi na kontroliran
način prenos signala zavrejo ali oslabijo. V primeru GLP-1R sta že poznani dve takšni
mesti, in sicer gre za fosforilacijo treh serinskih parov znotrajceličnega C-konca (Widmann
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 61 -
s sod., 1996) in za mono-ADP-ribozilacijo podenote β G-proteinov (Lupi s sod., 2000;
2002) (Slika 26). Poleg njiju zelo verjetno obstaja še tretja regulatorna točka, in sicer
mono-ADP-ribozilacija tretje znotrajcelične zanke GLP-1R, kot je bilo podrobno
pojasnjeno v prejšnjih poglavjih.
Slika 26: Shematski prikaz predpostavljene regulacije GLP-1R z ART.
Prikazani sta mono-ADP-ribozilacija podenote β G-proteinov (rumen oblaček) in na osnovi naših rezultatov
predpostavljena mono-ADP-ribozilacija tretje znotrajcelične zanke GLP-1R (rdeč oblaček). Mono-ADP-
ribozilacija navkljub prisotnemu agonistu prepreči prenos signala.
Izhodišče vseh dosedanjih na GLP-1R osnovanih načinov zdravljenja sladkorne bolezni
tipa 2 in debelosti je, kako doseči čim večjo začetno aktivacijo receptorja, in sicer (i) z
uporabo kemijsko različnih agonistov (ii) v različno visokih koncentracijah in (iii) z
različnimi načini ciljanja. Tako imajo različni analogi že sami po sebi, še posebej pa v
velikih koncentracijah, največkrat neprijetne stranske učinke, kot so bruhanje, občutek
slabosti, visok krvni tlak in utrip in povečano tveganje za akutni pankreatitis, le-ti pa se z
dolgotrajnejšim zdravljenjem samo še povečujejo (Arulmozhi in Portha, 2006). Poleg
neprijetnih stranskih učinkov je tudi povečano tveganje za pojav imunogenosti neposredno
povezana z visokimi odmerki zdravila. Kot smo ugotovili v naši raziskavi, je peptid IC3
učinkovit kompetitivni inhibitor ART in kot tak bi bil uporaben skupaj z agonisti
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 62 -
receptorja GLP-1R. Njegova prisotnost bi zmanjšala oz. preprečila mono-ADP-ribozilacijo
podenote β (Slika 27) in prenos signala bi tako nemoteno rezultiral v učinkovitejšem
sproščanju inzulina (Lupi s sod., 2000). Na tak način bi bila potrebna nižja koncentracija
agonista, lahko pa bi bili tudi bolj izbirčni, kateri agonist uporabiti in bi lahko izbrali
tistega z manj stranskimi učinki.
Slika 27: Shematski prikaz predpostavljene regulacije GLP-1R z ART skupaj s predlaganim terapevtskim
učinkom peptida IC3.
Prikazani sta mono-ADP-ribozilacija podenote β G-proteinov (rumen oblaček) in na osnovi naših rezultatov
predpostavljena mono-ADP-ribozilacija tretje znotrajcelične zanke GLP-1R (rdeč oblaček). V prisotnosti
peptida IC3 je ART kompetitivno inhibirana (modri oblački), podenota β in GLP-1R nista inhibirana z mono-
ADP-ribozilacijo in prenos signala je ob prisotnem agonistu mogoč.
Učinek peptida IC3 bi bil še močnejši, če je mono-ADP-ribozilacija tudi dejansko
mehanizem regulacije aktivnosti GLP-1R in vivo. V tem primeru bi hkrati preprečili tako
inaktivacijo podenote β kot tudi samega GLP-1R (Slika 27). Na tem mestu pa je potrebno
poudariti, da je mono-ADP-ribozilacija reverzibilen proces in če bi bila ta reverzibilna
narava kompetitivne inhibicije s peptidom IC3 res prisotna in vivo, bi njegova relativno
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 63 -
majhna koncentracija zadostovala za daljši čas, kar je seveda velika prednost, tako zaradi
stroškov kot tudi zaradi morebitnih neželenih stranskih učinkov.
In kot zadnje, v preteklih študijah je že bilo pokazano, da peptid IC3 uspešno oponaša
aktiviran GLP-1R, torej ima z vidika prenosa signala enako vlogo kot GLP-1R z vezanim
agonistom in uspešno aktivira različne tipe G-proteinov (Bavec s sod., 2003). To pa v
praksi pomeni, ne samo da se ustrezno poveča stopnja aktivacije G-proteinov, ampak tudi
– in to je bistveno – da s tem, vsaj delno, zaobidemo tudi desenzibilizacijo in
internalizacijo GLP-1R (Slika 27) kot posledico fosforilacije treh serinskih parov
znotrajceličnega C-repa (Widman s sod, 1997).
