1

混ぜるだけで様々な酵素の活性を蛍光で評価できる

検査キットの開発

龍谷大学理工学部物質化学科

宮武 智弘

関西９私大 新技術説明会

2015年 2月27日 科学技術振興機構

2

本技術の概要

• 本法は、様々な種類の酵素および酵素阻害剤の活性

を簡便に蛍光で評価する技術である。

• 蛍光色素を内封したリポソーム（蛍光性リポソーム）と、

その脂質分子膜を透過するポリマーを酵素反応溶液

と混ぜ合わせるだけで、酵素の活性を蛍光で検出で

きる。

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本技術の特徴・従来技術との比較

• 従来の酵素活性評価キットは汎用性に乏しい問題点

があったが、本技術では一つのキットで様々な酵素の

活性を評価することができる。

• 本技術はラベルフリーな酵素活性評価を可能とし、従

来技術よりも簡便に酵素活性の評価が行える。

• 本技術では酵素反応液に、試薬類を混ぜ合わせるだ

けで、速やかに蛍光発光による検出が可能であり、迅

速な酵素活性の検査が行える。

• 本技術では、市販の安価な試薬類を用いているため、

酵素検査キットのコストを低減できる。

4

F. Perret, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 1114-1115.

M. Nishihara, et al., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1659-1669.

両親媒性アニオン

(ドデシルホスフェイト等)

膜透過性ポリマー

・ポリアルギニン（pR: ポリペプチド）

・ポリアリルアミン（pAA: 合成高分子）

など

5(6)-カルボキシフルオレセイン

(CF)

CFが放出

蛍光発光

蛍光性リポソーム

(CH3)3NCH2CH2O P O

O

O-

CH2

CHOCOR

CH2OCOR

ジパルミトイルホスファチジルコリン

(DPPC)

○二分子膜の相転移温度

Tc = 41.4 ˚C

蛍光性リポソームと膜透過性ポリマー

5

DPPC ／

メタノール・

クロロホルム

フィルム状のDPPC

溶媒留去

乾燥 Buffer A* 凍結 ⇔ 融解

（４回）

メンブレンフィルター

100 nm

15回

ゲル濾過

クロマトグラフィー

Sephadex G-50

移動相 Buffer B*

*Buffer A

10 mM HEPES

10 mM KCL

50 mM (CF)

pH = 7.4

*Buffer B

10 mM HEPES

107 mM KCL

pH = 7.4

リポソーム

懸濁液

脂質二分子膜 CF

CF

CF 脂質

二分子膜

蛍光性

リポソーム

蛍光性リポソームの調製

6

F. Perret, et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 1114-1115.

M. Nishihara, et al., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1659-1669.

+ 蛍光性リポソーム

懸濁液

10 mM HEPES

107 mM KCl

Buffer, pH = 7.4

60 ˚C

60 秒

+ 両親媒性アニオン／水

蛍光セル

120 秒

+ 膜透過性ポリマー ／ 水

蛍光測定開始

蛍光光度計

恒温セルホ

ルダ

300 秒

+ Triton X-100

／ 水

両親媒性

アニオン

膜透過性

ポリマー

Triton X-100

膜透過活性を見積もる

蛍光の時間変化測定

lexc = 492 nm, ldet = 517 nm

蛍光性

リポソーム

膜透過活性の評価法

7

nH CH2 C H

CH2

NH3

+

H

C C

H2C CH2

N

CH3H3C+

n

CH2 CH2H H

H H

ポリリシン（pK）

pKa = 10.5

ポリアリルアミン（pAA）

pKa = 9.67 ポリジアリルジメチルアンモニウム

（pDADM）

ポリアルギニン（pR）

pKa = 12.5

様々な膜透過性ポリマー

NH C C OH

(CH2)3

NH

CNH2H2N

O

+

n

H

H

NH C C OH

(CH2)4

NH3

O

+

n

H

H

ポリペプチド

合成ポリマー

8

O

H

O

H

HO

H

H

OHH

COOH

O

H

HO

H

O

H

H

NHH

CH2OH

O

O

CH3

H

H

n

ヒアルロニダーゼ

ヒアルロニダーゼ

O

H

HO

H

HO

H

H

OHH

COOH

O

H

HO

H

O

H

H

NHH

CH2OH

OH

O

CH3

n

ヒアルロン酸 (HA)

