KARAKTERISASI

Rutin yang diisolasi kemudian dilakukan karakterisasi dan identifikasi bisa dengan mengukur titik lelehnya, absorpsi UV, spektrum FTIR, HPLC, kromatografi kertas dan KLT lalu hasilnya dibandingkan dengan rutin standar. Proses karakterisasi dan identifikasi bertujuan untuk menentukan ciri-ciri senyawa isolat hasil pemurnian dan menentukan struktur senyawa isolat hasil pemurnian.

HPLCRutin yang diisolasi bisa diidentifikasi menggunakan metode HPLC dan dibandingkan dengan rutin standar memakai kolom hyperclone ODCC C18 V-25cm dan campuran metanol : air (70:30) sebagai fase gerak dengan laju 0.5ml/min, dan dideteksi menggunakan UV pada panjang gelombang 280 nm. Kromatogram HPLC dari fraksi aqueous setelah ekstraksi dan isolasi dengan kloroform, dan standar rutin ditunjukkan pada gambar 2, 3 dan 4.

KLT dan Kromatografi KertasRutin yang diisolasi juga bisa dibandingkan dengan rutin standar menggunakan metode KLT; pre-coated aluminum sheet dengan silica gel GF254 sebagai fase diam dan fase gerak etil asetat : butanon : asam format : air (50:30:10:10), dan etil asetat : asam format : asam asetat : air (100:11:11:27). Pada kromatografi kertas, menggunakan kertas filter Watman No.1 sebagai fase pendukung dan fase gerak asam asetat : air (15:85) dan isopropil alkohol : air (60:40).

Penggunaan KLT memerlukan baku standar sebagai pembanding untuk memastikan ada atau tidaknya senyawa duga di dalam fraksi yang diuji. Dalam contoh ini, baku standar yang digunakan yaitu rutin.

Sedangkan nilai Rf dari rutin dan standar rutin dalam fase gerak yang berbeda-beda ditunjukkan pada tabel 1Table 1. Perbandingan nilai Rf rutin isolasi dan standar rutin pada fase gerak yang berbeda-beda

Solvent systems in TLC and Paper Chromatography

Rf value of isolated rutin

Rf value of standard rutin

Ethyl acetate: butanone: formic acid: water 0.31 0.28 Ethyl acetate: formic acid: acetic acid: water 0.38 0.35 Acetic acid: water 0.57 0.60 Isopropyl alcohol: water 0.78 0.80

atau

KLTFase diam silika gel GF 245 pre-coated, fase gerak metanol-etil asetat (7:3), hasilnya rutin isolat akan mempunyai Rf yang sama dengan rutin pembanding dan bercak berwarna kuning dengan penampak bercak alumunium (III) klorida 5%.

Kromatografi kertasFase pendukung kertas Watman No.1, fase gerak BAW butanol-asam asetat-air (4:1:5) dan asam asetat-air-asam klorida (30:10:3), penampak bercak alumunium (III) klorida 5% dan UV 366 nm.

Kromatografi kertas dengan pelarut pengembang yang berbedaMasing-masing kristal dilarutkan dalam metanol lalu dilakukan kromatografi kertas. Pelarut pengembangnya butanol : asam asetat : air (4:1:2,2) dan asam asetat : air (15:85).Hasil: memberikan warna bercak kuning, Rf sama dengan pembanding.

Analisis Spektrofotometri Proses karakterisasi dan identifikasi menggunakan metode spektrofotometri ultraviolet-visibel, dimana senyawa-senyawa yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi akan memberikan serapan pada panjang gelombang tertentu yang khas yang digunakan untuk mengeksitasi elektron pada atom-atom yang terdapat dalam molekul senyawa isolat. Untuk identifikasi rutin yang merupakan flavonol pengukuran serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-400 nm atau 200-500nm karena flavonol memberikan serapan di daerah panjang gelombang 250-280 nm dan pada 330-360 nm.

Rutin dilarutkan dalam metanol dan puncak serapan UV nya diukur lalu dibandingkan dengan rutin standar. Tahapannya:

Alat spektrofotometri UV-visibel diatur pada rentang panjang gelombang 200-500 nm atau 240-450nm,

Serapan dari pelarut, yaitu metanol diukur sebagai blanko, Sejumlah isolat dilarutkan dalam metanol kemudian diukur serapannya.

Spektrum UV dari rutin isolasi dan standar ditunjukkan gambar 6.