Poleg samega mehanizma delovanja sta za peptidno zdravilo v praksi pomembni
karakteristiki tudi mesto in način vnosa v telo ter mehanizem ciljanja. Mesto in način
vnosa vplivata tako na kemijsko in fizikalno obliko zdravila kot tudi na sestavo in obliko
pomožnih snovi (Pettit in Gombotz, 1998). Ker je mesto vnosa peptidnega zdravila skoraj
vedno bolj ali manj oddaljeno od mesta učinkovanja (to velja tudi v primeru GLP-1R v β-
celicah trebušne slinavke), je zaželeno čim bolj učinkovito ciljanje, saj se v tem primeru
zdravilo iz krvi v manjši meri porazdeli po celotnem telesu. S tem se izognemo neželenim
stranskim učinkom v drugih delih telesa, obenem pa potrebujemo manjše terapevtske
odmerke, saj zmanjšamo odstranitev zdravila iz krvi preko ledvic in njegovo
biotransformacijo v jetrih (Pettit in Gombotz, 1998; Okada s sod., 1994). Brez vsakršnih
eksperimentalnih podatkov uporabe peptida IC3 v terapevtske namene lahko o mestu in
načinu njegovega vnosa ter o mehanizmu njegovega ciljanja zgolj teoretično razpravljamo.
Peptid IC3 bi bilo smiselno vnesti subkutano ali intravensko skupaj z agonistom GLP-1R v
sistemski krvni obtok, nato pa poiskati način, da IC3 preide le v β-celice trebušne slinavke.
Takšen način vnosa peptidnega zdravila seveda ni najbolj praktičen in sprejemljiv za
bolnika, ima pa prednost pred peroralnim v tem, da ni potrebe po njegovi stabilizaciji pri
različnih pH vrednostih in po njegovi proteolizni stabilnosti (Pettit in Gombotz, 1998),
hkrati pa se izognemo biotransformaciji s strani gastrointestinalne mikrobiote (Sousa s
sod., 2008). Druga možnost bi bila uporaba genskega zdravila z uporabo kationskih
liposomov. Le-ti omogočajo prenos linearne DNA ali RNA, vnesemo jih lahko intravensko
in so sposobni preiti plazmalemo tarčne celice (Mlinarič-Raščan, 2005).
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 64 -
7 ZAKLJUČKI
S pričujočo študijo smo v celoti potrdili na začetku postavljeno hipotezo:
Endogena mono-ADP-riboziltransferaza je odgovorna za in vitro mono-ADP-
ribozilacijo ne samo podenote β G-proteinov, ampak tudi tretje znotrajcelične
zanke GLP-1R, in sicer na argininskem ostanku na mestu 348 v GLP-1R.
Prav tako so se potrdili vsi pričakovani rezultati:
- Z naraščajočimi koncentracijami peptida IC3 se stopnjuje inhibicija mono-ADP-
ribozilacije podenote β G-proteinov.
- Tudi peptid IC3 se mono-ADP-ribozilira, zato inhibicija mono-ADP-ribozilacije podenote
β G-proteinov ne poteka preko G-proteinov ali kako drugače, temveč prihaja do
neposredne interakcije med endogeno mono-ADP-riboziltransferazo in peptidom IC3 v
procesu kompetitivne inhibicije.
- Nespecifične vezave β-NAD+ oz. ADP-riboze ter neencimske kovalentne vezave ADP-
riboze na peptid IC3 ni.
- Mono-ADP-ribozilacija peptida IC3 se zgodi na argininskem ostanku na mestu 348
molekule GLP-1R.
Poleg tega smo ugotovili, da je tudi Cys341
mesto mono-ADP-ribozilacije, pri čemer je
udeležen isti encim kot v primeru Arg348
. Pri tem je Arg348
preferenčno mesto mono-ADP-
ribozilacije. Vsi opaženi učinki peptida IC3 se pričnejo v tistem koncentracijskem
območju, v katerem se zgodijo bistvene spremembe v njegovi sekundarni strukturi. Ker je
peptid IC3 v odnosu do ART kompetitivni inhibitor, obstaja njegova velika uporabnost pri
zdravljenju sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti, in sicer ob hkratni uporabi z agonisti
GLP-1R.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 65 -
8 LITERATURA
Abood M. E., Lee,N. M., Loh,H. H. (1987). Modification of opioid agonist binding by
pertussis toxin. Brain Research, 417: 70-74.
Ahrén B. (2011). GLP-1 for type 2 diabetes. Experimental Cell Research, 317: 1239-1245.
Arulmozhi D. K., Portha B. (2006). GLP-1 based therapy for type 2 diabetes. European
Journal of Pharmaceutical Sciences, 28: 96-108.
Ayoub M., Scheidegger D. (2006). Peptide drugs, overcoming the challenges, a growing
business. Chemistry Today, 24: 46-48.
Baggio L. L., Drucker D. J. (2007). Biology of Incretins: GLP-1 in GIP. Gastroenterology,
132: 2131-2157.
Barber T. M., Begbie H., Levy J. (2010). The incretin pathway as a new therapeutic target
for obesity. Maturitas, 67: 197-202.
Barragan J. M., Rodriguez R. E., Blazquez E. (1994). Changes in arterial blood pressure
and heart rate induced by glucagon-like peptide-1-(7–36) amide in rats. American
Journal of Physiology, 266: 459-466.