(Glucronic acid – N-acetylglucosamine)

b-1,4結合を切断

二糖

＜ヒアルロニダーゼの阻害剤＞

Cromolyn

O

O

HO

OH

OH

OH

OH

Quercetin

・ヒアルロン酸： 細胞間物質、保湿成分

・ヒアルロニダーゼ反応： 受精、胚成長、癌増殖、腫瘍転移と関係する

O

H

O

H

HO

H

H

OHH

COOH

O

H

H

O

H

O

NHH

CH2OH

H

HO3S

O

H

O

H

HO

H

H

OCOOH

H

HO

O

H

H

O

H

NHH

CH2OH

H

HO3S

HO

HO3S

Heparin

K. Mio, R. Stern, Matrix Biol. 2002, 21, 31

9

ポリアルギニンの膜透過を利用したヒアルロニダーゼ反応の検出

ヒアルロン酸 ポリアルギニン (pR)

+

二糖

+

ヒアルロニダーゼ LUVCF

膜透過

X

蛍光

アクチベータ

アニオン

汎用性の高い酵素反応モニタリングシステム

ポリアルギニンに対する結合定数が基質および生成物の間で異なれば、様々な酵素

反応に応用できる。

ポリアルギニン (pR) アクチベータ

アニオン

T. Miyatake, M. Nishihara, S. Matile, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12420.

10

0

10

20

30

40

50

60

0.001 0.01 0.1 1 10 100

HA Sodium Salt (g / mL)

ヒアルロン酸(HA)存在下でのポリアルギニンの膜透過

IC50 (HA) = 0.56 ±0.06 g / mL

蛍光測定条件

LUVCF c.a. 50 M

pR 250 nM

DP 2.5 ~ 100 M

HEPES 10 mM

KCl 107 mM

pH = 7.4, 60 ˚C

Inte

nsi

ty (%

)

ヒアルロン酸 (g / mL)

11

酵素活性の評価実験

+ 蛍光性

リポソーム

緩衝溶液

+ 膜透過性

ポリマー

+ 両親媒性

アニオン

サンプリング （10~20 L 程度）

酵素反応溶液

酵素反応溶液を少量取り、そこへ蛍光性リポソーム、

と膜透過性物質を加え、蛍光強度を測定する。

12

ヒアルロニダーゼ反応の追跡

0

10

20

30

40

50

60

0 4 8 12 16 20 24 28

Reaction Time (min)

t1/2 = 1.8 ± 0.2 min Inte

nsi

ty (%

)

13

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

Cromolyn (mM)Reaction Time (min)

Rela

tive

In

ten

sity (

%)

0 mM

4 mM 6 mM

8 mM

10 mM

O

OO

NaO

O

OH

O

O

O

ONa

O

Cromolyn

ヒアルロニダーゼの阻害剤

K. Mio, R. Stern, Matrix Biol.

2002, 21, 31

T. Miyatake, M. Nishihara, S. Matile, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12420.

ヒアルロニダーゼ阻害剤の活性評価

酵素反応時間 （分）

蛍光

強度

(%

)

14

ヘキソキナーゼの活性評価

ヘキソキナーゼ

膜透過性ポリマー

+

+

蛍光性リポソーム

膜透過

X

蛍光

両親媒性アニオン

膜透過性ポリマー

D-グルコース

D-グルコース-6-リン酸

ATP

ADP

両親媒性アニオン

この手法はその他のキナーゼ類（プロテインキナーゼ、酢酸

キナーゼ等）にも適応可能

15

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

+ LUVCF

10 mM HEPES

107 mM KCl

Buffer pH = 7.4

酵素反応条件

ヘキソキナーゼ 0, 0.2, 0.3 unit / mL

グルコース 2 mM

ATP 2 mM

MgCl2 1 mM

pH = 8.0, 30 ℃

オイルバス 30 ℃

+ pAA

+ DP

酵素反応液

Reaction Time (min)