Rutin isolasi juga bisa dikarakterisasi menggunakan FTIR menggunakan metode KBr disk lalu dibandingkan dengan rutin pembanding atau standar. Fraksi dipersiapkan sedemikian rupa untuk dikarakterisasi dengan menggunakan spektrum IR. Spektrum IR yang dihasilkan menunjukkan adanya ikatan-ikatan yang terjadi pada struktur kimia suatu senyawa. Dengan diketahuinya ikatan-ikatan kimia tersebut maka dapat diprediksi bentuk molekul dari suatu senyawa. Penggunaan metode FTIR terbatas pada senyawa yang berbentuk padatan. Sehingga bila suatu senyawa berbentuk larutan atau cair maka harus diubah sedemikian rupa sehingga bisa digunakan dalam penentuan karakteristik menggunakan FTIR. Salah satu contoh, spektrum IR yang digunakan adalah Bomem- Michelson 100 FTIR- spektrometer (4000-400 cm-1, 2 cm-1 resolusi, dan 150 scans). Spektrum IR solid non polar dibantu dengan menggunakan teknik KBr. Hasil yang didapatkan, terlihat pada spektrum di bawah (Spektrum IR ditunjukkan dalam gambar 5).

Spektrum rutin menunjukkan 2 major absorpsi pada 359 and 370 nm yang mengindikasikan keberadaan struktur flavonol. Absorpsi maksimum pertama berasal dari transisi π-π* dalam cincin A (sistem aromatik/benzoil) dan absorpsi maksimum kedua terobservasi pada 370nm yang kemungkinan berasal dari cincin B (sistem sinamoil). Struktur rutin sebagai berikut:

Gambar. Struktur Molekul RutinKeterangan :

Cincin A : benzoil

Cincin B : sinamoil

Penentuan spektrum serapan dan serapan geserKristal dilarutkan dalam metanol lalu diukur spektrum serapannya dengan spektrofotometer uv-vis. Diukur pula spektrum serapan geser setelah ditambahkan alumunium klorida.Identifikasi dengan melihat pergeseran kurva batokromik atau hipokromik dilakukan dengan menambahkan dua tetes pereaksi geser ke dalam kuvet berisi larutan isolat dalam metanol. Pereaksi geser yang digunakan adalah larutan NaOH 2M, alumunium (III) klorida 5%, dan larutan HCl.

Identifikasi dengan reaksi warnaKristal dilarutkan dalam air panas, ditambahkan serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida pekat. Terbentuk warna merah secara perlahan-lahan yang bisa ditarik amil alkohol.

Pemantauan titik lelehRutin yang diisolasi juga bisa dikarakterisasi dengan pengukuran titik lelehnya. Pengukuran titik leleh dilakukan menurut metode yang dianjurkan FI III 1979. Sehingga sampel hasil isolasi diharapkan memiliki titik leleh yang mendekati nilai tersebut. Ketidak murnian ditunjukkan apabila sampel meleleh pada rentang suhu yang cukup panjang dari titik tersebut.Titik leleh literatur 185-1920C.

IDENTIFIKASIDari KLT dan speKtrum IR di atas dapat diambil kesimpulan bahwa bentuk molekul 3 dimensi struktur rutin yaitu :

DAFTAR PUSTAKAhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2904757/pdf/1752-153X-4-12.pdf, diakses tanggal 11 September 2013 pukul 17.00 WIB.http://pharmacie-globale.info/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=256&Itemid=41, diakses tanggal 11 September 2013 pukul 17.10 WIB.

http://office.nu.ac.th/nu_journal/pdf/journal/12(2)25-37.pdf, diakses tanggal 11 September 2013 pukul 17.15 WIB.http://www.ijpsr.com/V3I3/40%20Vol.%203,%20Issue%203,%202012,%20IJPSR-1211,%20Paper%2040.pdf, diakses tanggal 11 September 2013 pukul 19.09 WIB.http://www.electrochemsci.org/papers/vol6/6041075.pdf, diakses tanggal 11 September 2013 pukul 19.10 WIB.http://repository.ui.ac.id/contents/koleksi/2/8461091b11768d82e5c01f3d66b0aca625479838.pdf, diakses tanggal 11 September 2013 pukul 19.20 WIB.

yang skripsi ntar ya ndin pustakanya nyusul, lupa gak catet halamannya