Bavec A. (2004). Novel features of amphiphilic peptide Mas7 in signalling via
heterotrimeric G-proteins. Journal of Peptide Science, 10: 691-699.
Bavec A. (2003). Vloga znotrajceličnih zank receptorja za glukagonu podobni peptid-1 pri
prenosu signala. Doktorska disertacija, Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta.
Bavec A., Hällbrink M., Langel Ü., Zorko M. (2003). Different role of intracellular loops
of glucagon-like peptide-1 receptor in G-protein coupling. Regulatory Peptides, 111:
137-144.
Bavec A., Jiang Y., Langel U., Zorko M. (2007). Role of cysteine 341 in arginine 348 of
GLP-1 receptor in G-protein coupling. Molecular Biology Reports, 34: 53-60.
Bavec A., Juréus A., Cigić B., Langel U., Zorko M. (1999). Peptitergent PD1 affects the
GTPase activity of rat brain cortical membranes. Peptides, 20: 177-184.
Bavec A., Licar A. (2009). Functional characterization of N-terminally GFP-tagged GLP-1
receptor. Journal of Biomedicine and Biotechnology (Online), 498149: 1-10.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 66 -
Bazarsuren A., Grauschopf U., Wozny M., Reusch D., Hoffmann E., Schaefer W., Panzner
S., Rudolph R. (2002). In vitro folding, functional characterization, and disulfide
pattern of the extracellular domain of human GLP-1 receptor. Biophysical Chemistry,
96: 305-318.
Benovic J. L., Shorr R. G., Caron M. G., Lefkowitz R. J. (1984). The mammalian beta 2-
adrenergic receptor: purification and characterization. Biochemistry, 23: 4510-4518.
Benovic, J. L., Pike L. J., Cerione R. A., Staniszewski C., Yoshimasa T., Codina J., Caron
M. G., Lefkowitz R. J. (1985). Phosphorylation of the mammalian beta-adrenergic
receptor by cyclic AMP-dependent protein kinase. Regulation of the rate of receptor
phosphorylation and dephosphorylation by agonist occupancy and effects on coupling
of the receptor to the stimulatory guanine nucleotide regulatory protein. Journal of
Biological Chemistry, 260: 7094-7101.
Benovic J. L., Strasser R. H., Caron M. G., Lefkowitz R. J. (1986). Beta-adrenergic
receptor kinase: identification of a novel protein kinase that phosphorylates the
agonist-occupied form of the receptor. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 83: 2797-2801.
Bourgeois C., Okazaki I., Cavanaugh E., Nightingale M., Moss J. (2003). Identification of
regulatory domains in ADP-ribosyltransferase-1 that determine transferase and NAD
glycohydrolase activities. Journal of Biological Chemistry, 278: 26351-26355.
Buck L., Axel R. (1991). A novel multigene family may encode odorant receptors: a
molecular basis for odor recognition. Cell, 65: 175-187.
Buteau J., Roduit R., Susini S., Prentki M. (1999). Glucagon-like peptide-1 promotes DNA
synthesis, activates phosphatidylinositol 3-kinase and increases transcription factor
pancreatic and duotenal homeobox gene 1 (PDX-1) DNA binding activity in β(INS-1)-
cells. Diabetologia, 42, 856-864.
Caron M. G., Srinivasan Y., Pitha J., Kociolek K., Lefkowitz R. J. (1979). Affinity
chromatography of the beta-adrenergic receptor. Journal of Biological Chemistry, 254:
2923-2927.
Cerione R. A., Sibley D. R., Codina J., Benovic J. L., Winslow J., Neer E. J., Birnbaumer
J., Caron M. G., Lefkowitz R. J. (1984). Reconstitution of a hormone-sensitive
adenylate cyclase system. The pure beta-adrenergic receptor and guanine nucleotide
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 67 -
regulatory protein confer hormone responsiveness on the resolved catalytic unit.
Journal of Biological Chemistry, 259: 9979-9982.
Clapham D. E., Neer E. J. (1997). G protein βγ subunits. Annual Review of Pharmacology
and Toxicology, 37: 167-203.
Corda D., Di Girolamo M. (2002). Mono-ADP-ribosylation: A tool for modulating
immune response and cell signaling. Science's Signal Transduction Knowledge
Environment, 2002: pe53, DOI: http://dx.doi.org/10.1126/stke.2002.163.pe53
Corda D., Di Girolamo M. (2003). Functional aspects of protein mono-ADP-ribosylation.
EMBO Journal, 22: 1953-1958.
Daaka Y., Luttrell L., Lefkowitz R. J. (1997). Switching of the coupling of the β2-
adrenergic receptor to different G-proteins by protein kinase A. Nature, 390: 88-91.
Davignon I., Catalina M. D., Smith D., Montgomery J., Swantek J., Croy J., Siegelman M.,
Wilkie T. M. (2000). Normal hematopoiesis and inflammatory responses despite
discrete signaling defects in Ga15 knock-out mice.Molecular and Cellular Biology, 20:
797-804.