Rel

ativ

e In

ten

sity

(%

)

pAAの膜透過を利用したヘキソキナーゼ反応の追跡

[ヘキソキナーゼ] = 0, 0.2, 0.3 unit / mL

0 unit

0.2 unit

0.3 unit

16

目視によるヘキソキナーゼ反応の評価

0 20 25 30 35 40 45 50

反応時間 / 分

ヘキソキナーゼ

ヘキソキナーゼ +

D-グルコサミン

ヘキソキナーゼ +

N-アセチル- D-グルコサミン

オイルバス 30 ℃

酵素反応液 0 20 25 30 35 40 45 50 分

+ LUVCF + pAA

+ DP

マイクロプレート

10 mM HEPES, 107 mM KCl Buffer pH = 7.4

酵素反応条件

ヘキソキナーゼ 0.1 unit / mL

グルコース 10 mM

ATP 2 mM

MgCl2 1 mM

pH = 8.0, 30 ℃

17

プロテインキナーゼおよびその阻害剤の活性評価

30

40

50

60

70

0 100 200 300 400 500

酵素反応時間 / 分

[H-89] = 0 M

25 M

100 M

200 M

蛍光

強度

(%

)

プロテインキナーゼ反応の追跡と阻害剤（H-89）の活性評価

18

酵素を用いた分子センシング（酵素センサー）

酵素 （生成物） 分析対象物質

（基質）

分子認識素子

トランスデューサー 物質変換を信号に変える

【電気化学的信号など】

酵素センサー

例） グルコース酸化酵素を用いたグルコースセンサー

glucose + O2 glucono lactone + H2O2 glucose oxidase

H2O2 2H+ + O2 + 2e- 酵素反応で生成した過酸化水素を電気化学的に検出・定量する

19

OHO

HOOH

CH2OH

O

CH2OH

CH2OH

OH

OH

O

スクロース（ショ糖）

O

OH

CH2OH

OH

HO

HO

HO

CH2OH

CH2OH

HO

OH

O

O

OH

CH2OPO3-

OH

HO

HO

HO

CH2OH

CH2OPO3-

HO

OH

O

グルコース

フルクトース

グルコース-6-リン酸

フルクトース-6-リン酸

＋ ＋ヘキソキナーゼ

ＡＤＰＡＴＰ

ポリアルギニンを添加

ATPはpRと

強く結合する

AＤPはpRと

強く結合しない

アクチベータアニオンを添加

アクチベータアニオンはpR

と結合しにくい

アクチベータアニオンはpR

と結合する

pRは膜透過

しにくい

蛍光

pRが膜透過し、

蛍光発光が観測される

CFを封入した

リポソームを添加

インベルターゼ

スクロースのセンシング

ソフトドリンク中のスクロースのセンシング

+ pAA

+ DP

+ LUVCF

インベルターゼ ヘキソキナーゼ

スクロース

グルコース グルコース-6-リン酸

フルクトース-6-リン酸 フルクトース

0

20

40

60

80

100

0 60 120 180 240 300

Time （sec）

Rel

ativ

e In

ten

sity

（

%）

Coca-Cola

Coca-Cola

zero

Coca-

Cola

Coca-

Cola

zero

20

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150

Coca-Cola (L)

0

20

40

60

80

100

0 50 100

カルピス (L)

コカコーラの量と蛍光強度の関係 カルピスの量と蛍光強度の関係

V50 =53±2 L V50=50±1 L

ソフトドリンク中のスクロースの定量

コカコーラ中のスクロース

270±9 M

カルピス中のスクロース

250±9 M

Rel

ativ

e In

ten

sity

（

%）

Rel

ativ

e In

ten

sity

（

%）

21

酢酸キナーゼを用いた酢酸の検出

酢酸キナーゼ反応

酢酸ナトリウム 300 mM

酢酸キナーゼ 7.5 units / mL

ATP 10 mM

MgCl2 10 mM

ヒドロキシルアミン 100 mM

TEA 56.3 mM (pH=7.6, 29 ℃)