De Lean A., Stadel J. M., Lefkowitz R. J. (1980). A ternary complex model explains the
agonist-specific binding properties of the adenylate cyclase-coupled beta-adrenergic
receptor. Journal of Biological Chemistry, 255: 7108-7117.
Di Girolamo M., Corda D. (2003). Mono-ADP-ribosylation of heterotrimeric G-proteins.
V: Bradshaw R., Dennis E. (Ur.). Handbook of cell signalling. Academic Press, San
Diego, str. 613-618.
Di Girolamo M., Dani N., Stilla A., Corda D. (2005). Physiological relevance of the
endogenous mono(ADP-ribosyl)ation of cellular proteins. FEBS Journal, 272: 4565-
4575.
Dillon J. S., Tanizawa Y., Wheeler M. B., Leng X. H., Ligon B. B., Rabin B. B., Rabin D.
U., Yoo-Warren H., Permutt M. A., Boyd A. E. (1993). Cloning in functional
expression of the human glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor. Endocrinology,
133: 1907-1910.
Dixon R. A., Kobilka B. K., Strader D. J., Benovic J. L., Dohlman H. G., Frielle T.,
Bolanowski M. A., Bennett C., D., Rands E., Diehl R. E., Mumford R. A., Slater E. E.,
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 68 -
Sigal I. S., Caron M. G., Lefkowitz R. J., Strader C. D. (1986). Cloning of the gene
and cDNA for mammalian beta-adrenergic receptor in homology with rhodopsin.
Nature, 321: 75-79.
Doyle M. E., Egan J. M. (2007). Mechanisms of action of glucagon-like peptide 1 in the
pancreas. Pharmacology & Therapeutics, 113: 549-593.
During M. J., Cao L., Zuzga D. S., Francis J. S., Fitzsimons H. L., Jiao X., Bland R. J.,
Klugmann M., Banks W. A., Drucker D. J., Haile C. N. (2003). Glucagon-like
peptide-1 receptor is involved in learning and neuroprotection. Nature Medicine, 9:
1173-1179.
Edvell A., Lindstrom P. (1999). Initiation of increased pancreatic islet growth in young
normoglycemic mice (Umea +/?). Endocrinology, 140: 778-783.
Fredriksson R., Gloriam D. E., Hoglund P. J., Lagerstrom M. C., Schioth H. B. (2003).
There exist at least 30 human G-protein-coupled receptors with long Ser/Thr-rich N-
termini. Biochemical and Biophysical Research Communications, 301: 725-734.
Freissmuth M., Selzer E., Marullo S., Schutz W., Strosberg A. D. (1991). Expression of
two human β-adrenergic receptors in Escherichia coli: functional interaction with two
forms of the stimulatory G protein. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 88: 8548-8552.
Frimurer T. M., Bywater R. P. (1999). Structure of the integral membrane domain of the
GLP-1 receptor. Proteins, 35: 375-386.
Frokjaer S., Otzen D. E. (2005). Protein drug stability: a formulation challenge. Nature
Reviews Drug Discovery, 4: 298-306.
Gilman A. G. (1987). G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annual
Review of Biochemistry, 56: 615-649.
Glaser V. (2009). Competition mounting in peptide market. Genetic Engineering &
Biotechnology News, 29. (http://www.genengnews.com/gen-
articles/competitionmounting-in-peptide-market/2971)
Göke, R., Conlon, J. M. (1988). Receptors for glucagon-like peptide-1(7–36)amide on rat
insulinoma-derived cells. Journal of Endocrinology, 116: 357-362.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 69 -
Grasso P., Deziel M. R., Reichert L. E. (1995). Synthetic peptides corresponding to
residues 551 to 555 and 650 to 653 of the rat testicular follicle-stimulating hormone
(FSH) receptor are suffcient for post-receptor modulation of Sortoli cell
responsiveness to FSH stimulation. Regulatory Peptides, 60: 177-183.
Haag F., Koch-Nolte F. (Ur.) (1997). ADP-ribosylation in animal tissues: structure,
function, and biology of mono (ADP-ribosyl) transferases and related enzymes.
Plenum Publishing Corporaton, New York.
Hällbrink M., Holmqvist T., Olsson M., Östenson C. G., Efendic S., Langel Ü. (2001).
Different domains in the third intracellular loop of the GLP-1 receptor are responsible
for G alpha(s) in G alpha(i)/G alpha(0) activation. Biochimica et Biophysica Acta,
1546: 79-86.
Han S., Arvai A. S., Clancy S. B., Tainer J. A. (2001). Crystal structure and novel
recognition motif of rho ADP-ribosylating C3 exoenzyme from Clostridium
botulinum: structural insights for recognition specificity and catalysis. Journal of
Molecular Biology, 305: 95-107.
Hara N., Tsuchiya M., Shimoyama M. (1996). Glutamic acid 207 in rodent T-cell RT6
antigens is essential for arginine-specific ADP-ribosylation. Journal of Biological
Chemistry, 271: 29552-29555.
Hassa P. O., Haenni S. S., Elser M., Hottiger M. O. (2006). Nuclear ADP-ribosylation
reactions in mammalian cells: where are we today in where are we going?
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70: 789-829.
Heller R. S., Kieffer T. J., Habener J. F. (1996). Point mutations in the first and third
intracellular loops of the glucagon-like peptide-1 receptor alter intracellular signaling.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 223: 624-632.
Hess D. T., Stamler J. S. (2011). Regulation by S-nitrosylation of protein post-translational
modification. The Journal of Biological Chemistry, 287: 4411-4418.
Holst, J. J. (2003). Implementation of GLP-1 based therapy of type 2 diabetes mellitus
using DPP-IV inhibitors. Advances in Experimental Medicine and Biology, 524: 263-
279.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 70 -
Horn F., Bywater R. P., Krause G., Kuipers W., Oliveira L., Paiva A. C., Sander C., Vriend
G. (1998). The interaction of class B G-protein-coupled receptors with their hormones.
Receptors Channels, 5: 305-314.
Hottiger M. O., Hassa P. O., Lüscher B., Schüler H., Koch-Nolte F. (2010). Toward a
unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases. Trends in Biochemical
Sciences, 35: 208-219.
Igel L. I., Powell A. G., Apovian C. M., Aronne L. J. (2012). Advances in medical therapy
for weight loss and the weight-centric management of type 2 diabetes mellitus.
Current Atherosclerosis Reports, 14: 60-69.
Jørgensen R., Wang Y., Visschedyk D., Merrill A. R. (2008). The nature and character of
the transition state for the ADP-ribosyltransferase reaction. EMBO Reports, 9: 802-
809.
Kang B. H., Shim Y. K., Tae Y. K., Song J. A., Choi B. K., Park I. S. Min B. H. (2014).
Clusterin stimulates the chemotactic migration of macrophages through a pertussis
toxin sensitive G-protein-coupled receptor in Gβγ-dependent pathways. Biochemical
and Biophysical Research Communications, DOI:
http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.02.071
Kato J., Zhu J., Liu C., Moss J. (2007). Enhanced sensitivity to cholera toxin in ADP-
ribosylarginine hydrolase-deficient mice. Molecular and Cellular Biology, 27: 5534-
5543.
Kent R. S., De Lean A., Lefkowitz R. J. (1980). A quantitative analysis of beta-adrenergic
receptor interactions: resolution of high and low affinity states of the receptor by
computer modeling of ligand binding data. Molecular Pharmacology, 17: 14-23.
Kharadia S. V., Huiatt T. W., Huang H. Y., Peterson J. E., Graves D. J. (1992). Effect of
an arginine-specific ADP-ribosyltransferase inhibitor on differentiation of embryonic
chick skeletal muscle cells in culture. Experimental Cell Research, 201: 33-42.
Kobilka B. K., Frielle T., Dohlman H. G., Bolanowski M. A., Dixon R. A., Keller P.,
Caron M. G., Lefkowitz R. J. (1987). Delineation of the intronless nature of the genes
for the human and hamster beta 2-adrenergic receptor in their putative promoter
regions. Journal of Biological Chemistry, 262: 7321-7327.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 71 -
Koch-Nolte F., Petersen D., Balasubramanian S., Haag F., Kahlke D., Willer T., Kastelein
R., Bazan F., Thiele H. G. (1996). Mouse T cell membrane proteins Rt6-1 in Rt6-2 are
arginine/protein mono(ADPribosyl)transferases and share secondary structure motifs
with ADP-ribosylating bacterial toxins. Journal of Biological Chemistry 271: 7686-
7693.
Koch-Nolte F., Reche P., Haag F., Bazan F. (2001). ADP-ribosyltransferases: plastic tools
for inactivating protein and small molecular weight targets. Journal of Biotechnology,
92: 81-87.
Kreymann B., Williams G., Ghatei M. A., Bloom S. R. (1987). Glucagon-like peptide-1 7–
36: a physiological incretin in man. Lancet, 2: 1300-1304.
Laing S., Unger M., Koch-Nolte F., Haag F. (2011). ADP-ribosylation of arginine. Amino
Acids, 41: 257-169.
Langer I., Vertongen P., Perret J., Waelbroeck M., Robberecht P. (2003). Lysine 195 and
aspartate 196 in the first extracellular loop of the VPAC1 receptor are essential for
high affinity binding of agonists but not of antagonists. Neuropharmacology, 44: 125-
131.
Lefkowitz R. J. (2004). Historical review: A brief history and personal retrospective of
seven-transmembrane receptors. TRENDS in Pharmacological Sciences, 25: 413-422.
Lichtarge O., Bourne H. R., Cohen F. E. (1996). An evolutionary trace method defines
binding surfaces common to protein families. Journal of Molecular Biology, 257: 342-
358.
Loesberg C., Van Rooij H., Smets L. A. (1990). Meta-iodobenzylguanidine (MIBG), a
novel high-affinity substrate for cholera toxin that interferes with cellular mono(ADP-
ribosylation). Biochimica et Biophysica Acta, 1037: 92-99.