酢酸キナーゼ

ＡＴＰ

CH3COOH

ＡDＰ

CH3COO P

OH

O

OH

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100

10 100 1000

0

20

40

60

80

100

1 10 100

酢酸の濃度と蛍光強度の関係

食用酢の量と蛍光強度の関係 酢酸キナーゼ反応曲線

Rel

ativ

e In

ten

sity

（

%）

Rel

ativ

e In

ten

sity

（

%）

Rel

ativ

e In

ten

sity

（

%）

time (min) 食用酢 (L) 酢酸 (mM)

V50=17±0.6

L

EC50=130±5

mM

食用酢中の酢酸の濃度 2200±200 (mM)

22

ラクトースの検出（甘味成分）

ガラクトシダーゼ

OHOHO

OHOH

OH

ラクトース

グルコース

ガラクトース

O

HOOH

OH

OHO

HO

HOOH

O

OH

OHO

HOOH

OH

OH

OHOHO

OHOH

OPO32-

グルコース-6-リン酸

OHO

HOOH

OH

OPO32-

ガラクトース-6-リン酸

ヘキソキナーゼ

ATP ADP

20

30

40

50

60

70

0.1 1 10

I %

[ラクトース]/mM

ラクトースの濃度に対する蛍光強度変化

EC50=1.2±0.08 mM

牛乳中のラクトース濃度

100±20 mM

122 mM (文献値)

20

30

40

50

60

70

1 10 100

I %

牛乳/L

牛乳の量に対する蛍光強度変化

V50=22±2 L W. J. Mullin, Food Res. Int. 1997, 304,

147

23

CH2OCOR

CHOCOR

CH2OCOR グリセロキナーゼ

グリセロール-3-リン酸 ATP ADP 脂肪

脂肪酸

グリセロール

リパーゼ

Liposome

pAA

Dp

Flu.

脂肪のセンシング

CH2OH

CHOH

CH2OH

CH2O

CHOH

CH2OH

P

O

O

O

牛乳 低脂肪牛乳

24

乳酸の検出

NHO

NO

O

O

O

OH

O

O

O

NHO

H2N

乳酸

乳酸

オキシダーゼ

ピルビン酸

ピレン酪酸

ヒドラジド (PBH) pR

蛍光

PBH-ピルビン酸

ヨーグルト中の乳酸濃度

45±5 mM

54 mM (文献値)

乳酸オキシダーゼ反応の追跡

0

20

40

60

80

100

0 30 60 90

I %

酵素反応時間/min

乳酸の濃度に対する

蛍光強度変化

0

20

40

60

80

100

0.1 1 10

I %

[乳酸]/mM

C50=3.4±0.2 mM

ヨーグルトの量に対する

蛍光強度変化

0

20

40

60

80

100

1 10

I %

ヨーグルト/L

V50=7.4±0.4 L F. Mizutani, et al., Anal Chem. Acta

1995, 314, 233

25

多品種の検体を迅速に検査でき、酵素あるいは酵素

阻害剤のスクリーニングに有効。医薬品開発などで、

薬理活性をもつ物質の探索などに利用できる。

使用する試薬類は溶液の状態で長期保存が可能であ

ることから、それらを組み合わせた酵素活性評価キット

としての利用が可能。

本技術は酵素活性を簡便に蛍光で検出できることから、

特定の物質を酵素で認識し、蛍光発光する蛍光酵素

センサーとしての応用も可能。

想定される用途

26

• 発明の名称 ：酵素反応の阻害剤活性分析

方法、および、分析キット

• 公開番号 ：特開2013-212103

• 出願人 ：学校法人龍谷大学

• 発明者 ：宮武智弘、礒谷侑司

本技術に関する知的財産権

27

龍谷大学

知的財産センター

知的財産アドバイザー 櫻井 雄三

ＴＥＬ: 077－543 － 7832

ＦＡＸ: 077－544 － 7263

e-mail: chizai＠ad.ryukoku.ac.jp

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