Ludden P. W. (1994). Reversible ADP-ribosylation as a mechanism of enzyme regulation
in procaryotes. Molecular and Cellular Biochemistry, 138: 123-129.
Lupi R., Corda D., Di Girolamo M. (2000). Endogenous ADP-ribosylation of the G protein
beta subunit prevents the inhibition of type 1 adenylyl cyclase. Journal of Biological
Chemistry, 275: 9418-9424.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 72 -
Lupi R., Dani N., Dietrich A., Marchegiani A., Turacchio S., Berrie C. P., Moss J.,
Gierschik P., Corda D., Di Girolamo M. (2002). Endogenous mono-ADP-ribosylation
of the free Gβγ prevents stimulation of phosphoinositide 3-kinase-γ and phospholipase
C-β2 and is activated by G-protein-coupled receptors. Biochemical Journal, 367: 825-
832.
Maehama T., Hoshino S., Katada T. (1996). Increase in ADP-ribosyltransferase activity of
rat T lymphocyte alloantigen RT6.1 by a single amino acid mutation. FEBS Letters,
388: 189-191.
Malek D., Münch G., Palm D. (1993). Two sites in the third intracellular loop of the D2
receptor are involved in functional G-protein-mediated coupling to adenylylate
cyclase. FEBS Lettters, 325: 215-219.
Marathe C., Rayner C. K., Jones K. L., Horowitz M. (2013). Glucagon-like peptides 1 in 2
in health in disease: A review. Peptides, 44: 75-86.
Mathi S. K., Chan Y., Li X., Wheeler M. B. (1997). Scanning of the glucagon-like peptide-
1 receptor localizes G-protein-activating determinants primarily to the N terminus of
the third intracellular loop. Molecular Endocrinology, 11: 424-432.
May D. C., Ross E. M., Gilman A. G., Smigel M. D. (1985). Reconstitution of
catecholamine-stimulated adenylate cyclase activity using three purified proteins.
Journal of Biological Chemistry, 260: 15829-15833.
McIntyre N., Holdsworth C. D., Turner D. S. (1964). New interpretation of oral glucose
tolerance. Lancet, 2: 20-21.
Mlinarič-Raščan I. (2005). Genska zdravila. Farmacevtski Vestnik, 56: 71-74.
Montrose-Rafizadeh C., Avdonin P., Garant M. J., Rodgers B. D., Kole S., Yang H.,
Levine M. A., Schwindinger W., Bernier M. (1999). Pancreatic glucagon-like peptide-
1 receptor couples to multiple G proteins and activate mitogen-activated protein kinase
pathways in chinese hamster ovary cells. Endocrinology, 140: 1132-1140.
Moss J., Tsai S. C., Adamik R., Chen H. C., Stanley S. J. (1988). Purification and
characterization of ADP-ribosylarginine hydrolase from turkey erythrocytes.
Biochemistry, 27: 5819-5823.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 73 -
Mumby S. M. (1997). Reversible palmitoylation of signaling proteins. Current Opinion in
Cell Biology, 9: 148-154.
Nauck M. A. (2011). Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus: Properties,
functions, and clinical implications. American Journal of Medicine, 124: S3-S18.
Navarro M., Rodriquez de Fonseca F., Alvarez E., Chowen J. A., Zueco J. A., Gomez R.,
Eng J., Blázquez E. (1996). Colocalization of glucagon-like peptide-1 (GLP-1)
receptors, glucose transporter GLUT-2, and glucokinase mRNAs in rat hypothalamic
cells: evidence for a role of GLP-1 receptor agonists as an inhibitory signal for food
and water intake. Journal of Neurochemistry, 67: 1982-1991.
Offermanns S. (2003). G-proteins as transducers in transmembrane signalling. Progress in
Biophysics & Molecular Biology 83, 101-130.
Oka M., Itoh Y., Shimidzu T., Ukai Y., Yoshikuni Y., Kimura K. (1997). Involvement of
metabotropic glutamate receptors in Gi- in Gs-dependent modulation of adenylate
cyclase activity induced by a novel cognition enhancer NS-105 in rat brain. Brain
Research, 754: 121-130.
Okada H., Doken Y., Ogawa Y., Toguchi H. (1994). Preparation of three-month depot
injectable microspheres of leuprorelin acetate using biodegradable polymers.
Pharmaceutical Research, 11: 1143-1147.
Okamoto T., Nishimoto I. (1992). Detection of G-protein-activator regions in M4 subtype
muscarinic, cholinergic, and alpha 2-adrenergic receptors based upon characteristics in
primary structure. Journal of Biological Chemistry, 267: 8342-8346.
Okazaki I. J., Moss J. (1999). Characterization of glycosylphosphatidylinositol-anchored,
secreted and intracellular vertebrate mono-ADP-ribosyltransferases. Annual Review of
Nutrition, 19: 485-509.
Okazaki I. J., Zolkiewska A., Takada T., Moss J. (1995). Characterization of mammalian
ADP-ribosylation cycles. Biochimie, 77: 319-325.
Pazos F., Helmer-Citterich M., Ausiello G., Valencia A. (1997). Correlated mutations
contain information about protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology,
271: 511-523.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 74 -
Peptide Synthesis in Pharmaceutical Manufacturing. PharmPro 2009, June 22
(http://www.pharmpro.com/Articles/2009/06/Peptide-Synthesis-In-Pharmaceutical-
Manufacturing/)
Petäjä-Repo U. E., Hogue M., Laperriére A., Walker P., Bouvier M. (2000). Export from
the endoplasmic reticulum represents the limiting step in the maturation and cell
surface expression of the human δ opioid receptor. Journal of Biological Chemistry,
275: 13727-13736.
Pettit, D. K. Gombotz W. R. (1998). The development of site-specific drug-delivery
systems for protein and peptide biopharmaceuticals. Trends in Biotechnology, 16:
343-349.
Pierce K. L., Premont R. T., Lefkowitz R. J. (2002). Seven-transmembrane receptors.
Nature Reviews Molecular Cell Biology, 3: 639-650.
Prabakaran S., Lippens G., Steen H., Gunawardena J. (2012). Post-translational
modification: nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic
information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and
Medicine, 4: 565-583.
Qanbar R., Bouvier M. (2003). Role of palmitoylation/depalmitoylation reactions in G-
protein-coupled receptor function. Pharmacology & Therapeutics, 97: 1-33.
Stevens R., Cherezov V., Katritch V., Abagyan R., Kuhn P., Rosen H., Wüthrich K.
(2013). The GPCR network: a large-scale collaboration to determine human GPCR
structure in function. Nature Reviews Drug Discovery, 12: 25-34.
Renthal R., Steinemann A., Stryer L. (1973). The carbohydrate moiety of rhodopsin:
lectin-binding, chemical modification and fluorescence studies. Experimental Eye
Research, 17: 511-515.
Rhee S. G. (2001). Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C. Annual
Review of Biochemistry, 70: 281-312.
Rodbell M., (1971) The glucagon-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of
rat liver. V. An obligatory role of guanylnucleotides and glucagon action. Journal of
Biological Chemistry, 246: 1877-1882.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 75 -
Ross E. M., Gilman A. G. (1977). Resolution of some components of adenylate cyclase
necessary for catalytic activity. Journal of Biological Chemistry, 252: 6966-6969.
Rost B., Yachdav G., Liu J. (2004). The PredictProtein server. Nucleic Acid Research, 32:
321-326. (https://www.predictprotein.org, dostopano: 06. oktobra 2011)
Rouille Y., Martin S., Steiner D. F. (1995). Differential processing of proglucagon by the
subtilisin-like prohormone convertases PC2 and PC3 to generate either glucagon or
glucagon-like peptide. Journal of Biological Chemistry, 270: 26488-26496.
Sadeghi H., Birnbaumer M. (1999). O-Glycosylation of the V2 vasopressin receptor.
Glycobiology, 9: 731-737.
Scheer A., Fanelli F., Costa T., De Benedetti P. G., Cotecchia S. (1996). Constitutively
active mutants of the alpha 1B-adrenergic receptor: role of highly conserved polar
amino acids in receptor activation. EMBO Journal, 15: 3566-3578.
Schroeder W. T., Lopez L. C., Harper M. E., Saunders G. F. (1984). Localization of the
human glucagon gene (GCG) to chromosome segment 2q36-37. Cytogenetics and Cell
Genetics, 38: 76-79.
Schwindinger W. F., Robishaw J. D. (2001). Heterotrimeric G-protein βγ-dimers in growth
in differentiation. Oncogene, 20: 1653-1660.
Shorr R. G., Lefkowitz R. J., Caron M. G. (1981). Purification of the beta-adrenergic
receptor. Identification of the hormone binding subunit. Journal of Biological
Chemistry, 256: 5820-5826.
Simon M. I., Strathmann M. P., Gautam N. (1991). Diversity of G proteins in signal
transduction. Science, 252: 802-808.
Sousa T., Paterson R., Moore V., Carlsson A., Abrahamsson B., Basit A.W. (2008). The
gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International
Journal of Pharmaceutics, 363: 1-25.
Sprang S. R. (1997). G protein mechanisms: insights from structural analysis. Annual
Review in Biochemistry, 66: 639-678.
Stadel J. M., Nambi P., Shorr R. G., Sawyer D. F., Caron M. G., Lefkowitz R. J. (1983).
Catecholamine-induced desensitization of turkey erythrocyte adenylate cyclase is
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 76 -
associated with phosphorylation of the beta-adrenergic receptor. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 80: 3173-3177.
Strathmann M., Simon M. I. (1990). G protein diversity: a distinct class of a subunits is
present in vertebrates and invertebrates. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 87: 9113-9117.
Su J. Y., Vo A. C. (2007). 2-Arachidonylglyceryl ether in abnormal cannabidiol-induced
vascular smooth muscle relaxation in rabbit pulmonary arteries via receptor-pertussis
toxin sensitive G proteins-ERK1/2 signaling. European Journal of Pharmacology, 559:
189-195.
Sunahara R. K., Dessauer C. W., Gilman A. G. (1996). Complexity and diversity of
mammalian adenylyl cyclases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 36:
461-480.
Takhar S., Gyomorey S., Su R. C., Mathi S. K., Li X., Wheeler M. B. (1996). The third
cytoplasmic domain of the GLP-1(7–36 amide) receptor is required for coupling to the
adenylyl cyclase system. Endocrinology, 137: 2175-2178.
Taylor W. R., Munro R. E., Petersen K., Bywater R. P. (2003). Ab initio modelling of the
N-terminal domain of the secretin receptors. Computational Biology and Chemistry,
27: 103-114.
Thorens B. (1992). Expression cloning of the pancreatic β cell receptor for the gluco-
incretin hormone glucagon-like peptide 1. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 89: 8641-8645.
Tsao P. I., von Zastrow M. (2001). Diversity and specificity in the regulated endocytic
membrane trafficking of G-protein-coupled receptors. Pharmacology & Therapeutics,
89: 139-147.
Tsuge H., Nagahama M., Oda M., Iwamoto S., Utsunomiya H., Marquez V. E., Katunuma
N., Nishizawa M., Sakurai J. (2008). Structural basis of actin recognition and arginine
ADP-ribosylation by Clostridium perfringens iota-toxin. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 105: 7399-7404.
Ueda K., Hayaishi O. (1985). ADP-ribosylation. Annual Review of Biochemistry, 54: 73-
100.
M. Deželak: Karakterizacija mono-ADP-ribozilacije tretje znotrajcelične zanke receptorja za glukagonu podobni peptid-1
Doktorska disertacija. Univerza v Ljubljana, Medicinska fakulteta, 2014.
- 77 -
Unger M. V., Hargrave A. P., Baldwin M. J., Schertler G. F. X. (1997). Arrangement of
the rhodopsin transmembrane α-helices. Nature, 389: 203-206.
Vogelsgesang M., Aktories K. (2006). Exchange of glutamine-217 to glutamate of
Clostridium limosum exoenzyme C3 turns the asparagine-specific ADP-
ribosyltransferase into an arginine modifying enzyme. Biochemistry, 45: 1017-1025.
Walsh, C. T. (2006). Posttranslational Modification of Proteins. Roberts and Company,
Englewood.
Wheeler M. B., Lu M., Dillon J. S., Leng X. H., Chen C., Boyd A. E. (1993). Functional
expression of the rat glucagon-like peptide-1 receptor, evidence for coupling to both
adenylyl cyclase and phospholipase-C. Endocrinology, 133: 57-62.
White J. W., Saunders G. F. (1986). Structure of the human glucagon gene. Nucleic Acids
Research, 14: 4719-4730.
Widmann C., Dolci W., Thorens W. (1996a). Desensitization and phosphorylation of the
glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor by GLP-1 in 4-phorbol 12-myristate 13-
acetate. Molecular Endocrinology, 10: 62-75.
Widmann C., Dolci W., Thorens W. (1996b). Heterologous desensitization of the
glucagon-like peptide-1 receptor by phorbol esters requires phosphorylation of the
cytoplasmic tail at four different sites. Journal of Biological Chemistry, 271: 19957-
19963.
Widmann C., Dolci W., Thorens W. (1997). Internalization in homologous desensitization
of the GLP-1 receptor depend on phosphorylation of the receptor carboxyl tail at the
same three sites. Molecular Endocrinology, 11: 1094-1102.
Wilden U., Kuhn H. (1982). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin: number of
phosphorylation sites. Biochemistry, 21: 3014-3022.
Yau L., Molnar P., Moon M. C., Buhay S., Werner J. P., Molnar K., Saward L., Del Rizzo
D., Zahradka P. (2008). meta-Iodobenzylguanidine, an inhibitor of srginine-dependent
mono(ADP-ribosyl)ation, prevents neointimal hyperplasia. The Journal Of
Pharmacology in Experimental Therapeutics, 326: 717-724.
ZAHVALA
Največja zahvala gre mojemu mentorju izr. prof. dr. Aljoši Bavcu, ki me je tekom mojega
študija in raziskovalnega dela strokovno in znanstveno podpiral.
Zahvaljujem se vsem zaposlenim na Inštitutu za biokemijo Medicinske fakultete Univerze
v Ljubljani za vso pomoč in potrpljenje pri mojem delu. Zahvala tudi zaposlenim na drugih
institucijah, kjer sem opravljal svoje raziskovalno delo.
Zahvalo izrekam vsem članom komisije za kritičen in konstruktiven pregled doktorske
disertacije ter za vse predlagane popravke.
Iskrena hvala staršema za vso materialno in nematerialno pomoč. Brez nje bi mi bilo
mnogo, mnogo težje.
In nenazadnje, iskrena hvala tudi moji hčeri Rebeki. Še posebej zaradi nje se je bilo
smiselno in vredno potruditi, vztrajati in nadaljevati tudi takrat, ko je bilo najtežje.